JPS6298239A - 植物又は植物の１部におけるシアナミドの測定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は植物又は植物の１部、特に果実におけるシアナ
ミドの測定法に関する。

従来の技術 西ｒイツ国特許出願公開第３１５０４０壬号明細書によ
れば、シアナミドは特に葡萄の房及び他の果実における
体眠芽を摘み取る薬剤として便用することができる。埋
填汚染の理由からこの植物内のシアナミド含有量を正確
に測定することが望ましい。しかし今日まで痕跡量のシ
アナミドを十分な精度で検出するための実施可能な分析
法は知られていない。

従来常用の検査法は、シアナミドのシアン基の強い電子
吸収性及びこれから生じるアルカリ媒体中で容易にｚイ
換可能のＰＨ−プロトンの酸性に基づく。特に銀シアナ
ミドの形成は一連の分析法においてこの含有量測定に利
用される。〔−ｅ　ｏ　ツ）　（Ｒ，Ｐｅｒｏｔｔｅ　
）著、＠Ｇａｚｚ、　Ｃｈｌｍ。

ｊｔａｌ、　’第３５巻、第２２８頁、（１９０５年）
参照〕。しかしこの方法では０．１％のシアナミド含有
量を測定することはできない。一連の比色分析法にあっ
てはクロルシアナミドはシアナミド検出のための反応性
中間工程を形成する。

この方法の場合にも痕跡量を正確に測定することはでき
々い。

アルカリ媒体中でシアナミドは配位子としてシアノ第一
鉄酸塩に組込まれ、その結果着色された錯体は痕跡量の
シアナミドを測定するのに利用される〔ビウイスケ（Ｄ
、　Ａ、　８ｕｙｓｋｅ　）及びダウニｙグ（Ｖ、　Ｄ
ｏｗｎｉｎｇ　）著、１Ａｎａ１．　Ｃｈｅｍ。

”第３２巻、１７９８頁（１９６０年）参照〕。

この方法の欠点はその非特異性にある、それというのも
一連の他の親核化合物もこれらの呈色反応を生じるから
である。従って呈色反応の前にこれらの有害物質を除去
することの必要性が著しい問題となる。

更に従来のペーパー及び薄層クロマトグラフィ分析法（
この場合呈色試薬として例えば１゜２−ナフトキノン−
４−スルホネートを使用する）も推薦するのに十分では
ない。

発明が解決しようとする問題点 従って本発明の根本課題は、公知技術水準のこれらの欠
点を有さすまた簡単な方法で高い感度及び十分な精度を
有する申し分のない測定法を提供し、特に痕跡量の場合
にも適している、植物又は植物の１部におけるシアナミ
ド測定法を開発することにある。

問題点を解決するための手段 この課題は本発明によれば、 ａ）シアナミドを植物から抽出し、 ｂ）引続き水性アルカリ、媒体中で１，２−ナフトキノ
ン−壬−スルホネートと反応させて、Φ−シアンイミｒ
−１，２−ナフトキノンにし、 Ｃ）この反応生成物を高圧液本クロマトグラフィ（ＨＰ
ＬＣ）により逆相で分離し、 ｄ）分光光度法テ波長４８５ｎｍ又は２７２ｎｍで測定
する ことによって解決される。

本発明による方法を用いた場合、シアナミ）％を邪Ｒ々
物質、例えばアミノ酸の存在でも極めて特異にまた好ま
しく検出し得ることは、予想外であった。

本発明によれば植物又は植物の１′Ｂ、特に総状花序を
技術的に常用の装置を用いて粉砕し、次いで水溶液中に
存在するシアナミドを抽出により果実から分離する。こ
の処理は有利には液−液一抽出法によって行なう。液−
液抽出用の溶剤としてはすべての水に不溶性の有ｍＭ剤
が適しており、これはシアナミドに関して水に比べて十
分な分配係数を有する。この場合特に有利なものとして
酢酸エチルのようなエステル又はジエチルエーテルのよ
うなエーテルが挙げられる。液−液一抽出を実施する形
式は任意の方法であってよい。最も簡単な実施形式では
シアナミドを常用の抽出装置の１つで抽出するか又は水
相を相応する溶剤で何回も振出すことによって得る。優
れた実施例ではシアナミド含有水溶液から不溶性の果実
残分を除去し、引続きシアナミドを液−液一抽出により
有利には固体吸着剤で分離する。その際抽出剤としては
同様に前記の水に不溶性の有機溶剤又は混合物を使用す
る。固体吸着剤としては特にケイノウ土を使用するのが
有利であるが、基本的には他の吸着剤、例えばシリカゲ
ル等を使用することもできる。

シアナミドを場合によっては他の植物白物質と一緒に分
離した後、有機溶剤を除去し、引続き水性アルカリ溶液
中で１，２−す７トキノンー牛−スルホネートをシアナ
ミドと反応させる。

−■−値として（１、出来るだけ急速な反応を得るため
に８〜１２、有利には９．５〜１０．５を選択する。−
値の調整は常用のアルカリ試薬例えば水酸化カリウム又
は水酸化ナトリウム、或いは炭酸す）　ＩＪウム又は炭
酸カリウムを用いて実施することができる。反応温度も
反応速度に対して大きな影響力をもつ。反応温度は１０
〜１５０℃、有利には８０〜１２０℃であり、この場合
反応は極めて迅速に進行し、シアナミＦ＋又は、シアナ
ミ）’と１．２−ナフトキノン−４−スルホネートとの
反応生成物を分解することはない。

有利にはナトリウム塩として使用することもできる、使
用した１、２−ナフトキノン−手−スルホネートの量は
本質的には試料のシアナミ）％含有量に依る。１，２−
ナフトキノン−杢−スルホネートは、シアナミドとの定
量的反応を可能とするためには少なくとも化学量論的量
て添加する必要がある。予期したシアナミＦ％含有量に
対して１０〜１０００倍の過剰量で使用するのが有利で
ある。１，２−ナフトキノン−牛−スルホネートの溶液
のの度は広範囲にわたって変えることができる。反応溶
液１０００ｄ当り５００〜１５００■の濃度が有利であ
る。

アルカリ媒体中でのシアナミドと１，２−ナフトキノン
−壬−スルホネートとの反応で、冬−シアンイミｒ−１
，２−ナフトキノンのナトリウム塩又はカリウム塩はオ
レンジ−赤色の染料として生じる。同時にこの反応で副
生成物が形成し、これは次の高圧液体クロマトグラフィ
（ＨＰＬＣ）で除去する必要がある。ＨＰＬＣを実施す
るため反応水溶液に冷却後有利にはテトラアルキルアン
モニウム塩を加え、引続き４−シアンイミ）１−１．２
−ナフトキノンのテトラアルキルアンモニウム塩を、水
に水溶性の有機溶剤で抽出する。

テトラアルキルアンモニウム塩は次の逆相−ＨＰＬＣで
のナフトキノン−誘導体の保持を改良し、従って副生成
物の除去を容易にする。この場合炭素原子数が１〜約１
２の同−又は異なるアルキル基（例えばメチル基、エチ
ル基、プロピル基、ブチル基及び／又はオクチル基）を
有する常用のテトラアルキルアンモニウム塩並びに常用
のアニオン例えばフルオリＰ１クロリｒ１ブロミｒ１　
　ヨーダイＰ１　ヒＰロキンド、アセテ−１及びハイド
ロゲンスルフエートを使用することもできる。この場合
特に適当なものとしては硫酸水素テトラブチルアンモニ
ウム及びメチルートリオクチルアンモニウムークロリド
ヲ挙げることができる。

・トーシアンイミｐ−１，２−ナフトキノンを抽出する
だめの溶剤としては特に塩素化炭化水素例えばジクロル
メタン、クロロホルム又は四塩化炭素が挙げられる。し
かし他の溶剤例えば炭化水素（例えばドルオール）も使
用することができる。

Φ−シアンイミｙ−１，２−ナフトキノン及び場合によ
っては副生成物を抽出した後、溶剤を例え一回転蒸発器
で完全に除去し、次いで残渣を高圧液体クロマトグラフ
ィ用溶離剤で捕集する。ＨＰＬＣ−系を施す前に液体混
合物から有利には膜ヂ過器によって場合によっては存在
する固体粒子を除去する。

逆相、有利には市販のｃ−６逆相で高圧液体クロマトグ
ラフィ処理した場合、反応生成物が分離する。移動相と
しては有利には、イオン対−クロマトグラフィで常用の
、メチル−トリオクチルアンモニウム−塩及びメタノー
ル／水／燐酸塩緩衝液（割合８００二１００：５０〜６
００：３５０：５０）からなる混合物を使用する。この
場合燐酸塩緩衝液は有利には一一値７゜０を有し、通常
燐酸水素二ナトリウム及び燐酸二水素カリウムからなる
。メチル−トリオクチルアンモニウム塩、例えば塩酸塩
の量は、通常メタノール／水／燐酸塩緩衝液１０００ｄ
当り０．１〜２．０ｇである。Φ−シアンイミＰ−１゜
２−ナフトキノン誘導体の分光光度法による測定は４８
５　ｎｍ又は２７２　ｎｍの波長で行うことができる。

標準液（シアナミ２０．０１ｍｑ）との比較においてピ
ーク高さを評価することによってシアナミド含有量を測
定することができる。

本発明方法を用いて極めて簡単かつスムーズに測定下限
０．０１〜０．０５　ｐｌ）ｍのシアナミド含有量を検
出することができる。

第１図ないし第４図は本発明方法で得られたＨＰＬＣ−
クロマトグラムを示すものである。

第１図はシアナミド１０μｇを含有する標準液を二回提
供することによって得たクロマトグラムを示す。ビーク
Ａはシアナミドピークであシ、ビークＢは副生成物又は
試薬ピークである。

第２図は、未処理の成熟した房から出発して得られたク
ロマトグラムを示す。ビークＢは植物内容物質に帰因す
る傷害ピークである。

第３図は、シアナミドで処理した成熟した葡萄の房から
得られた相応するＨＰＬＣ−クロマトグラムを示す。実
際にシアナミドはもはや検出されない。傷害ピーク日が
認められるだけである。

第４歯は、未処理の房から出発し、後に付加的にシアナ
ミド１０μｙを加えたクロマトグラムを示す。ビークＡ
はシアナミドピークであり、ピーク日は傷害ピークであ
る。

実施例 次に実施例に基づき本発明を詳述する。

Ａ）試料の作成 房５（ｌをミキサーで粉砕し、次いで少量の水で２５０
ＷＬｌエルレンマイヤーフラスコで洗浄し、超音波浴に
５分間置く。その後遠心分離し、上澄みを傾瀉する。沈
殿を水２０ばで２回洗浄し、遠心分離する。合した上澄
みをＮａＯＨによりー値５．８〜６．２に調整し、３５
℃の最高浴温で回転蒸発器で約２０−に濃縮する。試料
溶液をエキス）　ｖルー　ト［：　Ｅｘｔｒｅｌｕｔ　
、　Ｍｅｒｃｋ社’ＪＪＩｉ１１７３８）ｌ（ｌで吸収
させ、定量的に予め水１０Ｗｌで負荷させたケイソウ土
を含む既製のカラム（ＩＣＴ社製０ＣＴ２０５０）に集
める。

直ちに酢酸エチル４０ｏＩＩｊを用いて溶離を開始する
。水３０１Ｌ／を加えながらエステルを最高５５℃で回
転蒸発器で除去する。残りのＢ液を１゜２−ナフトキノ
ン−牛−スルホネートと引続キ反応させるために使用す
る。

日）反応及び測定 試料溶液にナフトキノン溶液（水１００罰当り１．２−
ナフトキノン−斗−スルホネート１ｇの濃度）５１ｊ及
びカルゼン酸ナトリウム溶液（濃度０．２モル／ｌ　”
）　１０ＩＬ（を加え、油浴中で５分間１００℃の温度
に加熱する。引続き試料溶液を水浴で室温に冷却し、定
量的に（水数ｄで後洗浄）振出ロートに移す。それぞれ
ジクロルメタン３０ｊｔ／で４回、それぞれ硫酸水素テ
トラブチルアンモニウム溶液（濃度０．１モル／ｌ）ｌ
　ｍｌを加えながら掘出す。合した有機相を３５℃で回
転蒸発器で蒸発乾固する。次いで残渣をメタノール５ｄ
で吸収し、膜濾過器を介して濾過した後ＨＰＣＬ−系に
送る。

標準としてシアナミド０．ＯＩＷを同様に分析する。

Ｃ）クロマトグラフィ条件 ＨＰＬｃ−’系：　−ｚ　ン）　ｏ　ｙ　（Ｋｏｎｔｒ
ｏｎ　）　ＨＰＬＣ６００Ｕ■／■ＩＳ−検出器：コン
ト０　、／　（Ｋｏｎｔｒｏｎ　）　Ｌ　Ｃ７２０（デ
ジタル溶解０．００１ ＡＥ　） 移動相；メチル−トリオクチルアンモニウムクロリド０
．５Ｆをメタノール／燐酸塩緩衝液（１：１　）１００
０ｄに溶かす。

燐酸塩緩衝液：溶液１６１０ｍと溶液■３９Ｑｉｕとを
混合 溶液■　：燐酸水素二ナトリウム１１．ｆｌを水で１０
００−に溶かす。

溶液■：燐酸二水素カリウム９．０ｇを水で１０００−
に溶かす。

分離カラム：ゾルノ々ツクス（Ｚｏｒｂａｘ　）　Ｃ８
、牛、６×２５０Ｗｓ（Ｄｕ　Ｐｏｎｔ社製） 流出速度：０．８〜１．２　ｄ／分 測測定波長４８５ｎｍ Ｄ）評価 この評価は次式により行なう： ｐｐｍ　ｃｙ　＝試料中のシアナミド含有量（ｍ９／ゆ
）ＨＰｒ　＝試料からの信号のピーク高さＡｄｄ　：標
準中のシアナミド量（μｙ）＋Ｖ＝比較信号のピーク高
さ εＩｎ　＝初期試料重量（ｇ）

【図面の簡単な説明】

第１図、第２図、第３図及び第４図は本発明方法で得ら
れたＨＰＬＣ−クロマトグラムを示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物又は植物の１部におけるシアナミドを測定する
   方法において、 ａ）シアナミドを植物から抽出し、 ｂ）引続き水性アルカリ媒体中で１，２−ナフトキノン
   −４−スルホネートと反応させ て、４−シアンイミド−１，２−ナフトキ ノンにし、 ｃ）この反応生成物を逆相での高圧液体クロマトグラフ
   ィで分離し、 ｄ）分光光度法で波長４８５ｎｍ又は２７２ｎｍで測定
   する、 ことを特徴とする、植物又は植物の１部におけるシアナ
   ミドの測定法。 ２、水性の植物抽出物を製造し、これからシアナミドを
   液−液抽出法により分離する、特許請求の範囲第１項記
   載の方法。 ３、水に溶解したシアナミドの抽出を、水に不溶性の有
   機溶剤を用いて実施する、特許請求の範囲第２項記載の
   方法。 ４、溶剤として酢酸エチル又はジエチルエーテルを使用
   する、特許請求の範囲第３項記載の方法。 ５、シアナミドの分離を固体吸着剤で液−液−抽出によ
   り実施する、特許請求の範囲第２項から第４項までのい
   ずれか１項に記載の方法。 ６、固体吸着剤としてケイソウ土を使用する、特許請求
   の範囲第５項記載の方法。 ７、シアナミドと１，４−ナフトキノン−スルホネート
   との反応をｐＨ−範囲８〜１２で実施する、特許請求の
   範囲第１項から第６項までのいずれか１項に記載の方法
   。 ８、シアナミドと１，２−ナフトキノン−４−スルホネ
   ートとの反応を１０〜１５０℃で実施する、特許請求の
   範囲第１項から第７項までのいずれか１項に記載の方法
   。 ９、１，２−ナフトキノン−４−スルホネートを少なく
   とも化学量論的量で加える、特許請求の範囲第１項から
   第８項までのいずれか１項に記載の方法。 １０、シアナミドと１，２−ナフトキノン−スルホネー
   トとの反応生成物をテトラアルキルアンモニウム塩とし
   て高圧液体クロマトグラフィに使用する、特許請求の範
   囲第１項から第９項までのいずれか１項に記載の方法。 １１、テトラアルキルアンモニウム塩を製造するため、
   硫酸水素テトラブチルアンモニウム又はメチルトリオク
   チルアンモニウムクロリドを使用する、特許請求の範囲
   第１０項記載の方法。 １２、４−シアンイミド−１，２−ナフトキノン塩を、
   アルカリ性水媒体から有機溶剤で抽出する、特許請求の
   範囲第１項から第１１項までのいずれか１項に記載の方
   法。 １３、高圧液体クロマトグラフィをＣ−８の逆相で実施
   する、特許請求の範囲第１項から第１２項までのいずれ
   か１項に記載の方法。 １４、高圧液体クロマトグラフィ用移動相として、メチ
   ル−トリオクチル−アンモニウム塩及びメタノール／水
   ／燐酸塩緩衝液−溶液（割合８５０：１００：５０〜６
   ００：３５０：５０）からなる混合物を使用する、特許
   請求の範囲第１３項記載の方法。 １５、燐酸塩緩衝液がｐＨ値７．０を有する、特許請求
   の範囲第１４項記載の方法。 １６、メタノール／水／燐酸塩緩衝液−溶液１０００ｍ
   ｌ当りメチル−トリオクチルアンモニウム塩０．１〜２
   ．０ｇを使用する、特許請求の範囲第１４項記載の方法
   。