DE3616324A1 - Monoklonale antikoerper - Google Patents

Description

- 5 - 600-7029

MONOKLONALE ANTIKOERPER

Die vorliegende Erfindung betrifft nicht-menschliche Primaten monoklonale Antikörper, Hybridoma Zell-Linien und Verfahren zu ihrer Herstellung sowie die Verwendung der genannten Zell-Linien zur Herstellung der genannten Antikörper.

Hybridomas werden Zellen genannt, die durch Fusionierung einer immortalisierten Zelle, insbesondere einer Myelomazelle, mit einer oft nicht transformierten Partner-Zelle entstehen. Letztere wird normalerweise ausgewählt wegen ihrer Fähigkeit, eine bestimmte Substanz zu produzieren (z.B. eine Lymphozytenzelle zur Herstellung von Antikörpern). Die resultierende Hybridzelle kann selektioniert und geklont werden, um so Zell-Linien zu erhalten, die Stoffe mit bestimmter Struktur und/oder Eigenschaft produzieren. Insbesondere können solche mit Lymphozyten gebildete Hybridomas zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern verwendet werden.

Die Entwicklung der Hybridoma-Technologie der letzten Jahre konzentrierte sich auf die Herstellung von Zell-Linien, die sowohl stabil sind als auch eine hohe und spezifische Produktionskapazität für eine bestimmte erwünschte Substanz besitzen. Es gäbe verschiedene Lösungsversuche, die hauptsächlich auf das Gebiet der Immunglobuline/Anti körper konzentriert waren.

- 6 - 600-7029

Eine Studie der früheren Antivitäten auf diesem Gebiet gibt einen Ueberblick über die dabei aufgetretenen Probleme und bisherigen Lb'sungs versuche.

Der ursprüngliche Anstoss zur Erforschung von Hybrid Zell-Linien, die monoklonale Produkte erzeugen, kam aus dem Gebiet der Immunbiologie. Bei den erhaltenen Produkten handelt es sich um monoklonale Antikörper. Konventionelle Antisera enthalten normalerweise eine sehr grosse Zahl von Antikörpern, die alle mit dem gleichen Antigen aufgrund ihrer unterschiedlichen Aminos'äuresequenz im Bereich der Bindungsstelle mit mehr oder weniger hoher Affinität reagieren. Darüber hinaus enthalten konventionelle Antisera auch eine grosse Menge von Antikörpern gegen Antigene, die frühere Defensivreaktionen des Individiums, in dem das Antiserum produziert wurde, wiedergeben. Für die meisten Verwendungszwecke sind solche "breite" Antisera ausreichend, aber neuere Entwicklungen der Wissenschaft machen höhere Anforderungen bezüglich Spezifit'ät und Reproduzierbarkeit notwendig.

Eine erste, inzwischen bereits klassische Lösung wurde von Kohler und Milstein [NATURE, 256_, 495 - 497 (1975)] beschrieben, denen es gelang pre-immunisierte Mäuse-MiIzzellen mit "drug"-sensitiven M'duse-Myeloma-Zellen zu fusionieren. Es gelang, die durch Fusion immortalisierten Zellen in vitro zu klonen und zu züchten, d.h. es wurde eine homogene Zellpopulation erhalten, die eine homogene Antikörperpopulation monoklonale Antikörperpopulation (monoklonale Antikörper) produzierte. Durch entsprechende Selektion dieser Zellklone aus den erhaltenen vielen Einzelklonen konnten diejenigen Zellen weitergezüchtet werden, welche Antikörper mit der gewünschten Anti gen spezifit'ät produzieren.

- 7 - 600-7029

Die auf diese Weise hergestellten Mäuseantikörper sind in Forschungs- und Diagnostikanwendungen nützlich und einige wurden bereits therapeutisch am Menschen angewandt. Es würde jedoch einen wesentlichen Fortschritt für die humane ImmunglobulinTherapie bedeuten, wenn auch menschliche oder nicht-menschliche Primaten Antikörper mit ähnlich guter Reproduzierbarkeit und Spezifität in dieser Art erhalten werden könnten. Damit würde auch der Gefahr einer Sensibilisierung vorgebeugt. Einige Versuche, das Problem der Herstellung menschlicher Antikörper in vitro zu lösen, wurden bereits unternommen, bisher jedoch ohne Erfolg.

1. Die Transformation von normalen menschlichen Lymphozyten mit Epstein-Barr Virus (EBV) ist nicht sehr erfolgreich, da der Prozess sehr langwierig ist und auch das Klonen und Selektionieren sich sehr schwierig gestaltet.

2. Fusionierung von normalen (menschlichen) Lymphozyten mit menschlichen Myelomazellen. Diese Methode scheint eine naheliegende Analogie zum Maus-Maus Hybridoma Verfahren darzustellen. Das Problem besteht jedoch darin, dass im menschlichen System nur eine einzige Myelomazell-Linie besteht und diese Zeil-Linie mit Mykoplasma kontaminiert ist (Mykoplasmen verhindern eine erfolgreiche Fusionierung).

3. Die Fusionierung von normalen (menschlichen) Lymphozyten mit einer EBV-transformierten menschlichen Lymphoblastoid-B-ZeI!-Linie ist wahrscheinlich das zuverlässigste und reproduzierbarste Verfahren, das bisher beschrieben wurde. Es leidet jedoch an den grundlegenden in vitro-Charakteristika der Lymphoblastoid-Zellen. Sie sind äusserst schwer zu klonen und, da sie ein frühes Stadium in B-Zellendifferenzierung

- 8 - 600-7029

darstellen, ist ihre Kapazität Antikörper zu produzieren und zu sezernieren, etwa zehnmal geringer als die für richtige Myelomazellen.

4. Die Fusion von menschlichen Lymphozyten mit Mäuse-Myeloma bringt Zellen mit den gleichen ausgezeichneten in vitro-Charakteristika wie die Maus-Maus-Hybridomas hervor, jedoch mit dem grossen Nachteil, dass solche Hybride eine inherente genetische Instabilität aufweisen. In diesem Zusammenhang ist es speziell nachteilig, dass sie das menschliche Chromosom, das die Information für die leichten Kappa-Ketten des Immunglobuli n-Moleküls trägt, ausstossen.

Es wurde in der Folge berichtet, dass bei der Verwendung einer xenogenetisehen Hybridoma-Zelie als Ausgangszelle für eine weitere Fusion mit einer anderen Zelle es möglich ist eine Hybridoma mit stark verbesserter Stabilität zu erhalten (Ostberg, et al., HYBRIDOMA ¹L, No. 4, 361, 1983). Diese xenogenetisehen Hybridomas stellen eine freundlichere Umgebung für eine verbesserte Stabilität hinsichtlich des Verlustes an Chromosomen dar.

A Die Erfindung betrifft eine Hybridoma Zeil-Linie, bestehend aus einer immortalisierten Ausgangszelle, die mit einer xenogenetischen Partnerzelle fusioniert wird, worauf die resultierende immortalisierte Zelle mit einer Zelle fusioniert wird, die fähig ist, einen nicht-menschlichen Primaten monoklonalen Antikörper zu produzieren. Letztere Zelle ist genetisch kompaktibel mit der genannten Partnerzelle im xenogenetisehen Hybridoma. Mit genetisch kompaktibel ist das Charakteristik gemeint, dass die Zelle der genannten Partnerzelle ähnlich ist was Spezies und Genus der Herkunft betrifft derart, dass ein signifikanter Verlust von Chromosomen vermieden wird und daher ein wünschbarer Stabilitätsgrad nach der Fusion erreicht wird.

- 9 - 600-7029

Es zeigt sich nun, dass die Herstellung und Verwendung von nicht-menschlichen Primaten monoklonale Antikörpern, hergestellt durch xenogenetische Hybridoma Fusionstechnik, sich als nützlicher Lösungsversuch bei der Behandlung von Menschen, die monoklonale Antikörper benötigen, und bei diagnostischen Anwendungen erwies. Es ist kein früherer Bericht über die Herstellung oder Isolierung von nicht-menschlichen Primaten monoklonale Antikörpern bekannt.

Dementsprechend ist es ein Gegenstand dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von stabilen Zell-Linien vorzusehen, die nicht menschliche Primaten monoklonale Antikörper "erzeugen, die nützlich sind bei der Behandlung von Menschen und als Diagnostika. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Beschaffung von Immunglobulinen, die von nicht-menschlichen Primaten Lymphozyten abstammen und sich für eine erfolgreiche Verwendung am Menschen eignen. Die nicht-menschlichen Primaten, die von diesem Aspekt der Erfindung eingeschlossen sind, umfassen im wesentlicheren die höheren Affen, z.B. Orang-Utans, Gorillas, oder Schimpansen und Affen wie "neue Welf'-Affen, z.B. Cebus-Affen, und "alte WeIf-Affen, z.B. Rhesus-Affen. Was die Verwendung von höheren Affen und Affen betrifft, so ist es klar, dass für praktische Zwecke die Verwendung von Tieren, die klein genug sind um unter Laborbedingungen leicht gehandhabt zu werden, vorgezogen wird. Der obige Aspekt soll aber alle nichtmenschlichen Primaten einschliessen.

Unter einem besonderen Aspekt ist die als immortalisierte Zelle gewählte xenogenetische Hybridoma Zelle ein Myelomahybrid, das seine eigene Fähigkeit zur Produktion von Immunglobulin verloren hat. Ein Beispiel einer solchen xenogenetisehen Hybridoma Zelle würde das zwischen einer Myeloma Zelle und einer Lymphozyten

-' -'.-' '-■ 36Ί 6324

- 10 - 600-7029

Zelle sein. Geeignete Myeloma Zellen können von Mäusen und Ratten erhalten werden erzeugen vorzugsweise kein Immunglobulin. Diese Myelomas können ihrerseits Hybride sein (z.B. Mäusemyeloma χ Mäuse-Lymphozyten). So eine Zelle ist z.B. die Mäuse SP-2 Myeloma Zeil-Linie. Diese wird dann beispielsweise mit einem Affen-Lymphozyten fusioniert, wobei ein Affen monoklonaler Antikörper hergestellt wird.

Wie beschrieben in der vorgehend zitierten HYBRIDOMA 2_-Literaturstelle (wie auch in den entsprechenden Patentanmeldungen, z.B. UK Patentanmeldung 2,113,715A, veröffentlicht am 10. August 1983) werden die für die Immortalisierung verwendeten xenogenetisehen Hybridomas vor der weiteren Fusionierung "drug"-resistent gemacht und vorzugsweise zur Verbesserung der Ausbeute der gewünschten Substanz mit einem Lymphozyten, der vorsensiti viert wurde, fusioniert. Die Methoden der "drug"-Resistenz und der vorsensitiven Behandlung wie auch das Verfahren der Fusionierung dieser Zellen sind konventionelle Methoden. Die Selektion der gewünschten Hybride und das Klonen werden nach an sich bekannten Methoden, wie früher beschrieben und veröffentlicht, durchgeführt (siehe z.B. obige Literaturzitate).

In einer besonderen Ausführungsform gemäss der vorliegenden Erfindung wird die SP-2-Zell-Linie verwendet. Diese war ursprünglich ein Hybridoma zwischen der P3-X63-Ag8-Linie und Mäuse-Milz-Zellen, die Antikörper gegen rote Schafblutzellen bilden. Sie hat die Fähigkeit zur Bildung von Antikörpern verloren (CF. M. Shulmann et al., NATURE 276., 269, 1978).

Die SP-2-Zell-Linie ist beispielsweise erh'ältlich durch das NIGMS Human Genetic Mutant Cell Depository Ref. GM 35669 A (siehe US DHHS 1982 Catalog of Cell Lines). Die Zeil-Linie wird "drug"-

- 11 - 600-7029

resistent gemacht und hierauf mit normalen menschlichen peripheren Lymphozyten nach bekannten Verfahren fusioniert [CF. G. Galfre et al., NATURE 26£, 550 (1977) und R. Nowinski et al., SCIENCE 210., 537 (1980)].

Es wird eine grosse Anzahl Hybriden erhalten und nach ungefähr fünf Wochen werden fünf Klone selektioniert, die rasches Wachstum ohne Antikörperproduktion zeigen. Diese Zellen werden dann auf Resistenz gegen 8-Azaguanin selektioniert und mit drei dieser Linien ist es möglich, Mutanten zu erhalten, die gegen 20 iig/ml von 8-Azaguanin resistent sind. Diese Zellen sind gleichzeitig sensitiv gegen Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin (HAT)-Medium, was zeigt, dass sie ihre Fähigkeit zur Erzeugung von Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase verloren haben. Eine dieser Linien ist SPAZ 4. Sie kann genutzt werden für eine weitere Fusion, um das Antikörper produzierende Hybridoma zu erhalten.

Die einfachen Hybridoma Zell-Linien der vorliegenden Erfindung, welche nicht-menschliche Primaten monoklonale Antikörper produzieren können, falls dies gewünscht oder verlangt wird, weiter fusioniert werden, wie z.B. mit einer weiteren Lymphozytenzelle von einem Affen, um damit Zellen mit grösserer Stabilität oder mit etwas verschieden gewünschten Eigenschaften zu erhalten.

Die erfindungsgemäss hergestellten Antikörper können am Menschen zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten, bösartigen Tumoren sowie Allergien eingesetzt werden. Sie können eingesetzt werden zur Behandlung von Abstossungen bei Transplantationen sowie bei anderen bekannten Indikationen wie bei durch Pharmazeutika verursachte Toxizität, z.B. Digoxin. Sie können bei diagnostischen Anwendungen, z.B. in Behältern (kits) und ähnlichem verwendet werden.

- 12 - 600-7029

Beispiele von Typen der Zell-Linien auf welche sich die vorliegende Erfindung bezieht, sind Zell-Linien, die Maus-Myeloma-ZeIlen und Menschen und nicht-Menschen Primaten Zellen umfassen, um so aus einer xenogenetisehen Maus-Menschen Zelle eine (Maus χ Menschen) χ nicht-menschlichen Primaten Zeil-Linie, z.B. eine (Maus χ Menschen) χ Affen Hybridoma Zeil-Linie, oder (Maus χ nicht menschlichen Primaten) χ nicht-menschlichen Zeil-Linie, wie eine (Maus χ Affen) χ Affen Zeil-Linie. Weitere gemäss der vorliegenden Erfindung vorgesehene Zell-Linien schliessen, z.B. eine [(Maus χ Menschen) χ nicht-menschlichen Primaten] χ nichtmenschlichen Primaten Zeil-Linie, z.B. [(Maus χ Menschen) χ Cebus-Affe] χ Cebus-Affe Zeil-Linie, eine [(Maus χ Menschen) χ Rhesus-Affe] χ Rhesus-Affe Zeil-Linie, eine [(Maus χ Menschen) χ Schimpansen] χ Schimpansen Zeil-Linie, und eine [(Maus χ Menschen) χ Rhesus-Affe] χ Schimpansen Zeil-Linie.

Die nach der vorliegenden Erfindung hergestellten monoklonalen Antikörper werden für die therapeutische Anwendung nach an sich bekannten Methoden konfektioniert und verabreicht, sowie für die diagnostische Verwendung in konventionellen Behältern (kits) aufgehoben .

In den nachfolgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert .

- 13 - 600-7029

BEISPIEL 1

Digoxin wird in 2 ml absolutem Aethanol gelbst und 2 ml 0,1 molares Natriumperjodat wird tropfenweise hinzugefügt. Die Mischung wird während 48 Minuten inkubiert. Hierauf werden 60 Mikroliter Aethylenglykol zugegeben. Nach 5 Minuten Inkubaktion werden 50 mg "keyhole limpet" Hämocyanin (KLH) in 10 ml Wasser bei einem pH 9,5 hinzugefügt. Nachdem der pH sich bei 9,5 stabilisiert hat, werden 0,3 g NaBH4 in 2 ml Wasser zugegeben. Das so erhaltene Präparat wird während der Nacht gegen eine Salzlösung dialysiert.

Ungefähr 4 mg KLH-Digoxin in einem Volumen von 0,5 ml wird zusammen mit 0,5 ml Freund¹s Komplett Adjuvant emulgiert. Die Emulsion wird intramuskulär in beide Oberschenkel eines Cebus-Affen injiziert. Folgend dieser ersten Injektion wird dem Tier 4 mal eine ähnliche Menge KLH-Digoxin, aber jetzt emulgiert in 0,5 ml Freund¹s Inkomplett Adjuvant, verabreicht. Nach dieser Immunisierung zeigt der Bluttest, dass das Tier Antikörper produziert hat, die bei einer Reaktion mit Digoxin in der Lage sind bei in vitro-Studien, die Toxizität von Digoxin zu inaktivieren. Dies kann gezeigt werden durch die Beobachtung, dass Verdünnungen von Affen-Serum den toxischen (letalen) Effekt von Digoxin (oder seines Analogons Ouabain) auf sensitivierte menschliche Lymphoblastoid-Zellen in einer Zellkultur neutralisieren. Nachdem das Tier zwei Monate geruht hat, wurde eine weitere i.v. Injektion von 0,5 ml KLH-Digoxin in Salzlösung verabreicht.

Am dritten Tag nach der letzten intravenösen Injektion, werden dem Tier für die Fusionierung Zellen entnommen.

- 14 - 600-7029

a. Blut wird einer peripheren Vene entnommen und in einer Spritze, enthaltend 50 jil Heparin-Lösung (10,000 USP Einheiten/ml), gegeben. Die Blut-Lymphozyten werden gereinigt durch stufenweises zentrifugieren auf einem Kissen von PERCOLL® [Pharmacia, Inc., Piscataway, N.J.3. Nach dem Zentrifugieren werden die Zellen in "Hank's balanced salt solution" (Gibco Laboratories, Grand Island, N.Y., Katalog No. 310 - 4020, im Handel allgemein zugänglich) gewaschen.

b. Durch Anwendung von aseptischen chirurgischen Techniken werden Lymphknoten aus der Leistengegend entfernt. Um einzelne Zeil-Suspensionen zu präparieren, werden die Lymphknoten durch ein feinmaschiges Stahl netz gedruckt. Die isolierten Zellen werden in "Hank's balanced salt solution" gewaschen.

c. Durch Anwendung von aseptischen chirurgischen Techniken wird am Tier eine teilweise Splenektomie durchgeführt. Eine Einzel-Zellsuspension wird aus dem Milzfragment hergestellt, indem man das Organ durch ein feinmaschiges Stahl netz drückt. Die isolierte Einzel-Zellsuspension wird in "Hank's balanced salt solution" gewaschen.

Ungefähr 2 χ 10? isolierte Lymphozyten werden mit einer annähernd gleichen Menge von SPAZ-4 Myeloma-Ze11 en (erhältlich nach an sich bekannten Methoden, wie z.B. im vorstehend zitierten HYBRIDOMA 2^ aufgeführt) in serumfreiem Medium gemischt und in einer Zentrifuge mit niedriger Geschwindigkeit pelletiert. Das Zeil-Pellet wird während einer Minute mit 1,0 ml von 50 % PEG-1500 in "Hank's balanced salt solution" bei einem pH von 8,0 behandelt. Nach einer Minute Inkubation bei 37 ^β C wird langsam ein ml "Hank's balanced salt solution" hinzugefügt. In der folgenden Minute werden weitere 10 ml von "Hank's solution" hinzugefügt. Die

- 15 - 600-7029

Zellen werden erhalten durch zentrifugieren und resuspendieren in 20 ml von Dulbecco's modifiziertem "Eagle Medium" (No. 430 2100, Gibco Laboratories) VIROLOGY (3, 396 (1959); VIROLOGY 12_, 185 (1960); Gewebe-Kultur Standards Committee, IN VITRO, Vol. 6, No. 2, S. 93, enthaltend 20 % fötales Ochsen-Serum und unter Verwendung von HAT (Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin) als Selektionssystem.

Nach ungefähr drei Wochen, wenn gutes Wachstum in den Kulturen-Näpfchen gesehen wird, wird der Ueberstand von den zu testenden Kulturen entfernt. Die Testierung wird mittels einer ELISA-Technik durchgeführt, indem mit Ochsen-Serum Albumin (BSA) gekuppeltes Digoxin als Antigen benutzt wird (das BSA-Digoxin wird in analoger Weise zum KLH-Digoxin hergestellt). Positive Klone werden festgestellt, indem man ein Kaninchen anti-menschliches oder anti-Affen Immunglobulin-Peroxydase System verwendet. Positive Klone werden zur Aufarbeitung ausgelesen und zur gleichen Zeit geklont durch Begrenzung der Verdünnung in Mikrotiter-Näpfchen, wobei Maus-Thymozyten als Füllstoff-Zellen verwendet werden. Sobald eine grosse Anzahl Zellen zur Verfugung stehen, werden die Klone in flüssigem Stickstoff bei - 196 ^β C eingefroren .

Antikörper werden hergestellt durch Wachsen von Hybridoma Zell-Linien entweder in einer stationären Kultur oder in einer Roller-Kultur, wobei Dulbecco's MEM mit einem Maximum von 10 % fötalen Ochsen-Serum verwendet wird. Die Antikörper, in einer Konzentration von 20 bis 50 Mikrogramm per Milliliter, werden durch Affinitäts-Chromatographie an Sepharose Protein A-Säulen (Pharmacia, Inc.) gereinigt. Hierbei wird das zu chromatographierende Material auf die Säule aufgetragen. Die Bindungskapazität der Säule wird gesättigt und die Säule mit Phosphat

- 16 - 600-7029

gepufferter Salzlösung gewaschen. Nachdem das ungebundene Material aus der Säule entfernt worden ist, wird die Säule mit 0,05 M Natriumzitrat, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid (pH 3,0) eluiert. Das Eluat wird rasch neutralisiert durch Zugabe von 1 M Tris-HCl, pH 8,0).

BEISPIEL 2

Zellen, die gemäss den Zell-Produktions- und Selektionsverfahren von Beispiel 1 hergestellt wurden und die über längere Zeit ihre Fähigkeit Immunglobulin zu erzeugen, verloren haben, werden "drug"-resistent gemacht durch Behandlung in Gegenwart von 20 iig/ml 8-Azaguanine, wodurch es möglich ist, HAT in bekannter Weise als Selektionssystem zu brauchen. Die resultierenden Zellen werden dann fusioniert mit immunisierten Cebus-Affen Lymphozyten und nach Behandlung wiederum mit HAT-Medium die positiven Zellkulturen selektioniert, wobei man die gleichen Verfahren wie im vorstehend beschriebenen Beispiel 1 verwendet.

Gemäss diesem Verfahren wurden bei der Fusion unter Verwendung von Zellen des Cebus-Affen drei Antikörper erhalten. Die Hybridomas wurden mit 7-1, 11-1 und 11-3 bezeichnet. Alle drei Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit, die Toxizität von Digoxin an einer menschlichen Lymphoblastoid Zeil-Linie, IM-9 zu hemmen, getestet. Wurden die Antikörper bei einer Endkonzentration von 100 iig/ml verwendet, so wurde das folgende Resultat erreicht:

- 17 - 600-7029

Zugabe	Digoxin, Dosis, die keinen Schaden
	verursacht
Phosphat	2,9 χ 10-8 μ
gepufferte
Salzlösung
7-1	4,7 χ 10-7 μ
11-1	9,4 χ 10-7 μ
11-3	2,3 χ 10-7 M

Der 7-1 Antikörper wurde auch wegen seiner Spezifizitat gegen andere Typen von Digitalis-Alkaloiden getestet. Das Resultat wird in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst:

Wirkstoff Wirkstoff, Dosis, die keinen Schaden

verursacht

Phosphat

gepufferte

Salzlösung 7-1

Ouabain 2 χ 10"⁸ M 2 χ ΙΟ"⁸ Μ

Digitoxin 5,9 χ KT⁹ M 2,3 χ ΙΟ"⁸ Μ

Deslanosid 2,3 χ 10~⁸ Μ 1,9 χ 10-7 μ

Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass die nach obiger Methode hergestellten Antikörper gegen den toxischen Effekt von Wirkstoffen protektiv wirken können. Im Falle der Digitalis-Alkaloide kann ein Antikörper gegen zwei der Wirkstoffe, die vom Patienten ausserhalb der Klinik verwendet werden (Digoxin und Digitoxin) und gegen einen parenteral verwendeten Wirkstoff (Deslanosid) schützen. Er hat keine Wirkung gegen einen anderen parenteralen Wirkstoff (Ouabain).

- 18 - 600-7029

BEISPIEL 3

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, wird beim erwachsenen männlichen Schimpansen KLH-Digoxiη als Immunogen verwendet. Nach insgesamt fünf Injektionen dieses Antigens, welches getrennt im Abstand von zwei Wochen verabreicht wird, wird mit 0,5 ml KLH-Digoxin intravenös verabreicht (ungefähr 4 mg Protein) ein letztes Mal stimuliert. Am sechsten Tag nach der letzten i.v. Injektion wird dem Tier eine Blutprobe entnommen und einen Tag nach der Blutung für die Zellfusion mit der SPAZ-4 Myeloma Zeil-Linie verwendet, wobei das vorstehend umrissene Verfahren angewandt wird. Von der am sechsten Tag erhaltenen Probe werden IgG-Antikörper produzierende Hybridoma, die mit CH 4-14 und CH 4-25 bezeichnet werden, erhalten. Letztere haben eine Lambdaresp. leichte Kappa-Kette. Die Charakterisierung der leichten Ketten erfolgt auf an sich bekannte Weise, indem man Reagentien gegen humane Immunglobuline verwendet. Solche Reagentien geben unzweideutige Resultate und die Reaktivität ist stärker gegenüber anti-human Reagentien als gegenüber anti-Affen Reagentien wie sie gegen den Cynomolgus-Affen hergestellt wurden. Beide von ihnen (Maus χ Menschen) χ Schimpansen-Antikörper haben Affinitäten für Digoxin, die deutlich höher sind als der im vorstehenden Beispiel 2 erwähnte Cebus-Antikörper 11-1.

Claims (22)

SANDOZ-PATENT-GMBH Case 600-7029 Lörrach PATENTANSPRUECHE:

1. Eine Hybridoma Zeil-Linie, umfassend eine immortalisierte Zelle, die mit einer Zelle fusioniert wird, die fähig ist, einen nicht-humanen monoklonalen Antikörper zu produzieren, wobei die immortalisierte Zelle eine xenogenetische Hybridoma Zelle umfasst, die aus einer Ursprungs-immortalisierten Zelle und einer Partner-Zelle fusioniert wird und wobei die genannte Antikörper produzierende Zelle genetisch kompatibel mit der genannten Partner-Zelle ist.

2. Eine Hybridoma Zeil-Linie wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die den genannten Antikörper produzierende Zelle den gleichen Genus wie die Partner-Zelle in der xenogenetisehen Hybridoma Ursprungszelle hat.

3. Eine Hybridoma Zeil-Linie wie in Anspruch 1 beansprucht, worin die den genannten Antikörper produzierende Zelle die gleiche Spezies wie die Partner-Zelle in der xenogenetisehen Hybridoma Ursprungszelle hat.

4. Eine Hybridoma Zeil-Linie wie in Anspruch 2 beansprucht, worin die den nicht-humanen Primaten monoklonale Antikörper produzierende Zelle ein Lymphozyt ist.

1 c ^

. ■ ; j ο Z

- 2 - 600-7029

5. Eine Hybridoma Zeil-Linie wie in Anspruch 1 beansprucht, worin der nicht-humane Primaten monoklonale Antikörper ein Affen-monoklonaler Antikörper ist.

6. Eine Hybridoma Zeil-Linie nach Anspruch 1, worin die immortalisierte Ursprungszelle eine SP-2 Zeil-Linie ist.

7. Eine Methode zur Herstellung der Hybridoma Zeil-Linie nach Anspruch 1, indem man eine xenogenetische Hybridoma-Zelle "drug"-resistent macht, diese dann mit einer Antikörper produzierenden Zelle, die genetisch mit der Partner-Zelle im xenogenetisehen Hybridoma kompatibel ist, fusioniert und das gewüschte Hybrid selektioniert.

8. Eine Methode wie in Anspruch 7 beansprucht, worin die .,... Selektion eines gewünschten Hybrids aufgrund des Mangels an Sensitiv!tat gegenüber HAT und der Prüfung auf die Fähigkeit nicht-humane Primaten monoklonale Antikörper zu erzeugen, erfolgt.

9. Ein Zell-Fusionssystem, welches eine nicht-humane Primaten monoklonale Antikörper produzierende Zelle und eine xenogenetische Hybridoma-Zelle umfasst, fusioniert aus einer immortal isierten Zelle und einer Partner-Zelle, welche genetisch kompatibel mit der genannten Antikörper produzierenden Zelle ist, in einer Nährmedium-Kultur, zusammen mit einem Agens, welches die Fusion der genannten Zellen unterstützt.

10. Nicht-humaner monoklonal er Antikörper.

11. Ein Antikörper gem'dss Anspruch 10, wobei der Antikörper ein Affen-monoklonaler Antikörper ist.

ORIGINAL IHSPECTSD

- 3 - 600-7029

12. Eine (Maus χ Menschen) χ nicht-Menschen Primaten Hybridoma Zeil-Linie.

13. Eine (Maus χ nicht-Menschen Primaten) χ nicht-Menschen Primaten Hybridoma Zeil-Linie.

14. Eine Zeil-Linie gemäss Anspruch 12, wobei die Zeil-Linie eine (Maus χ Menschen)) χ Affen Hybridoma Zeil-Linie ist.

15. Eine Zeil-Linie gemäss Anspruch 13, wobei die Zeil-Linie eine (Maus χ Affen) χ Affen Hybridoma Zeil-Linie ist.

16. Eine Hybridoma Zeil-Linie, umfassend eine Trioma-Zelle, die mit einer nicht-humanen Primaten monoklonale Antikörper produzierenden Zelle fusioniert wird, wobei die Trioma-Zelle die Fusion einer immortalisierten Zelle mit einem nichthumanen Primaten Lymphozyten umfasst und wobei die immortalisierte Zelle eine xenogenetische Hybridoma Zelle umfasst, die aus einer Ursprungs-immortalisierten Zelle und einer Partner-Zelle fusioniert wird und wobei der genannte Lymphozyt genetisch kompatibel ist, sowohl mit der genannten Partner-Zelle als auch mit der genannten Antikörper produzierenden Zelle.

17. Eine Hybridoma Zeil-Linie wie in Anspruch 16 beansprucht, worin die genannte Antikörper produzierende Zelle den gleichen Genus wie der Lymphozyt hat.

18. Eine Hybridoma Zeil-Linie wie in Anspruch 17 beansprucht, worin der Lymphozyt den gleichen Genus wie die Partner-Zelle und die genannte Antikörper produzierende Zelle hat.

·-· ■■■■-■ "--'·-· 3816324

- 4 - 600-7029

19. Eine Zeil-Linie nach Anspruch 16, wobei die Zeil-Linie eine [(Maus χ Menschen) χ nicht-Menschen Primaten] χ nichtMenschen Primaten Zeil-Linie ist.

20. Eine Zeil-Linie nach Anspruch 10, wobei die Zeil-Linie eine [(Maus χ Menschen) χ Schimpansen] χ Schimpansen Zeil-Linie
ist.

21. Eine Zeil-Linie nach Anspruch 14, wobei die Zeil-Linie eine (Maus χ Menschen) χ Schimpansen Zeil-Linie ist.

22. Ein Antikörper nach Anspruch 10, wobei der Antikörper ein
Schimpansen monoklonaler Antikörper ist.