DE3608552C2

DE3608552C2 -

Info

Publication number: DE3608552C2
Application number: DE19863608552
Authority: DE
Inventors: Joachim Dipl.-Phys. Dr. 5000 Koeln De Wagner; Manfred 5653 Leichlingen De Kliemann; Alfred Dipl.-Phys. Dr. 5060 Bergisch Gladbach De Zembrod; Karl-Georg Dr. 5600 Wuppertal De Metzger; Hans-Joachim Dr. 5620 Velbert De Zeiler
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1986-03-14
Filing date: 1986-03-14
Publication date: 1990-04-19
Also published as: DE3608552A1

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Messung kleiner Bakterienkonzentrationen nach dem Nephelometer- Prinzip mit einer optischen Anordnung zur Erfassung des an den Bakterien gestreuten Lichtes und einer elektroni schen Auswerteeinheit, wobei die optische Anordnung eine Laserlichtquelle, eine Meßküvette, einen Photodetektor und Blenden zur Aussonderung des ungestreuten Lichts umfaßt.

Nephelometer dieser Art sind z. B. in DE-A-28 13 245 und DE-A-24 09 273 beschrieben. Die zuerst genannte Offenlegungsschrift beschreibt eine Anordnung zur Messung der Größe der in einer Flüssigkeit dispergierten Teilchen. Im wesentlichen geht es dabei um die Ausbildung der zu messenden Probe in Form eines offenen Flüssigkeitsfilmes und die Art und Weise der Teilcheninjektion. Der optische Aufbau entspricht einem konventionellen Nephelometer. Modifikationen betreffen eine Adaption des Strahlenganges für den Fall von unidirektional durch das Meßfenster laufenden Teilchen. Es finden sich keine Angaben, über welchen Intensitätsbereich optische Signale mit Sicherheit detektiert werden können.

In DE-A-24 09 273 wird ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen von Antigen-Antikörper-Reaktionen beschrieben. Diese Reaktionen führen zu einer Trübung der Meßflüssigkeit in der Küvette, die quantitativ mittels eines Nephelometers bestimmt wird. Der optische Aufbau weist gegenüber einem konventionellen Nephelometer eine verbesserte Ausblendung des Primärbündels und eine Blende zur Unterdrückung der Streustrahlung des Laserbündels an diesen Blenden auf. Die beschriebene Anordnung ist in der Lage, das gestreute Licht über 1,5 Dekaden sicher zu detektieren.

Bei der Messung sehr kleiner Bakterienkonzentrationen nach dem Nephelometerprinzip kommt es darauf an, gestreutes Licht mit einer hohen Nachweisempfindlichkeit über mehrere Dekaden innerhalb einer möglichst kurzen Meßzeit sicher zu detektieren. Der Hintergrund für diese Problemstellung soll nachfolgend näher erläutert werden.

Untersuchungen von Medikamenten zur Prüfung ihrer Wirksamkeit gegen Infektionskrankheiten setzen definierte Bakterienkonzentrationen voraus. Bakterien liegen im Rahmen solcher Prüfungen typischerweise in Suspensionen aggregiert (Ketten, Haufen, Cluster) vor, da sich die Bakterien nach einer Teilung nicht immer voneinander trennen. Für die Untersuchung wichtig sind jedoch nur die sogenannten Colony Forming Units (CFU).

Für Untersuchungen dieser Art ist insbesondere der Bereich von 10³ bis 10⁸ Bakterien pro ml interessant, weil solche Bakterienkonzentrationen physiologisch relevant sind. Üblicherweise werden bei diesen Konzentrationen Abtötungskurven (Bakterienwachstum bei Antibiotikazugaben) gemes sen. Eine bekannte Meßmethode ist z. B. das Ausplattieren. Dabei wird aus der Bakteriensuspension eine Probe gezogen und auf einem Nährmedium ausgestrichen (plattiert). Nach Bebrüten des Nährmediums (ca. 1 Tag) können die gewachse nen Kolonien dann ausgezählt werden. Des weiteren werden photometrische Trübungsmessungen zur Bestimmung der Bakterienkonzentration herangezogen. Diese Methode ist aber nur anwendbar für Bakterienkonzentrationen <5 · 10⁶ Bakterien pro cm³, wobei der Grenzwert von der Art der Bakterien abhängt. Ferner existieren kommerziell erhält liche Geräte, die auf der Basis von Einzelteilchen- Meßverfahren arbeiten. Sie beruhen auf Meßverfahren, die für die Teilchengrößenbestimmung entwickelt wurden (z. B. Coulter-Counter). Nachteilig wirkt sich bei diesen Geräten aus, daß jedes gezählte Partikel als Bakterium interpre tiert werden muß. Um Fehlmessungen zu vermeiden, müssen die Bakteriendispersionen sehr gut von Fremdpartikeln, wie Staub, Luftblasen u. a., gereinigt werden. Es gibt jedoch noch die Möglichkeit, anschließend an eine Messung eine Untersuchung der Teilchengrößenverteilung im Hinblick auf die Anzahl kleiner Partikel durchzuführen, um dann aus der Teilchengrößenverteilung die Anzahl der tatsächlich ge zählten Bakterien zu ermitteln.

Hier setzt die Erfindung an. Es bestand die Aufgabe eine Meßmethode zu entwickeln, die die Bestimmung von Bakteri enkonzentrationen in dem oben angegebenen Bereich (ins besondere 10³ bis 10⁵ Bakterien pro ml) mit einer gegen über den bekannten Verfahren verbesserten Meßzeit ermög licht. Ziel der Erfindung ist also die Verkürzung der Meßzeit bei hohen Meßempfindlichkeiten.

Diese Aufgabe wird unter Verwendung eines Nephelometers mit einer Laserlichtquelle, einer Meßküvette, einem Photo detektor und Blenden zur Aussonderung des ungestreuten Lichts erfindungsgemäß durch folgende Merkmale gelöst:

a) Der streuende Bereich der zur Untersuchung der Bakte riendispersion benutzten Küvette wird mittels zweier Linsen auf eine zwischen zentralen Blenden liegende Strecke abgebildet.
b) Das an den zentralen Blenden vorbeitretende Streu licht wird durch eine weitere Linsenoptik in die Ebene einer Lochblende fokussiert.
c) Das aus der Lochblende austretende Licht wird wiederum mittels Linsen auf einen Photodetektor fokussiert.

Vorzugsweise besteht die zur Fokussierung des Streulichtes auf die Lochblende dienende Linsenoptik aus einer paralle les Licht erzeugenden Linse und einer weiteren, das parallele Licht auf die Lochblende fokussierenden Linse, wobei zwischen diesen beiden Linsen eine stabförmige Blen de angeordnet ist, um parasitäres Streulicht auszuson dern.

Weitere Verbesserungen und Verfeinerungen sind in den Unteransprüchen beschrieben.

Gegenüber dem Verfahren der Ausplattierung hat die erfin dungsgemäße Nephelometermessung den Vorteil eines wesent lich geringeren Zeitbedarfs. Abtötungskurven (Killing- Kurven) können erstmals in Echtzeit untersucht und darge stellt werden.

Gegenüber der Trübungsmessung hat das erfindungsgemäße Meßgerät den Vorteil, daß wesentlich geringere Bakterien konzentrationen definiert erfaßt werden können, während die Meßzeiten für beide Verfahren etwa vergleichbar sind.

Gegenüber dem Einzelteilchen-Meßverfahren hat das erfin dungsgemäße Nephelometer den Vorteil, daß simultan sehr viele Bakterien vermessen werden. Störende Einzelteilchen fallen auf Grund dieses dem Meßprinzip innewohnenden Mittelungsverfahrens praktisch nicht ins Gewicht. Dieses Mittelungsverfahren liefert auch bei einer kürzeren Meß zeit eine höhere Meßgenauigkeit. Auf Grund der nachfol genden elektronischen Datenauswertung, bei der in einem Signalzug das Minimum gesucht wird und dieses Minimum der Konzentration der homogen verteilten Bakterien (ohne stö rende Aggregate, große Partikel, Staub, Luftblasen u. a.) zugeordnet wird, kann hier die sonst notwendige aufwendige Probenpräparation entfallen. Weiterhin hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäße Nephelometermessung ca. um einen Faktor 2- bis 3mal schneller ist als die Einzelteilchen- Messung.

Im Vergleich zu allen drei aufgeführten konkurrierenden Meßverfahren bietet allein die Erfindung die Möglichkeit, eine Messung während der Bestimmung einer Abtötungskurve on-line auszuführen, ohne das Bakterien-Antibiotika-System dabei zu stören.

Im folgenden wird die Erfindung an Hand von Zeichnungen und Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigt

Fig. 1 den prinzipiellen optischen Aufbau des Nephelo meters,

Fig. 2 einen typischen Meßschrieb und

Fig. 3 ein Prinzipschaltbild für die elektronische Meßwertverarbeitung und

Fig. 4 die gemessene Streuintensität als Funktion der Bakterienkonzentration in doppelt logarithmi schem Maßstab.

Gemäß Fig. 1 durchsetzt das von dem Laser 1 erzeugte und durch die Blende 2 begrenzte Lichtbündel die Kunststoff küvette 3 an den Punkten P 1 und P 2. In der Kunststoffkü vette 3 befindet sich die Probe, deren Bakterienkonzen tration gemessen werden soll. Das nicht gestreute Laser licht wird durch die Blende 4 zurückgehalten. Der Durch messer der Blende 4 entspricht dem minimalen Streuwinkel des Gerätes, der hier ca. 5° beträgt. Die Linsen 5 und 6 bilden den streuenden Bereich der Küvette 3 auf die zwi schen den zentralen Blenden 8 und 9 liegende Strecke ab. Dadurch wird das für das Meßsignal maßgebliche Streulicht noch weiter gegenüber dem Untergrund angehoben und damit eine deutliche Verbesserung der Meßempfindlichkeit er reicht, so daß kleine Bakterienkonzentrationen überhaupt erst zum Streulicht beitragen können.

Das an den zentralen Blenden 8 und 9 vorbeitretende Streu licht wird durch die Linse 10 (dritte Linse) paralleli siert und anschließend durch die Linse 11 in die Ebene einer Lochblende 12 fokussiert. Zwischen den Linsen 10 und 11 ist eine stabförmige Blende 13 angeordnet, um das durch Anisotropie-Effekte der Kunststoffküvette (Ziehstreifen) bedingte parasitäre Streulicht auszusondern. Bei Verwen dung von Glasküvetten kann diese Blende entfallen und statt der beiden Linsen 10 und 11 eine einzige Linse ver wendet werden.

Die Lochblende 12 bewirkt, daß alle Lichtanteile aufgefan gen werden, die nicht exakt aus der Brennebene der Linse 10 und somit aus dem Bereich zwischen den zentralen Blen den 8 und 9 auf der optischen Achse kommen.

Die Linsen 14 und 15 fokussieren schließlich das aus der Lochblende 12 austretende Streulicht über ein zwischenge schaltetes, auf die Laserlichtwellenlänge abgestimmtes Interferenzfilter 16 auf einen Photomultiplier 17. Das im Photomultiplier 17 erzeugte Meßsignal wird einer elektro nischen Auswerteschaltung (s. Fig. 3) zugeführt. Ein typischer Meßschrieb (Photomultiplierstrom in mA als Funktion der Zeit in min.) ist in Fig. 2 dargestellt. Nachfolgend wird die Auswertung des Meßsignals näher erläutert.

Ein disperses System kann zur Aggregat- und Agglomeratbil dung neigen. Diese Aggregate oder Agglomerate sind, bezo gen auf die Anzahl der Einzelpartikel nicht sehr häufig. Bei hinreichender Verdünnung enthält dann die Probe im Meßvolumen nur noch wenige Aggregat- oder Agglomeratteil chen, verglichen mit der Anzahl der Einzelpartikel. Diese stören die Bestimmung der Einzelpartikel in der Dispersion durch hohe Streulichtanteile, die sich zu den in Fig. 2 ersichtlichen Signalspitzen aufaddieren. Die Aufgabe der Auswerteschaltung besteht nun darin, den zeitunabhängigen Untergrund des Signals zu ermitteln. Gesucht wird also während einer vorgegebenen Meßzeit das Minimum im Signal zug (nach Fig. 2). Dies geschieht mit der in Fig. 3 dar gestellten Auswerteschaltung. Das am Photomultiplier 17 anstehende Signal wird durch den Operationsverstärker 18 invertiert und anschließend einem zweiten Operationsver stärker 19 zugeführt, an dessen Ausgang eine Diode 20 und ein Kondensator 21 liegt. Die Schaltung 19, 20, 21 spei chert jeweils den negativen Spitzenwert des Signals (nega tiver Peak-Detektor). Auf diese Weise wird das Minimum des Photomultiplierstroms (siehe Fig. 2) bestimmt. Der dritte Operationsverstärker 22 dient hier lediglich als Impedanz wandler, damit ein niederohmiger Ausgang zur Verfügung steht. Alternativ kann das Minimum im Kurvenzug nach Fig. 2 auch mit Hilfe eines Rechners ermittelt werden.

Gemäß Fig. 3 wird das so gewonnene Minimum des Streulicht signals aufgetragen gegen die durch Ausplattieren (für Mikrobiologen das relevante, aufwendige Kalibrierverfah ren) gewonnene Bakterienkonzentration pro ml. Es ergibt sich eine überraschend weitreichende Linearität von über drei Dekaden.

Die schnelle Meßzeit (ca. 20 bis 30 Sek) ermöglicht im Prinzip eine on-line Meßtechnik. Dadurch kann die sonst übliche aufwendige Probenentnahme entfallen. Für Ver gleichsmessungen werden zweckmäßig mehrere Küvetten 3 mittels eines Küvettenschiebers (nicht gezeigt) nachein ander in den Strahlengang geschoben. Für den Küvetten schieber können mehrere austauschbare Aufsätze vorgesehen werden, deren Bezeichnung vom Auswerterechner erkannt wird. Auf diese Weise können verschiedene Versuche simul tan durchgeführt werden. Weiterhin kann der Auswerterech ner die Nummer der gerade im Strahlengang befindlichen Küvette erkennen und in die Meßverarbeitung miteinbezie hen.

Claims

1. Vorrichtung zur Messung kleiner Bakterienkonzentra tionen nach dem Nephelometer-Prinzip mit einer opti schen Anordnung zur Erfassung des an den Bakterien gestreuten Lichtes und einer Auswerteelektronik, wobei die optische Anordnung eine Laserlichtquelle, eine Meßküvette, einen Photodetektor und Blenden zur Aussonderung des ungestreuten Lichts umfaßt, dadurch gekennzeichnet,

a) daß der streuende Bereich der Küvette (3) mit tels zweier Linsen (5, 6) auf die zwischen den zentralen Blenden (8, 9) liegende Strecke abge bildet wird,
b) daß das an den zentralen Blenden (8, 9) vorbei tretende Streulicht durch eine dritte Linsen optik (10, 11) in die Ebene einer Lochblende (12) fokussiert wird und
c) daß das aus der Lochblende (12) austretende Licht durch eine vierte Linse (14, 15) auf den Photodetektor (17) fokussiert wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die dritte Linsenoptik (10, 11) aus einer paralle les Licht erzeugenden Linse (10) und einer weiteren, das parallele Licht auf die Lochblende (12) fokussie renden Linse (11) besteht und daß zwischen den beiden Linsen (10, 11) eine stabförmige Blende (13) angeord net ist, die von Anisotropie-Effekten bei Kunststoff küvetten herrührendes parasitäres Streulicht ausson dert.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 2, dadurch gekenn zeichnet, daß ein Küvettenschieber mit mehreren Küvetten (3) vorgesehen ist, die nacheinander in den Strahlengang geschoben werden.

4. Vorrichtung nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die mit dem Photodetektor (17) verbun dene Auswerteschaltung (18, 19, 20, 21, 22) während einer vorgegebenen Meßzeit das Minimum der zeitlichen Meßwerte abfragt und anzeigt.