DE3601686C2 - - Google Patents

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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/28—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase involving peroxidase
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    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/826—Additives, e.g. buffers, diluents, preservatives

Description

Die Erfindung betrifft eine chemische Zusammensetzung zum Nachweis von auf Peroxid wirkenden Enzymen.
Die Enzymassays nutzen die Aktivität verschiedener Enzyme auf Peroxide, die nach den folgenden allgemeinen Reaktionsgleichungen ablaufen:
Enzym + ROOH → C + ROH (I)
C + AH₂ → Enzym + H₂O + A (II)
wobei C für die Enzymradikal-Sauerstoffkomponente und A für einen chromogenen Stoff steht, der seine Farbe aufgrund des Verlustes der Wasserstoffatome ändert.
Das Enzym kann ein beliebiges auf Peroxid wirkendes Enzym sein, wie beispielsweise (aber nicht im einschränkenden Sinne): Peroxidase, Katalase und Myeloperoxidase. Im folgenden wird der Einfachheit halber Peroxidase als ein repräsentatives Enzym verwandt.
Beispiele für chromogene Stoffe sind: Chloronaphthol, Benzidin, Tetramethylbenzidin, 3-Amino-9-Äthylcarbazol, Dichloronaphthol, Dibromonaphthol, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-Dihydrochlorid, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-(Dihydrochlorid-Dihydrat), 3-Methylbenzothiazol-2, 1-Hydrazon, Parahydroxyphenol-Essigsäure, 2,2′-Azino-Di-(3-Äthylbenzothiazolin-Sulfonsäure), 5-Aminosalizylsäure, Guajakol, o-Tolidin, Pyrogallol.
Beispiele für häufig angewandte Assays werden nachfolgend kurz beschrieben.
Enzymimmunoassay (EIA)
In diesem Test wird einem auf Spuren eines bestimmten Antigens zu untersuchenden Medium der entsprechende unlösliche Antikörper, nämlich ein Peroxidase-Konjugierter Antikörper, zugefügt. Nach Waschen wird ein H₂O₂-haltiges Substrat und ein chromogener Stoff hinzugefügt. In Gegenwart des getesteten Antigens wird der Peroxidase-Konjugierte Antikörper an das Antigen gebunden. Die Zugabe des Substrats bewirkt die Zersetzung des H₂O₂ durch die Peroxidase unter Farbentwicklung.
Immuno-Peroxidaseassay (IPA)
Diese Methode setzt ein Antigen, ein Anti-Antigen und ein Konjugat aus Peroxidase-konjugiertem Antikörper Anti-Antikörper Anti-Antigen ein. Die Peroxidase wird gebunden und es entwickelt sich wie oben Farbe bei Zugabe des Substrates.
Peroxidase - Anti - Peroxidase-Methode (PAP)
Diese Methode verwendet die Wechselbindung (reciprocal bonding) der folgenden Mittel: Antigen, Anti-Antigen (produziert in Kaninchen), Ziegen-Antikaninchen IgG und Peroxidase-Antiperoxidase (Antiperoxidase produziert in Kaninchen). Die Bindung der Peroxidase wird wieder erhalten, welche zu einer Farbentwicklung bei Zugabe des Substrates führt.
Zusätzlich zu den aufgeführten Assays werden andere Extrazellulärtests durchgeführt, beispielsweise zum Nachweis einer enzymatischen Aktivität in einem vorgegebenen Medium. In diesen Fällen wird das Substrat direkt dem enzymhaltigen Medium zugegeben und Enzymaktivität/-Konzentration wird anhand der Intensität der erzeugten Farbe abgelesen.
Obige und ähnliche Assays sind heutzutage für eine ganze Palette klinischer Tests in Anwendung. Die Anwendung dieser Methoden wird jedoch dadurch entscheidend erschwert, daß frische Substratlösung kurz vor ihrer Anwendung vorbereitet werden muß, da chromogene Stoffe und Peroxide nicht über längere Zeitspannen nebeneinander bestehen können, weil eine spontane Farbentwicklung aufgrund der Zersetzung des Peroxides eintritt, wodurch ein Sauerstoffradikal entsteht. Diese Zersetzung findet sehr leicht unter Einfluß von Licht, Metallionen, Verunreinigungen etc. statt. Ein derartig spontan reagiertes Substrat kann für einen zuverlässigen Test nicht verwendet werden und muß ersetzt werden.
Als Stand der Technik sei noch auf die US-Patente 42 78 439, 41 48 611 und 40 71 317 verwiesen.
Hieraus ist die Anwendung chromogener Verbindungen bekannt und daß bestimmte Lösungsmittel wie Dimethylsulfen, Dimethylsulfoxid oder N,N-Dimethylformamid die Stabilität und Sensitivität derartiger Kompositionen verbessern.
Demzufolge ist es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Zusammensetzung anzugeben, in der Substrate verwendet werden, die bereit zur Anwendung gelagert werden können, ohne dabei zu verderben, und dadurch alle Tests, die diese Stoffe einsetzen, zu vereinfachen und zu beschleunigen.
Gelöst wird diese Aufgabe mit den im Anspruch 1 angegebenen Merkmalen.
Vorzugsweise Weiterbildungen ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Es hat sich gezeigt, daß es möglich ist, ein Verfahren zur Durchführung von Enzymassays anzuwenden, das stabile Lösungen aus chromogenen Stoffen und Peroxiden verwendet.
Es gelten dabei spezielle Anforderungen an die Zusammensetzung und die übrigen Bedingungen, wenn diese Lösungen erfindungsgemäß als Substrate in biologischen Tests verwendet werden, je nachdem, ob die Tests intrazellulär oder extrazellulär durchgeführt werden. Insbesondere hat sich gezeigt, daß bei Ausführung intrazellulärer Assays die Mengenverhältnisse zwischen dem organischen Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung in einem bestimmten Bereich liegen müssen, damit verwertbare Farbreaktionen ablaufen. Der Bereich ist bei intrazellulären Tests wesentlich enger als bei extrazellulären Tests.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht im einzelnen darin, das auf Enzymhaltigkeit zu testende Medium mit einer Zusammensetzung in Berührung zu bringen, die
  • a) eine chromogene Verbindung,
  • b) ein Peroxid,
  • c) ein wassermischbares, organisches Lösungsmittel,
  • d) ein wäßriges Lösungsmittel oder eine Pufferlösung und
  • e) eine Verbindung mit der allgemeinen Formel wobei jedes der R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy, CF₃, Halogen, Nitro, SO₂OH, NHCH₂, CH₂NH₂ oder ein unteres Alkyl sein können und X Stickstoff, Sauerstoff, Kohlenstoff- oder Schwefel ist,
    oder eine Verbindung mit der Formel: wobei R₅, R₅′, R₆ und R₆′ jeweils Wasserstoff, ein unteres Alkenyl, -NH₂, Phenyl wahlweise substituiert, -NO₂, Halogen, -OCH₃, Hydroxy, COOC₆H₅, COOH, CH₂COOH oder SO₂OH sein können,
    oder eine Verbindung mit der Formel wobei R₇ und R₈ jeweils Hydroxy oder ein unteres Alkenyl sein können, R₉ Alkenyl ist und R₁₀ eine Azulengruppe ist, wahlweise substituiert mit einer oder mehreren geraden oder verzweigten Alkylgruppen C₁-C₁₀,
    oder eine Verbindung mit der Formel: wobei Y und Z jeweils Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel sein können und R₁₁ Wasserstoff oder Hydroxyphenyl ist,
    oder eine Verbindung mit der Formel wobei R₁₂, R₁₃, R₁₄ und R₁₅ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy oder ein unteres Alkyl sein können,
    oder ein Salz einer der Verbindungen (I), (II), (III), (IV) oder (V) enthält
und danach zu prüfen, ob eine Farbentwicklung stattfindet.
Das wassermischbare organische Lösungsmittel hat vorzugsweise ein Gasphasen-Dipolmoment von größer oder gleich 1.60 D.
Einer bevorzugten Ausführungsform zufolge wird das Enzym ausgewählt unter Peroxidase, Katalase und Myeloperoxidase.
Das Verfahren kann sinnvoll in intrazellulären Assays, d. h. wenn das Assay ein IPA oder PAP ist, durchgeführt werden. Einer bevorzugten Ausführungsform gemäß kann es auch in einem extrazellulären enzymatischen Aktivitätstest, d. h. in einem EIA angewendet werden.
Wenn das Assay ein intrazelluläres Assay ist, liegt das Verhältnis zwischen dem organischen Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung bevorzugt zwischen 45 : 55 und 25 : 75, vorzugsweise bei 35 : 65 Volumenprozent.
Wenn das Assay ein extrazelluläres Assay ist, liegt das Verhältnis zwischen dem organischen Lösungmittel und der wäßrigen Lösung bevorzugt zwischen 80 : 20 und 20 : 80 Volumenprozent. Es hat sich gezeigt, daß sowohl in intrazellulären als auch in extrazellulären Assays Dimethylsulfoxid besonders geeignet als organisches Lösungsmittel ist.
Die chemische Zusammensetzung zur Durchführung des Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, daß es
  • a) eine chromogene Verbindung,
  • b) ein Peroxid,
  • c) ein wassermischbares organisches Lösungsmittel,
  • d) ein wäßriges Lösungsmittel oder eine Pufferlösung, und
  • e) eine Verbindung mit der allgemeinen Formel (I), (II), (III), (IV) oder (V) oder ein Salz dieser Verbindungen enthält.
Die Zusammensetzung kann in der wäßrigen Lösung außerdem 0 bis 5000 ppm chelatierende Mittel enthalten. Diese sind vorzugsweise ausgewählt aus Pyrophosphat, Acetanilid, Citrat oder 8-Hydroxichinolin, entweder für sich oder als Gemisch zweier oder mehrerer solcher chelatierender Mittel.
In einer bevorzugten Mischung enthält die Zusammensetzung:
0 bis  200 ppm Pyrophosphat
0 bis  200 ppm Acetanilid
0 bis 1000 ppm Citrat
0 bis 2000 ppm 8-Hydroxychinolin oder ein Semi-Sulfatsalz davon.
Das wassermischbare organische Lösungsmittel hat vorzugsweise ein Dipolmoment größer oder gleich 1.6 D. Es wird vorzugsweise ausgewählt aus Methanol, Äthanol, Dioxan, Dimethylsulfoxid, Sulfolan, Dimethylsulfon, Hexamethylphosphor-Triamid oder Dimethylformamid.
Die Verbindung mit der Formel (I) wird vorzugsweise ausgewählt aus 8-Hydroxichinolin, 4-Chloro-7-(Trifluoromethyl), Chinolin, 5-Chloro-7-Jodo-8-Hydroxichinolin, 5-Chloro-8-Hydroxichinolin oder aus Kupfer- oder Semi-Sulfatsalz des 8-Hydroxichinolins.
Die Verwendung mit der Formel (II) ist vorzugsweise 4-Anilinosulfonsäure und die Verbindung mit der Formel (III) ist vorzugsweise Colecalciferol.
Der Puffer ist vorzugsweise ausgewählt aus Phosphatpuffer (PB), Trispuffer (Hydroxymethyl-Aminomethan), Boratpuffer und Glycinpuffer.
Die chromogene Verbindung wird vorzugsweise ausgewählt aus: Chloronaphthol, Benzidin, Tetramethylbenzidin, 3-Amino-9-Äthylcarbazol, Dichloronaphthol, Dibromonaphthol, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-Dihydrochlorid, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin(Dihydrochlorid-Dihydrat), 3-Methylbenzothiazol-2, 1-Hydrazon, Parahydroxiphenyl-Essigsäure, 2,2′-Azino-Di(3-Äthylbenzothiazolinsulfonsäure), Aminoantipyrin/phenol, o-Dianizidin, o-Toluidin, 5-Aminosalizylsäure, Guajakol, Pyrogallol, o-Tolidin.
Vorzugsweise liegt das Mengenverhältnis zwischen dem organischen Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung in einer Anwendungsform zwischen 45 : 55 und 25 : 75 Volumenprozent, am besten bei 35 : 65 Volumenprozent.
Weiterhin liegt das Mengenverhältnis zwischen dem organischen Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung in einer anderen Anwendungsform vorzugsweise zwischen 80 : 20 und 20 : 80 Volumenprozent.
Der pH-Wert der genannten Zusammensetzungen sollte zwischen 7 und 8, vorzugsweise bei 7,6 liegen.
Die Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden nachfolgend anhand von Beispielen erläutert, die erläuternd, aber nicht einschränkend aufzufassen sind.
Beispiele 1-15
Diese Beispiele illustrieren die intrazelläre/extrazelluläre Wirkung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen.
Verschiedene Zusammensetzungen wurden unter Verwendung von Dimethylsulfoxid (DMSO) als das organische Lösungsmittel sowie von Trispuffer hergestellt, und deren volumetrischen Verhältnisse wurden variiert. Alle Zusammensetzungen enthielten die folgenden Stoffe:
100 mg 8-Hydrochinolin-Semi-Sulfatsalz, 500 mg 4-Chloro-1-Naphthol, destilliertes Wasser, 80 mg Acetanilid, 80 mg Pyrophosphat und 800 mg Citrat. Die Gesamtmenge von Wasser und DMSO betrug 1 Liter.
Die daraus resultierenden Zusammensetzungen wurden über einen Monat hinweg gelagert und dann zu Vergleichstests zum Nachweis von Peroxidase sowohl in zellulär gebundener Form, als auch in freier Lösung (Meerrettich) herangezogen. Die Ergebnisse dieser Tests sind, als relative Färbungen angegeben, in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1
Beispiel 16
Ein EIA-Test wurde für den Nachweis menschlichen chlorionischen Gonadotropins durchgeführt unter Anwendung von 4-Aminoantipyrin/phenol als Chromogen und einer Zusammensetzung ähnlich jener der vorangegangenen Beispiele mit einem DMSO-Gehalt von 35%.
Auf die Anwendung des Substrates hin entwickelte sich eine rosafarbene Färbung. Der Gehalt an gebundener Peroxidase wurde mit Hilfe der Spektralphotometrie bei 510 nm bestimmt.
Beispiel 17
Der Test aus Beispiel 16 wurde mit o-Dianizidin als Chromogen und einem DMSO-Gehalt von 30% wiederholt. Färbung trat ein und wurde bei 400 nm abgelesen.
Beispiel 18
Der Test aus Beispiel 16 wurde mit 5-Aminosalizylsäure als Chromogen wiederholt. Die Konzentration wurde durch Bestimmung der Absorptionsfähigkeit bei 540 nm ermittelt.
Beispiel 19
Es wurde ein IPA-Test zur Bestimmung von Chlamydia Trachomatis mit einer ähnlichen Zusammensetzung wie in den Beispielen 1-15 mit einem DMF-Gehalt von 35% durchgeführt. Als Chromogen diente 4-Chloro-1-Naphthol. Bei Zugabe des Substrates wurde ein unlöslicher ultramarineblauer Komplex erhalten.
Beispiel 20
Ein PAP-Test wurde mit einem DMSO-Gehalt von 25% und 4-Chloro-1-Naphthol als Chromogen zur Bestimmung von Epstein Bar durchgeführt. Bei Zugabe des Substrates wurde ein unlöslicher ultramarineblauer Komplex erhalten.
Beispiele 21-23
Es wurde eine Lösung getestet, um den Gehalt von Peroxidase, produziert von Meerrettich, zu bestimmen. Drei unterschiedliche Tests unter Anwendung von Äthanol als Lösungsmittel mit einem Gehalt von 65%, bezogen auf den Puffer und 4-Chloro-1-Naphthol, o-Dianizidin und Guajakol als die drei verschiedenen Chromogene wurden vorgenommen. Alle drei Tests ergaben vergleichbare Ergebnisse.
Vergleichstest
Alle beschriebenen Beispiele wurden mit frischen und mit wochenlang "tisch-gelagerten" (desk-stored) Substraten durchgeführt. Es wurden dabei keine feststellbaren Unterschiede in den Ergebnissen mit den frisch hergestellten Zusammensetzungen einerseits und mit den Wochen vorher hergestellten Zusammensetzungen andererseits ermittelt.

Claims (17)

1. Chemische Zusammensetzung zum Nachweis von auf Peroxid wirkenden Enzymen, die
  • a) eine chromogene Verbindung,
  • b) ein Peroxid,
  • 2c) ein wassermischbares organisches Lösungsmittel,
  • d) ein wäßriges Lösungsmittel oder eine Pufferlösung und
  • e) eine weitere Komponente enthält,
dadurch gekennzeichnet, daß diese Komponente eine Verbindung der allgemeinen Formel wobei R₅, R₅′, R₆ und R₆′ jeweils Wasserstoff, ein unteres Alkenyl, -NH₂, wahlweise substituiertes Phenyl, -NO₂, Halogen, -OCH₃, Hydroxy, COOC₆H₅, COOH, CH₂COOH oder SO₂OH sein können,
oder eine Verbindung mit der Formel wobei R₇ und R₈ jeweils Hydroxy oder ein unteres Alkenyl sein können, R₉ ein Alkenyl ist und R₁₀ eine Azulengruppe, wahlweise mit einer oder mehreren geraden oder verzweigten Alkylgruppen von C₁-C₁₀ substituiert ist,
oder eine Verbindung mit der Formel wobei R₁₂, R₁₃, R₁₄ und R₁₅ jeweils unabhängig voneinander Wasserstoff, Hydroxy oder ein unteres Alkyl sein können,
oder ein Salz einer der Verbindungen (I), (II) oder (III) ist.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das wasserlösliche organische Lösungsmittel ein Gasphasen-Dipolmoment von größer oder gleich 1.60 D aufweist.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die wäßrige Lösung 0 bis 5000 ppm chelatierender Mittel enthält.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die chelatierenden Mittel ausgewählt sind aus Pyrophosphat, Acetanilid, Citrat oder 8-Hydroxichinolin, entweder für sich oder als Gemisch zweier oder mehrerer solcher chelatinierender Mittel.
5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es
0 bis  200 ppm Pyrophosphat,
0 bis  200 ppm Acetanilid,
0 bis 1000 ppm Citrat,
0 bis 2000 ppm 8-Hydroxichinolin oder ein Semi-Sulfatsalz davon enthält.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel ausgewählt ist aus Methanol, Äthanol, Dioxan, Dimethyl-Sulfoxid, Sulfolan, Dimethylsulfon, Hexamethylphosphor-Triamid oder Dimethylformamid.
7. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung mit der Formel (I) ausgewählt ist aus 8-Hydroxichinolin, 4-Chloro-7-(Trifluoromethyl), Chinolin, 5-Chloro-7-Jodo-8-Hydroxichinolin, Chlorohydroxichinolin, 5-Chloro-8-Hydroxichinolin oder aus Kupfer- oder Semi-Sulfatsalz des 8-Hydroxichinolins.
8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung mit der Formel (II) 4-Anilinosulfonsäure ist.
9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Verbindung mit der Formel (III) Colecaliferol ist.
10. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer ausgewählt ist aus Phosphatpuffer, Trispuffer (Hydroximethyl-Aminomethan), Boratpuffer und Glycinpuffer.
11. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die chromogene Verbindung ausgewählt ist aus: Chloronaphthol, Benzidin, Tetramethylbenzidin, 3-Amino-9-Äthylcarbazol, Dichlornaphthol, Dibromonaphthol, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin-Dihydrochlorid, 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin oder (Dihydrochlorid-Dihydrat), 3-Methylbenzothiazol-2, 1-Hydrazon, Parahydroxyphenyl-Essigsäure, 2,2′-Azino-Di (3-Äthylbenzothiazolinsulfonsäure), 4-Aminoantipyril/phenol, o-Dianizidin, o-Toluidin, 5-Aminosalizylsäure, Guajakol, o-Tolidin, Pyrogallol.
12. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mengenverhältnis zwischen dem organischen Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung zwischen 45 : 55 und 25 : 75 Volumenprozent liegt.
13. Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Mengenverhältnis zwischen dem organischen Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung etwa bei 35 : 65 Volumenprozent liegt.
14. Zusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Mengenverhältnis zwischen dem organischen Lösungsmittel und der wäßrigen Lösung zwischen 80 : 20 und 20 : 80 Volumenprozent liegt.
15. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ihr pH-Wert zwischen 7 und 8 liegt.
16. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert etwa 7,6 beträgt.
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