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Verfahren zum Ermitteln der Mittellage eines
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elektrophoretischen Bildes Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum
Ermitteln der Mittellage eines elektrophoretischen Bildes oder eines Satzes von
elektrophoretischen Bildern. Elektrophoretische Bilder werden insbesondere zur biologischen
Analyse von hochmolekularen Substanzen, wie Proteinen in Serum-Proben, angefertigt.
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Es sind verschiedene elektrophoretische Verfahren bekannt, beispielsweise
die sogenannte Tiselius-Elektrophorese, die Papier-Elektrophorese und die Cellulose-Acetat-Elektrophorese.
Unter diesen Verfahren wird besonders die Cellulose-Acetat-Elektrophorese vorgezogen,
da die Cellulose-Acetat-Schicht, welche als Substrat für eine Pufferlösung dient,
folgende Vorteile aufweist: Die Cellulose-Acetat-Schicht absorbiert die Probe nur
geringfügig und der Verlust an Probenmaterial ist gering, so daß auch sehr kleine
Mengen von Proben analysiert werden können.
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Auch erzeugt ein Cellulose-Acetat-Film elektrophoretische Bilder mit
hoher Auflösung im Vergleich zu einem Papier- Substrat.
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Durch einfaches Eintauchen in eine Flüssigkeit, wie flüssiges Paraffin
oder Decalin kann der Cellulose-Acetat-Film vollständig wie Glas transparent gemacht
werden.
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Es ist auch bekannt, eine Mehrzahl von Proben auf dem Substrat anzuordnen
und diese Proben gleichzeitig einer Elektrophorese auszusetzen. Nachdem das Substrat
einer Färbung unterzogen wurde, wird es in eine Flüssigkeit, wie Decalin oder flüssiges
Paraffin
eingetaucht, um es durchsichtig zu machen. Auch dann, wenn bei einem derartigen
elektrophoretischen Verfahren die Proben äquidistant auf dem Substrat aufgetragen
werden, variieren die Positionen der auf dem Substrat geformten elektrophoretischen
Bilder aufgrund unterschiedlicher Einflüsse, wie beispielsweise einer Streckung
oder Schrumpfung des Substrates.
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Auch können die Positionen auf dem Substrat, auf welchem die Proben
aufgetragen sind, voneinander abweichen. Darüberhinaus können die Zwischenräume
zwischen aufeinanderfolgenden Sätzen von elektrophoretischen Bildern von Proben
aufgrund von Veränderungen unterschiedlichster Faktoren, wie beispielsweise des
pH-Wertes der Pufferlösung, der Temperatur, der elektrophoretischen Zeitspanne und
-spannung, variieren. Auch können die genannten Zwischenräume sich aufgrund einer
Xnderung der Probenmenge ändern, die an der die Probe auftragenden Spitze haftet.
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Unter den vorstehenden Umständen fallen die Mittelpunkte von Sätzen
von elektrophoretischen Bildern von Proben nicht immer mit den Mittelpunkten derjenigen
Flächen auf dem Substrat zusammen, auf welche die Proben aufgetragen worden sind.
Nachfolgend wird der Mittelpunkt der Fläche auf dem Substrat, auf welche die Probe
aufgetragen ist, als Mittelpunkt der Proben-Auftragung bezeichnet. Werden Sätze
von elektrophoretischen Bildern auf einem Substrat optisch mittels eines Densitometers
abgetastet, wobei der Mittelpunkt der Probenauftragung zugrundegelegt wird, so können
die elektrophoretischen Bilder nicht exakt bestimmt werden, weil der Abtastort vom
Mittelpunkt eines Satzes von elektrophoretischen Bildern abweichen kann. Dementsprechend
kann das Densitogramm, also ein Satz von Fraktionsbildern, nicht genau wiedergegeben
werden und auch die elektrophoretische Analyse ist entsprechend ungenau.
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Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren
zum genauen Ermitteln des Mittelpunktes eines elektrophoretischen Bildes anzugeben,
so daß auch die elektrophoretische Analyse exakt ausführbar ist.
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Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe ist mit ihren Ausgestaltungen
in den Patentansprüchen gekennzeichnet.
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Das erfindungsgemäße Verfahren zum Ermitteln des Mittelpunktes elektrophoretischer
Bilder auf einem Substrat zeichnet sich also dadurch aus, daß das Substrat mehrmals
um den Mittelpunkt der Proben-Auftragung optisch in einer vorgegebenen Teilung mittels
eines Schlitzes abgetastet wird, dessen Breite kleiner ist als die Breite der elektrophoretischen
Abbildung, um eine Vielzahl von optischen Dichtewerten zu gewinnen, welche in einem
Speicher gespeichert werden, und daß eine mittlere Position des elektrophoretischen
Bildes entsprechend den gespeicherten Dichtewerten abgeleitet wird.
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Nachfolgend wird die Erfindung anhand eines in der Zeichnung dargestellten
Ausführungsbeispieles näher erläutert. Dabei zeigt: Fig. 1 eine schematische Ansicht
eines Densitometers, mit welchem die Mittellage des elektrophoretischen Bildes bestimmbar
ist; Fig. 2 eine Draufsicht auf ein auf einem Substrat gebildetes elektrophoretisches
Bild; Fig. 3 eine schematische Darstellung des örtlichen Verlaufes der Abtastung;
Fig. 4 den Verlauf der optischen Dichteverteilung des in Fig. 3 gezeigten elektrophoretischen
Bildes; und Fig. 5 die mittleren optischen Dichten für einzelne Abtastungen.
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Fig. 1 illustriert schematisch ein Densitometer für die photoelektrische
Abtastung eines Substrates, auf dem elektrophoretische Bilder geformt sind. Das
Densitometer weist ein Gefäß 1 aus durchsichtigem Material, wie Acryl, auf. Im Gefäß
1 ist eine Flüssigkeit 2 enthalten, welche den Cellulose-Acetat-Film durchsichtig
macht, wie beispielsweise flüssiges Paraffin oder Decalin. Das Gefäß 1 hat einen
Eingang la, durch den das streifenförmige Substrat 3 aus Cellulose-Acetat in das
Densitometer eingeführt wird, und einen Ausgang lb, durch den das Substrat 3 wieder
aus dem Densitometer herausgeführt wird. In der Mitte des Gefäßes 1 ist eine Meßstation
lc vorgesehen. Es genügt, wenn im Gefäß nur die Meßstation aus durchsichtigem Material
geformt ist. Die Meßstation lc befindet sich auf tieferem Niveau als der Eingang
la und der Ausgang 1b und ist vollständig mit der Flüssigkeit 2 gefüllt. Wie nachfolgend
näher erläutert werden wird, ist die MeBstation lc vorzugsweise horizontal ausgerichtet,
so daß der messende Lichtstrahl senkrecht auf das Substrat 3 auftrifft.
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Am Eingang la und Ausgang Ib des Gefäßes 1 sind Antriebsrollen 4,
5 bzw. angetriebene Rollen 6 und 7 angeordnet. Das Substrat 3 wird zwischen den
Zuführrollen 4, 6 sowie den Abgaberollen 5, 7 eingeklemmt und wird vom Eingang la
zum Ausgang lb in Richtung des Pfeiles A transportiert. Hierzu sind die antreibenden
Rollen 4, 5 mit den Elektromotoren 8 bzw. 9 verbunden, welche ihrerseits von einer
Steuereinrichtung 10 gesteuert werden. Die Rollen 4, 5 können mittels eines endlosen
Bandes oder einer Kette miteinander verbunden sein und können auch durch einen einzigen
Elektromotor angetrieben werden.
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Zur Erzeugung eines messenden Lichtstrahles mit geeigneter Wellenlänge
(gewöhnlich 490 bis 600 nm) ist unter dem Gefäß eine Lichtquelleneinheit 19 aus
einer Lichtquelle 11, einem Wärmestrahlenfilter 12, einer Linse 13, einem Filter
14, einem Prisma 15 und einem Schlitz 16 angeordnet. Die Breite W des
Schlitzes
16 soll kleiner sein als die Breite m der elektrophoretischen Bilder (s. Fig. 2).
Oberhalb des Gefäßes 1 ist ein Photodetektor 17 angeordnet, welcher mit der Signal-Verarbeitungsschaltung
18 verbunden ist.
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Die Lichtquelleneinheit 19 und der Photodetektor 17 werden durch einen
geeigneten Antrieb, welcher durch die Steuereinheit 10 gesteuert wird, senkrecht
zur Zeichenebene der Fig. 1 bewegt, d.h. in einer Richtung, in welcher die Elektrophorese
stattgefunden hat.
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Da die Breite W des Schlitzes 16 kleiner ist als die Breite m der
elektrophoretischen Bilder, ist es zum Abtasten eines Satzes von elektrophoretischen
Bildern einer vollständigen Probe erforderlich, die Bild-Abtastung oftmals durchzuführen.
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Wie in Fig. 2 dargestellt ist, sind auf dem Substrat 3 eine Vielzahl
von Sätzen von elektrophoretischen Bildern einer Vielzahl von Proben gebildet und
in jedem Satz ist jeweils eine Vielzahl von elektrophoretischen Bildern unterschiedlicher
Substanzen erzeugt, welche in der Probe enthalten sind. Die Bilder eines Satzes
erstrecken sich über die Breite R des Substrates 3. Ein Satz elektrophoretischer
Bilder einer ersten Probe wird an einem Ort gebildet, der von der Vorderkante 3a
des Substrates 3 den vorbestimmten Abstand L aufweist und nacheinander werden weitere
Sätze von elektrophoretischen Bildern mit einem Abstand P in Richtung A gebildet,
wobei das Substrat 3 durch die Rollen 4 bis 7 in Richtung A geführt wird.
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Wie in Fig. l dargestellt ist, weist das Densitometer weiterhin einen
Photosensor 20 aus einer Lichtquelle 20a und einem Photodetektor 20b auf, welche
auf den beiden Seiten des Gefäßes 1 angeordnet sind. Der Photosensor 20 dient dazu,
die Vorderkante 3a des Substrates 3 nachzuweisen.
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Die Rollen 4 bis 7 werden durch die Steuereinrichtung 10 derart gesteuert,
daß das Substrat 3 schrittweise um die Mittellage
einer Proben-Auftragung
in Richtung A mit einer Schrittlänge p transportiert wird, wobei die Schrittlänge
p kleiner ist als der Abstand P. Nach der Abtastung einer Probe wird das Substrat
um eine Strecke weitergeschoben, die im wesentlichen dem Abstand P gemäß den Fig.
3-5 entspricht, um die Abtastung der nächsten Probe vorzubereiten. Während das Substrat
3 um die kleine Wegstrecke p vorgeschoben wird, werden die Lichtquelleneinheit 19
und der Photodetektor 17 über die Breite R des Substrates bewegt. Auf diese Weise
wird ein Satz elektrophoretischer Bilder optisch mehrmals an aufeinanderfolgenden
Positionen S1, S2, ... abgetastet, welche nahe der Mittellage der Proben-Auftragung
liegen.
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Nachfolgend wird das Verfahren zur Bestimmung der Mittellage im einzelnen
erläutert. Wird das Substrat 3 in das Gefäß 1 mittels der Rollen 4 und 6 eingegeben,
so wird die Vorderkante 3a des Substrates 3 durch den Photosensor 20 nachgewiesen.
Das Substrat 3 wird dann weitergeschoben und gestopt, sobald eine erste Abtaststelle
S1 in der Mitte des Schlitzes 16 der Meßstation lc angelangt ist, wobei die erste
Abtaststelle S1 einer Position entspricht, die nahe der Vorderkante 3a des Substrates
3 liegt und hiervon eine Strecke entfernt ist, die zwei kleinen Strecken (im obigen
Sinne) (2 x p) in bezug auf die Mittellage der Probenauftragung entspricht, d.h.
L - 2 x p. Während des Vorschubes des Substrates 3 in der Flüssigkeit 2 wird das
Substrat durchsichtig. Sodann werden die Lichtquelleneinheit 19 und der Photodetektor
17 über die volle Breite R des Substrates 3 bewegt und das Substrat wird optisch
mittels des Lichtstrahles bei einer gegebenen Wellenlänge abgetastet. Der Lichtstrahl
tritt aus dem Schlitz 16 aus, der eine Breite W aufweist. Der das Substrat 3 passierende
Lichtstrom wird vom Photodetektor 17 empfangen und ein Ausgangssignal des Photodetektors
wird in die Signal-Verarbeitungseinrichtung 18 eingegeben. Während der optischen
Abtastung des Substrates entlang einer Abtastlinie, welche die erste Abtaststelle
S1 durchläuft, werden die optischen Dichten der elektrophoretischen Bilder von Albumin
(Alb),
-Globulin (0(1)' CC2-Globulin (oc,), rS-Globulin (ß) und
r-Globulin (9 nacheinander in der genannten Reihenfolge gewonnen.
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Diese optischen Dichtewerte werden in einem Speicher gespeichert,
der in der Signal-Verarbeitungseinrichtung 18 vorgesehen ist. Sodann wird das Substrat
3 in Richtung A um die Strecke p weitergeschoben und eine zweite Abtaststelle S2
wird im messenden Lichtstrahl positioniert, wobei die Lichtquelleneinheit 19 und
der Photodetektor 17 noch unbewegt sind. Sodann werden die Lichtstrahleinheit 19
und der Photodetektor 17 in einer Richtung bewegt, die derjenigen der ersten Abtastung
entgegengesetzt ist und die elektrophoretischen Bilder zur 4, «2' l und Alb werden
nacheinander in dieser Reihenfolge abgetastet, um die optischen Dichtewerte dieser
Bilder an der zweiten Abtaststelle S2 zu ermitteln. Diese optischen Dichtewerte
werden ebenfalls im Speicher gespeichert, wobei eine Zuordnung zu den bei der ersten
Abtastung gewonnenen Dichtewerten vorgenommen wird. Die vorstehenden Maßnahmen werden
derart nacheinander wiederholt, daß ein Satz elektrophoretischer Bilder einer ersten
Probe 5-mal optisch an aufeinanderfolgenden Stellen S1, S2 ... S5 abgetastet wird.
Beim vorliegenden Ausführungsbeispiel wird die Start-Stelle S1 für die Abtastung
so bestimmt, daß die dritte Abtast-Stelle S3 mit der Mittellage der Proben-Auftragung
zusammenfällt. Die Start-Stelle S1, die kleine Strecke p und die Anzahl der Abtastungen
für jede Probe können aber unter Berücksichtigung der Breite W des Schlitzes und
der Breite m der elektrophoretischen Bilder variiert werden. Insbesondere ist es
vorteilhaft, die kleine Wegstrecke p zu verringern und die Anzahl der Abtastungen
zu erhöhen, so daß sich aufeinanderfolgende Abtast-Stellungen überlappen.
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Nachdem die optischen Dichtewerte von fünf Abtastungen im Speicher
gespeichert sind, werden Mittelwerte OD1, OD2, ..., OD5 für die einzelnen Abtastungen
berechnet und der Maximalwert unter diesen Mittelwerten bestimmt. Fig. 5 zeigt die
mittleren optischen Dichtewerte für einzelne Abtastungen. Wie in Fig. 5 gezeigt,
fällt der maximale Mittelwert der dritten Abtastung in
der Stellung
S3 für die erste Probe mit der Mittellage der Proben-Auftragung zusammen. Sodann
werden die optischen Dichtewerte, welche beim dritten Abtasten an der Stelle S3
erhalten wurden, ausgewählt und ein Satz von Fraktionsbildern der ersten Probe wird
unter Verwendung der ausgewählten optischen Dichtewerte gebildet. Fig. 4 zeigt ein
derartiges Densitogramm, d.h.
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ein derart gebildetes Fraktionsbild. Vom Densitogramm werden die Fraktionspunkte
zwischen Albumin, il-oc2-, ß - und y-Globulin bestimmt und es werden die Fraktionswerte
dieser Substanzen berechnet.
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Sodann wird ein Satz elektrophoretischer Bilder einer zweiten Probe
optisch abgetastet. Hierzu wird das Substrat 3 in Richtung A derart bewegt, daß
die erste Abtaststelle S1 sich in der Meßstation lc befindet. Das heißt, bei diesem
AusfUhrungsbeispiel wird das Substrat 3 um eine Strecke vorgeschoben, die um den
Betrag P-2xp-2xp=P-4xp von der fünften Abtaststelle S5 der ersten Probe entfernt
ist (mit dem Symbol "x" wird die Multiplikation bezeichnet). Sodann werden die Lichtquelleneinheit
19 und der Photodetektor 17 über die Breite R des Substrates bewegt, wobei das Substrat
in der ersten Abtaststellung S1 angehalten wird. Danach wird das Substrat 3 um die
kleine Wegstrecke p vorgeschoben und die Lichtquelleneinheit 19 und der Photodetektor
17 werden in einer Richtung bewegt, die derjenigen der ersten Abtastung entgegengesetzt
ist. In gleicher Weise wie vorstehend für die erste Probe beschrieben, wird ein
Satz elektrophoretischer Bilder einer zweiten Probe optisch an den einzelnen Abtaststellen
S1, S2, ... S5 abgetastet, um optische Dichtewerte zu gewinnen, welcher im Speicher
der Signal-Verarbeitungseinrichtung 18 gespeichert werden. In der Signal-Verarbeitungseinrichtung
werden Mittelwerte der optischen Dichte zunächst berechnet und sodann wird der maximale
Mittelwert daraus bestimmt. Bei diesem Ausführungsbeispiel zeigt die Abtastung an
der zweiten Stelle S2, welche verschieden ist von der Mittellage S3 der Proben-Auftragung,
ein Maximum für den Mittelwert der optischen Dichte. Dementsprechend wird das Densitogramm
der zweiten Probe auf der Grundlage des optischen
Dichtewertes
gebildet, welcher bei der zweiten Abtastung an der Stelle S2 gewonnen worden ist.
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Nachdem die Fraktionsbilder der zweiten Probe verarbeitet sind, wird
das Substrat 3 um eine Wegstrecke weitergeschoben, die dem Wert P-2xp-3xp=P-5xp
entspricht, so daß die erste Abtaststelle der dritten Probe sich in der Meßstation
lc befindet. Wie oben beschrieben, werden aufeinanderfolgende Sätze von elektrophoretischen
Bildern von verschiedenen Proben derart verarbeitet. Durch optische Abtastung der
elektrophoretischen Bilder mit Hilfe des Schlitzes 16, dessen Breite W kleiner ist
als die Breite m des Bildes, werden folgende Vorteile erzielt: (1) Die Ermittlung
der Mittellage der elektrophoretischen Bilder und die photoelektrische Abtastung
der elektrophoretischen Bilder können mittels eines einzigen Densitometers ausgeführt
werden, weshalb die gesamte Vorrichtung einen einfachen Aufbau aufweist.
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(2) Die Mittellage der elektrophoretischen Bilder kann durch Verarbeitung
der optischen Dichtewerte gewonnen werden, die mittels des Densitometers erhalten
wurden, weshalb es nicht erforderlich ist, das Substrat zweimal abzutasten.
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(3) Da der Abstand, über den das Substrat zwischen zwei aufeinanderfolgenden
Proben transportiert wird, auf der Grundlage der Mittellage der elektrophoretischen
Bilder der vorangegangenen Probe bestimmt wird, ist es immer möglich, die Mittellagen
der elektrophoretischen Bilder von aufeinanderfolgenden Proben exakt zu ermitteln,
auch wenn das Substrat gedehnt oder geschrumpft ist.
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Folgende Änderungen sind z.B. beim vorstehenden Ausführungsbeispiel
möglich: Anstatt die Mittellage eines Satzes von elektrophoretischen Bildern einer
Probe gemeinsam für die-einzelnen
Bilder durch Bestimmung des maximalen
Mittelwertes der optischen Dichte unter den Mittelwerten jeder Abtastung zu bestimmen,
ist es auch möglich, die Mittellage der einzelnen elektrophoretischen Bilder getrennt
zu ermitteln. Beispielsweise werden für das erste elektrophoretische Bild von Albumin
fünf optische Dichten bei fünf Abtastungen an den Stellen Sl, S2, ..., S5 miteinander
verglichen. Sodann wird die Mittellage des Bildes des Albumins als diejenige Stellung
bestimmt, welche den maximalen Wert der optischen Dichte unter diesen fünf Werten
erzeugt. Entsprechend kann die Mittellage des Bildes von «1- 1 Globulin als derjenige
Punkt bestimmt werden, welcher bezüglich der optischen Dichte den Maximalwert unter
den fünf Werten annimmt, die beim Abtasten an den Stellen S1, S2, ..., S5 gewonnen
worden sind. Sodann kann das Densitogramm mittels der maximalen optischen Dichte
gebildet werden, welche derart aus den einzelnen Bildern Alb, 1' «2- 6 und y-Globulin
gewonnen worden sind.
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Beim Berechnen des Mittelwertes der optischen Dichte für die elektrophoretischen
Bilder können auch die zwei kleinsten Werte weggelassen werden und der Mittelwert
anhand der verbleibenden drei Dichtewerte gebildet werden.
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Beim vorstehenden Ausführungsbeispiel wurde der Abstand P zwischen
aufeinanderfolgenden Mittellagen von Proben-Auftragungen als konstant angenommen.
Es ist aber auch möglich, daß die Abstände zwischen aufeinanderfolgenden Mittellagen
variieren. In diesem Falle können die aufeinanderfolgenden Intervalle zuvor in der
Steuerschaltung gespeichert werden und der Vorschub des Substrates erfolgt entsprechend.
Somit können die Mittellagen der elektrophoretischen Bilder der Proben unabhängig
davon, ob die Proben von Hand oder maschinell auf das Substrat aufgetragen worden
sind, exakt bestimmt werden.
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Da der Satz elektrophoretischer Bilder mehrmals optisch um eine Mittellage
der Proben-Auftragung abgetastet worden ist, ist es auch dann, wenn die elektrophoretischen
Bilder voneinander abweichen, möglich, die Mittellage exakt zu bestimmen.