DE3485920T2

DE3485920T2 - Kolorimetrisches immunoessay auf fester oberflaeche, sowie dazu zu verwendender teststab und seine herstellung.

Info

Publication number: DE3485920T2
Application number: DE8484303021T
Authority: DE
Inventors: Sarah R Baxter; Kenneth C Kasper; John C Lankford; Douglas D Rundle; Henry Garrett Wada
Original assignee: Quidel Corp
Current assignee: Quidel Corp
Priority date: 1983-05-06
Filing date: 1984-05-04
Publication date: 1993-04-15
Anticipated expiration: 2004-05-05
Also published as: ATE80735T1; EP0125118B1; EP0125118A3; AU2706384A; CA1223813A; DE3485920D1; JPS6069554A; EP0125118A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Immunoassay, das eine Enzymmarkierung verwendet, bei dem die Detektion der unbekannten Substanz colorimetrisch direkt auf einer festen Oberfläche durchgeführt wird. Spezifischer bezieht sich das System auf die Detektion eines Antigens oder Antikörpers in einer biologisch abgeleiteten Flüssigkeitsprobe, etwa einem Serum oder Urin.
Es gibt eine Anzahl von bekannten Techniken zur Bestimmung einer unbekannten Menge von Antigen oder Antikörper in einer biologischen Flüssigkeit, etwa einem Serum oder Urin. Zwei weithin verwendete sind kompetitive Bindungs- und Sandwich-Immunoasseys, die markierte oder gekennzeichnete immunochemische Reagenzien verwenden. Beispielsweise wird bei einer typischen Sandwichtechnik zur Detektion eines unbekannten Antigens in einer Probe Antikörper für das unbekannte Antigen an einer festen Oberfläche gebunden und mit dem Antigen zur Reaktion gebracht. Nach Waschen der festen Oberfläche wird ein markierter Antikörper mit der Oberfläche zur Reaktion gebracht und die Menge von gebundenem markiertem Antikörper als eine Indikation der Antigenmenge in der Serumprobe gemessen. Bei der kompetitiven Technik kann ein an einer festen Oberfläche gebundener Antikörper mit der Probe, die eine unbekannte Menge des zu bestimmenden Antigens enthält, und mit markiertem Antigen des gleichen Typs kontaktiert werden. Nach Waschen wird die Menge des markierten Antigens, das auf der Oberfläche gebunden ist, gemessen, wodurch eine indirekte Anzeige der Menge von unbekanntem Antigen in der Probe geliefert wird. Bekannte Markierer sind vom radioaktiven der fluorometrischen Typ, die durch Instrumentierung detektiert werden und colorimetrische Markierer, typischerweise ein Enzymmarkierer, der die Konversion eines entsprechenden Substrats in eine gefärbte Form bewirkt.
In einer kompetitiven Technik wird Antigen mit enzymmarkiertem Antigen und einem antikörperbeschichteten Rohr bestimmt. (Engvall, et al, Biochim. Biophys. Acta. 251 (1971), 427-434.) Dort wird an die Testrohrwandung gebundener Antikörper mit der Flüssigkeitsprobe, die das unbekannte Antigen enthält, und mit einer bekannten Menge von markiertem Antigen kontaktiert, um ein immunologisches Reaktionsprodukt zu bilden. Nach Waschen wird das Rohr mit einer Lösung gefüllt, die ein Substrat enthält, das seine Farbe in Anwesenheit des Enzymmarkierers auf dem Antigen ändert. Ein chemisches Unterbrechungsmittel wird zum Beenden der Reaktion zugesetzt und die Substratlösung mit dem Substrat in löslicher Form wird in einer Mikroküvette angeordnet. Die Farbänderung des Substrats in der Lösung wird durch Messen der Absorbanz der Lösung bei einer bestimmten Wellenlänge bestimmt. Dieses System leidet unter bestimmten Nachteilen, wozu das Erfordernis der Verwendung eines unabhängigen Detektionsinstruments, keine permanente Aufzeichnung der Testresultate, das Erfordernis einer chemischen Unterbrecherlösung für die enzymatische Reaktion und Ungenauigkeiten aufgrund von ungebundenem markiertem Antigen auf der Oberfläche, das in die Substratlösung gewaschen wird und das Substrat konvertiert, gehören.
Bei einem anderen Immunoassey wird die markierte Substanz auf einer Oberfläche deponiert, die direkt gelesen wird. Das Hauptsystem, das in Harte U.S. Patent 4,133,639 offenbart ist, besteht darin, daß eine mit Fluorochrom markierte Substanz auf einer undurchlässigen kontinuierlichen Fläche abgelagert und die Fläche mit einem Fluoreszenzmessergelesen wird. Bezüglich des Systems wird auch ausgeführt, daß es auf die Detektion von radioaktiven Markierern in einem Radioimmunoassey und auf spektrofotometrische Detektion anwendbar ist. Zusätzlich schlägt das Patent in Spalte 7, Zeilen 25 bis 38 vor, daß das System auf die Verwendung eines enzymmarkierten Systems, wie es in Pesce et al, Clin. Chem. 20/3, 353-359 (1974) offenbart ist, anwendbar ist. In jenem System wird die Farbe durch Konvertieren des löslichen Substrats in eine gefärbte Form entwickelt und die Farbe spektrofotometrisch in der Lösung abgetastet. Das Harte-Patent führt aus, daß es sich von Pesce darin unterscheidet, daß das diagnostische Reagenz an einem Teströhrchenträger adsorbiert wird (anstatt kovalent gebunden zu werden). Obwohl ein Hauptziel des Harte-Patents das direkte Abtasten einer Oberfläche mit einem Instrument ist, wird in Harte keine Anregung geliefert, wie das Pesce- System im Hinblick auf das direkte Abtasten der Oberfläche adaptiert werden könnte.
US-A-4168146 offenbart einen schwammigen Teststreifen zum Ausführen von Immunoasseys, wobei der Streifen daran gebundene Antikörper besitzt. Zur Benutzung wird der Streifen mit der wäßrigen Lösung, die ein vermutetes Antigen enthält, kontaktiert. Er wird dann seinerseits mit einer wäßrigen Lösung enthaltend markierte Antikörper kontaktiert.
EP-A-0063810 offenbart Geräte und Ausstattungen für Immunoasseys, die feste poröse Träger, vorzugsweise in Blattform, mit Antigenen oder Immunoglobulinen oder beiden, die direkt hieran gebunden sind, umfassen.
US-A-4299916 offenbart eine Analysemethode, die eine feste Oberfläche verwendet, an der eines der Glieder eines immunologischen Paars (mip) gebunden ist und ein signalerzeugendes System verwendet, das ein katalytisches Glied, gebunden an einem mip, umfaßt, wobei das Signalsystem in einem meßbaren Signal auf der besagten festen Oberfläche resultiert, das zu der Analytikamenge in dem Medium in bezug steht.
WO-A-8002800 offenbart eine Methode zum Feststellen der Ovulation bei weiblichen Menschen umfassend die Verwendung einer schwammigen Matte, die einen Antikörper gegen östrogen-induzierte Peroxidase enthält.
Clinical Chemistry, Band 28, Nr. 9 (1982), Seite 1862 bis 1866 offenbart Enzymimmunoasseytechniken für einen Bereich von Glycoproteintropahormonen unter Verwendung von Antikörpern für die α- und β-Untereinheiten des zu untersuchenden Hormons. Der Anti-α-Untereinheitsantikörper wird an Meerrettich-Peroxidase gekoppelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein colorimetrisches Immunoassey von Antigen oder Antikörper durch direkte visuelle Beobachtung einer Farbe auf einer festen Oberfläche vorgeschlagen. Bezogen auf ein Sandwich-Immunoassey zum Detektieren von Antigen in einer Flüssigkeitsprobe wird die Probe, die das unbekannte Antigen enthält mit einer festen Phase umfassend immobilisierten Antikörper gebunden an einer Schicht auf einer festen Oberfläche und mit einem löslichen enzymmarkierten Antikörper kontaktiert. Das Antigen wird immunologisch an dem immobilisierten Antikörper und dem markierten Antikörper gebunden. Die feste Phase wird von unreagiertem löslichem enzymgekennzeichnetem Antikörper freigewaschen. Dann wird die feste Phase mit einer lösliches Substrat für das Enzym enthaltenden Lösung kontaktiert, um zu bewirken, daß das Substrat in eine unlösliche gefärbte Form konvertiert wird, die sich auf der festen Phase niederschlägt. Danach wird die feste Phase von der Substratlösung getrennt und visuell als eine halbquantitative Indikation für die Anwesenheit des zu entdeckenden Antigens gelesen. Das System ist auch anwendbar auf die Detektion von unbekanntem Antikörper in einer analogen Sandwichtechnik. Eine bevorzugte feste Oberfläche ist eine nicht quellfähige, undurchlässige, aus Plastikmaterial bestehende kontinuierliche Oberfläche eines Tauchstabes, obwohl andere Formen der festen Oberflächen wie etwa ein Perlstab verwendet werden können. Dieses System ist auch auf ein kompetitives colorimetrisches Immunoassey anwendbar. Das System ist auf die Schwangerschaftsfeststellung anwendbar, wobei das zu entdeckende Antigen menschliches Choriongonadotropin ist, ebenso wie auf die Ovulationsfeststellung, wobei das Antigen luteinisierendes Hormon ist.
Die folgenden Vorteile werden durch Verwendung des vorliegenden Systems erreicht. Eine erhöhte Empfindlichkeit wird aufgrund der Enzymsubstratverstärkung des Signals im Kontrast zu direkter Markierung des Antikörpers oder Antigens geliefert. Untergrundrauschen aufgrund von unvollständigem Waschen der Enzymmarkierung wird durch direktes Lesen der festen Oberfläche anstelle von einem Lesen der Substratlösung, die ungebundene enzymmarkierte Substanz, die beim Waschen entfernt wurde, enthalten kann, minimalisiert. Ferner wird die Beendigung der enzymatischen Reaktion auf dem Tauchstab durch Entfernen aus der Substratlösung und Abspülen in Wasser und gegebenenfalls Löschen im Gegensatz zum Erfordernis einer chemischen Unterbrecherlösung, wo das lösliche Substrat in Lösung gelesen wird, ohne weiteres bewirkt. Zusätzlich kann der gefärbte Tauchstab als eine Permanentaufzeichnung des Testresultats verwendet werden. Eine Halbquantifizierung der Testresultate wird durch visuelle Inspektion der Intensität der Farbe auf dem Stab im Vergleich mit einer Farbkarte oder einem Referenzstab erreicht. Weiterhin erfordert das System kein Instrument und kann so für den Heimtestmarkt verwendet werden. In bezug auf einen derartigen Markt ist der colorimetrische Endpunkt leichter lesbar als andere Systeme, die keine Instrumentenausrüstung erfordern wie etwa Agglutinationsreaktionstests.
Das System verwendet konventionelle Sandwich- oder Kompetitivtechniken. Enzymmarkiertes Diagnostikreagenz wird immunologisch an einer festen Oberfläche gebunden und das Enzym gelangt in Wechselwirkung mit einem löslichen Substrat, um zu bewirken, daß es in eine unlösliche gefärbte Form konvertiert wird, die sich als Niederschlag auf der festen Phase niederschlägt. Die feste Phase wird von dem Reaktionsgefäß und Substrat entfernt und gegebenenfalls gewaschen. Die Menge an unbekannter Substanz in der Probe kann durch Anschauen der Farbe direkt auf der Oberfläche der festen Phase bestimmt werden.
Allgemein liefert daher die Erfindung ein Verfahren für das colorimetrische Immunoassey einer immunologisch reaktiven, in einer Flüssigkeitsprobe zu entdeckenden Substanz, umfassend ein
Kontaktieren der besagten Probe mit einer nicht quellbaren, aus undurchlässigem Plastikmaterial bestehenden, durchgehenden, festen Oberfläche, wobei die chemische Natur der Plastikoberfläche derart ist, daß sie das Binden eines Antigens oder eines Antikörpers an ihr erlaubt, sowie geeignet ist, um darauf zu entdeckende Substanz von der besagten Probe zu immobilisieren, und ein Verwenden der besagten Oberfläche zum Immobilisieren eines enzymmarkierten, diagnostischen Reagenz für die besagte, zu entdeckende Substanz in einer Menge in bezug auf die Menge an besagter Substanz, die immobilisiert wurde, Kontaktieren des resultierenden festen Materials mit einer Lösung eines Substrats für das besagte Enzym, das hierdurch in eine unlösliche, gefärbte Form konvertiert wird und Ermöglichen der besagten unlöslichen, gefärbten Form, sich als ein Niederschlag auf dem besagten resultierenden, undurchlässigen, festen Material niederzuschlagen, um diesem eine visuell unterscheidbare Farbe, die sich auf die Anwesenheit besagter Substanz bezieht, zu verleihen, und Trennen des resultierenden, gefärbten, festen Materials von der besagten Substratlösung.
Ein allgemeiner Aspekt der Erfindung liefert ein Verfahren umfassend
(a) ein Kontaktieren der besagten, die besagte zu entdeckende Substanz enthaltenden Probe mit einer undurchlässigen festen Phase umfassend immobilisierte Antisubstanz gebunden in einer Schicht auf der besagten festen Oberfläche, und entweder mit löslicher enzymmarkierter Antisubstanz oder mit freier enzymmarkierter Substanz des gleichen Typs wie die zu entdeckende Substanz, um zu bewirken, daß eine Menge der Enzymmarkierung immobilisiert wird, die zur Menge der besagten, in der Probe zu entdeckenden Substanz in Bezug steht;
(b) ein Trennen der gemäß Schritt (a) resultierenden festen Phase von flüssiger Phase;
(c) ein Kontaktieren der abgetrennten festen Phase von Schritt (b) mit einer Lösung enthaltend lösliches Substrat für das Enzym, um zu bewirken, daß das Substrat in eine unlösliche, gefärbte Form konvertiert wird, die sich als Niederschlag auf der undurchlässigen festen Phase absetzt, um dieser eine visuell unterscheidbare Farbe bezüglich der Anwesenheit der besagten, in der Probe zu entdeckenden Substanz zu verleihen, und
(d) ein Trennen der besagten festen Phase von der besagten Substratlösung.
Zur Vereinfachung der Beschreibung wird das System zunächst mit bezug auf ein sandwichartiges colorimetrisches Antigenimmunoassey beschrieben. Eine effektive Sandwichmethodik, die Enzymmarkierungen verwendet, wird in Wada, H.G., et al, Clin. Chem. 28/9, 1862-1866 beschrieben. Das obige Sandwichsystem wurde zum Feststellen von Antigen in einer biologisch abgeleiteten Probe beschrieben.
Bei der Sandwichtechnik wird der Antikörper als eine gebundene Schicht auf einer festen Oberfläche, etwa dem Reaktionsteil eines Tauchstabes immobilisiert. Diese feste Phase wird dann mit der Antigen enthaltenden Flüssigkeitsprobe und mit enzymmarkiertem Antikörper, der mit dem Antigen immunologisch reaktiv ist, kontaktiert. Das Antigen wird an den auf der festen Phase immobilisierten Antikörpern und mit dem markierten Antikörper auf der festen Phase gebunden, um ein Reaktionsprodukt in Reihenfolge umfassend feste Oberfläche*Antikörper*Antigen* enzymgekennzeichneter Antikörper zu liefern. Der "*" kennzeichnet eine Bindung. Beispielsweise kann die Bindung zwischen der Oberfläche und dem Antikörper eine kovalente oder eine Adsorptionsbindung sein. Die Bindungen zwischen dem immobilisierten Antikörper und dem Antigen und zwischen dem Antigen und dem markierten Antikörper umfassen immunologische Bindungen. Nach Bildung des Reaktionsproduktes wird die feste Phase von dem unreagierten löslichen enzymmarkierten Antikörper getrennt und vorzugsweise gewaschen. Dann läßt man die feste Phase mit einer Lösung enthaltend lösliches Substrat für das Enzym reagieren, um zu bewirken, daß das Substrat in eine unlösliche gefärbte Form konvertiert wird, die sich auf der festen Phase niederschlägt, um dieser eine visuell unterscheidbare Farbe zu verleihen. Die Oberfläche wird von dem Substrat entfernt und die Farbe als Anzeige für die Menge von Antigen in der Probe betrachtet. Die Oberfläche kann mit Wasser besprüht oder berieselt werden, um Restsubstrat zur vollständigen Beendigung der enzymatischen Reaktion und Speicherung des reagierten Tauchstabes zu entfernen.
Die mit dem Antigen oder Antikörper aufzuschichtende feste Phase umfaßt eine nicht quellbare, aus undurchlässigem Plastikmaterial bestehende, kontinuierliche Oberfläche. Der Ausdruck "undurchlässig" soll eine Oberfläche ausschließen, die für eine wesentliche zurückhaltende Absorption von Reagenzien während des Waschens, wie etwa Filterpapier, geeignet ist. Mit anderen Worten, die feste Oberfläche sollte im wesentlichen flüssigkeitsundurchlässig sein, um ein effektives Entfernen von ungebundenem Reagenz durch Waschen zu erlauben. Eine bevorzugte Farbe für den Tauchstab ist weiß oder eine andere Farbe, die die Farbe des Farbstoffs verstärkt. Falls gewünscht, können andere feste Phasen als Tauchstäbe, etwa die feste Oberfläche eines Perlstabes, verwendet werden.
Die chemische Natur der aufzuschichtenden Oberfläche ist derart, daß ein Binden des Antigens oder Antikörpers ermöglicht wird. Für eine kovalente Bindung umfassen geeignete Oberflächen ein Plastikmaterial wie Polymethylacrylat, Polystyrol, Polyethylen, Polyterephthalat, Polyester, Polypropylen und dergleichen. Gemäß einem typischen Fall kann das diagnostische Reagenz (Antigen oder Antikörper) an eine Plastikfolie gebunden werden, die danach in geeignete Tauchstabform geschnitten wird, die in ein Reaktionsgefäß, etwa ein Teströhrchen, paßt. Der Ausdruck "Tauchstab" bedeutet einen Artikel mit einem Handhabungsteil und mit einem Reaktionsoberflächenteil. Für kovalente Bindung kann eine indirekte Kopplung verwendet werden, bei der Kopplungsreagenzien, die mit funktionellen Gruppen der Diagnostikreagenzien reaktiv sind, als Brücken zwischen der Polymeroberfläche und einem Diagnostikreagenz dienen. Solche funktionalen Gruppen umfassen Aminogruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen, Amidogruppen und Carboxylgruppen. Geeignete Kopplungstechniken zwischen dem Polymer und Diagnostikreagenz sind in Bennich et al U.S. Patent 3,720,760 angegeben. In solchen Fällen kann das zu immobilisierende Diagnostikreagenz durch Absorption auf die feste Oberfläche, anstatt kovalent gebunden zu werden, geschichtet werden.
Bei einer spezifischen Technik kann die kovalente Bindung des Antikörpers an den Tauchstab durch Vorbeschichten der Plastikoberfläche mit einem Film aus Agarose oder anderem hydrophilen Polymer wie Polysaccharid, Polyethylenglycol, Polypeptid und dergleichen bewirkt werden. Der Antikörper oder das Antigen wird dann an dieser hydrophilen Beschichtung befestigt. Die hydrophile Beschichtung vermeidet eine nichtspezifische Bindung des Analysten oder Enzym-Konjugaten an der Plastikoberfläche durch hydrophobe Wechselwirkung. Daher minimalisiert die Verwendung dieser Art von Tauchstab Hintergrundbindung.
In dem nächsten Schritt wird die immobilisierte, Antikörper enthaltende, feste Phase mit der biologisch abgeleiteten Flüssigkeitsprobe, typischerweise ein Serum oder Urin, enthaltend das zu entdeckende unbekannte Antigen und mit löslichem enzymmarkiertem Antikörper kontaktiert. Der immobilisierte Antikörper und der enzymmarkierte Antikörper reagieren beide immunologisch mit dem Antigen, so daß das Reaktionsprodukt umfassend feste Oberfläche*Antikörper*Antigen* enzymmarkierter Antikörper gebildet wird. Irgendeine der konventionellen bekannten Zusatzreihenfolgen für die Sandwichtechnik kann verwendet werden. Beispielsweise können das Antigen, der immobilisierte Antikörper und der markierte Antikörper gleichzeitig zugesetzt werden. Bei dieser Technik ist es bevorzugt, einen monoklonalen Antikörper als markierten Antikörper zu verwenden, um Probleme des Querblockierens durch immobilisierte und markierte Antikörper zu minimalisieren.
Gemäß einer anderen Technik, der "Forward" Sandwichuntersuchung, läßt man das Antigen mit dem immobilisierten Antikörper vor dem Reagieren mit dem markierten Antikörper reagieren. In diesem Fall kann nach Inkubation des Antigens und immobilisierten Antikörpers die Oberfläche gewaschen werden, um ungebundenes Material vor dem Zusatz des markierten Antikörpers zu entfernen.
Zusätzlich kann die "Reverse" Sandwichuntersuchung verwendet werden, bei der das Antigen und der markierte Antikörper mit oder ohne eine Inkubationsstufe vor dem Kontakt mit dem immobilisierten Antikörper gemischt werden können. Forscher haben angeregt, daß diese Zusatzordnung die Vorteile erhöhter Empfindlichkeit und herabgesetzter Inkubationszeiten liefert, wie in Piasso et al U.S. Patent Nr. 4,098,876 ausgeführt ist.
Nach Reaktion zum Bilden des die feste Phase enthaltenden immobilisierten Antikörper-Antigen-enzymmarkierten Antikörpers wird die feste Phase von der den unreagierten löslichen enzymmarkierten Antikörper enthaltenden Lösung getrennt. Dem folgt vorzugsweise ein Waschschritt zum Entfernen von ungebundenem markiertem Antikörper von der Oberfläche der festen Phase.
Danach wird die abgetrennte feste Phase mit einer lösliches Substrat für das Enzym enthaltenden Lösung kontaktiert. Ein bedeutendes Merkmal der Erfindung besteht darin, daß das Substrat von einem Typ ist, der in Anwesenheit des Enzyms von löslicher in unlösliche Formkonvertiert. Da das Enzym auf der Oberfläche der festen Phase ist, wird das unlösliche Substrat, das durch das Enzym auf der festen Phase aktiviert wird, direkt auf der festen Phase niedergeschlagen. Für diesen Zweck wird es bevorzugt, als feste Phase eine Reaktionsfläche eines Tauchstabes zu verwenden, die in ein Testrohr einer Substratlösung und gemischt mit dem Substrat getaucht werden kann.
Das niedergeschlagene Substrat liegt in einer visuell unterscheidbaren gefärbten Form vor. In einer Ausführungsform ist das Substrat anfänglich ungefärbt und wird in Anwesenheit des Enzyms in eine gefärbte Form konvertiert. In einer anderen Ausführungsform ist das lösliche Substrat von einer ersten Farbe oder einem ersten Farbton unkonvertiert in eine zweite Farbe oder einen zweiten Farbton beim Niederschlagen.
Nach genügender Reaktionszeit für das Enzym, um die Konversion des Substrats in unlösliche gefärbte Form zu bewirken, wird die feste Phase von der Substratlösung getrennt. Das Vorhandensein der visuell unterscheidbaren Farbe auf der festen Phase ist eine Anzeige, daß die biologisch abgeleitete Flüssigkeit das zu entdeckende Antigen enthält. Die Intensität der Farbe auf der festen Phase ist eine halbquantitative Bestimmung der Konzentration des Antigens in der biologischen Flüssigkeit. Das heißt, die Intensität der Farbe ist proportional zur Konzentration des Antigens. Durch Vergleichen der Farbe auf der festen Phase mit einer Farbkarte oder einer festen Bezugsphase wie einer Tauchstaboberfläche können halbquantitative Ergebnisse für die Testresultate erhalten werden. Die Verwendung eines Instruments, etwa eines Reflektionsdensitometers mit opaken Tauchstäben oder eines Spektrofotometers mit einem optisch klaren Tauchstab kann angewendet werden, um den quantitativen Aspekt dieses Testsystems zu vergrößern.
Das Antigen- oder Antikörperkonjugat mit dem Enzym wird vorzugsweise durch konventionelle Techniken der Verbindung durch einen oder mehrere kovalente Bindungen gebildet. Solche kovalente Anbindungen können durch Zusatz von externen Kopplungs- oder Brückenbildungsmolekülen oder durch direkte Kondensation von existierenden Seitenketten bewirkt werden. Bifunktionale Brückenbildungsmittel zum Erfüllen dieses Zweckes sind im Stand der Technik gut bekannt. Ein Vorteil des Systems besteht darin, daß die Waschschritte besonders schnell sind, indem die feste Oberfläche (Tauchstab) nach Enzyminkubation und vor Kontakt mit dem Substrat gespült werden kann. Ungebundenes Enzym ist nicht so kritisch in diesem System, da Enzymantikörper, der nicht vollständig abgewaschen wurde, in die Substratlösung diffundieren und keinen Niederschlag direkt auf der festen Oberfläche bewirken wird. Daher wird Untergrundrauschen durch unvollständiges Waschen minimalisiert.
Ein weiterer Vorteil des Systems verglichen zum Lesen der Substratlösung besteht darin, daß es leicht ist, die Enzym-Substrat-Reaktion an dem gewünschten Endpunkt zu stoppen. Das heißt, zu einer geeigneten Zeit wird der Tauchstab aus der Enzymlösung entfernt, was die Substratreaktion stoppt. Dies steht im Gegensatz zum Lesen der Lösung, bei der eine chemische Unterbrecherlösung vorgesehen werden muß.
Ein weiterer Vorteil des Systems besteht darin, daß der gefärbte Tauchstab als permanente Aufzeichnung der Testresultate so lange verwendet werden kann, wie der Substratfarbstoff von genügender Stabilität ist.
Die obige Sandwichtechnik wurde in bezug auf die Bestimmung eines unbekannten Antigens in einer biologisch abgeleiteten Lösung beschrieben, die immobilisierten Antikörper und löslichen, enzymmarkierten Antikörper verwendet. Das System ist besonders wirksam zur Schwangerschaftsfeststellung, wo das zu entdeckende Antigen menschliches Choriongonadotropin ist. Zusätzlich kann das System zur Ovulationsfeststellung verwendet werden, wo das zu entdeckende Antigen luteinisierendes Hormon ist. Das System ist ferner anwendbar auf die Bestimmung irgendeines Antigens, gegen das geeignete Antikörper erhoben werden können.
Es sollte verstanden werden, daß die Sandwichtechnik auch auf die Bestimmung von Antikörper in einem System anwendbar ist. In diesem Fall wird der auf der festen Oberfläche immobilisierte Antikörper durch immobilisiertes Antigen substituiert und der enzymmarkierte Antikörper durch ein enzymmarkiertes Antiimmunoglobulin substituiert. In anderen Bezügen ist die vorstehende Beschreibung anwendbar.
Ein bevorzugtes finales reagiertes Produkt, das durch die Sandwichtechnik gebildet wird, ist ein reagierter Tauchstab für ein Immunoassey. Bei einem derartigen Tauchstab umfaßt ein fester Reaktionsflächenabschnitt gebundene aufeinanderfolgende Schichten wie folgt. Die erste Schicht ist Antikörper immunologisch gebunden an Antigen. Derartiges Antigen ist seinerseits immunologisch gebunden an enzymmarkiertem Antikörper. Ein visuell unterscheidbar gefärbtes Substrat ist auf der Oberfläche solch aufeinanderfolgender Schichten niedergeschlagen. Das Substrat ist von einem Typ, der von einer löslichen in eine niedergeschlagene gefärbte Form aufgrund der Anwesenheit des Enzyms konvertiert worden ist. Wie oben ausgeführt, umfassen geeignete Antigene menschliches Choriongonadotropin (hCG) und luteinisiertes Hormon (hLH).
Die vorliegende Erfindung ist ferner anwendbar auf die sogenannte kompetitive Bindungstechnik für das colorimetrische Immunoassey von zu entdeckendem Antigen in einer biologisch abgeleiteten Flüssigkeitsprobe. In diesem Fall wird der immobilisierte Antikörper in einer Schicht an eine feste Fläche gebunden, die eine feste Phase in der gleichen Weise wie vorstehend ausgeführt, bildet. Diese feste Phase wird mit dem die biologisch abgeleitete Flüssigkeit enthaltenden, zu entdeckenden Antigen und mit freiem enzymmarkiertem Antigen des gleichen Typs wie das zu entdeckende Antigen kontaktiert. Eine vergleichende immunologische Reaktion wird zum Auftreten zwischen dem immobilisierten Antikörper und sowohl (a) dem zu entdeckenden Antigen, als auch (b) dem enzymmarkierten Antigen bewirkt. Das heißt, die Konzentration des zu entdeckenden Antigens in der biologisch abgeleiteten Flüssigkeit ist umgekehrt proportional zu dem an die feste Phase gebundenen enzymmarkierten Antigen.
Nach der obigen kompetitiven Reaktion wird die feste Phase von Schritt (a) von der flüssigen Phase abgetrennt. Vorzugsweise wird die Oberfläche gewaschen, um ungebundenes enzymmarkiertes Antigen von der Oberfläche zu entfernen.
Dann wird die abgetrennte feste Phase mit einer Lösung enthaltend lösliches Substrat für das Enzym kontaktiert, um zu bewirken, daß das Substrat in eine unlösliche Form konvertiert wird, die sich auf der festen Phase niederschlägt, um diesem eine visuell unterscheidbare Farbe zu verleihen. Die feste Phase wird von der Substratlösung abgetrennt und als eine Inversindikation der Menge an zu entdeckendem Antigen in der biologisch abgeleiteten Probe gelesen. Daher steigt die Farbintensität auf der festen Oberfläche mit der abnehmenden Anwesenheit von zu entdeckendem Antigen.
Die Beschreibung der obigen Einzelheiten der Handhabung und Vorteile der vorliegenden Erfindung in bezug auf die Sandwichtechnik sind ebenfalls auf die analoge Vergleichstechnik anwendbar.
Ein analoges Reaktionsprodukt für die Vergleichstechnik umfaßt einen reaktiven Tauchstab mit einem Festreaktionsoberflächenabschnitt. Gebunden an den Oberflächenabschnitt ist eine Antikörperschicht, von dem wenigstens ein Abschnitt immunologisch an enzymmarkiertes Antigen gebunden ist, und visuell unterscheidbares gefärbtes Substrat, das auf die Schicht niedergeschlagen ist. Das Substrat ist von einem Typ, der von einer löslichen in eine niedergeschlagene gefärbte Form aufgrund der Anwesenheit des Enzyms konvertiert worden ist.
Wie vorstehend ausgeführt, sind geeignete Substratlösungen von einem Typ, der ein unlösliches Reaktionsprodukt erzeugt, der auf dem Tauchstab oder einer anderen festen Oberfläche niederschlägt. Eine besonders effektive Enzym-Substrat-Kombination ist das alkalische Phosphataseenzym und sein Substrat, 5-Bromo-4-chloro-3-Indolylphosphat (gemeinhin bezeichnet als BCIP). Dies ist ein sehr stabiles Phosphatasesubstrat, das in einem histochemischen Farbstoff für Phosphataseaktivität in Gewebeabschnitten verwendet wurde. Die enzymatische Dephosphorylation von BCIP in Aminoalkoholpuffer liefert das Indolyl-3-ol- Derivat, das dimerisiert, um ein blau gefärbtes, unlösliches Produkt zu liefern.
Andere Substrate für alkalische Phosphatase sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt:

TABELLE 1

ENZYM SUBSTRATLÖSUNG

ALKALIPHOSPHATASEN (1) Naphthol-AS-MX-phosphat¹ und Fast Blue RR Salz²
(bildet blauen Farbstoffniederschlag)
(2) Naphthol-AS-MX-phosphat¹ und Fast Violet B Salz³ (bildet violetten Farbstoffniederschlag)
(3) Naphthol-AS-GR-phosphat&sup4; und Fast Blue RR Salz&sub2; (bildet grünen Farbstoffniederschlag)
(4) 5-Bromo-4-chloro-3-Indolyl-phosphat (bildet blauen Niederschlag)
(5) 3-Indoxylphosphat (bildet blauen Niederschlag)
PEROXIDASEN (1) p-Phenylendiamin, Katechin und H&sub2;O&sub2; (bildet braunschwarzen Niederschlag)
(2) Amino-9-ethylcarbozol und H&sub2;O&sub2; (bildet rötlichbraunen Niederschlag)
(3) o-Dianisidinhydrochlorid und H&sub2;O&sub2; (bildet blauen Niederschlag)
LACTATDEHYDROGENASE (1) NADH (B-Nicotinamidadenindinucleotid, reduziert), Phenazinmethosulfat, und Nitroblau-Tetrazolium (bildet purpurnen Niederschlag)
¹3-Hydroxy-2-naphtoesäure, 2,4-Dimethoxyanilidphosphat
²diazotiert, 4-Benzoylamino-2,5-Dimethoxyanilin, ZnCl&sub2; ³diazotiert, 6-Benzamido-4-methoxy-m-toluidinchlorid &sup4;3-Hydroxy-2-anthranoesäure-2-methylanilid
Die folgenden Beispiele sind für die vorliegende Erfindung illustrativ.

Beispiel 1

Bildung von Tauchstäben, die kovalent an Antikörper gebunden sind

Dieses Beispiel demonstriert die Immobilisation eines Antikörpers an ein α-human-luteinisierendes Hormon auf einer 0,2 mm-dicken Folie (die "Folie") von Polyterephthalatethylenglycol (Mylar), laminiert mit Agar und anschließendes Formen eines Tauchstabes. Die Folie wird unter dem Handelsnamen Gel Bond von FMC Bio Products, Rockland, Maine, geliefert.
Die Folie wurde während 5 min in Wasser eingeweicht und der zu koppelnde agarosebeschichtete Abschnitt wurde in einer 20 mM-wäßrigen Lösung von Natriummetaperjodat während 30 min bei 20-24ºC eingeweicht. Dem Entfernen aus der Perjodatlösung folgend wurde die Folie dreimal in deionisiertem Wasser gewaschen, dann über Nacht bei 2-8ºC in einer Pufferlösung (0,1M NaCO&sub3;, 0,5M NaCl, pH 9,2) enthaltend 50 ug/ml von monoklonalem Antikörper spezifisch für eine α-Untereinheit von menschlichem luteinisiertem Hormon (hLH) und menschlichem Choriongonadotropin (hCG) bei 2-8ºC inkubiert. Die Antikörper wurden durch Hybridisierung von Nackenmuskellymphocyten mit Mäusemyelomazellen gefolgt durch Klonen gemäß dem Verfahren beschrieben durch Kohler und Milstein in Nature, 256, 495-499 (1975) erhalten. Der Inkubation folgte die Behandlung der Folie mit einer wäßrigen Lösung aus Natriumborhydrid (1,0 mg/ml) während 30 min bei 4ºC und drei Waschgängen mit der phosphatgepufferten oben genannten Salzlösung (PBS).
Die reagierte Folie enthielt eine gleichmäßige Schicht von permanent an die Folie gebundenen Antikörpern.
Die Folien wurden über Nacht unter Vakuum getrocknet und getrocknet aufbewahrt. Die Folien wurden in Tauchstäbe von 6 mm · 4 Inch unter Verwendung eines Papierschneiders geschnitten und trocken aufbewahrt.

Beispiel 2

Bildung von Tauchstäben enthaltend absorbierten Antikörper

Weiße Polystyrolfolien 4 in. · 11-1/4 in. · 1/32 in., gebildet durch Extrusion aus Dow-484 oder Cosden 825E Polystyrol, frei von Ölen und Fett gewaschen, wurden durch Eintauchen des breiten (11-1/4 in.) Endes in PBS enthaltend 50 mM Natriumphosphat, 0,9 w/v NaCl, pH 7,0, 5ug/ml monoklonalen Antikörper spezifisch für eine α-Untereinheit von hLH und hCG beschichtet. Die Folien wurden bis zu einer Höhe von 15 mm in die Beschichtungslösung eingetaucht und für etwa 24 h bei Raumtemperatur inkubiert. Überschüssiger Antikörper wurde von den Folien durch Tauchen der Folien in PBS unter Verwendung von drei Änderungen von PBS abgewaschen. Die gewaschenen Folien wurden über Nacht unter Vakuum getrocknet. Die getrockneten Folien wurden in Tauchstäbe von 6 mm · 4 in. unter Verwendung eines Papierschneiders geschnitten und trocken aufbewahrt.

Beispiel 3

Verwendung von Tauchstäben beim sandwichartigen Enzym-Immunoassey für hLH

Dieses Beispiel demonstriert die Verwendung der in Beispiel 2 hergestellten Tauchstäbe zur Entwicklung einer Kalibrierungskurve für eine nicht kompetitive Untersuchung für hLH unter Verwendung der "gleichzeitigen" Inkubation von Probenfestphase und markiertem Antikörper.
Eine Vorratslösung von monoklonalem Antikörper, spezifisch für die β-Untereinheit von hLH, wurde entsprechend dem Kohler und Milstein Verfahren, erwähnt im Beispiel 1, präpariert. Die Antikörper wurden dann mit alkalischer Rinderdarmphosphatase gemäß dem Verfahren beschrieben durch E. Engvall in Methods in Enzymology 70, 419-483 (1980) konjugiert. Das resultierende Konjugat hatte ein Enzym/Antikörper-Verhältnis von näherungsweise 2:1 und die endgültige Konjugatlösung hatte eine Konzentration von näherungsweise 36 ng/ml, basierend auf aktivem Antikörper gelöst in 400 mm Tris HC1, pH 7,5, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, 0,04% Tween-20 (Polyoxyethylensorbitan, Monolaurat), ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel, geliefert durch Atlas Chemical Industries, Inc., Wilmington, Delaware. Ein 10 mm · 75 mm Kulturrohr wurde mit 500 ul dieser Lösung gefüllt.
Eine Lösung (500 ul) von menschlichem Urin mit einer bekannten Menge von hLH versehen wurde dann zugesetzt und die Mischung wurde gerührt. Sieben derartiger Lösungen von menschlichem Urin wurden mit Konzentrationen von 0,0 bis 7,0 ng/ml (0 bis 60 mIU/ml) bei gleichen 10 mIU/ml Intervallen, bezeichnet als Proben 1 bis 7, verwendet.
Ein Tauchstab mit Abmessungen mit 4,0 in. in der Länge und 6 mm in der Breite mit einem Abschnitt, der sich von einem Ende 1,5 cm erstreckt, beschichtet auf beiden Seiten mit dem α-Antikörper, wurde von der in Beispiel 2 präparierten Folie abgeschnitten. Der Tauchstab wurde in dem Reaktionsrohr mit dem antikörperbeschichteten Abschnitt vollständig eingetaucht angeordnet und auf diese Weise bei Raumtemperatur während 30 min inkubiert. Der Tauchstab wurde dann entfernt und mit einem Strom von Leitungswasser auf beiden Seiten gespült. Überschüssiges Wasser wurde dann abgeschüttet und der Tauchstab in 1,0 ml einer Substratlösung angeordnet, die 1,0 mg/ml BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat) und einen geeigneten Aminoalkoholpuffer, d. h. Aminomethylpropanol enthielt, in einem 10 mm · 75 mm Kulturrohr bei pH 9-11 angeordnet. Die Reaktion ließ man beim Raumtemperatur während 30 bis 60 min ablaufen, nach welcher Zeit der Tauchstab aus dem Substrat entfernt und nach Bespritzen oder Berieseln mit Luft getrocknet wurde.
Die von jeder der sieben Proben erhaltenen Ergebnisse waren folgende:
Der Tauchstab der Probe 1 zeigte keine Farbe. Der Tauchstab der Probe zeigte eine leichte Blaufärbung. Die Intensität der Färbung stieg progressiv von Probe 2 bis Probe 7 in direktem Verhältnis zu der hLH-Konzentration. Der hLH-Gehalt einer unbekannten Probe kann halbquantitativ durch visuellen Vergleich mit den beschriebenen Bezugstauchstäben bewertet werden.

Beispiel 4

Klare Mylar-Tauchstäbe ersetzten die Tauchstäbe von Beispiel 2 und wurden in der Sandwichuntersuchung, wie in Beispiel 3 beschrieben, verwendet. Die blaue Farbe, die auf den Tauchstäben abgelagert wurde, wurde spektrofotometrisch durch Anordnung der gefärbten Enden des Tauchstabs in dem Lichtweg eines Spektrofotometers bestimmt. Wo BCIPSubstrat verwendet wurde, wurde die Absorbanz bei 620 nm bestimmt.
In einer Reihe von Versuchen unter Verwendung einer einstündigen Substratinkubation werden die Ergebnisse des Lesens der klaren Tauchstäbe durch ein Spektrofotometer gemäß der folgenden Tabelle erhalten: TABELLE 2 hLH-Gehalt (mIU/ml)

Beispiel 5

Verwendung von Tauchstäben im sandwichartigen Enzym-Immunoassey für hCG

Dieses Beispiel demonstriert die Verwendung von Tauchstäben hergestellt nach Beispiel 1 zum Entwickeln einer Kalibrierungskurve für eine nicht kompetitive Untersuchung bezüglich hCG, die die "Forward" sequentielle Inkubation der Probe und Festphase und eine zweite Inkubation mit markiertem Antikörper verwendet.
Eine Vorratslösung von monoklonalem Antikörper, spezifisch für die β-Untereinheit von hCG, wurde entsprechend dem Kohler und Milstein Verfahren, zitiert in Beispiel 1, präpariert. Die Antikörper wurden dann mit alkalischer Rinderdarmphosphatase entsprechend dem Verfahren beschrieben durch E. Engvall, zitiert in Beispiel 3, konjugiert. Die resultierenden Konjugate hatten ein Enzym/Antikörper-Verhältnis von etwa 2:1 und die finale Konjugatlösung hatte eine Konzentration von etwa 100 ng/ml, basiert auf aktivem Antikörper gelöst in 50 mM Tris-HCl, 0,064% w/v NaCl, 1 mg/ml Rinderserumalbumin, pH 7,5, 0,04% Tween-20.
Ein 10 mm · 75 mm Kulturrohr wurde mit 1 ml dieser Lösung gefüllt. Ein Tauchstab messend 4 in. in der Länge und 6 mm in der Breite mit einem sich 1,5 cm von einem Ende erstreckenden, auf beiden Seiten mit dem α-Antikörper beschichteten Abschnitt wurde von der in Beispiel 2 präparierten Folie abgeschnitten. Der Tauchstab wurde in jede von sechs Urinproben enthaltend 0 bis 200 ng/ml hCG (0 bis 1000 mIU/ml) mit dem antikörperbeschichteten Abschnitt vollständig eingetaucht angeordnet und bei Raumtemperatur während 5 min inkubiert. Der Tauchstab wurde dann aus der Urinprobe entfernt und für 5 bis 10 min in dem 10 mm · 75 m Kulturrohr gefüllt mit Enzymkonjugat bei Raumtemperatur inkubiert. Der Tauchstab wurde dann entfernt und in destilliertem oder Leitungswasser durch Verschwenken des Tauchstabs in einem Becher gewaschen. überschüssiges Wasser wurde dann abgeschüttet und der Tauchstab in 1,0 ml Substratlösung enthaltend 1 mg/ml BCIP und einen geeigneten Aminoalkoholpuffer wie Aminomethylpropanol in einem 10 mm · 75 Kulturrohr bei einem pH Wert von 9-11 angeordnet. Die Reaktion ließ man bei Raumtemperatur während 10 bis 20 min vonstatten gehen, nach welcher Zeit der Tauchstab aus dem Substrat entfernt und nach Bespritzen oder Berieseln mit Wasser luftgetrocknet wurde.
Die verschiedenen Mengen von hCG im Urin ergaben Tauchstäbe mit Blaufärbung direkt proportional zur Menge von hCG in der Probe. Die hCG-negative Urinprobe ergab einen weißen oder farblosen Tauchstab. Eine unbekannte Probe oder eine Lösung einer unbekannten Probe konnte halbquantitativ durch visuellen Vergleich mit den beschriebenen Referenztauchstäben bestimmt werden. Unter Verwendung eines einzigen Kalibrators bei dem gewünschten Grenzwert konnten unter Verwendung dieses visuellen Tests qualitative Resultate zur Schwangerschaftsbestimmung vorgenommen werden. Die Testempfindlichkeit konnte auch eingestellt werden, um die visuelle Detektionsgrenze auf den gewünschten Grenzwert für einen qualitativen Test zu setzen.

Beispiel 6

Dieses Beispiel demonstriert die Verwendung von Tauchstäben hergestellt wie im Beispiel 2 zur Entwicklung einer Kalibrationskurve für Mäuse-IgG.
Anti-Mäuse-IgG (Fc-spezifisch) hergestellt durch Ammoniumsulfatfraktionierung aus Kaninchenantiseren wurde verwendet, um Polystyrolfolien wie in Beispiel 2 zu beschichten.
Monoklonales Mäuse-IgG&sub1; wurde mit alkalischer Rinderdarmphosphatase, wie im Beispiel 3 beschrieben, gekoppelt. Dieses alkaliphosphatasegekoppelte Mäuse-IgG&sub1; wurde als das markierte Antigen in der folgenden kompetitiven EIA für Mäuse-IgG nach Verdünnung 1:2000 in Untersuchungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,064% NaCl, 0,04% Tween-20, 1 mg/ml Rinderserumalbumin) verwendet.
Eine Lösung (100 ul) von Mäuse-IgG&sub1; in phosphatgepufferter Salzlösung (10 mM Natriumphosphat, pH 7,0, 0,9% NaCl) enthaltend verschiedene Mengen von IgG&sub1; wurde in ein 10 m · 75 mm Kulturrohr mit 900 ul des markierten Antigens in Asseypuffer gegeben und die Mischung gerührt. Sechs derartiger Lösungen von Mäuse-IgG&sub1; wurden mit Konzentrationen von 0 bis 0,1 mg/ml verwendet.
Ein Tauchstab messend 4 in. in der Länge und 6 mm in der Breite mit einem sich von einem Ende 2,0 cm erstreckenden Abschnitt, der auf beiden Seiten mit Anti-Mäuse-IgG (Fc-spezifisch) beschichtet ist, wurde von der wie oben präparierten Folie abgeschnitten. Der Tauchstab wurde in dem Reaktionsrohr mit dem antikörperbeschichteten Abschnitt vollständig eingetaucht angeordnet und bei Raumtemperatur für 30 min inkubiert. Der Stab wurde dann entfernt und kurz mit Leitungswasser auf jeder Seite berieselt. Überschüssiges Wasser wurde dann abgeschüttelt und der Tauchstab in 1,0 ml Substratlösung bestehend aus 1,0 mg/ml BCIP in einem geeigneten Aminoalkoholpuffer wie etwa Aminomethylpropanol, pH 9-11, angeordnet. Die Reaktion erfolgte bei Raumtemperatur während 10 min, nach welcher Zeit der Tauchstab aus dem Substrat entfernt wurde. Der Tauchstab wurde nach leichtem Besprühen luftgetrocknet.
Es bestand eine inverse Beziehung zwischen der Blaufärbungsintensität auf dem Tauchstab und der Menge von Mäuse-IgG in der Probe. Es ist möglich, eine unbekannte Probe oder Lösung einer unbekannten Probe durch visuellen Vergleich mit den Referenztauchstäben zu semiquantifizieren.

Claims

1. Verfahren für das kolorimetrische Immunoessay einer immunologisch reaktiven, in einer Flüssigkeitsprobe zu entdeckenden Substanz, umfassend ein Kontaktieren der besagten Probe mit einer aus nicht quellbaren, undurchlässigen Plastikmaterial bestehenden, durchgehenden, festen Oberfläche, wobei die chemische Natur der Plastikoberfläche derart ist, daß sie das Binden eines Antigens oder eines Antikörpers an ihr erlaubt, sowie geeignet ist, um darauf zu entdeckende Substanz von der besagten Probe zu immobilisieren, und ein Verwenden der besagten Oberfläche zum Immobilisieren eines Enzym markierten, diagnostischen Reagenz für die besagte, zu entdeckende Substanz in einer Menge in bezug auf die Menge an besagter Substanz, die immobilisiert wurde, Kontaktieren des resultierenden festen Materials mit einer Lösung eines Substrats für das besagte Enzym, das hierdurch in eine umlösliche, gefärbte Form konvertiert wird, und Ermöglichen der besagten unlöslichen, gefärbten Form, sich als ein Niederschlag auf dem besagten resultierenden, undurchlässigem, festen Material niederzuschlagen, um diesem eine visuell unterscheidbare Farbe, die sich auf die Anwesenheit besagter Substanz bezieht, zu verleihen, und Trennen des resultierenden, gefärbten, festen Materials von der besagten Substratlösung.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, umfassend

(a) ein Kontaktieren der besagten die besagte zu entdeckende Substanz enthaltenden Probe mit einer nicht quellbaren, aus undurchlässigem Plastikmaterial bestehenden, kontinuierlichen, festen Phase, wobei die chemische Natur der Plastikfläche derart ist, daß sie ein Binden eines Antigens oder eines Antikörpers an ihr, umfassend immobilisierte, in einer Schicht an die besagte feste Oberfläche gebundene Antisubstanz, ermöglicht, und mit löslicher Enzym-markierter Antisubstanz oder mit freier Enzym-markierter Substanz des gleichen Typs wie die besagte zu entdeckende Substanz, um zu bewirken, daß eine Menge der Enzymmarkierung immobilisiert wird, die zur Menge der besagten, in der Probe zu entdeckenden Substanz in Bezug steht;

(b) ein Trennen der gemäß Schritt (a) resultierenden festen Phase von flüssiger Phase;

(c) ein Kontaktieren der abgetrennten festen Phase von Schritt (b) mit einer Lösung enthaltend lösliches Substrat für das Enzym, um zu bewirken, daß das Substrat in eine unlösliche, gefärbte Form konvertiert wird, die sich als Niederschlag auf der nicht quellbaren, aus undurchlässigem Plastik bestehenden, kontinuierlichen, festen Phase absetzt, um dieser eine visuell unterscheidbare Farbe bezüglich der Anwesenheit der besagten, in der Probe zu entdeckenden Substanz zu verleihen; und

(d) ein Trennen der besagten festen Phase von der besagten Substratlösung.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei die immobilisierte Antisubstanz ein monoklonaler Antikörper ist und/oder eine enzymmarkierte Antisubstanz verwendet wird, die ein enzymmarkierter, monoklonaler Antikörper ist.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die besagte zu entdeckende Substanz menschliches Choriongonadotropin ist, wobei das Verfahren zur Schwangerschaftsfeststellung verwendet wird, oder luteinisierendes Hormon ist, wobei das Verfahren zur Ovulationsfeststellung verwendet wird.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das besagte Substrat vor dem Kontakt mit dem Enzym farblos ist und sich in eine gefärbte unlösliche Form in Anwesenheit des Enzyms umwandelt.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die besagte feste Oberfläche ein Reaktionsflächenteil eines Eintauchstabes gebildet aus einem Material ausgewählt aus der Gruppe umfassend Polymethylmethacrylat, Polystyrol, Polyethylen, Polyterephthalat, Polyester und Polypropylen ist.

7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das ein sandwichartiges Verfahren für das kolorimetrische Immunoessay eines in einer biologisch erhaltenen Flüssigkeitsprobe enthaltenen Antigens unter Verwendung einer festen Oberfläche ist, umfassend die Schritte des

(a) Kontaktierens der besagten biologisch erhaltenen Flüssigkeitsprobe, die das zu entdeckende Antigen enthält, mit einer nicht quellbaren, aus undurchlässigem Plastikmaterial bestehenden, kontinuierlichen, festen Phase, wobei die chemische Natur der Plastikoberfläche derart ist, daß sie ein Binden eines Antigens oder eines Antikörpers auf ihr ermöglicht, umfassend immobilisierten Antikörper gebunden in einer Schicht an einer festen Oberfläche, und mit löslichem, enzymmarkiertem, immunologisch mit dem besagten Antigen reaktiven Antikörper, um zu bewirken, daß das besagte Antigen immunologisch sowohl an dem besagten immobilisierten Antikörper als auch an dem besagten markierten Antikörper auf der besagten festen Phase gebunden wird;

(b) Trennens der undurchlässigen festen Phase von der Lösung enthaltend unreagierten, löslichen, enzymmarkierten Antikörper;

(c) Kontaktierens der abgetrennten festen Phase aus Schritt (b) mit einer Lösung enthaltend lösliches Substrat für das Enzym, um zu bewirken, daß das Substrat in eine unlösliche, gefärbte Form umgewandelt wird, die sich als Niederschlag auf der undurchlässigen festen Phase absetzt, um dieser eine visuell unterscheidbare Farbe als eine Indikation für die Anwesenheit des in der biologisch erhaltenen Flüssigkeitsprobe zu entdeckenden Antigens zu verleihen; und

(d) Trennens der besagten festen Phase von der besagten Substratlösung.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, das ein konkurrierendes Verfahren für das kalorimetrische Immunoessay eines in einer biologisch abgeleiteten Flüssigkeitsprobe enthaltenen Antigens ist, das eine feste Oberfläche verwendet, umfassend die Schritte des

(a) Kontaktierens von immobilisiertem, in einer Schicht auf einer nicht quellbaren, aus undurchlässigem Plastikmaterial bestehenden, kontinuierlichen, festen Oberfläche befindlichem Antikörper, wobei die chemische Natur der Plastikfläche derart ist, daß sie das Binden eines Antigens oder eines Antikörpers an ihr erlaubt, das eine feste Phase mit der besagten biologisch abgeleiteten, zu entdeckendes Antigen enthaltenden Flüssigkeitsprobe und mit freiem enzymmarkiertem Antigen des gleichen Typs wie das besagte, zu entdeckende Antigen bildet, um eine konkurrierende immunologische Reaktion zwischen dem besagten immobolisierten Antikörper und dem besagten, zu entdeckenden Antigen und enzymmarkierten Antigen zu bewirken;

(b) Trennens der reagierten festen Phase von Schritt (a) von der flüssigen Phase;

(c) Kontaktierens der separierten festen Phase von Schritt (b) mit einer Lösung enthaltend lösliches Substrat für das Enzym, um zu bewirken, daß das Substrat in eine unlösliche, gefärbte Form überführt wird, die sich als Niederschlag auf der undurchlässigen, festen Phase absetzt, um dieser eine visuell unterscheidbare Farbe als eine Umkehrindikation für die Menge des in der biologisch abgeleiteten Flüssigkeitsprobe enthaltenen Antigens zu verleihen; und

(d) Trennens der besagten festen Phase von der besagten Substratlösung.

9. Reagierter Eintauchstab für ein Immunoessay, umfassend einen undurchlässigen festen Reaktionsoberflächenabschnitt, an den aufeinanderfolgende Schichten von Antikörper immunologisch gebunden an Antigen, das immunologisch an enzymmarkierten Antikörper gebunden ist, und ein visuell unterscheidbar gefärbtes, auf besagte aufeinanderfolgende Schichten niedergeschlagenes Substrat, das von einer löslichen in eine niedergeschlagene gefärbte Form aufgrund der Anwesenheit des besagten Enzyms umgewandelt wurde.

10. Reagierter Eintauchstab für ein Immunoessay umfassend einen nicht quellbaren, aus undurchlässigem Plastikmaterial bestehenden, kontinuierlichen, festen Reaktionsoberflächenabschnitt, wobei die chemische Natur des Plastikoberfläche derart ist, daß sie es erlaubt, ein Antigen oder einen Antikörper an ihr zu binden, an dem eine Schicht aus Antikörper, von dem wenigstens ein Teil immunologisch an enzymmarkiertes Antigen gebunden ist, und visuell unterscheidbar gefärbtes Substrat, das auf die besagte Schicht niedergeschlagen ist, gebunden ist, wobei das besagte Substrat von einer löslichen in eine niedergeschlagene gefärbte Form aufgrund der Anwesenheit des besagten Enzyms konvertiert worden ist.

11. Reagierter Eintauchstab gemäß Anspruch 9 oder 10, wobei das Antigen menschliches Choriongonadotropin oder luteinisierendes Hormon ist.

12. Verfahren zur Herstellung eines reagierten Eintauchstabs gemäß einem der Ansprüche 9 bis 11, umfassend das Ausführen der Schritte eines Verfahrens wie in einem der Ansprüche 6 bis 8 beansprucht.