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EXTRAKTIONSMITTEL ZUM EXTRAHIEREN VON CHO-
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LESTERIN UND VERFAHREN FÜR SEINE HERSTELLUNG Die Erfindung bezieht
sich auf das Gebiet der Medizin und betrifft insbesondere ein Extraktionsmittel
zum Extrahieren von Cholesterin und ein Verfahren für seine Gewinnung.
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DasExtraktionsmittel kann in der Medizin für die Extraktion von Cholesterin
aus den Membranen der Lipoproteide des Blutes, der Formenelemente des Blutes (Erythrozyten
und Thrombozyten) und aus Zellmembranen der Blutgefäßwände verwendet werden.
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Bekannt ist ein Extraktionsmittel zum Extrahieren von Cholesterin
in Form von Liposomen aus Phosphatidylcholin, das aus Eidotter extrahiert wurde.
Das Extraktionsmittel findet Anwendung beim Extrahieren des Cholesterins aus Membranen
der Lebermikrosomen (Journal "Biochimija", Band 46, 6, 1981, "Nauka"-Verlag, (Moskau),
E.A. Borodin und andere "Einfluß des Einbaus und des Entzugs von Cholesterin auf
die Viskosität der Lipidbischicht und die Geschwindigkeit der Oxydationsprozesse
in Lebermikrosomen von Ratten, S. 1109-1118) (1) sowie beim Extrahieren von Cholesterin
aus Haut-Fibroblasten (Journal Biochimica et Biophysica Acta v. 685, 1982, Verlag
"Elsevier Biomidical Press" (Amsterdam), Poznansky M.J.
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et al. "Cholesterol movement between human skin fibroblasts and phosphatidylcholine
vesicles pp. 182-190)(2).
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Das genannte Extraktionsmittel gewinnt man durch Einwirkung von Ultraschall
auf das in Wasser solubilisierte Phosphatidylcholin, das aus Eidottern extrahiert
wurde,
und anschließende Zentrifugierung zwecks Beseitigung des
nichtdispergierten Phosphatidylcholins.
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Die Liposome aus Eiphosphatidylcholin als Extraktionsmittel des Cholesterins
extrahieren jedoch nicht genügend effektiv das Cholesterin und weisen eine niedrige
Stabilität auf; infolgedessen aggregieren die Liposome bei der Lagerung des Extraktionsmittels
und sedimentieren.
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Bekannt ist ein Extraktionsmittel zum Extrahieren von Cholesterin
in Form von Komplexen des Phosphatidylcholins, das aus Eidottern extrahiert wurde,
und von Apoproteinen, die aus Lipoproteiden mit hoher Dichte (LhD) extrahiert wurden.
Dieses Extraktionsmittel wird beim Extrahieren von Cholesterin aus Membranen von
Hepatomzellen und Hautfibroblasten verwendet.
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Dieses Extraktionsmittel wird in einem Verfahren gewonnen, das darin
besteht, daß man die wäßrige Lösung, die ein Gemisch aus Phosphatidylcholin, das
aus Eidottern extrahiert wird, mit Apoproteinen enthält, mit Ultraschall bestrahlt
(Journal of Biological Chemistry, v.
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259, Nr. 9, 1982, Verlag American Society of Biological Chemists,
Inc., Rockville Pike, Bethesda; Rothblath G.H., Phillips M.C. "Mechanism of cholesterol
efflux from cells. Effects of acceptor structure and cQncentration", pp. 4775-4782)
(3).
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Dieses Extraktionsmittel extrahiert jedoch auch ungenügend effektiv
das Cholesterin, und es sind bei der Einführung des Extraktionsmittels ins Blut
immunologische Komplikationen als Antwortreaktion auf die Einführung eines artfremden
Eiweißes möglich. Die Ausscheidung von
Apoproteinen aus Lipoproteiden
hoher Dichte stellt außerdem eine komplizierte und kostspielige Prozedur dar.
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In derselben Veröffentlichung (3) wurde ein Extraktionsmittel des
Cholesterins in Form von gemischten Mizellen des Phosphatidylcholins der Eidotter
und Salze der Gallensäure, beispielsweise Natriumdesoxycholats, beschrieben. Die
in diesem Extraktionsmittel vorhandenen Salze der Gallensäuren besitzen eine stark
ausgeprägte toxische Wirkung auf biologische Membranen. Die Effektivität des Extraktionsmittel
beim Extrahieren von Cholesterin ist außerdem unzureichend hoch.
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Das Ziel der vorliegenden Erfindung besteht in der Entwicklung eines
Extraktionsmittels zum Extrahieren von Cholesterin, das effektiver das Cholesterin
aus Zellen entzieht und eine geringere toxische Wirkung im Vergleich zu den bekannten
Extraktionsmitteln aufweist.
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Das gestellte Ziel wurde erreicht durch die Entwicklung eines Extraktionsmittels
zum Extrahieren von Cholesterin, das Phosphatidylcholin enthält, das in einem wäßrigen
Medium solubilisiert ist, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß es
ein Gemisch aus Polypropylenglykol und Polyethylenglykol mit der Molekularmasse
von 2.000 bis 9.000 und aus Zetyltrimethylammoniumbromid enthält und folgende Zusammensetzung
in Masseanteilen aufweist: Phosphatidylcholin 1 Gemisch aus Polypropylenglykol und
Polyethylenglykol mit der Molekularmasse von 2.000 bis 9.000 0,1 bis 0,4
Zetyltrimethylammoniumbromid
0,002 bis 0,04 mit einem Gehalt an Phosphatidylcholin in 1 ml von 10 bis 35 mg und
positiv geladen ist.
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Als Phosphatidylcholin, das in der Zusammensetzung des Extraktionsmittels
enthalten ist, kann Phosphatidylcholin verwendet werden, das aus Sojabohnen extrahiert
wurde. In diesem Fall ist das Extraktionsmittel effektiver.
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Im Polymergemisch soll das Massenverhältnis zwischen dem Polypropylenglykol
und Polyethylenglykol zweckmäßigerweise im Bereich 1 bis 9:1 bis 4 gehalten werden.
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Bei dem genannten Verhältnis der Komponenten wird die größte Stabilität
des Extraktionsmittels bei seiner Lagerung erreicht.
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Der Vorteil des erfindungsgemäßen Extraktionsmittels ist seine hohe
Fähigkeit im Vergleich zu den bekannten Extraktionsmitteln, Cholesterin zu extrahieren.
Das erfindungsgemäße Extraktionsmittel extrahiert Cholesterin aus Membranen der
Erythrozyten um 50 % wirksamer als das bekannte Extraktionsmittel auf der Grundlage
der gemischten Mizellen des Phosphatidylcholins und des Natriumdesoxycholats und
um 100 % wirksamer als das bekannte Extraktionsmittel in Form von Liposomen des
Phosphatidylcholins, das aus Eidottern extrahiert wurde.
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Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Extraktionsmittels ist
seine geringere Toxizität im Vergleich zu den bekannten Extraktionsmitteln, die
an männlichen weißen Mäusen mit einem Gewicht von 16 bis 18 g bei intraperitonealer
Einführung ermittelt wurde. LD50 des erfindungsgemäßen Extraktionsmittels ist gleich
90 je 1 g des Gewichtes eines Tieres und LD50 des bekann-
ten Extraktionsmittels
auf der Grundlage der gemischten Mizellen des Phosphatidylcholins und des Natriumdesoxycholats
ist ( 5 /ul je 1 g des Gewichtes eines Tieres.
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Ein weiterer Vorteil des Extraktionsmittels besteht in seiner Stabilität
bei der Lagerung.
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Das erfindungsgemäße Extraktionsmittel kann infolge seiner hohen Fähigkeit,
Cholesterin zu extrahieren, und seiner geringen Toxizität als pharmazeutisches Mittel
für die Behandlung der Atherosklerose verwendet werden.
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Gegenstand der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Gewinnung des
Extraktionsmittels zum Extrahieren von Cholesterin, das die Einwirkung von Ultraschall
auf das in wäßrigem Medium solubilisierte Phosphatidylcholin und anschließende Zentrifugierung
vorsieht, das erfindungsgemäß dadurch gekennzeichnet ist, daß man der Einwirkung
des Ultraschalls eine wäßrige Lösung unterwirft, die folgende Komponenten in Masseanteilen
enthält: Phosphatidylcholin 1 Gemisch aus Polypropylenglykol und Polyethylenglykol
mit der Molekularmasse von 2.000 bis 9.000 0,1 bis 0,4 Zetyltrimethylammoniumbromid
0,002 bis 0,04 mit einem Gehalt an Phosphatidylcholin in 1 ml von 10 bis 35 mg.
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Zweckmäßigerweisc sollen als Phosphatidylcholin Phosphatidylcholine
eingesetzt werden, die aus pflanzlichen Rohstoffen, beispielsweise aus Sojabohnen,
extrahiert wurden, weil die Extraktionsmittel, die Phosphatidylcholine aus Sojabohnen
enthalten, durch die größte Effek-
tivität bei der Extraktion von
Cholesterin gekennzeichnet sind. Beispielsweise extrahiert das Extraktionsmittel,
das Phosphatidylcholin der Sojabohnen enthält, das Cholesterin aus Membranen der
Erythrozyten um 20 % effektiver als ein Extraktionsmittel, das Phosphatidylcholin
enthält, das aus Eidottern extrahiert wurde.
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Im Polymergemisch soll das Massenverhältnis zwischen dem Polypropylenglykol
und Polyethylenglykol wünschenswerterweise im Bereich 1 bis 9:1 bis 4 gehalten werden.
Bei der Vergrößerung des Gehaltes an Polyethylenglykol über den obengenannten Wert
hinaus ist eine Verringerung der Stabilität des Extraktionsmittels bei seiner Lagerung
und ein Niederschlagen des Phosphatidylcholins möglich.
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Die Vergrößerung des Gehaltes an Polypropylenglykol im Gemisch über
den obengenannten Wert hinaus geht mit einer Verringerung der Löslichkeit des Polymergemisches
in Wasser einher.
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Es wird empfohlen, die Temperatur des Extraktionsmittels bei der Einwirkung
auf dasselbe mit Ultraschall in einem Bereich von 0 bis +100C zu halten. Eine Erhöhung
der Temperatur über den obengenannten Wert hinaus kann zur Oxydation von Fettsäureresten
des Phosphatidylcholins beitragen, was nicht wünschenswert ist. Das im genannten
Verfahren gewonnene Extraktionsmittel gewinnt eine positive Ladung infolge des Vorhandenseins
des Zetyltrimethylammoniumbromids.
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Nachstehend wird eine ausführliche Beschreibung der Erfindung angeführt.
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Als Ausgangskomponente, Phosphatidylcholin, kann man Phosphatidylcholine
unterschiedlicher Herkunft, bei-
spielsweise Phosphatidylcholine
tierischer Herkunft, die aus Eidottern, Muskeln und Gehirn von Tieren extrahiert
werden, Phosphatidylcholine pflanzlicher Herkunft, die aus Sojabohnen, aus Sonnenblumen
und aus anderen dafür geeigneten Rohstoffen extrahiert werden, sowie synthetische
Phosphatidylcholine verwenden. Das Verfahren wird in der Praxis wie folgt durchgeführt.
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1 Masseanteil Phosphatidylcholin wird in einem inerten organischen
Lösungsmittel, beispielsweie in Diethylether, aufgelöst. Es wird eine solche Menge
des Phosphatidyldholins genommen, daß sein Gehalt in 1 ml Extraktionsmittel 10 bis
35 mg beträgt. Dann wird das organische Lösungsmittel zur Trockne eingedampft, und
man gießt 27 bis 100 Volumenanteile einer wäßrigen Lösung hinzu, die ein Gemisch
aus Polypropylenglykol und Polyethylenglykol mit der Molekularmasse von 2.000 bis
9.000 und Zetyltrimethylammoniumbromid enthält. Der Gehalt an dem genannten Polymergemisch
in der wäßrigen Lösung beträgt 0,1 bis 0,4 Masseanteile je 1 Masseanteil des Phosphatidylcholins
und der Gehalt an Zetyltrimethylammoniumbromid beträgt 0,002 bis 0,04 Masseanteile
je 1 Masseanteil des Phosphatidylcholins. Das Massenverhältnis des Polypropylenglykols
zum Polyethylenglykol im Gemisch ist im Bereich 1 bis 9:1 bis 4 möglich. Die Komponenten
werden sorgfältig bis zur Solubilisierung des Phosphatidylcholins vermischt. Die
angefallene trübe Flüssigkeit wird in Gläser für Ultraschall-Desintegrator übertragen
und einer Ultraschalleinwirkung mittlerer Stärke, beispielsweise bei 50 bis 100
W, ausgesetzt.
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Wenn das Extraktionsmittel die Form einer durchsichtigen opaleszierenden
Flüssigkeit annimmt, wird die Ultraschalleinwirkung beendet. Die Dauer der Ultraschalleinwirkung
hängt vom Volumen des Extraktionsmittels und der Kon-
zentration
des Phosphatidylcholins in demselben ab und beträgt üblicherweise 1 bis 10 Minuten.
Die Temperatur des Extraktionsmittels bei der Ultraschalleinwirkung soll nicht +10
0C übersteigen, sonst ist die Oxydation von Fettsäureresten des Phosphatidylcholins
möglich, was unzulässig ist.
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Nach der Einwirkung des Ultraschalls wird das Extraktionsmittel zwecks
Entfernung von Metallstückchen zentrifugiert, die vom Endstück des Ultraschall-Desintegrators
während der Einwirkung des Ultraschalls in die Flüssigkeit geraten. Das dadurch
gewonnene Extraktionsmittel wird unter einem Stickstoffstrom in Ampullen verschlossen
und bei einer Temperatur von 00 bis 40C gelagert.
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Bei Nichteinhaltung der Verfahrensbedingungen wird erfindungsgemäß
der gewünschte Effekt nicht erreicht, d.h., daß kein Extraktionsmittel gewonnen
wii, das die obengenannten Eigenschaften aufweist. Wenn bei der Gewinnung des Extraktionsmittels
die Menge des Phosphatidylcholins 35 mg/ml übersteigt, so kann das zur Ausfällung
des Phosphatidylcholins bei der Lagerung des Extraktionsmittels führen. Der Gehalt
an Phosphatidylcholin im Extraktionsmittel kann unter 10 mg/ml liegen. Das wird
seine Eigenschaften nicht beeinflussen. Bei niedrigeren Konzentrationen dieser Komponente
wird aber die Verwendung einer größeren Menge des Extraktionsmittels erforderlich,
was unzweckmäßig ist. Wenn bei der Gewinnung des Produktes eine Menge des genannten
Gemisches von Polymeren genommen wird, die 0,4 Masseanteile je 1 Masseanteil des
Phosphatidylcholins übersteigt, so wird das zur Vergrößerung der Toxizität des Extraktionsmittels
führen. Bei einem Massenverhältnis des Phosphatidylcholins und des genannten Polymergemisches
von 1:1,6 und einem Gesamtgehalt an Phosphatidylcholin im Extraktionsmittel von
25
mg/ml beträgt beispielsweise LD50 eines solchen Extraktionsmittels etwa 18 1 je
1 g des Körpergewichtes, während LD50 des Extraktionsmittels, das erfindungsgemäß
beim Massenverhältnis des Phosphatidylcholins zum Polymergemisch gleich 1:0,2 gewonnen
wird, 90 pol je 1 g des Körpergewichtes beträgt. Wenn bei der Gewinnung des Produktes
das Massenverhältnis zwischen dem Polypropylenglykol und den Polyethylenglykol im
Polymergemisch unter 1:4 liegt, so wird das herzustellende Extraktionsmittel bei
der Lagerung ungenügend stabil, und es entsteht die Möglichkeit der Ausfällung des
Phosphatidylcholins. Wenn bei der Gewinnung des Produktes die Temperatur des Extraktionsmittels
bei der Ultraschalleinwirkung +10 0C übersteigt, so entsteht die Möglichkeit der
Oxydation des Phosphatidylcholins, was unzulässig ist.
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Der Gehalt an Zetyltrimethylammoniumbromid soll in einem Bereich von
0,002 bis 0,04 Masseanteilen je 1 Masseanteil des Phosphatidylcholins gehalten werden.
Dieser Gehalt wird dadurch bestimmt, daß bei einem Gehalt an Zetyltrimethylammoniumbromid
unter dem genannten Wert die Ausfällung des Phosphatidylcholins erfolgen kann und
das Extraktionsmittel seine Stabilität verliert. Bei einem Gehalt an Zetyltrimethylammoniumbromid
über 0,04 Masseanteile ist die Vergrößerung der Toxizität des Extraktionsmittels
möglich, was nicht wünschenswert ist.
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Dadurch wird infolge Nichteinhaltung der erfindungsgemäßen Verfahrensbedingungen
kein Produkt mit den erwünschten Eigenschaften erhalten. Wie aus der Beschreibung
hervorgeht, ist das erfindungsgemäße Verfahren einfach und erfordert keinen großen
Energieaufwand. Sämtliche Ausgangskomponenten sind bekannte und zugängliche
Stoffe.
Das zum Einsatz kommende Gemisch aus Polypropylenglykol mit Polyethylenglykol ist
unter der Bezeichnung Pluronic umfassend bekannt und auch zugänglich.
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Zu einer besseren Erläuterung der vorliegenden Erfindung werden die
folgenden konkreten Beispiele für ihre Durchführung angeführt.
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Beispiel 1 In einen Rundkolben von 500 ml Fassungsvermögen werden
5 g Phosphatidylcholin der Sojabohnen eingebracht, 50 ml Diethylether hinzugefügt,
der Kolben mit einem Stopfen abgeschlossen und der Inhalt bis zur vollständigen
Auflösung des Phosphatidylcholins vermischt. Der Diethylether wird in einem Rotor-Verdampfungsapparat
bei einer Temperatur von 400C eingedampft. Dem an den Kolbenwandungen haftenden
Phosphatidylcholin gießt man 200 ml einer wäßrigen Lösung hinzu, die 1 g des Gemisches
von Polypropylenglykol und Polyethylenglykol (Massenverhältnis 9:1) mit der Molekularmasse
2.000 und 0,05 g Zetyltrimethylammoniumbromid enthält. Der Inhalt wird bis zur vollständigen
Abtrennung des Phosphatidylcholins von den Kolbenwandungen und seiner Solubilisierung
intensiv vermischt. Die entstehende milchig trübe Flüssigkeit wird portionsweise
zu je 20 ml in Bechergläser mit einem Volumen von 50 ml übertragen, die in ein Wasserbad
mit Eis eingebracht werden, und es erfolgt die Ultraschalleinwirkung in einem Ultraschall-Desintegrator
abwechselnd je 30 Sekunden mit Abständen von 1 Minute bis zum Anfallen einer durchsichtigen
opaleszierenden Flüssigkeit. Die gesamte Zeit der Einwirkung des Ultraschalls beträgt
3 bis 5 Minuten. Die hergestellte Flüssigkeit wird bei 20.000 Upm während 15 Minuten
mit dem Ziel der Entfernung von Metallstückchen zentrifugiert, die vom
Endstück
des Ultraschall-Desintegrators in die Flüssigkeit geraten. Das erhaltene Extraktionsmittel
wird unter einem Stickstoffstrom in 10 ml-Ampullen verschlossen und bei einer Temperatur
von 0 bis +4 0C gelagert.
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Das erhaltene Extraktionsmittel hat eine positive Ladung und enthält
25 mg Phosphatidylcholin in 1 ml. Das Massenverhältnis Phosphatidylcholin : Polymergemisch
: Zetyltrimethylammoniumbromid beträgt 1:0,2:0,01. Das Extraktionsmittel extrahiert
30 % Cholesterin 'lin vitro" aus Erythrozyten-Membranen unter folgenden standardisierten
Bedingungen. Das Verhältnis Erythrozyten-Schatten : Extraktionsmittel (bestimmt
nach Phospholipidgehalt) beträgt 1:2, die Inkubationszeit 3 Stunden, die Temperatur
370C, die Zusammensetzung des Inkubationsmediums ist wie folgt: 100 mmolar tris-HCl-Puffer,
pH 7,4; 0,5 mmolare Ethylendiamintetraessigsäure, 3 g Phospholipid der Erythrozyten-Schatten;
6 mg Phospholipid des Extraktionsmittel; Volumen des Inkubationsgemisches 3,5 ml.
Bei der Untersuchung der akuten Toxizität des Extraktionsmittels an männlichen weißen
Mäusen mit einem Gewicht von 16 bis 18 g bei intraperitonealer Einführung des Extraktionsmittels
beträgt LD50 etwa 90 1 je 1 g Körpergewicht. Das Extraktionsmittel ist bei Lagerung
stabil.
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Beispiel 2 Man verfährt wie in Beispiel 1 mit dem Unterschied aber,
daß man 2 g des Gemisches von Polypropylenglykol und Polyethylenglykol (Massenverhältnis
3:2)mit der'Molekularmasse 3.000 verwendet. Das erhaltene Extraktionsmittel enthält
25 mg Phosphatidylcholin in 1 ml. Das Massenverhältnis Phosphatidylcholin : Polymergemisch
: Zetyltrimethylammoniumbromid beträgt 1:0,4:0,01. Das erhaltene Extraktionsmittel
weist eine positive Ladung
auf, extrahiertaus den Membranen der
Erythrozyten unter den standardisierten Bedingungen (wie in Beispiel 2 beschrieben)
30 % Cholesterin und ist bei der Lagerung stabil.
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Beispiel 3 Man verfährt wie in Beispiel 1 mit dem Unterschied aber,
daß man Phosphatidylcholin verwendet, das aus Eidottern extrahiert wurde, und 0,025
g Zetyltrimethylammoniumbromid nimmt. Das erhaltene Extraktionsmittel enthält 25
mg Phosphatidylcholin in 1 ml. Das Massenverhältnis Phosphatidylcholin : Polymergemisch
: Zetyltrimethylammoniumbromid beträgt 1:0,2:0,025. Das erhaltene Extraktionsmittel
weist eine positive Ladung auf, extrahiert aus den Membranen der Erythrozyten unter
den standardisierten Bedingungen (wie in Beispiel 1 beschrieben) 25 % Cholesterin
und ist bei der Lagerung stabil.
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Beispiel 4 Der Prozeß wird wie in Beispiel 1 mit dem Unterschied aber
durchgeführt, daß man 2 g Phosphatidylcholin der Sojabohnen, 0,8 g des Gemisches
aus Polypropylenglykol und Polyethylenglykol (Massenverhältnis 1:4) mit der Molekularmasse
von 9.000 und 0,004 g Zetyltrimethylammoniumbromid nimmt. Das hergestellte Extraktionsmittel
enthält 10 mg Phosphatidylcholin in 1 ml. Das Massenverhältnis Phosphatidylcholin
: Polymergemisch : Zetyltrimethylammoniumbromid beträgt 1:0,4:0,002. Das erhaltene
Extraktionsmittel weist eine positive Ladung auf, extrahiert aus Membranen der Erythrozyten
unter den standardisierten Bedingungen (wie in Beispiel 1 beschrieben) 28 % Cholesterin
und ist bei der Lagerung stabil.
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Beispiel 5 Der Prozeß wird wie in Beispiel 1 durchgeführt, man nimmt
aber 7g Phosphatidylcholin der Sojabohnen, 1 g Gemisch des Polypropylenglykols mit
Polyethylenglykol (Massenverhältnis 9:1) mit der Molekularmasse 2.000 und 0,28 g
Zetyltrimethylammoniumbromid. Das erhaltene Extraktionsmittel enthält 35 mg Phosphatidylcholin
in 1 ml. Das Massenverhältnis Phosphatidylcholin : Polymergemisch : Zetyltrimethylammoniumbromid
beträgt 1:0,1:0,04. Das erhaltene Extraktionsmittel weist eine positive Ladung auf,
extrahiert aus Membranen der Erythrozyten unter den standardisierten Bedingungen
(wie in Beispiel 1 beschrieben) 30 % Cholesterin und ist bei der Lagerung stabil.
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Beispiel 6 Dieses Beispiel veranschaulicht ein Verfahren zur Gewinnung
des Extraktionsmittels unter den die Erfindung verletzenden Bedingungen.
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Der Prozeß wird wie in Beispiel 1 mit dem Unterschied aber durchgeführt,
daß man 8 g Gemisch des Polypropylenglykols mit Polyethylenglykol (Massenverhältnis
9:1) mit der Molekularmasse 2.000 nimmt. Das erhaltene Extraktionsmittel enthält
25 mg Phosphatidylcholin in 1 ml. Das Massenverhältnis Phosphatidylcholin : Polymergemisch
: Zetyltrimethylammoniumbromid beträgt 1:1,6:0,01. Das erhaltene Extraktionsmittel
extrahiert aus Membranen der Erythrozyten unter den standardisierten Bedingungen
(wie in Beispiel 1 beschrieben) 30 % Cholesterin und ist bei der Lagerung stabil.
Bei der Untersuchung der Toxizität des Extraktionsmittels an männlichen weißen Mäusen
mit einem Gewicht von 16 bis 18 g bei intraperitonealer Einführung beträgt aber
LD50 des Extraktionsmittels « 18 fil.
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Zur Untersuchung der Effektivität des Extraktionsmittels,
das
erfindungsgemäß wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellt wird, wurde bei der Extraktion
von Cholesterin "in vitro" die Extraktion von Cholesterin aus Membranen der Erythrozyten
mit dem vorliegenden Extraktionsmittel sowie mit den bekannten Extraktionsmitteln,
Liposomen aus Phosphatidylcholin, das aus Eidottern extrahiert wurde, die in der
Veröffentlichung (1) beschrieben sind, und mit gemischten Mizellen aus Phosphatidylcholin,
das aus Eidottern extrahiert wurde, und aus Natriumdesoxycholat, die in der Veröffentlichung
(3) beschrieben sind, durchgeführt.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt.
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Die Bedingungen der Extraktion von Cholesterin sind wie folgt: Inkubationszeit
3 Stunden; Temperatur 37 0C. Die Zusammensetzung des Inkubationsmediums ist wie
folgt: 100 mmolarer tris-HCl-Puffer, pH 7,4; 0,5 mmolare Ethylendiamintetraessigsäure,
3 mg Phospholipid der Erythrozyten-Schatten; 6 mg Phospholipid des Extraktionsmittels.
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Tabelle 1 Extraktion von Cholesterin aus Membranen von Erythrozyten-Schatten
der Kaninchen mit Extraktionsmitteln auf der Grundlage des Phosphatidylcholins Bezeichnung
des Extraktionsmittels Extraktion von Cholesterin, % 1 2 Extraktionsmittel, hergestellt
nach Beispiel 1 30 + 2
Tabelle 1 (Fortsetzung) 1 2 Bekanntes Extraktionsmittel,
Liposomen aus Phosphatidylcholin von Eidottern (Veröffentlichung 1) 15 + 1,2 Bekanntes
Extraktionsmittel, gemischte Mizellen des Phosphatidylcholins der Eidotter und des
Natriumdesoxycholats (Veröffentlichung 3) 18 + 1,6 Aus der Tabelle ist zu ersehen,
daß das erfindungsgemäß hergestellte Extraktionsmittel Cholesterin "in vitro" aus
Membranen der Erythrozyten um rv 100 % effektiver als Liposome aus Phosphatidylcholin
der Eidotter und um J bi60 % effektiver als gemischte Mizellen des Phosphatidylcholins
der Eidotter und des Natriumdesoxycholats extrahiert.
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Zur Untersuchung der Toxizität des erfindungsgemäß hergestellten Extraktionsmittels,
wie in Beispiel 1 beschrieben, sowie der bekannten gemischten Mizellen des Phosphatidylcholins
der Eidotter und des Natriumdesoxycholats, die wie in der Veröffentlichung (3) beschrieben
hergestellt werden, wurde die Ermittlung von LD50 bei der intraperitonealen Einführung
dieser Extraktionsmittel männlichen weißen Mäusen mit einem Gewicht von 16 bis 18
g durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt.
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Tabelle 2 Ermittlung der Toxizität Bezeichnung des Extraktionsmittels
LD50 Extraktionsmittel nach Beispiel 1 90 flug Körpergewicht Bekanntes Extraktionsmittel.
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Gemischte Mizellen des Phosphatidylcholins der Eidotter und des Natriumdesoxycholats
5 pl/g Körpergewicht Aus der Tabelle ist zu ersehen, daß das erfindungsgemäß hergestellte
Extraktionsmittel eine unvergleichbar geringere Toxizität als das bekannte Extraktionsmittel
auf der Grundlage der gemischten Mizellen des Phosphatidylcholins der Eidotter und
des Natriumdeoxycholats (veöffentlichung 3) aufweist.
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Es wurden Untersuchungen der Fähigkeit des wie in Beispiel 1 beschrieben
hergestellten Extraktionsmittels zur Extraktion von Cholesterin aus biologischen
Membranen "in vivo" durchgeführt. Das Extraktionsmittel wurde Kaninchenmännchen
der Chinchilla-Rasse mit einem Gewicht von 2,5 bis 4 kg mit experimenteller Atherosklerose
eingeführt. Die Kontrollgruppe von Tieren befand sich im Zustand der spontanen Regression
atherosklerotischer Affektionen. Das Extraktionsmittel wurde den Tieren langsam
während eines Monats in einer Dosis von 10 g Phosphatidylcholin je Tier intravenös
eingeführt. Den Grad der Extraktion von Cholesterin aus biologischen Membranen beurteilte
man nach der Verringerung des Ver-
hältnisses Cholesterin/Phospholipide
(ChS/PhL) in Membranen der Erythrozyten und Thrombozyten, des Index der Athe rogenität
Gesamt-ChS-LhD-ChS LhD - ChS im Blutserum und der Fläche der Aortenwand, die von
Lipidablagerungen bei den Tieren eingenommen wird, die das Extraktionsmittel erhielten,
im Vergleich zu den Tieren der Kontrollgruppe. Die erzielten Ergebnisse sind in
Tabelle 3 angeführt.
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Tabelle 3 Extraktion von Cholesterin "in vivo" mit dem Extraktionsmittel
Tiergruppen ChS/PhL ChS/PhL GesamthS-LhD Fläche n-Anzahl Erythro- Thrombo- LhD -
ChS der der Tiere zyten zyten Aorta-Mol/Mol Mol/Mol wand, die mit Lipidenablagerungen
bedeckt ist Versuchsgruppe n = 7 0,66+0,07 0,92+0,09 6,1+ 0,6 14+ 2,5 Kontrollgruppe
n = 7 0,82+0,08 0,99+0,08 11 + 1,3 32+ 4,3 Wie aus der Tabelle zu ersehen ist, zeugen
die Ergebnisse davon, daß das erfindungsgemäße Extraktionsmittel fähig ist, Cholesterin
aus Membranen der Erythrozyten, Thrombozyten,
Lipoproteiden des
Blutes und aus Membranen der Zellen der Aortawand bei intravenöser Einführung bei
Tieren mit experimenteller Atherosklerose zu extrahieren.