DE2208898A1 - Verfahren zur Gewinnung von aktivierten Lipid-Emulsionen zur Verwendung als Reagens in der Seroimmunologie - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von aktivierten Lipid-Emulsionen zur Verwendung als Reagens in der SeroimmunologieInfo
- Publication number
- DE2208898A1 DE2208898A1 DE19722208898 DE2208898A DE2208898A1 DE 2208898 A1 DE2208898 A1 DE 2208898A1 DE 19722208898 DE19722208898 DE 19722208898 DE 2208898 A DE2208898 A DE 2208898A DE 2208898 A1 DE2208898 A1 DE 2208898A1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- protein
- emulsion
- molecules
- albumin
- lipid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/92—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
- G01N2800/044—Hyperlipemia or hypolipemia, e.g. dyslipidaemia, obesity
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
pf. Hans-Heinrich Willrath I Dr. Dieter Weber
Dipl.-Phys. Klaus SeifFert
D_ „ WiESBaden 23. Feb. 1972
p*tf.*i327
II/Wh
ΚΠΟΤΛΤΕΚΓ
Ref. 112/72
Institut National de la Sante et de la
Recherche Medicale, 3 Rue Leon Bonnat/
Paris 16, Frankreich
Verfahren zur Gewinnung von aktivierten
Lipid-Emulsionen zur Verwendung als Reagens
in der Seroimmunologie
Priorität: Französische Patentanmeldung Nr. 71 06.658 vom 26. Februar 1971
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Gewinnung von
Lipid-Emulsionen. Sie bezieht sich gleichfalls auf die derart
gewonnenen Produkte, welche als Reagens in der Seroimmunologie verwendet werden können. Ein besonders interessantes Anwendungsgebiet
ist das Erkennbarwordenlassen von Antikörpern durch Agglutination
der Lipid-Emulsion, insbesondere von Antikörpern im Blutkreislauf, die für die Hyperlipidämie verantwortlich sind.
201836/1171
X-
Zur Erläuterung der Erfindung wird im folgenden kurz eines ihrer Anwendungsgebiete beschrieben. Man weiß seit 1965, dafl die Hyperlipidäroie
durch Eigenantikörper eine Krankheit ist, die oft zu Schädigungen der Arterien (Arteriosklerose) führt und darauf zurückzuführen
ist, daß im Blutkreislauf Antikörper vorhanden sind, und zwar meistens Antiliponroteine. Von den wichtigsten Schriften
zum Stand der Technik seien hier die Artikel von J.L. Beaumont
in "European Journal of Clinical and Biological Research" (Autoimmune hyperlipidemia, an atherogenic metabolic disease of immune
origin) und in "'Atherosclerosis: Proceedings of the Second
International Symposium" (Autoimmune hyperlipidemia), Springer-Verlag
New York 1970 erwähnt. Diese Artikel enthalten zahlreiche bibliographische Hinweise, die den Stand der Dokumentation über
diese Frage vervollständigen. In der nun folgenden Beschreibung werden diese Schriften in Einzelheiten nicht mehr erwähnt, sie
seien hier nur zur genauen Angabe des Standes der Technik erwähnt.
Es ist von großer Bedeutung, eine Krankheit auf möglichst einfache Weise zu erkennen, beispielsweise die Hyperlipidämie durch
Eigenantikörper. Man hat jedoch festgestellt, daß die für diese Krankheit verantwortlichen Antikörper kaum jemals ausgefällt werden
und im allgemeinen nur wenig agglutinieren, so daß man,
selbst '/έπη man die reinen Antikörper und Antigene besitzt, mit
den herkömmlichen Verfahren (Niederschlag in Salzlösung oder Gel, Agglutination von senslbilisierten roten blutkörperchen oder
"Latex-Teilchen) keine nachweisbare Reaktion erhält. Man muß also andere Mittel zur Aufspürung zuhilfe nehmen, die insbesondere
daß Phänomen der Agglutination einer Lipid-Emulsion verwenden.
209836/1171
Dieses Phänomen ist gekennzeichnet durch die mit dem Auge oder unter dem Mikroskop sichtbare Agglutination von Lipid-Teilchen
einer Emulsion bei Anwesenheit eines Serums oder einer Serumfraktion/ die einen Antikörper enthalten, der mit einer an der
Oberfläche der Emulsion liegenden Substanz (Antigen) reagiert. Es ist spezifisch und kann durch einen Überschuß an Antigen gehemmt
werden. Dieses Phänomen steht demjenigen der Agglutination von roten Blutkörperchen oder anderen Teilchen (Latex) nahe, die
durch andere Substanzen, welche heute laufend zur Untersuchung von Antikörpern verwendet werden, aktiviert oder nicht aktiviert
sind. Ferner wird in der Serohämatogolie bereits ein Ausflokkungsphänomen der Lipid-Emulsion bei bestimmten Tests, teils
immunologischer Art (Wasserman-Reaktion), teils nicht spezifischer
Art (Test auf Kopfcholesterin) verwendet.
In einigen Schriften zum Stand der Technik, insbesondere in der
britischen Patentschrift 1 163 470, wurde die Verwendung eines trockenen, ungiftigen Öls zur Herstellung verschiedener Vaccine
vorgeschlagen. Diese Vaccine werden durch eine Dispersion eines Antigen-Stoffes in einem solchen Ol gebildet, welches insbesondere
ein Pflanzenöl, wie Olivenöl oder Ernußöl sein kann* Auf diese Weise gewonnene Produkte sind Vaccine und keine Reagentien,
die zur Aufspürung von Antigen-Antikörper-Reaktionen verwendet
werden können. Außerdem werden diese Vaccine gewonnen, indem vorher sorgfältig getrocknete Antigene in dem öl dispergiert
werden. Mit der Erfindung wird hingegen ein Verfahren zur Gewinnung'aktivierter Lipid-Emulsionen vorgeschlagen, bei dem
eine Öl-in-Wasser-Emulsion hergestellt wird, auf deren Oberflä-
209836/1178
ehe eich das Antigen befindet. Die Emulsion nach der Erfindung,
die also ein wäflriges Milieu enthalt, ist nicht ale Vaccin verwendbar, sondern ala Reagens durch Agglutination.
Zur Erläuterung des bisher bekannten Agglutinationsverfahrens unter Verwendung eines Latex sei die unter der Nummer 65 04823
veröffentlichte holländische Patentanmeldung herangezogen. Diese %
Schrift betrifft ein Verfahren zur Bildung eines Reagens für imraunochemische Bestimmungen, bei dem man einen aus Latex gebildeten inerten Träger oder eine Suspension eines derartigen inerten
Träger· mit einem inerten Protein behandelt, wenach das Protein
durch ein Antigen oder einen Antikörper aktiviert wird. Dieses Verfahren gehört zum Stand der Technik für die Aufspürung von
Antigen-Antikörper-Reaktionen. Diese Erfindung schlägt gleichfalls
ein Reagens eines solchen Typs vor, jedoch unterscheidet sich der Träger, auf dem das Antigen befestigt ist, grundlegend von
dem bekannten Träger insofern, ale bei dem bekannten Träger ein
Latex verwendet wird, während die Erfindung als TrVger eine Öl-in-Wasser-Emulsion vorsieht. .
Die für die Aufspürung verschiedener Antikörper verwendeten herkömmlichen Reagensmittel eignen sich in der Tat für bestimmte
Anwendungsgebiete nicht, insbesondere 1. für selche, wo die Antikörper mit Stellen reagieren, die in diesen Reagentien nicht
vorhanden sind und 2. für solche, wo die Antikörper nur sehr wenig agglutinicren, wie dies bei der Hyperlipidämie der Fall ist.
Es war demnach erforderlich, neuartige Reagentien zu entwickeln,
die gemäß der Erfindung durch eine aktivierte Lipid-Emulsion ge- * )
bildet werden. . ·. . ■
y 209838/.178 \
Der Erfindung liegt demnach die Aufgabe zugrunde, ein allgemeines Verfahren zur Gewinnung aktivierter Lipid-Emulsionen zu entwickeln.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist ein Verfahren, das zu aktivierten Lipid-Einuleionen führt, die sich durch den Antigenaktivator wesentlich unterscheiden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die mittels eines derartigen Verfahrene gewonnenen aktivierten Lipid-Emulsionen.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Verwendung der neuartigen aktivierten Lipid-Emulsionen als Reagens für die Agglutination zur Entdeckung von Antikörpern in der Seroimmunologie.
Die Erfindung bezieht sich auch auf die Reagentien zur Agglutination der Lipid-Emulsion, die insbesondere zur Anzeige von
Antikörpern verwendet werden sollen, welche für die Hyperlipid-Ämie durch Eigenantikörper verantwortlich sind.
Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein allgemeines Verfahren zur Auffindung von Antikörpern gegen Substanzen, die sehr wenig
oder gar nicht wasserlöslich sind, d.h. im wesentlichen lipophi-Ie Substanzen.
Ferner liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Anzeige kleiner Antigenmoleküle (Haptene) mittels Verwendung
aktivierter Lipid-Emulsionen zu entwickeln.
Allgemein ausgedrückt, hat die Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung aktivierter Lipid-Emulsionen zum Gegenstand, das dadurch
gekennzeichnet ist, daß man in einem neutralen bei Raumtempera-
209836/1178
tür flüssigen Ol eine Emulsion mit einem Protein bildet, das
mindestens einen dem zu entdeckenden Antikörper entsprechenden Antlgenaktivator aufweist oder aus einem solchen besteht.
In einer besonderen Aueführungsfonn betrifft die Erfindung ein
Verfahren zur Gewinnung aktivierter LApid-Emulsionen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man ein Protein, wie das ß-Lipoprotein, das von Lipiden befreite Albumin und die Proteine des
normalen Serums in innigen Kontakt mit einem neutralen, bei Raumtemperatur flüssigen Ul bringt und durch aufeinanderfolgende
ZeJitrifugierungen und Reinigungen eine stabile Emulsion bildet.
Unter einen anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren
zur Gewinnung aktivierter Lipid-Emulsionen, das dadurch gekennzeichnet 1st, daß 1MB ein Protein, auf den Moleküle fixiert sind,
die durch die spezifischen Antikörper erkannt werden, in innigen Kontakt mit einem neutralen, bei Raumtemperatur flüssigen 01
bringt und durch aufeinanderfolgende Zentrifuglerungen und Reinigungen eine stabile Emulsion bildet.
Die Proteine, die zur Fixierung anderer Moleküle dienen, sind beispielsweise das ß-Lipoprotein und das Serumalbumin. Vorzugsweise wird das Albumin verwendet. Als Moleküle, die auf den Proteinen fixiert werden können, verwendet man vorzugsweise kleine
Moleküle (Haptene). Nachstehend werden hierzu zahlreiche Beispiele angeführt.
Das Verfahren nach der Erfindung wird im einzelnen anhand der nun folgenden Beschreibung erläutert.
209836/1178
X. Bildung der Proteine
j»
Die Protein« bildin einen wesentlichen Bestandteil der neuartigen
Lipid-Emulsionen. Nach dem Verfahren gerntß der Erfindung werden
diese Emulsionen durch die genannten Proteine aktiviert. Je
nach Art des verwendeten Proteins, d.h. je nach Art des Antigenaktivators,
können verschiedene aktivierte Lipid-Emulsionen
gewonnen werden. Dieses Merkmal ist von besonderem Interesse für die Auffindung der Huprfrlipidämie durch Eigenantikörper oder jeder
anderen Krankheit mit Antikörpern, wobei die Agglutination mit den Reagens geschieht, wenn die Emulsion das oder die dem
fraglichen Antikörper entsprechenden Antigene enthält»
Die Lipid-Emulsionen nach der Erfindung werden so durch die An-
Wesenheit von Proteinen an ihrer Oberfläche stabilisiert, welche
sie gleichzeitig aktivieren, indem »ie sie reaktiv mit einigen Antikörpern machen» Es ist mit den aktivierten Lipid-Emulsionen
möglich, die Anwesenheit von Antikörpern zu erkennen, die mit den Stellen oder Gruppen reagieren, die bei den für die Aktivierung
verwendeten Proteinen vorhanden sind.
Gemäß der Erfindung kann man zur Bildung der aktivierten Lipid-Emulsionen
Proteine verwenden, auf denen andere Moleküle fixiert sind, die geeignet sind, von spezifischen Antikörpern erkannt zu
werden.
Nachstehend wird zur beispielhaften Erläuterung die Bildung bestimmter
Proteine beschrieben, die zur Gewinnung aktivierter -Emulßionen geeignet sind.
209836/1178
Α» Bildung von ß-Lipoproteinen
In einer ersten Ausführungsform geht man vom ß-Llpoprotein
menschlichen oder tierischen Ursprunges aus. Im folgenden wird die Bildung menschlichen ß-Lipoproteins im einzelnen beschrieben. Man verwendet normales menschliches Serum (SNH), welches
mit gleicher Menge Veronalpuffer vom pH 5,5 vermischt wird. Man
erhält mit einer Lösung A Michaelis, die aus 29,43 g Veronalnatrium, 19,43 g Natriumacetat und destilliertem Wasser (Rest auf
1 1) besteht, den Veronalpuffer von pH 5,5, indem man 1 Volumenteil der Lösung A Michaelis mit 9 Volumenteilen physiologischen
Serums (Gehalt an NaCl 9 Gewichts-% und an NaN3 1 Gewichts-%)
mischt und den pH-Wert mit BCl einstellt.
•1· Ausfallung des fl-Lipoproteins
Die Mischung SHN-Veronalpuffer, pH-Wert 5,5 wird auf 1 : 2
verdünnt, und ihr wird ein gleiches Volumen einer ausfällenden Lösung zugegeben. Einem Volunenteil auf 1 : 2 verdünnter
Mischung wird also ein Volumenteil einer ausfällenden Lösung zugesetzt, die aus einem Volumenteil einer 50 gewichts-%*-igen
MgClj-Lösung und einen Volumenteil einer 4 gewichts-%-igen
Heparinlösung besteht. Nach gründlicher Vermischung läßt man
die Mischung eine Nachtbei 4° C stehen, gleit ab, gießt die
obenauf schwimmende Flüssigkeit weg und isoliert und wäscht das ausgefällte Produkt.
2. Waschen des Niederschlages
Das Waschen des Niederschlages geschieht in mehreren Stufen,
a) Man wäscht mit der unter 1. beschriebenen ausfällenden Lösung mehrmals, beispielsweise dreimal. Bei jeder Waschung
209836/1178
bringt man den Niederschlag in Suspension, schleudert und
schüttet die Waschlösung fort, um den gewaschenen Niederschlag zu isolieren.
b) Man nimmt den nach der Stufe a) erhaltenen Niederschlag mit dem Veronalpuffer mit dem pH-Wert 5,5/ der oben bei
1. definiert wurde, erneut auf, um die teilweise Auflösung des Niederschlages zu erzielen.
c) Man führt eine neue Fällung, Volumen pro Volumen, durch die ausfällende Lösung durch.
d) Man führt noch weitere Waschungen, etwa zwei, des nach c) gewonnenen Niederschlages durch und zwar mit Hilfe der ausfällenden Lösung und unter denselben Bedingungen wie bei a).
e) Man löst den in der Stufe d) gewonnenen, gewaschenen Niederschlag in einem Veronalpuffer vom pH-Wert 7,3 auf.
Der Veronalpuffer mit einem pH-Wert von 7,3 wird durch Vermischen von 1 Volumenteil der unter 1. definierten Lösung A Michaelis mit 9 Volumenteilen des oben beschriebenen physiologischen Serums erhalten und der pH-Wert mit
HCl eingestellt. Man erhält also am Ende der Stufe e) eine Lösung von ß-Lipoprotein in dem Puffer.
3· Reinigung des B-Lipoproteins
a) Man dialysiert die ß-LipoproteinelÖsung gegen einen 0,05 m
Phoephatpuffer, pH-Wert 6,5. Die mit der Abkürzung TPO4
bezeichneten Phosphatpuffer entsprechen der Formel PO4H2Na-H3O (Molekulargewicht 137,99).
b) Man bringt die Lösung auf eine DEAE-Zellulosesäule (Diä-
thylaminoäthylzelluloae), die mit 0,05 m TPO4, pH-Wert 6,5,
209836/1178
konditioniert ist. Das Ausv/aschen erfolgt mit 0,05 m TPO4,
pH-Wert 6,5, bis zur Ausschaltung der /'-Globuline (Gewinnung eines DO von 0 bis 280 nyu), sodann mit 0,15 m TPO4,
pH-Wert 6,5, was zur Auswaschung der ß-Lipoproteinfraktion führt.
c) Man dialysiert die Spitze des ß-Lipoproteins gegen das oben
beschriebene physiologische Serum.
Nach diesen verschiedenen Stufen erhält man das menschliche ß-Lipoprotein, das leicht bei einer Temperatur von etwa 4° C
konserviert werden kann.
Bei der obigen ausführlichen Beschreibung wurde von normalem menschlichem Serium auegegangen. Man kann letzteres aber auch
durch tierisches Serum ersetzen, je nach der vorgesehenen Verwendung für die aktivierte Lipid-Emulsion, die auf nachstehend
beschriebene Weise gewonnen wird.
Ferner können die verschiedenen geschilderten Stufen abgewandelt werden. Sie wurden in allen Einzelheiten geschildert,
um dem Fachmann ein leichtes Reproduzieren zu ermöglichen. Die einzige Bedingung ist, daß man am Ende einen Anteil gereinigter
ß-Lipoproteine gewinnt. Die unter 3. geschilderten chromatographiechen
Reinigungsmittel haben in der Praxis zu guten Ergebnissen geführt.
Bei einer anderen Ausführungsform geht man vom Albumin menschlichen
oder tierischen Ursprunges aus. Im folgenden wird im einzelnen die Bildung menschlichen entlipidisierten Albumins beschrie-
209836/1178
ben, es versteht sich jedoch von selbst, daß man letzteres durch
ein Produkt tierischen Ursprunges ersetzen kann, je nach der vorgesehenen Verwendung für die schließlich gewonnene aktivierte
Lipid-Emuliion.
Man verwendet beispielsweise menschliches Albumin, Fraktion V,
das von der Firma Calbiochem vertrieben wird. Die Entlipidisierung dieses Albumins geschieht durch gewöhnlichen Äther. Zu diesem Zweck bringt man Albumin in Pulverform in Behälter, die in
ein Eisbad von 0° C eingetaucht sind, und gibt etwa 5 Volumenteile Äther hinzu. Man rührt mehrere Male kräftig um, etwa dreimal, und läßt die Mischung zwischendurch jeweils einige Zeit ruhen (Ruhezeit beispielsweise 15 Minuten). Man schleudert und
schüttet den Äther fort, um das feste Produkt abzutrennen. Dieses Produkt wird wieder mit Äther aufgenommen, erneut wie vorher
gerührt, anschließend geschleudert und das Albumin isoliert. Dieser Vorgang kann mehrmals wiederholt werden, wie es bei Extraktionen durch Lösungsmittel üblich ist. Schließlich wird das Albumin im Vakuum getrocknet, und man gewinnt entlipidieiertes Albumin.
Auch bei dieser Herstellungsart sind Abänderungen denkbar. Man
kann etwa den Äther durch ein anderes Lösungsmittel oder Löaungsmittelgemiach ersetzen, die die Lipide aus dem Albumin extrahieren können, etwa Methylal, Chloroform oder andere Lösungsmittel.
1. .Mit dem ß-Lipoprotein kann man leicht auf Lipid-Emulsionen
Heparin und andere Mucopolysaccharide nach einem weiter unten beschriebenen Verfahren fixieren.
209836/1178
2. Mit Albumin sind die Möglichkeiten noch gröBer als mit ß-Lipoprotein. Man kann ohne Zwischenprodukt mit irgendeinem chemischen Mittel zahlreiche Moleküle auf Albumin fixieren. Diese Fixierung wird noch verstärkt, wenn das Albumin vorher gemäß dem unter B. beschriebenen Verfahren entlipidiaiert wird.
Sie erstreckt sich auf sehr unterschiedliche Körper:
a) Lipide: Man hat so phospholipidhaltiges Albumin hergestellt und verwendet (Mischung aus Phospholipiden/ Cephalin, Lecithin und Sphingomyelin). Man hat gleichfalls fettsäurehalti·
ge· Albumin verwendet (insbesondere Ölsäure).
b) Vitamine: Vitamin A-haltiges Albumin wurde gebildet und zur
Bildung entsprechend aktivierter Lipidemulsionen verwendet.
c) Medikamente, insbesondere Acetylsalicylsäure und ein Hypocholesterinmittel.
d) Mucopolysaccharide und insbesondere das Heparin, welches mittels Albumin auf den Emulsionen fixiert werden kann, wie
mittels ß-Lipoprotein.
Die Aufzählung dieser Substanzen betrifft diejenigen, für welche Versuche gemacht wurden, und ist keineswegs erschöpfend.
Es 1st sicher, daß das Anwendungsgebiet des Verfahrene nach der Erfindung sehr viel größer ist.
Dauer und Temperaturen der Inkubation der Antigene in Kontakt mit Trägerproteinen, wie Albumin oder β-Lipoprotein, können
je nach Art des zu fixierenden Antigens verändert werden, wobei die optimale Dauer zwischen 24 und 48 Stunden bei einer
* Tempeatur von 4° C liegt. Es ist möglich, diese Dauer durch
Erhöhung der Temperatur und durch Inkubation bei beispieleweise 37° C zu verringern.
209836/1178
Tm folgenden wird beispielsweise die Bildung heparinhaltiger
ß-Lipoproteine beschrieben.
Man verwendet die nach A oder den oben beschriebenen Varianten gewonnenen und gereinigten ß-Lipoproteine. Man gibt zu dan
ß-Lipoproteinen eine gleiche Menge Heparin, etwa Fournier-IIeparin zur intravenösen Einspritzung mit 5000/u/ml, und mischt sorgfältig. Man verwendet etwa 20 mg ß-Lipoprotein und 20 mg Heparin.
Man laßt die Mischung während einer bestimmten Dauer (30 Minuten) bei 4° C inkubieren und filtert dann auf eine Säule, die mit
Dextran-Gel versehen ist, welches unter der Bezeichnung "Sephadex G 200" von der Firma Soclete Pharraacie Uppsala vertrieben
wird und besondere Eigenschaften für die Gelfiltration hat. Sodann wird mit physiologischem Serum eluiert, und man erhält die
Spitze aus dem niedergeschlagenen "Sephadex" entsprechend
einer Fraktion, deren Volumen etwas größer als das der aufgebrachten Prob« ist. So erhält man heparinhaltige ß-Lipoproteine.
Wie bei den vorigen FSllan sind auch hier Abänderungen möglich,
insbesondere die Vewendung tierischer Produkte anstelle menschlicher Produkte, oder die Verwendung anderer Heparinarten, wobei
das einzige Ziel die Isolierung eines Proteinan£eiles auf der Basis heparinhaltiger β-Lipoproteine ist.
Ee sei bemerkt, daß die Bildung aktivierter Lipid-Emulsionen mit
andere Moleküle aufweisenden Proteinen nach dem gleichen Verfahren geschieht wie für den allgemeinen Fall mit ß-Lipoprotein
oder Albumin. Re genügt,mit besonderen Mitteln das als Fixierungsmittel dienende Protein herzustellen.
209836/1178
Die Fixierung des betrachteten Moleküls auf dem Protein kann entweder in wäßrigem Milieu geschehen, wenn es sich um eine wasserlösliche Substanz handelt (z.B. Heparin) oder in einem Zwei-Phasen-System,
wenn das Produkt in Wasser unlöslich ist. In diesem Pail verwendet man eines der beiden folgenden Verfahren:
Längerer Kontakt der wäßrigen Proteinlösung mit dem Produkt in trockener Form.
Längerer Kontakt des Proteins in wäßriger Lösung mit dem in einer anderen mit Wasser nicht mischbaren Phase löslich gemachten Produkt.
Das letztgenannte Verfahren wird vor allem bei der Bildung lipidhaltigen Albumins verwendet (Phospholipide; Fettsäuren,
fettlöellche Vitamine). Die für die zweite Phase verwendeten Lösungsmittel
sind Xther und Chloroform. Außerdem kann man Albumin,
das mit bestimmten Substanzen angefüllt ist, ausgehend vom Serum von Menschen oder Tieren, die sie absorbiert haben, bilden,
wobei die Transportfunktion des Albumins hier von Bedeutung ist.
Dies wurde z.B. für Albumin mit HypolipidHHedikaraent
verwirklicht. Nach der Fixierung wird die Proteinlösung entweder
durch Gelfiltration, Chromatographie oder durch Ausbreitung gewaschen
Sobald die mit "HilfsmolekUlen" oder "assoziierten Molekülen"
versehenen Proteine gewaschen und wieder in physiologischer Lösung aufgenomen 3ind, sind sie zur Bildung aktivierter Lipidemu1εionen
nach den beschriebenen allgemeinen Verfahren bereit.
p_^ 3ei einer wieder anderen Ausführungsform v/ird das normale
menschliche oder tierische Serum als solches zur Gewinnung aktivierter
Lipid-Emulsionen vewendet.
209836/1178
Zur Gewinnung der Emulsion verwendet man ein neutrales, bei
Raumtemperatur flüssiges öl tierischen oder pflanzlichen Ursprungs. Das handelsübliche Olivenöl liefert gute praktische Ergebnisse und ist leicht erhältlich.
Allgemein gesagt wird die Emulsion gebildet, indem bestimmte Mengen von Ol und Protein in physiologischer wäßriger Lösung
miteinander vermischt werden und das Gemisch der Wirkung von Ultraschall ausgesetzt wird.
Die genauen Mengen von Protein und 01 variieren je nach Art des
Proteins und können durch vorausgehende Versuche bestimmt werden. Nachfolgend werden erläuternde Beispiele angeführt. Im allgemeinen 1st es angebracht, Proteinkonzentrationen zu verwenden,
die bzüglich der Emulsion höher als 1500 Jf/ml sind. Mengen unterhalb von 15OO J/ml liefern ein nur mittelmäßiges Ergebnis
und eine schwierigere Konservierung der Emulsionen. Die optimalen Mengen von Proteinen für die Bildung der Emulsionen liegen
gewöhnlich zwischen 20OO und 3000 J(TmI, variieren jedoch je nach
Art des verwendeten Antigene. Man kann auch höhere Konzentrationen verwenden, wobei das überschüssige Antigen während der Waschung an der "Sephadex"- oder "Sepharos·"-Säule entfernt wird.
Nach Durchgang durch Ultraschall ist die Emulsion im allgemeinen
stabilisiert. Wenn jedoch Suspensionsteilchen sich während der
Konservierung später von der Flüssigkeit abtrennen, genügt es, die- Emulsion vor der Verwendung nur kurze Zeit der Wirkung von
Ultraschall auszusetzen.
209836/1178
Di· Emulsion ist im allgemeinen durch die Waschungen gereinigt.
Eine andere wirksame Reinigungsart ist die Gelfiltration. Die Emulsion kann bei Anwesenheit eines Bakterienwachstumshemmers
in einer Kunststoffumhüllung konserviert werden. Als Hemmstoff
wird Natriumarid NaN. vorzugsweise verwendet.
In der Emulsion können noch andere Zusatzstoffe verwendet werden.
Auch kann die Emulsion durch VorfSrbung sichtbar gemacht werden.
Im folgenden werden zur Erläuterung besondere Bereitungsarten
für aktivierte Lipid-Emulsionen beschrieben.
Die folgende Tabelle zeigt die Proportionen von Protein zu Olivenöl, mit denen praktisch aktivierte Lipid-Emulsionen zur Verwendung nach der Erfindung gewonnen werden. Von den unten aufgeführten Werten kann man jedoch geringfügig abweichen, insbesondere kann man die Menge an 01 variieren. Die Proteine der Tabelle I sind im obigen Abschnitt I definiert.
Protein·
Olivenöl
Aktivierte Lipid-Emuleion mit ß-Lipoproteinen
Aktivierte Lipid-Emulsion SHN (normales menschl. Serum)
Aktivierte Lipid-Emulsion mit entlipi dlsiertem Albumin
sion mit heparinhaltigen
reines menschl.
Serum (70.000
f/ml) Menge: 1 ml
entlipidieiertes
Albumin 20OO r/ml Menge; 1 ml
Spitze aus der Filtrierung auf "Sephadex G 2OO" mit einem 75,ul
Gehalt an ß-Lipopro- ' teinen von 1500 /
Menge: 1 ml
75,ul
25O,ul
200.Ul
209836/1178
Man unterzieht das nach Abschnitt A gewonnene ölgemisch der Wirkung von Ultraschall. Zu diesem Zweck taucht man eine UltraschaU-sonde in das das Gemisch enthaltende Rohr und behandelt während
einer dem Gemischvolumen proportionalen Zeit, im Verhältnis von 1 Minute pro ml Proteinlösung. Vorzugsv/eise ist eine Erhöhung
der Temperatur des Gemisches zu vermeiden, und man geht also so
vor, daß man die Außenwand des Rohres abkühlt, etwa indem man es in ein Eisbad von 0° C taucht. Die Wirkung des Ultraschalls mufl
es ermöglichen, alle öltropfen zu zerschlagen.
Nach dem eigentlichen Durchgang durch Ultraschall löst man die Emulsion entweder mit einem Phosphatpuffer oder mit physiologischem Serum auf. Der verwendete Phosphatpuffer liefert einen
pH-Wert von 7,3 und weist die folgende Zusammensetzung auf:
Nie vorher enthält das physiologische Serum pro Liter destillierten Wassers 9 g NaCl und 1 g NaN3.
Anders als die Emulsion aus entlipidisiertem Albumin werden die
vorstehenden Emulsionen zur Hälfte mit dem oben beschriebenen Phosphatpuffer aufgelöst, der seinerseits auf 1 : 5 in destillierten Wasser verdünnt wird. Die Emulsion aus entlipidisiertem Albumin wird nur auf 1 : 5 mit physiologischem Serum verdünnt. In
jedem Fall fügt man an der Oberfläche 0,5 ml destillierten Wassers bei und vermeidet dadurch seine Vermischung mit der emulgierten Phase.
209836/1178 original inspected
Danach folgt «ine Inkutation während etwa zehn Minuten bei mittlerer Temperatur, etwa Raumtemperatur oder im Wasserbad bei
37° C. Die dicksten Elemente schwimmen spontan nach oben und werden durch Abgießen entfernt. Im Falle der Emulsion mit B-Heparin,
welches an der Oberfläche schwimmt, muß man aufpassen, um nicht
die kleinen obenauf schwimmenden öltropfen wegzuschütten.
Zunächst wird die Emulsion einer Vorbehandlung unterzogen, die dazu dient, die bei der ültraechallbehandlung schlecht zerkleinerten, eine Haut bildenden groben Emulsionsteilchen zu eliminieren. Zu diesem Zweck bringt man auf die Oberfläche 0,5 ml
destillierten Wassers und schleudert mit geringer Geschwindigkeit (2500 Umdrehungen je Minute)« Sodann entfernt man die gebildete
Haut und wiederholt den Vorgang mehrere Male. Nach Entfernen der Häute konserviert man ein darunter schwimmendes Produkt, das die
eigentlich verwendbare Emulsion darstellt und der eigentlichen Waschung unterzogen wird.
Im folgenden wird die Waschung der Emulsionen auf der Basis, der
6-Lipoproteine, menschlichen normalen Serums und des ß-Heparin
beschrieben. Die von ilurer Haut befreiten Emulsionen werden mit
dem oben beschriebenen und in einer Verdünnung von 1 : 5 verwendeten Phoephatpuffer pH-Wert 7,3 gewaschen. Die Emulsionen werden auf 1 : 4 mit dem Puffer verdünnt und sodann unter Abkühlung
bei 10.000 Umdrehungen je Minute geschleudert. Die Gesamtschleuderdauer beträgt etwa 5 Minuten, und man überschreitet nicht die
Geschwindigkeit von 10.000 Umdrehungen je Minute, um die Agglutinatlon der Emulsionen und andere zweitrangige Phänomene zu
209836/1178
vermeiden. Nach jedem Schleudern gießt man ab und sammelt das
obenauf Schwingende; man löat mit dem auf 1 : 5 verdünnten Phosphatpuffer auf und homogenisiert durch einen erneuten kurzen
Ultraschalldurchgang. Man wiederholt diesen Vorgang viermal für die Emulsionen der Basis von ß-Lipoprotein und normalem menschlichem Serum und fünfmal für die Emulsionen mit heparinhaltigen
ß-Lipoproteinen. Es muß darauf geachtet werden, daß die Jeweiligen Ultraschalldurchgsnge zwischen jedem Waschvorgang kurz sind
(etwa 10 Sekunden).
Im folgenden wird die Waschung der Emulsionen auf der Basis von
entllpidisiertem Albumin beschrieben. Zu diesem Zweck unterzieht
man die ihrer Raut entledigten und einer Inkubation während 10 Minuten unterzogenen Emulsionen einer Gelfiltration. Die Filtrierung geschieht in einer mit "Sephadex G 200" ausgestatteten
SSuIe für die Gelfiltration. Man führt die Auswaschung durch physiologisches Serum entsprechend der obigen Definition durch
und konserviert den nicht ausgewaschenen Anteil.
Nach den verschiedenen Waschungen muß man die eventuell gebildete Haut wieder entfernen. Zu diesem Zweck kann man auf üblich«
Weise durch aufeinanderfolgende SchleudervorgSnge, etwa drei pro
Minuter vorgehen, mit 25po Umdrehungen je Minute, wobei 0,5 ml
destillierten Wassers auf die Oberfläche gebracht werden. In Abwandlung kann man auch in zwei Schichten bei erhöhter Geschwindigkeit schleudern, etwa zwei Minuten Schleudern mit 3500 Umdrehungen je Minute, wobei die gesamte Schleuderdauer dann 5 Minuten beträgt. Diese Vorgänge werden bei der Emulsion auf der Basis von heparinhaltigen ß-Lipoproteinen überflüssig, da diese
209836/1178
selbst an der Oberfläche schwimmen. Manchmal ist es notwendig,
diese Emulsion vor dem Gebrauch einer kurzen Ultraschallwirkung auszusetzen*
Schließlich sei noch ein vereinfachtes Verfahren zum Waschen der
Emulsionen erwähnt, das ebenfalls gute praktische Ergebnisse ergeben hat:
Nach dem Oltraschalldurchgang wird die Emulsion durch einminütiges Schleudern mit 2500 Umdrehungen je Minute von den groben
schlecht zerteilten und eine Haut bildenden Emulsionsteilchen be· freit.
Die eigentliche Waschung geschieht auf einer "Sepharose"- oder
"Sephadex^Säule (die je nach Art des Antigens ausgewählt wird), .welche mit 0,075 m Phoephatpuffer, pH 7,3, konditioniert ist.
Man erhält so eine austretende Spitze, die die aktivierte und gewaschene Lipid-Emulsion enthält.
Zum Auswaschen der "Sephadex1*- oder "Sepharose"-saule.n, die zum
Waschen der Emulsionen verwendet werden, nimmt man einen 0,075 m Phosphatpuffer, pH 7,3, oder physiologisches Serum. Es ist
gleichfalls möglich, diese Säulen mit einem 0,1 m Tris-Puffer,
pH *7 und 9, physiologfcchem Serumpuffer, pH-Wert 7 durch das
Tris, einem Borsäurepuffer, pH 7,8, einem Veronalpuffcr, pH 7,
oder einem anderen bei Auswaschungen gebräuchlichen Puffer auszuwaschen.
Vorzugsweise werden verdünnte Emulsionen verwendet. Man kann beispielsweise nach den im Abschnitt C beschriebenen Wa-
209836/1178
schlingen die Emulsionen auf 1 : 20 mit NaCl (physiologisches Serum
auf 1:5) oder mit einem Phosphatpuffer, pH-Wert 7,3, von phyBiologischer MolaritSt auf 1 : 5 verdünnen. Man erhält so eine
Emulsion, deren Transparenz schwach, jedoch ausreichend ist, wenn man eine Emulsionsprobe von etwa 50 ,ul entnimmt.
Die Emulsion kann bei einer Temperatur zwischen 4 und 20° C in Rühren oder Beuteln aus Kunststoff, beispielsweise Polyatyrolröhren,
aufbewart werden.
Bildet sich eine Haut an der Oberfläche, genügt es, die Emulsion zu dekantieren und die Haut wegzuwerfen. Ein Ultraschalldurchgang
vor dem Gebrauch ist nicht notwendig, außer bei den aktivierten Emulsionen auf der Basis von heparinhaltigen 0-Lipoproteinen.
In diesem letzten Pail muß die Wirkung des Ultraschalls unbedingt
kurz sein.
Sodann sind die aktivierten Llpid-Emulslonen in der Praxis als
Reagentien für Agglutination verwendbar. Im folgenden werden die Anwendungsgebiete und die Verwendbarkeit dieser Emulsionen beschrieben.
III, Anwendungsgebiete der aktivierten Lipjd-Emulsionen
Die aktivierten Lipid-Emulsionen nach der Erfindung werden zur
Untersuchung und Aufzeigung einer ganzen Reihe von Antikörpern
und serologischer Reaktionen verwendet, welche nicht mit den herkömmlichen
Reagentien ausfindig gemacht werden können, insbesondere rote Blutkörperchen oder die sensibilisierten Latex-Partikel.
Die aktivierten Lipid-Emulsionen werden also zur Aufspürung von Antikörpern bei zahlreichen Krankheiten verwendet, insbesondere
bei Hyperlipid&nie durch ^igenantikörper.
209836/1178
Bei den durch die Erfindung vorgese' enen Anwendungsgebieten ist
die Empfindlichkeit der Emulsionen auf die Anwesenheit von Antikörpern sehr hoch. Die Spezifität der Reaktionen ist immer leicht
kontrollierbar. Ferner erhält man besonders klare und reproduzierbare Ergebnisse.
Das Verfahren besteht allgemein gesagt darin, geringe und gleiche
Mengen einer aktivierten Llpid-Emulsion und des flüssigen Mediums,
das die aufzufindenden Antikörper enthält, zusammenzubringen.
Im folgenden werden als erläuternde Beispiele einige Durchführungeformen derartiger Versuche angeführt.
Die aktivierten Lipid-Emulsionen werden verwendet, nachdem sie
nach der unter IZ. D. beschriebenen Yfeise gewaschen und mit dem
Phosphatpuffer verdünnt sind, der seinerseits mit destilliertem
Wasser auf l : 5 verdünnt ist. Derartige Emulsionen werden dann
in Mikroröhrchen der Größenordnung von etwa 5O,ul gefüllt und
ergeben eine klare, jedoch schwache Opaleszenz,
Zur Durchführung der Versuche füllt man 5Ολι1 der mit Antigene*
aktivierten Emulsion auf den Boden der Rühren und gibt 50 λιΓ
eines flöseigen Mediums auf der Basis von physiologischem Serum
hinzu, welches die Antikörper enthält und durch Reihenverdünnungsversuche untersucht werden soll. Die Röhren werden dann eine Stunde bei 37° C und dann eine Stunde bei 4° C inkubiert. Danach werden sie bis zu einer sehr hohen Maximalgeschwindigkelt von
18.000 Umdrehungen je Minute sehr kurz geschleudert und mit dem Auge oder unter dem Mikroskop betrachtet.
209836/1178
Als Abwandlung inkubiert man die Gläser eine Nacht lang bei 4° C,
schleudert anschließend jedoch nicht. Da die Emulsionen stabil sind, können die Resultate später ohne Änderung abgelesen werden.
Die Ablesung der Röhren mit dem Auge geschieht durch Transparenz.
Die negativen Proben sind milchig und homogen. Die positiven Reaktionen zeigen sich, wenn das Glas völlig klar ist und an der
Oberfläche eine agglutinierte Haut zeigt.
Zur Ablesung mit dem Mikroskop entnimmt man die an der Oberfläche der Gläser gebildete Haut und betrachtet sie unter dem Phasenkontrast-Mikroekop, indem man sie zwischen Objektträger und
Deckglas legt. Die negativen Proben zeigen kleine freie und bewegliche Kugeln. Die positiven Proben zeigen mehr oder weniger
.dicke Agglutinate. Die Ablesung besteht also darin, die Agglutinate und die mehr oder weniger vollständige Verminderung der
freien Kugeln zu beobachten. Im allgemeinen is,t diese Ablesung sehr genau.
Nun wird ein vereinfachtes Ableseverfahren erläutert, welches gleichfalls bei den Versuchen verwendet werden kann.
Auf ein Glasplättchen wird ein Tropfen Serum oder des zu prüfenden Stoffes gebracht. Man fügt sodann einen Tropfen aktivierter
Lipid-Emulsion hinzu und vermischt mit Hilfe eines Rührstabes.
Man beobachtet sofort eine makroskopische Reaktion. Ein positives
Ergebnis zeigt sich durch Agglutination beliebiger Form der aktivierten Lipid-Partikel. Bei einem negativen Ergebnis fehlt die
Ägg-lutin&tion.
209836/1178
Die Erfindung ist keineswegs auf die obigen spezifischen Durchführung sformen beschränkt, die nur als Erläuterung angeführt
wurden. So kann das Verfahren nach der Erfindung nicht nur zum Aufspüren der Hyperlipidämie durch Eigenantikörper dienen» sondern ebenfalls zum Aufspüren gegen die Antigene von Lipid-Emulsionen, die nicht wasserlösliehe Substanzen enthalten, aktiver
Antikörper.
Man kann auf diese Weise eine große Anzahl von Antikörpern durch
Fixierung in Wasser unlöslicher Antigene aufspüren, entweder direkt oder über Proteine* Das Verfahren nach der Erfindung kann
auch zur Untersuchung natürlicher Antigene verwendet werden, die wenig oder gar nicht ausfallen. Eine interessante Anwendung der
Erfindung besteht auch in einem Titrationsverfahren der Antikörper.
Beispielshalber werden nachstehend weitere Arten der Bildung von Lipid-Emulsionen beschrieben, um die Allgeneingültigkeit der
Anwendung des Verfahrens nach der Erfindung aufzuzeigen. Die nachstehenden Bildungsweisen basieren auf der oben beschriebenen
Grundlage.
1. Durch et-Lipoproteine aktivierte Llpld-Emulsionen
Die Bildung und Reinigung νοηΛ-Lipoproteinen, ausgehend von
normalem menschlichem Serum, geschieht nach der in ä&m Artikel "Purification de I1alpha-1-lipoproteine du serum" von
J.L. Beaumont und N. Lemort, Annalen der "Biologie Clinique",
1969, 27 (237 - 245) beschriebenen Weise.
209836/1178
Die Lösung von gereinigten d-Lipoproteinen in einer Konzentration
von etwa 3000 jyml und von Olivenöl im Verhältnis
0,1 ml pro ral der d-Lipoproteinlösung.
Das Gemisch wird eine Minute pro ml Ultraschall ausgesetzt,
was eine nicht gewaschene Emulsion aus cl-Lipoproteinen ergibt.
2, Mit Desoxyribonucleinsäure (ADN) aktiverte Llpid-Emulsionen
Man verwendet eine handelsübliche Desoxyribonucleinsäure in einer Konzentration von etwa 3000 JfVmI. Man führt eine Vorinkubation
des ADN mit entlipidieiertem menschlichem Albumin in einer Konzentration von etwa 2000 JYmI durch in Lösung in
einem physiologischen Puffer von physiologischem pH und physiologischer Molaritat, Die zwischen 24 und 48 Stunden dauernde
Inkubation geschieht bei 4° C.
Man gibt zu dem ADN-Älbumin-Gemiech 0,1 ml Olivenöl. Das Gemisch
wird 1 Minute pro ml der Lösung Ultraschall ausgesetzt, was eine nicht gewaschene ADN-aktivierte Lipid-Emulsion ergibt.
. ,^*m
3. Mit Streptolysin aktivierte Lipid-Emulsion Vorinkubation: Eine handelsübliche gereinigte Streptolysinlösung
mit einer Konzentration von etwa 3000 //ml wird während
24 bis 48 Stunden bei 4° C mit einer ß-Lipoproteinlösung von etwa 2OOO f/ml inkubiert.
Man g^tbt zu der Lösung aus Streptolysin und ß-Lipoprotein
nach der Inkubation 0,1 ml Olivenöl pro ml der Lösung. Das
209836/1 178
Gemisch wird 1 Minute pro ml der Lösung Ultraschall ausgesetzt, was ein· nicht gewaschene mit Streptolysin aktivierte
Lipid-Enml^ion ergibt.
4. Mit r-Clobuim aktivierte Lipid-Emulsion
Zu einer handelsüblichen ^-Glöbttlin-Lösung mit einer Konzentration von etwa 3000 Jf/ml gibt man Olivenöl im Verhältnis
0,1 ml pro ml der Lösung. Das Geraisch wird 1 Minute pro ml
Lösung Ultraschall ausgesetzt, was eine mit ^-Globulin aktivierte Lipid-Emulsion ergibt.
Nach dem Ultraschalldurchgang werden die Emulsionen 10 Minuten bei 37° C inkubiert. Man schleudert 1 Minute mit 2000 Umdrehungen je Minute, um die gröbsten Partikel auszusondern,
und wirft die überflüssige Haut fort. Das darunter Schwimmende wird gewaschen, entweder durch Schleudern oder durch Filtern auf eine "Sephadex G 200"- oder "Sepharose"-Säule, die
mit 0,075 m Phosphatpuffer, pH-Wert 7,3, oder physiologischem
Serum eluiert ist.
5. Mit Gewebe-Antigenen aktivierte Lipid-Emulsion
Nach Entnahme eines Organe führt man eine Perfusion mit physiologischem Serum durch, um das Blut des Tieres zu eliminieren. Man zermalmt anschließend ein Organtoil (Leber bei
0° C in physiologischem Serum und schleudert. Man nimmt das obenauf Schwimmende und filtert es auf einem Durieux-Filter,
was eine dicke und stark proteinhaltige Flüssigkeit ergibt. • Man bereitet eine Lipid-Emulsioh'mit diesem Filtrat und erhXlt
eine Emulsion, indem man zu 1 ml Filtrat 0,1 ml Olivenöl gibt.
209836/1178
Die opitimale Konzentration des Filtrates liegt bei etwa 15 mg/ml. Man kann eine Emulsion ausgehend von einer Konzentration von 5 mg Proteinen pro ml erhalten. Die Konzentration
der Emulsion steigt mit der Konzentration des zermalmten Produktes. Bei 40 mg pro ml erzielt man eine sehr konzentrierte
Lösung.
Wie bei den anderen Präparationen dauert der Ultraschalldurchgang 1 Minute pro ml der zu eraulgierenden Lösung.
Inkubation und Waschen auf der Säule geschieht wie vorstehend beschrieben.
Die obigen zusätzlichen Beispiele 1 bis 5 können gemäß den
allgemeinen Angaben der Beschreibung abgewandelt werden. Es ist beispielsweise auch möglich, mit Streptolysin aktivierte
Emulsionen zu erhalten, ohne vorher mit ß-Lipoprotein zu inkubieren.,
Ebenfalls kann man ^-Globulin-Emulsionen nach Inkubation unter Anwesenheit von Albumin erhalten; das Albumin und das
ß-Lipoprotein fungieren dann als Träger für die Fixierung der Antigene auf der Emulsion.
Das vorstehende Verfahren kann auch zur Herstellung von Emulsionen verwendet werden, welche mit Antigenen aus gutartigen
oder bösartigen Geschwülsten entnommen sind.
Es ist gleichfalls möglich, Emulsionen mit Antigenen Virenursprunges zu aktivieren.
Es sei besonders hingewiesen auf die besondere wichtige Funk-* tion, die ein Protein, etwa das Albumin, im Verfahren nach der
209836/1176
Erfindung spielt. Gemäfi der Erfindung wird das Albumin selbst
als Antigen oder als TrMger für ein Antigen verwendet, dank
seiner Eigenschaft, Heptene zu fixieren, die ohne es nicht in die Emulsion integriert werden könnten. Bei einem bereits
bekannten Verfahren, etwa dem in der.holländischen Anmeldung
Nr. 65 04 823 beschriebenen Latex-Verfahren, wird das benutzte Albumin zur Neutralisierung des inerten Trägers verwendet,
der aus einem Latex besteht.
Die Erfindung kann auf dem Gebiet der Ablesung noch perfektioniert werden, ohne dafl diese Perfektionierungen den Rahmen der
Erfindung sprengen. Die Ablesung kann etwa durch Verwendung eines Anti-Antikurper-Semras sensibilisiert werden. Auch kann
die Ablesung durch Einsat» eine· PartikeliÄhlers automatisiert werden.
209836/1178
Claims (30)
1. Verfahren zur Gewinnung aktivierter Lipid-EmuIsionen zur Verwendung
als Reagens zur Auffindung von Antikörpern, dadurch gekennzeichnet,
daß man in einem neutralen, bei Raumtemperatur flüssigen öl eine Emulsion mit einem Protein bildet, welches mindestens
einen dem aufzufindenden Antikörper entsprechenden Antigenaktivator enthält oder aus wenigstens einem solchen besteht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein, wie das ß-Lipoprotein, das d-Lipoprotein, entlipidisiertee
Albumin, Streptolyein, die Jf-Globuline, Proteine aus Gewebeextraktion
oder Proteine normalen Serums, in innigen Kontakt mit einem neutralen, bei Raumtemperatur flüssigen öl bringt und
durch aufeinanderfolgende Ultraschallbehandlungen, Zentrifugierungen
und Reinigungen eine stabile Emulsion bildet.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Protein, auf dem Moleküle fixiert sind, die geeignet sind, von
spezifischen Antikörpern erkannt zu werden, in innigen Kontakt mit einem neutralen, bei Raumtemperatur flüssigen 01 bringt und
durch aufeinanderfolgende Ultraschallbehandlungen, Bentrifugierungen
und Reinigungen eine stabile Emulsion bildet.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet,
daß man Proteine menschlichen oder tierischen Ursprunges verwendet.
5. Verfahren nach einen der Anrjprüche ι bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß man P-Lipoproteine aus Serum verwendet, die durch Chro-
209836/1 178
matographie auf einer SSuIe und entsprechendes Eluieren mittels
eines Phosphatpuffers gereinigt sind.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man Albuminmoleküle verwendet, die durch ein Lösungsmittel, wie normalen Äther, entlipidisiert wurden.
7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man
ß-Lipoproteine oder entlipidisiertes Albumin verwendet, auf welche andere, den aufzuspürenden Antikörpern entsprechende Moleküle
(Heptene) fixiert sind.
8. Verfahren nach Anspruch 3 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daB
man Moleküle verwendet, die aus den Lipiden, Phospholipiden und deren Genischen, Cephalin, Lecithin, Sphingomyelin oder Fettsäuren, einschließlich Ölsäure, ausgewählt sind.
9. Verfahren nach Anspruch 3 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß
die fixierten Moleküle Vitamine sind, einschließlich Vitamin A, die insbesondere auf entlipidisiertem Albumin fixiert sind.
10. Verfaren nach Anspruch 3 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß Medikamente auf den entlipidisierten Albumin fixiert sind, insbesondere Aoetylsalicylsäure oder ein Hvpocholesteroleniemlttel.
11. Verfahren nach Anspruch 3 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die
fixierten Moleküle Mucopolysaccharide, wie Heparin, sind.
12. Verfahren nach Anspruch 3 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß
nan Desoxyribonucleinsäure (ADN), Streptolysln,
Antigene aus gutartigen oder bösartigen Geschwulsten oder Antigene von Virusursprung auf dem Protein fixiert, das in die Emulsion gegeben wird.
209836/1178
13. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man wasserlösliche
Moleküle verwendet, etwa Heparin, in welchem Fall die Fixierung auf dem Protein hergestellt wird, indem das Protein
In wäßrigen Milieu in engen Kontakt mit den genannten Molekülen
gebracht wird.
14. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man wasserunlösliche
Moleküle verwendet, in welchem Fall die Fixierung durch längeren Kontakt einer wäßrigen Proteinlösung mit dem in
trockener Form verwendeten zu fixierenden Produkt hergestellt wird.
15. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man wasserunlösliche
Moleküle verwendet und dann die Fixierung durch längeren Kontakt einer wäßrigen Proteinlösung mit einer Lösung des
zu fixierenden Produktes in einer mit Wasser nicht mischbaren Phase herstellt.
16. Verfahren nach einem der Ansprüohe 13 bis 15, dadurch gekennzeichnet,
daß die Proteinlösung, nachdem das Protein und die zu fixierenden Moleküle miteinander in Kontakt gebracht sind, durch Gelfiltration
, Chromatographie oder Aussalzung gewaschen wird, dann wieder in physiologisch· Lösung gebracht wird, und daß die Proteine,
auf welche die Moleküle fixiert wurden, dann für die Herstellung der aktivierten Lipid-Emulsionen verwendet werden.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet,
daß man direkt Serum oder Albumin von diesem Serum verwendet.
18. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein
öl tierischen oder pflanzlichen Ursprunges, wie Olivenöl, verwendet.
209 836/1 1.7 8
19. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dosierte Mengen von 01 und Protein in physiologischer Lösung ver
mischt und das Gemisch Ultraschallwirkung aussetzt, wobei die Konzentration der Proteine in der Emulsion vorzugsweise höher
als 1500 Jf/ml, bezogen auf die Emulsion, ist und insbesondere
2000 bis 3000 y/ml betrügt.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß nan die
Emulsion durch Waschungen oder durch Gelfiltration reinigt.
21. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die
Lipid-Emulslon in zwischen 4° C und 20° C aufbewahrten Plastikhüllen verpackt.
22. Aktivierte Lipld-Emulsionen, dadurch gekennzeichnet, daß sie
aus einer Emulsion als öl, beispieleweise Olivenöl, in Wasser
mit einem Protein an der Oberflache, das mindestens ein aktivierendes Antigen aufweist oder aus einem solchen besteht, besteht.
23. Lipid-Emulsion nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß sie
ein Protein enthält, das mindestens einen dem aufzuspürenden Antikörper entsprechenden Antigenaktivator aufweist oder bildet
und menschlichen öder tierischen Ursprunges ist.
24. Lipid-Emulsion nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß die
Konzentration des Proteins in der Emulsion höher als 1500 f/iul,
bezogen auf die Emulsion, ist, insbesondere zwischen 2000 und 30OO JYmI liegt. N
25. Lipid-Emulsion nach Anspruch 23 und 24, dadurch gekennzeichnet,
daß das Protein ein ß-Lipoprotein, ct-Lipoprotein, Streptolysin,
^-Globulin, Protein aus Gev/ebeextrakten, Protein des normalen
20983 6/1178
Serums, entlipidisiertes Albumin oder ein anderes analoges Protein
ist, das einen Antigenaktivator bildet.
26. Lipid-Emulsion nach Anspruch 23 und 24, dadurch gekennzeichnet,
daß das Protein Moleküle trägt, die geeignet sind, von spezifischen Antikörpern erkannt zu werden.
27. Lipid-Eraulsion nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das
si Protein ein ß-Lipoprotein oder entlipidr^rtes Albumin ist, wobei
die fixierten Moleküle unter den Lipiden, wie den Phospholipiden und deren Gemischen, Cephalin, Lecithin, Sphingomyelin, oder den
Fettsäuren, einschließlich der ölsäure, den Vitaminen, einschließ lich Vitamin A, Medikamenten, wie Acetylsalioylsäure oder Hypocholesteroläraiemitteln,
Mucopolysaccharide^, wie Heparin, Desoxyribonucleineäure
(ADN), Streptolysin, Jf-Globulin, den Antigenen
aus gutartigen oder bösartigen Geschwulsten oder Antigenon von
Virusursprung, ausgewählt sind,
28. Lipid-Emulsion nach Anspruch 22 bis 27, dadurch gekennzeichnet,
daß sie gewaschen und mit einem Phsophatpuffer verdünnt ist und,
wenn sie in Mikrogläser gefüllt ist, Opaleszenz aufweist.
29. Verwendung einer aktivierten Lipid-Emulsion nach Anspruch 22 bis
28 zur Aufdeckung von Krankheiten durch Eigenantikörper, etwa der
Hyperlipidämie.
30. Verwendung einer aktiven Lipid-Emulsion nach Anspruch 22 bis 28
zur Titration von Antikörpern.
209836/1178
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SU782588248A SU923355A3 (ru) | 1972-02-25 | 1978-03-02 | Способ контактной сварки термопластичных труб враструб и устройство дл его осуществлени |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
FR7106658A FR2127174A5 (de) | 1971-02-26 | 1971-02-26 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2208898A1 true DE2208898A1 (de) | 1972-08-31 |
Family
ID=9072548
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19722208898 Pending DE2208898A1 (de) | 1971-02-26 | 1972-02-25 | Verfahren zur Gewinnung von aktivierten Lipid-Emulsionen zur Verwendung als Reagens in der Seroimmunologie |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US3849546A (de) |
CH (1) | CH538693A (de) |
DE (1) | DE2208898A1 (de) |
ES (1) | ES400155A1 (de) |
FR (1) | FR2127174A5 (de) |
GB (1) | GB1374532A (de) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4193983A (en) * | 1978-05-16 | 1980-03-18 | Syva Company | Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith |
-
1971
- 1971-02-26 FR FR7106658A patent/FR2127174A5/fr not_active Expired
-
1972
- 1972-02-22 CH CH252672A patent/CH538693A/fr not_active IP Right Cessation
- 1972-02-23 US US00228741A patent/US3849546A/en not_active Expired - Lifetime
- 1972-02-23 GB GB834672A patent/GB1374532A/en not_active Expired
- 1972-02-25 DE DE19722208898 patent/DE2208898A1/de active Pending
- 1972-02-25 ES ES400155A patent/ES400155A1/es not_active Expired
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US3849546A (en) | 1974-11-19 |
FR2127174A5 (de) | 1972-10-13 |
CH538693A (fr) | 1973-06-30 |
GB1374532A (en) | 1974-11-20 |
ES400155A1 (es) | 1975-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
DE3650513T2 (de) | Verzögerter immunologischer Test in fester Phase | |
DE60120487T2 (de) | Verfahren zur detektion von vitamin d metaboliten | |
DE3103826C2 (de) | Immuno-Testverfahren | |
DE69209935T2 (de) | Verfahren und magnetische Vorrichtung zur immunologischen Analyse von Festphasen | |
DE68927406T2 (de) | Verwendung zweier Molekülarten um Liposomen mit einer positiven Ladung auszustatten | |
CH655246A5 (de) | Verfahren zur herstellung von partikeln aus lipoidloeslichen stoffen. | |
DE1648999C3 (de) | Verfahren zur immunochemischen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern | |
DE2628468C2 (de) | Verfahren zur Färbung von Basophilen und Reagens zur Durchführung dieses Verfahrens | |
DE2806430A1 (de) | Verfahren zum nachweis und zur bestimmung des lipoproteins lp-x im serum | |
DE2900546B2 (de) | Verfahren zum Standardisieren einer markierten Bindungskomponente, welche in einem spezifischen Bindungstest-Verfahren mit einem Liganden reagiert, gegen einen Liganden-Referenzstandard und Verwendung der standardisierten markierten Bindungskomponente in spezifischen Bindungstest-Verfahren | |
DE3105555C2 (de) | ||
DE60108316T2 (de) | Medizinische Kit und Methode zur Bestimmung eines Arzneimittels | |
DE2650502C3 (de) | Herstellung von Liposomen welche Arzneistoffe enthalten | |
DE3875184T2 (de) | System und verfahren fuer eine visuelle probe einer zu bestimmenden substanz. | |
DE2850950C3 (de) | Verwendung von nativem oder thermisch modifiziertem Cytochrom c als Stabilisator für ein immunochemisches Meßreagens, immunochemisches Meßreagens sowie Pufferlösung zur Probenverdünnung bei immunchemischen Meßverfahren | |
DE2714751C2 (de) | ||
DE2208898A1 (de) | Verfahren zur Gewinnung von aktivierten Lipid-Emulsionen zur Verwendung als Reagens in der Seroimmunologie | |
DE3887727T2 (de) | Partikelstabilisierte Epitope zur Standardisierung und Kontrolle von Immuntests. | |
DE2742835A1 (de) | Antigenfraktionen von schistosoma mansoni-eiern, geeignet fuer die untersuchung von schistosomiasis | |
DE3787826T2 (de) | Einzelnes flüssiges Reagens für Tests. | |
DE2618449A1 (de) | Serumdiagnostische zusammensetzung | |
DE2243237A1 (de) | Nachweis der immunreaktion gegenueber krebs | |
DE2517219B2 (de) | Verfahren zur gewinnung eines hypothyreoten kontrollserums, danach hergestelltes hypothreotes kontrollserum und verwendung desselben | |
DE4103727A1 (de) | Zur spezifischen erkennung eines antigens des stratum corneum der menschlichen epidermis befaehigte antikoerper, ihre herstellung und ihre anwendung, insbesondere als traeger von arzneimittelwirkstoffen | |
DE3437517C2 (de) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
OHA | Expiration of time for request for examination |