DE3875184T2

DE3875184T2 - System und verfahren fuer eine visuelle probe einer zu bestimmenden substanz.

Info

Publication number: DE3875184T2
Application number: DE8888307028T
Authority: DE
Inventors: Jeffery Hayden Bruton; Stephen James Lovell
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1987-08-06
Filing date: 1988-07-29
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2008-07-30
Also published as: AU605615B2; AU2056088A; CA1305664C; DK435188A; EP0302673B1; EP0302673A1; DE3875184D1; ATE81405T1; FI883671A0; ES2035299T3; JPS6466562A; GR3006002T3; DK435188D0; MY103592A; FI883671A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf eine Prüfung für einen zu bestimmenden Liganden (Analyt) und auf bei einer solchen Prüfung verwendete Produkte. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf eine Festphasenprüfung.
Bei einer Festphasenprüfung ist es bekannt einen bekannten Analyten (zu bestimmende Substanz) durch eine sogenannte Sandwichprüftechnik zu bestimmen. Bei einer solchen Sandwichprüfung wird ein Bindemittel für den zu bestimmenden Liganden (Analyt) auf einem festen Träger abgestützt, wobei im Zuge der Prüfung ein Komplex eines solchen abgestützten Bindemittels, des Analyten und eines Markierungsmittels gebildet wird und das Markierungsmittel aus einem Bindemittel für den Analyten besteht, welcher mit einer erkennbaren Etikette markiert ist.
In der auf das Institute Pasteur übertragenen Französischen Patentschrift Nr. 2,523,311 ist eine indirekte Sandwichprüfung beschrieben, bei welcher ein Komplex von Bindemittel, Analyten, Kupplungsverbindung aus einem Bindemittel für den Analyten und Albumin und einem aus markiertem Antialbumin bestehenden Markierungsmittel gebildet wird. Zu in dieser Patentschrift beispielsweise genannten Etiketten gehören unter anderen Enzyme, Fluorochrome, radioaktive Elemente, rote Blutkörperchen und Lectine.
In der EP-A-154 749 ist ein Verfahren zum Prüfen eines Analyten (zu bestimmende Substanz) beschrieben, bei welchem ein fester Träger, ein Bindemittel für einen Analyten und ein Markierungsmittel zwecks konkurrenzierender Verbindung mit dem Analyten abstützt und eine sichtbare teilchenförmige Etikette aufweist. Bei dieser konkurrenzierenden Bindungsprüfung sind die Ergebnisse visuell erkennbar.
In der US-Patentschrift 4,582,810 ist eine Suspension von diagnostischen Teilchen, welche Antikörpermolekülse aufweisen, die an einen Polymerkern aus einem Carboxylatderivat gebunden sind, beschrieben. Antikörper werden an den Kern über eine Avidin- Biotin-Brücke gebunden. Die Teilchen sind in einem Agglutinationstest brauchbar.
Die vorliegende Erfindung ist darauf gerichtet eine verbesserte indirekte Sandwichprüfung zum Bestimmen eines Analyten zu schaffen, wobei ein eine teilchenförmige Etikette enthaltendes Markierungsmittel verwendet wird.
In Übereinstimmung mit der Erfindung wird eine Prüfung geschaffen, bei welcher die zu bestimmende Substanz (Analyt) (qualitativ und/oder quantitativ) durch eine indirekte Sandwichprüftechnik bestimmt wird, wobei im Zuge der Prüfung ein Komplex aus (i) einem Bindemittel für den auf einem festen Träger abgestützten Analyten (zu bestimmende Substanz), (ii) dem Analyten, (iii) einer Kupplungsverbindung aus einem für den Analyten spezifischen Bindemittel und einem Liganden und (iv) einem Markierungsmittel aus einem Bindemittel für den Liganden der mit einer sichtbaren teilchenförmigen Etikette etikettierten Kupplungsverbindung gebildet wird, wobei die teilchenförmige Etikette ein Liposom ist, welches einen erkennbaren Marker enthält. Zumindest jener Teil des festen Trägers, auf welchem das Bindemittel abgestützt ist, besitzt einen Oberflächenbereich (Fläche zu Einheitsgewicht an Material) solcherart, daß das Bindemittel auf der Prüffläche in einer solchen Konzentration (Gewicht pro Flächeneinheit) abgestützt werden kann, daß das Markierungsmittel unter den Prüfbedingungen sichtbar ist. Der hier verwendete Begriff "sichtbar" bedeutet, daß die Etikette ohne die Verwendung von Geräten, also mit dem bloßen Auge gesehen werden kann. Eine solche Prüfung wird im vorliegenden Zusammenhang als "sichtbare indirekte Sandwichprüfung" oder "sichtbare Prüfung" bezeichnet.
Die bei der sichtbaren Prüfung verwendete Prüffläche ist im allgemeinen aus einem Celluloseester gebildet, wobei Nitrocellulose außergewöhnlich gute Ergebnisse liefert. Es ist darauf hinzuweisen, daß mit dem Ausdruck "Nitrocellulose" auf Salpetersäureester der Cellulose Bezug genommen wird, welche Nitrocellulose allein oder Mischester von Salpetersäure und anderen Säuren und insbesondere aliphatischen Carbonsäuren mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen sein können, wobei Essigsäure bevorzugt ist. Solche feste Träger, welche von mit Salpetersäure allein oder mit einem Gemisch aus Salpetersäure und einer anderen Säure wie Essigsäure veresterter Cellulose gebildet sind, werden häufig als Nitrocellulose-Papier bezeichnet.
Obzwar Nitrocellulose ein bevorzugtes Material für die Prüffläche ist, können selbstverständlich auch andere Materialien verwendet werden, deren Oberfläche ausreicht das Bindemittel in einer oben angegebenen Konzentration abzustützen. und die somit für solche Prüfflächen verwendet werden können.
Im allgemeinen wird bei der sichtbaren Prüfung eine Prüffläche verwendet, deren Oberfläche eine solche ist, daß das Bindemittel in einer Konzentration von zumindest 1 ug/cm² (im allgemeinsten Fall in einer Konzentration von zumindest 10 ug/cm²) und vorzugsweise in einer Konzentration von zuinindest 40 ug/cm² abzustützen.
Entsprechend einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird somit eine Sandwichprüfung geschaffen, bei welcher ein Sandwich aus Träger-Bindemittel-Analyt-Kupplungsverbindung- -Markierungsmittel gebildet wird, wobei die Kupplungsverbindung aus zwei Liganden gebildet wird und hiebei einer der Liganden ein Bindemittel für den Analyten ist und der andere Ligand an das Markierungsmittel gebunden ist.
Die Kupplungsverbindung enthält einen Binder für den Analyten, welcher in der Regel ein Antikörper gegenüber dem Analyten (polyclon und/oder monoclon) ist und einen Liganden für welchen ein Binder (Bindemittel) vorliegt.
Der Ligand der Kupplungsverbindung kann irgendeiner aus einer Vielzahl von Liganden sein, für welchen ein Bindemittel existiert. So kann beispielsweise der Ligand der Kupplungsverbindung Biotin, Dinitrophenol, Trinitrophenol, Fluorescein-isothiocyanat, Fluroesceinisocyanat, Peroxydase, alkalische PhosPhatase, Albumin, Ferritin usw. sein. Der Ligandenteil der Kupplungsverbindung ist im allgemeinen ein Hapten.
Die Kupplungsverbindung kann dadurch hergestellt werden, daß ein Bindemittel für den Analyten mit einem geeigneten Liganden nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden, beispielsweise dadurch kojugiert wird, daß eine geeignete Kupplungs- oder Abstandshalterverbindung mit zwei funktionsfähigen reaktionsfähigen Gruppen verwendet wird, von welchen eine in der Lage ist mit einer funktionellen Gruppe des Bindemittels verknüpft zu werden und die zweite in der Lage ist mit einer funktionellen Gruppe des geeigneten Liganden verknüpft zu werden. In einigen Fällen mag es möglich sein das Bindemittel direkt mit dem Liganden unter Bildung einer Kupplungsverbindung zu kuppeln oder zu konjugieren, indem beispielsweise eine reaktionsfähige funktionelle Gruppe des Bindemittels mit einer reaktionsfähigen Gruppe des geeigneten Liganden gekuppelt wird.
Das Markierungsmittel enthält ein Bindemittel für den Liganden der Kupplungsverbindung und ist vorzugsweise ein Antikörper (monoclon oder polyclon). Im Zuge der Prüfung wird somit das Markierungsmittel von der Kupplungsverbindung gebunden, die Kupplungsverbindung vom Analyten gebunden und der Analyt vom abgestützten Bindemittel auf dem festen Träger gebunden.
Entsprechend einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Reagenzsatz geschaffen, welcher ein Prüfsubstrat der oben beschriebenen Art mit einem auf der Prüffläche des Substrats abgestütztem Bindemittel, eine Kupplungsverbindung der oben beschriebenen Art und ein Markierungsmittel der oben beschriebenen Art aufweist, welches ein Bindemittel für den Liganden der Kupplungsverbindung enthält, welche mit einer sichtbaren teilchenförmigen Etikette etikettiert ist. Der Reagenzsatz kann auch Vergleichsstandards (Proben mit bekannten Konzentrationen des Analyten), Puffer, Waschlösungen u.dgl. enthalten. Die Reagenzien können in geeigneten Behältern, z.B. Proberöhren, enthalten sein.
Wie oben angegeben, wird beim Herstellen des Markierungsmittels für die sichtbare Prüfung das Bindemittel für den Liganden mit einer teilchenförmigen Etikette etikettiert, welche ein Liposom ist, welches ein annehmbares Markierungsmittel enthält.
Wie auf dem Fachgebiet bekannt, können Liposome aus einer Vielzahl von Lipiden, einschließlich Phospholipiden, Glycolipiden, Steroiden, relativ langkettigen Alkylestern wie beispielsweise Alkylphosphaten, Fettsäureestern, Lecithin, Fettsäureaminen u.dgl. hergestellt werden. Es kann ein Gemisch aus fettartigen Materialien, beispielsweise eine Kombination aus neutralem Steroid, einem beladenen Amphiphil und einem Phospholipid, verwendet werden. Als illustrative Beispiele für Phospholipide können Lecithin, Sphingomyelin, Dipalmitoyllecithin u.dgl. erwähnt werden. Als repräsentative Steroide können Cholesterin, Cholestanol, Lanesterol u.dgl. verwendet werden. Als repräsentative Beispiele für beladene amphiphile Verbindungen, welche in der Regel 12 bis 30 Kohlenstoffatome enthalten, können Mono- oder Dialkylphosphat oder ein Alkylamin, z.B. Dicetylphosphat, Stearylamin, Hexadecylamin, Dilaurylphosphat u.dgl., erwähnt werden.
Die Liposomperlen werden in einer das Markierungsmittel enthaltenden wässerigen Lösung hergestellt, wobei die Perlen das Markierungsmittel in ihrem Inneren enthalten. Die Liposomperlen können in der Lösung durch kräftiges Rühren hergestellt werden, worauf das Markierungsmittel vom äußeren der Perlen entfernt wird.
Weitere Einzelheiten der Herstellung von Liposomen sind in der US-Patentschrift Nr. 4,342,826 und in der internationalen PCT-Veröffentlichung Nr. WO 80/01515 angegeben, welche beide Literaturstellen hier als Bezugsquelle eingeschlossen sind.
Wie oben erwähnt, kann das in der Perle eingeschlossene Markierungsmittel ein Farbstof oder irgendein anderes ohne Zerstörung der Perlen sichtbares Material sein.
Das Bindemittel für den Liganden der Kupplungsverbindung kann in solcher Weise mit der teilchenförmigen Etikette markiert sein, daß ein für die Erfindung geeignetes Markierungsmittel nach auf dem Fachgebiet allgemein bekannten Methoden erhalten wird, wobei die angewendete Methode vom verwendeten Bindemittel und von der verwendeten teilchenförmigen Etikette abhängt. Derartige Arbeitsweisen sind unter anderen covalentes Kuppeln, Derivatisieren oder Aktivieren u.dgl. Beim Herstellen eines Markierungsmittels, in welchem das Bindemittel mit Perlen etikettiert ist, können die Perlen mit einer mit einem Bindemittel derivatisierten Komponente hergestellt werden, wobei die Perlen bei ihrer Herstellung mit dem Bindemittel sensibilisiert werden. Bei einer anderen Arbeitsweise können anfänglich die das Markierungsmittel enthaltenden Perlen zuerst hergestellt und dann mit dem Bindemittel nach auf dem Fachgebiet bekannten Methoden sensibilisiert werden.
Das Markierungsmittel enthält somit ein Bindemittel für den Liganden der Kupplungsverbindung und eine teilchenförmige Etikette, wobei die teilchenförmige Etikette ein Markierungsmittel schafft, welches unter Prüfbedingungen sichtbar ist, so daß die Anwesenheit und/oder die Menge des Analyten (der zu analysierenden Substanz) ohne weitere Behandlung und ohne die Verwendung von Geräten, z.B. die Verwendung eines einen Farbstoff als teilchenförmige Etikette enthaltenden Liposoms, bestimmt werden kann.
Entsprechend einem bevorzugten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das Bindemittel fuhr den Analyten, welcher auf der Prüffläche des Testsubstrats abgestützt ist, vorzugsweise in einem definierten Bereich der Prüffläche, beispielsweise in Form eines Flecks abgestützt statt über die gesamte Prüffläche das Testsubstrats verteilt. Wie oben erwähnt, ist entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform das Bindemittel für den Analyten, welcher auf der Prüffläche abgestützt ist, vorzugsweise in einer Menge von zumindest 1 ug/cm², vorzugsweise in einer Menge von zumindest 10 ug/cm² und insbesondere in einer Menge von 40 ug/cm² vorhanden. Die restliche Abbindekapazität der Prüffläche des gesamten Testsubstrats kann durch Behandeln der Prüffläche mit einer oder mehreren Arten von Proteinen, welche bei der Prüfung verwendete Materialien nicht spezifisch binden, abgesättigt oder blockiert werden. So kann beispielsweise die restliche Abbindekapazität durch Verwendung von Rinderserumalbumin blockiert werden.
In einigen Fällen wird beim Aufbringen des Bindemittels für den Analyten (insbesondere ein Antikörper) auf die Prüffläche in die Lösung des Antikörpers eine Polyhydroxyverbindung (Glycerin, Erythrit, Sorbit usw.) oder ein Zucker (Glucose, Saccharose) eingebracht um während der Prüfung nicht-spezifische Bindungen (falsche Positiva) zu vermeiden.
Entsprechend einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das Prüfsubstrat eine Prüfschicht, welche die Prüffläche zum Abstützen des Bindemittels für den Analyten in solcher Konzentration aufweist, daß das bei der Prüfung verwendete Markierungsmittel im an die Prüffläche gebundenen Zustand unter Prüfungsbedingungen in der Prüffläche ohne weitere Behandlung sichtbar ist, wobei das Prüfsubstrat unterhalb der Prüfschicht auch eine Steuerschicht aufweist, welche von einem porösen Material solcher Porengröße gebildet ist, daß der Durchfluß der Prüfreagenzien gesteuert wird, wenn solche Reagenzien auf die erste Schicht aufgebracht werden. Das Prüfsubstrat besitzt vorzugsweise auch eine poröse Distanzschicht, welche eine von einem Absorptionsmaterial gebildete Absorptionsschicht in Abstand von der Durchflußsteuerschicht hält.
Die Absorptionsschicht besitzt eine Absorptionsfähigkeit, welche ausreicht die während der Prüfung auf die Prüfschicht aufgebrachten Reagenzflüssigkeiten zu absorbieren. Zusätzlich sorgt das Absorptionsmaterial für einen Durchfluß durch das Prüfsubstrat.
Selbstverständlich kann die gesamte Prüfschicht vom Material der Prüffläche gebildet sein, jedoch kann alternativ lediglich die Prüffläche der Prüffschicht aus einem solchen Material gebildet sein.
Da das Prüfsubstrat in einer solchen Weise verwendet wird, daß die Prüfreagenzien durch die Schichten des Prüfsubstrats fließen, besitzt die Prüffläche weiters eine Porengröße, welche größer ist als die bei der Prüfung verwendete teilchenförmige Etikette, so daß unter Versuchsbedingungen nicht gebundene Anteile des Markierungsmittels in das Prüfsubstrat strömen und in der Prüffläche nicht sichtbar sind. Im allgemeinen soll die Prüffläche eine Porengröße von zumindest 3 um und insbesondere von zumindest 5 um besitzen. Im allgemeinen überschreitet die Porengröße nicht 12 um. Selbstverständlich können jedoch, obzwar die zuvor erwähnten Porengrößen bevorzugt sind, andere Porengrößen je nach den bei der Prüfung verwendeten Materialien verwendet werden.
Die Strömungssteuerschicht des Prüfsubstrats ist von einem porösen Material gebildet, welches dazu dient die Strömungsgeschwindigkeit der Prüfreagenzien durch die Prüffläche hindurch und in das Prüfsubstrat hinein zu steuern. Das zum Aufbauen der Strömungssteuerschicht verwendete poröse Material besitzt eine kleinere Porengröße als das für den Aufbau der prüffläche verwendete Material. Die Strömungssteuerschicht dient somit dazu die Geschwindigkeit der Prüfreagenzien durch die stärker poröse Prüffläche zu verringern.
Im allgemeinen besitzt die Strömungssteuerschicht, welche dazu dient die Strömungsgeschwindigkeit der Prüfreagenzien durch die Prüffläche hindurch und in das Prüfsubstrat hinein zu steuern, eine Poregröße von zumindest 0,5 um, wobei die Porengröße im allgemeinen 10 um nicht übersteigt.
Die Porengröße der Strömungssteuerschicht aber auch die Dicke der Strömungssteuerschicht werden vorzugsweise in solcher Weise bemessen, daß die Strömung der Prüfreagenzien durch die Prüffläche hindurch die erforderliche Empfindlichkeit ergibt aber auch eine rasche und genaue Prüfung ermöglicht.
Die Porengröße und die ihr entsprechende Strömungsgeschwindigkeit für die zweite Schicht sind vom erwarteten Bereich der Konzentration des Analyten abhängig. In dem Maße wie der Konzentrationsbereich des Analyten zunimmt, kann die Porengröße und die Strömungsgeschwindigkeit zunehmen. Tatsächlich kann bei einigen in hohen Konzentrationen vorliegenden Analyten die zweite Schicht des Substrats entfallen.
Entsprechend einer Ausführungsform wird die Schicht zum Steuern der Strömungsgeschwindigkeit durch das Prüfsubstrat in solcher Weise ausgelegt und bemessen, daß die Strömungsgeschwindigkeit der Materialien durch die Prüffläche in der Größenordnung von zumindest 0,5 ml/min liegt und im allgemeinen nicht mehr als 2 ml/min beträgt. Selbstverständlich ist jedoch der Rahmen der vorliegenden Erfindung durch solche Strömungsgeschwindigkeiten nicht eingeschränkt.
Die Durchflußsteuerschicht ist vorzugsweise von einem nicht-faserigen Material gebildet und besitzt vorzugsweise Poren oder Kanäle, die für eine Strömung in einer einzigen Richtung aus der Prüfschicht in die Schicht unterhalb der Durchflußsteuerschicht sorgen, d.h. daß die Durchflußsteuerschicht definierte Strömungskanäle aufweist, welche die Strömung durch die Schicht hindurch richten und eine Strömung quer zur Schicht möglichst gering halten. Die Poren oder Kanäle besitzen vorzugsweise einheitliche Größe. Die Strömungssteuerschicht ist vorzugsweise von einem Polycarbonat gebildet.
Unmittelbar unterhalb der Steuerschicht des Prüfsubstrats ist eine Distanzschicht aus porösem Material vorgesehen, welche für einen Abstand zwischen der Strömungssteuerschicht und einer porösen Absorptionsschicht sorgt. Die Distanzschicht dient hauptsächlich dazu durch die oberen Schichten des Prüfsubstrats hindurch in die Absorptionsschicht des Prüfsubstrats gelangte Materialien daran zu hindern in die oberen Schichten zurückzugelangen. Zu diesem Zweck besitzt die als Distanzschicht wirkende poröse Schicht eine Dicke, welche ausreicht in die Absorptionsschicht gelangte Materialien unter Versuchsbedingungen daran zu hindern in die oberen Schichten nach oben zurückzuströmen. Weiters besitzt die poröse Distanzschicht eine größere Porengröße als die Strömungssteuerschicht, so daß die Distanzschicht nicht im Sinne einer Drosselung der Strömung durch das Prüfsubstrat wirkt.
Selbstverständlich können jedoch in einigen Fällen Fälle eintreten, welche es ermöglichen auf die Distanzschicht zu verzichten, soferne die restlichen Schichten des Prüfsubstrats, also die Prüffläche, die Strömungssteuerschicht und die Absorptionsschicht, solche Eigenschaften besitzen, daß die Gefahr eines Rückstaus von Material ausgehend von der Absorptionsschicht in die Prüffläche im wesentlichen verhindert wird. Nichtsdestoweniger ist jedoch die Verwendung einer Distanzschicht bevorzugt. Falls eine Strömungssteuerschicht nicht verwendet wird, hält die Distanzschicht die Prüffläche in Abstand von der Absorptionsschicht.
Das Prüfsubstrat besitzt auch eine Absorptionsschicht (vierte Schicht), welche aus einem porösen Material aufgebaut ist, dessen Absorptionskapazität bzw. Absorptionsfähigkeit ausreicht die flüssigen Prüfreagenzien oder -materialien, welche während der Prüfung in das Prüfsubstrat einströmen, zu absorbieren. Die Absorptionsschicht wirkt auch so, daß sie eine Antriebskraft (Konzentrationsunterschied) erzeugt, welche verursacht, daß die auf die Prüffläche aufgebrachten Reagenzien in das Substrat, also in die Absorptionsschicht, strömen.
Entsprechend der vorliegenden Erfindung wird somit eine Prüfmethode geschaffen, bei welcher ein Markierungsmittel verwendet wird, dessen Etikettierteil eine sichtbare teilchenförmige Etikette ist, wobei die Prüfung auf einem Prüfsubstrat vorgenommen wird, welches vorzugsweise aus mehreren Schichten aus Materialien mit verschiedenen Eigenschaften, sowie zuvor beschrieben, aufgebaut ist und wobei die Prüfreagenzien durch die Prüffläche des Prüfsubstrats strömen.
Die für den Aufbau der verschiedenen Schichten des Prüfsubstrats verwendeten Materialien werden so gewählt, daß sie die oben beschriebenen Eigenschaften haben. Zusätzlich sollen solche Materialien den Analyten oder das Markierungsmittel nicht spezifisch binden. Die Materialien können als solche bereits derartige Eigenschaften besitzen oder können alternativ so behandelt werden, daß eine nicht-spezifische Bindung vermieden wird, indem beispielsweise das Material mit einem geeigneten Protein wie Rinderserumalbumin behandelt wird. Die Prüffläche des Substrats wird vorzugsweise auch mit einem Netzmittel behandelt, um ein richtiges Hindurchströmen der Prüfreagenzien durch die Prüffläche hindurch und in das Prüfsubstrat hinein sicherzustellen. Als repräsentative Beispiele für Netzmittel können Saccharose, Glycerin, Glucose, Sorbit usw. erwähnt werden. Die Prüffläche kann gleichzeitig mit einem Protein und einem Netzmittel, beispielsweise mit einer wässerigen Lösung von Rinderserumalbumin und Saccharose, behandelt werden.
Im allgemeinen ist das Prüfsubstrat in oder auf einem geeigneten Träger, beispielsweise auf einer Karte oder in einem Behälter, abgestützt. Die Auswahl eines geeigneten Trägers für das Prüfsubstrat wird auf Grund der hier gegebenen Hinweise als im Rahmen des Durchschnittsfachmannes liegend erachtet.
Zusätzlich ist das Prüfsubstrat im allgemeinen mit einem Abdeckmaterial versehen, welches die Prüfreagenzien zur Prüffläche richtet, in welcher das Bindemittel abgestützt ist. Somit kann beispielsweise das Substrat mit einer Karte bedeckt sein, welche eine Öffnung aufweist, welche über dem Bereich der Prüffläche liegt, die das Bindemittel enthält, womit die verschiedenen Prüfreagenzien direkt auf jenen Teil der Prüffläche gerichtet werden, welcher das Bindemittel enthältg. Alternativ kann das Prüfsubstrat in einem Behälter angeordnet werden, welcher eine geeignete Öffnung zum direkten Zuführen der Prüfreagenzien zur Prüffläche des Substrats aufweist.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf eine in der beiliegenden Zeichnung dargestellte Ausführungsform näher erläutert, wobei
die Zeichnung eine vereinfachte schematische Ansicht einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung zeigt.
Selbstverständlich ist jedoch der Schutzumfang der Erfindung hiedurch nicht eingeschränkt.
In der Zeichnung ist ein allgemein mit 10 bezeichnetes Prüfsubstrat gezeigt, welches eine allgemein mit 11 bezeichnete erste Schicht 11 aufweist, die eine Prüffläche zum Abstützen eines Bindemittels in einer solchen Konzentration aufweist, daß das Markierungsmittel, in welchem die Etikette eine teilchenförmige sichtbare Etikette ist, in gebundener Form unter Prüfbedingungen sichtbar ist. Ein bevorzugtes Material ist Nitrocellulose, welches eine Porengröße von mehr als 2 um und in der Regel von weniger als 12 um besitzt.
Unterhalb der Schicht 11 befindet sich eine mit dieser Schicht in Berührung stehende zweite Schicht 12, welche zum Steuern der Strömung der Materialien durch das Prüfsubstrat dient. Die zweite Schicht besitzt eine geringere Porengröße als die Schicht 11 und besitzt die zuvor beschriebenen Eigenschaften. Diese Schicht ist vorzugsweise von einem Polycarbonat gebildet.
Unmittelbar unterhalb der Schicht 12 ist in Berührung mit dieser Schicht eine Schicht 13 vorgesehen, welche in der zuvor beschriebenen Weise als Distanzschicht dient.
Die Schicht 13 ist von einem porösen Material gebildet und besitzt eine größere Porengröße als die Schicht 12. Die Schicht 13 kann beispielsweise aus einem nicht-verwebten Polyacetat bestehen. Unmittelbar unterhalb der Schicht 13 und in Berührung hiemit ist eine Schicht 14 vorgesehen, welche in der zuvor beschriebenen Weise aus einem Absorptionsmaterial gebildet ist. Die Schicht 14 ist vorzugsweise aus einem Cellulosematerial, z.B. aus absorbierendem Cellulosepapier, aufgebaut.
Das Prüfsubstrat ist somit aus den Schichten 11, 12, 13 und 14 aufgebaut und bildet ein in sich vereinigte Substrat 10. Die Schichten können miteinander, beispielsweise durch Vernähen der Schichten, verbunden sein, jedoch können auch andere Methoden zum Verbinden der Schichten dienen.
Wie im besonderen gezeigt ist, befindet sich das Prüfsubstrat 10 in einem Prüfbehälter, welcher einen Unterteil 15 und einen Deckel 16 aufweist. Der Unterteil 15 besitzt eine solche Tiefe, daß das Substrat 10 sich innerhalb des Behälters befindet. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform besitzt der Behälter drei Seiten in allgemein dreieckiger Form und abgerundete Ecken.
Der über der Schicht 11, dem Substrat 10 und der Prüffläche 18 liegende Deckel 16 besitzt einen erhabenen Teil mit einer geeigneten Öffnung 17, welche über jenem Bereich der Schicht 11 liegt, welcher das abgestützte Bindemittel enthält, wobei dieser Bereich der Prüffläche schematisch allgemein mit 18 bezeichnet ist.
Der Deckel 16 ist oberhalb der Schicht 11 durch zahnartige Vorsprünge 19 abgestützt, welche sich von den Seiten des Unterteils 15 nach oben erstrecken. Die Vorsprünge 19 sind ausreichend hoch, so daß Luftspalte 20 vorhanden sind, über welche die Seiten des Substrats 10 belüftet werden können. Die Luftspalte 20 sind von den Vorsprüngen 19, dem Deckel 16 und dem Unterteil 15 begrenzt.
Der die Öffnung 17 umgebende erhabene Teil des Deckels 16 besitzt einen gefärbten Bereich 21, dessen Farbe sich kontrastreich von der Farbe des Deckels 16 und von der in der Prüffläche 18 zu erzeugenden Farbe abhebt, um ein besseres Ablesen der Prüfergebnisse zu ermöglichen, welche im allgemeinen durch eine Farbe bestimmt sind. Bei der bevorzugten Ausführungsform sind der Unterteil 15, der Deckel 16 und der gefärbte Bereich 21 aus Kunststoffen gefertigt.
Das auf der Schicht 11 abgestützte Bindemittel beansprucht somit nur einen Teil der gesamten Schicht 11, wobei der die Öffnung 17 aufweisende Deckel 16 die bei der Prüfung verwendeten Materialien in solche Richtung lenkt, daß sie mit dem abgestützten Bindemittel 18 in Berührung kommen und wobei diese Materialien anschließend durch das Prüfsubstrat zur Absorptionsschicht 14 strömen und hiebei aufeinanderfolgend durch die Schichten 11, 12 und 13 hindurchtreten.
Bei Verwendung des Testsubstrats 10 für eine Sandwichprüfung kann beispielsweise das abgestützte Bindemittel ein für den zu bestimmenden Analyten (zu bestimmende Substanz) spezifischer Antikörper sein. Falls die Sandwichprüfung sequenziell durchgeführt werden soll, wird zunächst eine den Analyten enthaltende oder mutmaßlich enthaltende Probe über die Öffnung 17 im Deckel 16 auf das Substrat aufgebracht, womit die Probe mit dem Bindemittel in der Prüffläche 18 in Berührung gelangt und die Probe durch das Substrat hindurch zur Absorptionsschicht 14 strömt. Der in der Probe enthaltene Analyt wird im Bereich der Prüffläche 18 spezifisch an das Bindemittel gebunden.
Eine aus einem Bindemittel für den Analyten und einem Liganden, welcher vom Bindemittel des bei der Prüfung verwendeten Markierungsmittel gebunden ist, bestehende Kupplungsverbindung wird auf das Prüf substrat aufgebracht und genötigt den Analyten zu binden.
Anschließend wird das Markierungsmittel über die Öffnung 17 im Deckel 16 aufgebracht, wobei das Markierungsmittel ein Bindemittel enthält, welches sich an den Liganden der Kupplungsverbindung bindet und welches mit einer sichtbaren teilchenförmigen Etikette etikettiert ist. Das Markierungsmittel wird an die Kupplungsverbindung gebunden und jedweder ungebundene Anteil strömt durch das Prüfsubstrat zur Absorptionsschicht 14.
Gewünschtenfalls kann auf das Prüfsubstrat 10 vor dem Zusetzen des Markierungsmittels eine Waschlösung aufgebracht werden.
In ähnlicher Weise kann nach dem Zusetzen des Markierungsmittels auf das Prüfsubstrat eine Waschlösung aufgebracht werden, um jedwedes Markierungsmittel, welches in der Prüffläche nicht spezifisch an den Komplex gebunden wurde, in die Absorptionsschicht 14 zu spülen.
Gewünschtenfalls kann die Öffnung 17 mit einem Einsatz ausgestattet werden, welcher ein Filter aufweist, welches auf die Prüffläche auf zubringende Prüfmaterialien filtert.
Das Auftreten einer Färbung in der Prüffläche 18 weist auf das Vorliegen des Analyten hin, wobei, falls die Prüfung eine quantitative Prüfung ist, die Intensität einer solchen Färbung auf die Menge an in der Probe enthaltenem Analyten hinweist.
Obzwar in einer bevorzugten Ausführungsform die Prüfung im ''Durchfluß"-Format durchgeführt wird, bei welchem das Bindemittel an einem geeigneten Substrat abgestützt ist und Probe, Kupplungsverbindung und Markierungsmittel veranlaßt werden das Substrat zu durchströmen, ist es doch möglich für die Prüfung andere Formate anzuwenden, z.B. das abgestützte Bindemittel zu kontaktieren, ohne die Reagenzien durch das Substrat hindurchströmen zu lassen, indem beispielsweise eine Textkarte verwendet wird oder über die Oberfläche des Prüfsubstrats eine chromatographische oder kapillare Strömung erzeugt wird usw..
Ob zwar es bevorzugt ist ein Prüfsubstrat der oben beschriebenen Konfiguration beim Arbeiten nach einer Durchflußprüfung anzuwenden, ist es gleichermaßen auch möglich andere Konfigurationen, z.B. eine Kombination aus Prüfsubstrat und Absorptionsmaterial ohne Strömungssteuerschicht und Distanzschicht, anzuwenden.
Die indirekte Sandwichprüfung kann nach verschiedenen Formaten durchgeführt werden.
Beispielsweise können Analyt und Kupplungsverbindung miteinander in Berührung gebracht werden, worauf das erhaltene Gemisch mit dem abgestützten Bindemittel in Berührung gebracht wird. Im Zuge einer weiteren Alternative ist es möglich das Markierungsmittel, die Kupplungsverbindung und die Probe miteinander in Berührung zu bringen und das erhaltene Gemisch mit dem abgestützten Bindemittel in Berührung zu bringen.
Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, welche jedoch den Schutzumfang der Erfindung nicht einschränken.

BEISPIEL I

A. Biotinylieren von Aminogruppen (des Lysins) des Antikörpers.
Bei dieser Arbeitsweise wird N-Hydroxysuccinimidobiotin (NHS-Biotin) verwendet, welches im Handel erhältlich ist (z.B. Sigma Chemical Company). Die Arbeitsweise beim Biotinylieren ist folgende:
(i) NHS-Biotin (4 mg/ml) in Dimethylsulfoxid wird unter Rühren tropfenweise einer Antikörperlösung (1 mg/ml) in 0,1-molarem NaHCO&sub3;, pH = 8,2, im Verhältnis von 1:20 (v/v) zugesetzt. Das Gemisch wird dann während 4 h bei Raumtemperatur stehengelassen.
(ii) Nach 4 h werden 0,1 Vol.-tle. 1-molarer Glycinäthylester (pH = 7,5) zugesetzt, worauf die Lösung gegen 0,1-molares NaHCO&sub3; erschöpfend dialysiert wird, um nicht gebundenes Biotin abzutrennen.
B. Biotinylieren der Kohlehydratfraktion des Antikörpers.
(i) Antikörper wird gegen 10-mmolare und a n NaCl 0,15-molarem Natriumphosphatpuffer mit pH = 7,5 dialysiert. Nach der Dialyse wird die Konzentration des Antikörpers auf 1 mg/ml und der pH-Wert durch Zusetzen von 1-molarem Acetatpuffer mit pH = 4,5 auf 5,5 eingestellt.
(ii) Der Lösung des Antikörpers wird Natriumperjodat (100-mmolar) in 20 mmolarem Natriumacetat/ 0,15-molarem NaCl mit pH = 5,5 bis zu einer Endkonzentration von 10 mmolar zugesetzt. Die Oxydation wird bei Raum-Temperatur während 15 bis 30 min ablaufen gelassen, worauf die Umsetzung durch Zusetzen von Äthylenglykol (bis 0,1-molar) abgebrochen wird.
(iii) Die Antikörperlösung wird durch eine G-25-Kolonne in Richtung nach unten geleitet, welche zuvor mit 20-mmolarem Acetat/0,15-molarem NaCl vom pH = 5,5 ins Gleichgewicht gebracht worden war. Antikörper enthaltende Fraktionen wurden gesammelt.
(iv) Biotinhydrazid (5 mg/ml) in DMSO) wurde dem aufgefangenen Antikörper bis zu einer Endkonzentration des Biotinhydrazids von 0,25 mg/ml zugesetzt. Die Antikörperkonzentration in dieser Stufe betrug 0,3 bis 0,5 mg/ml. Das Gemisch wurde während 24 h bei 4ºC stehengelassen und dann gegen 0,1-molares NaHCO&sub3; vom pH = 8,3 dialysiert, um ungebundenes Biotinhydrazid abzutrennen. BEISPIEL II Ein Prüfsystem für N. gonorrhoeae ist folgendermaßen beschaffen:
Stufe (i): Monocloner Antikörper gegen N. gonorrhoeae (MAb 148.1) wird in Form von Flecken auf 5 um-Nitrocellulose aufgebracht - 3 ul aufgebracht bei 500ug/ml. Die Membran wird dann während 15 min bei Raumtemperatur trocknen gelassen.
Stufe (ii): Die bespritzte Membran wird sodann durch Inkubieren in PBS blockiert, welche 0,5 % (w/v) Trockenmilch niedrigen Fettgehalts enthielt, wobei während 60 min bei 37ºC inkubiert wurde.
Stufe (iii): Die blockierte Membran wird zwecks Entfernens überschüssiger Blockierlösung mit PBS gewaschen und bei Raumtemperatur trocknen gelassen.
Stufe (iv): Die Membran wird sodann auf Absorptionspapier gelegt.
Stufe (v): Durch die Membran wird sodann N.gonorrhoeae-Antigen geleitet. Eine Fraktion des Antigens wird vom aufgesprühten MAb 148.1 eingefangen. Durch die Membran kann bis zu 1 ml Antigen in 1 % BSA/1 % Octyl-β-D-glucopyranosid/30 % Ziegenserum/ 0,2 % Trockenmilch/PBS (pH = 7,4) hindurchgeleitet werden (BSA = Rinderserumalbumin, PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung).
Stufe (vi): Durch die Membran hindurch wird sodann nach der Arbeitsweise gemäß Beispiel 1 hergestellter biotinylierter Anti-N -gonorrhoeae-Antikörper aus Kaninchen (100 ul bei 10 ug/ml) geleitet. Dieser Antikörper erkennt durch MAb 148.1 eingefangenes Antigen. Der biotinylierte Kaninchenantikörper wird mit dem in Stufe (v) verwendeten Puffer verdünnt.
Stufe (vii): Durch die Membran wird sodann eine Lösung geleitet, welche mit Anti-Biotin-Antikörper aus Ziegen (es werden 100 ul Liposomen verwendet) beschichtete Liposomen enthält. Diese Liposomen, welche Sulforhodamin enthalten, verbinden sich mit dem biotinylierten Antikörper und ergeben ein Signal (rote Farbe).
Stufe (viii): Durch die Membran wird PBS (200 ul) geleitet, um nicht gebundene Liposomen herauszuwaschen. Die Farbintensität nimmt mit zunehmender Konzentration des Antigens zu.
Die vorliegende Erfindung ist auf Methoden und Produkte zum Bestimmen einer Vielzahl von Analyten anwendbar. Als repräsentative Beispiele für Analyten können Drogen, einschließlich therapeutische Drogen und mißbräuchlich verwendete Drogen, Hormone, Vitamine, Proteine einschließlich Antikörper aller Klassen, Peptide, Steroide, Bakterien, Fungi, Viren, Parasiten, Komponenten oder Produkte von Bakterien, Fungi, Viren oder Parasiten, Allergene aller Arten, Produkte oder Bestandteile normaler oder bösartiger Zellen, usw. erwähnt werden. Als spezielle Beispiele können T&sub4;, T&sub3;, Digoxin, hcG, Insulin, Theophyllin, luteinisierende Hormone, verschiedene Krankheitszustände verursachende oder hiemit vergesellschaftete Organismen wie Streptococcus pyogenes (Gruppe A), Herpes Simplex I und II, Cytomegalovirus, Rubella, Chlamydiae, Candida albicans, Neisseria gonorrhoeae, Haemophilos influenzae, Strep. der Gruppe B, S. pneumoniae, Neisseria meningitidis, Clostridium difficile, für Organismen spezifische Antikörper, z.B. für Rubella spezifischer Antikörper HTLV III(HIV), usw. erwähnt werden.
Der Analyt kann in verschiedensten Proben, einschließlich beispielsweise Körperflüssigkeiten wie Speichel, Urin, Serum usw., Abstrichen, z.B. aus der Kehle, bestimmt werden. In einigen Fällen mag es möglich sein einen Analyten in Gesamtblut festzustellen.
Die vorliegende Erfindung ist besonders insofern vorteilhaft als die Empfindlichkeit der Prüfung dadurch verbessert wird, daß zum Ermitteln eines Analyten sowohl eine Kupplungsverbindung als auch ein Markierungsmittel verwendet wird. Darüber hinaus ist es möglich ein bestimmtes Markierungsmittel für die Prüfung verschiedenartiger Analyten zu verwenden.
Diese und weitere Vorteile sollten aus den hier gemachten Angaben für den Fachmann auf diesem Gebiete offensichtlich sein.
Im Lichte der oben gemachten Angaben sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung möglich, weshalb die Erfindung im Rahmen der folgenden Patentansprüche in anderer Weise in die Praxis umgesetzt werden kann als sie im besonderen beschrieben worden ist.

Claims

1. Reagenzsatz für die Verwendung bei der Bestimmung einer zu bestimmenden Substanz, mit einem abgestützten Bindemittel für die zu bestimmende Substanz, wobei das Bindemittel auf der Prüffläche eines festen Trägers abgestützt ist und die Prüffläche des Trägers von einem Material gebildet ist, welches einen Oberflächenbereich zum Abstützen des abgestützten Bindemittels aufweist, und mit einem Markierungsmittel, worin das abgestützte Bindemittel in einer Konzentration abgestützt ist, bei welcher das Markierungsmittel auf dem Träger unter Versuchsbedingungen sichtbar ist, dadurch gekennzeichnet, daß der Reagenzsatz weiters eine aus einem Bindemittel für die zu analysierende Substanz und einem Liganden bestehende Kupplungsverbindung aufweist und das Markierungsmittel ein Bindemittel für den Liganden der Kupplungsverbindung enthält, welche mit einer sichtbaren teilchenförmigen Etikette etikettiert ist, die ein einen erkennbaren Marker enthaltendes Liposom darstellt.

2. Reagenzsatz nach Anspruch 1, worin der feste Träger eine erste Schicht, eine zweite Schicht, eine dritte Schicht und eine vierte Schicht aufweist und diese Schichten eine über der anderen angeordnet sind, wobei die erste Schicht die Prüffläche mit darauf abgestütztem abgestützten Bindemittel aufweist, die zweite Schicht ein poröses Material mit geringerer Porengröße als die erste Schicht aufweist, um den Durchfluß van Prüfreagenzien durch den festen Träger zu steuern, die dritte Schicht eine poröse Distanzschicht ist und die vierte Schicht ein absorbierendes Material aufweist, dessen Absorptionsfähigkeit ausreicht, die auf das Prüfsubstrat aufgebrachten Flüssigkeiten zu absorbieren und für einen Durchfluß durch das Substrat zu sorgen, wobei die Prüfung auf die zu bestimmende Substanz eine Durchflußprüfung ist.

3. Reagenzsatz nach Anspruch 1 oder 2, worin zumindest die Prüffläche von Nitrocellulose gebildet ist.

4. Reagenzsatz nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin das Bindemittel für die Kupplungsverbindung ein Antikörper ist und das Bindemittel für das Markierungsmittel ein Antikörper ist

5. Reagenzsatz nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, worin der Ligand der Kupplungsverbindung Biotin ist.

6. Reagenzsatz nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, worin das abgestützte Bindemittel auf dem festen Träger in einer Konzentration von zumindest 1 ug/cm² abgestützt ist.

7. Reagenzsatz nach den Ansprüchen 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, worin die zweite Schicht ein nicht-fasriges Material ist, welches für den Durchfluß in einer einzigen Richtung sorgt.

8. Verfahren zur Prüfung einer zu bestimmenden Substanz, bei welchem

ein Komplex aus (i) einem abgestützten Bindemittel, welches abgestützte Bindemittel ein Bindemittel für die zu bestimmende Substanz ist und auf der Prüffläche eines festen Trägers abgestützt ist, (ii) einer zu analysierenden Substanz, (iii) einer Kupplungsverbindung, welche ein Bindemittel für die zu analysierende Substanz und einen Liganden enthält, und (iv) einem Markierungsmittel, welches ein Bindemittel für den Liganden dar Kupplungsverbindung enthält, welche mit einer sichtbaren teilchenförmigen Etikette etikettiert ist, die ein einen erkennbaren Marker enthaltendes Liposom darstellt, gebildet wird, wobei die Prüffläche von einem Material gebildet ist, welches einen Oberflächenbereich zum Abstützen des abgestützten Bindemittels aufweist, und wobei das abgestützte Bindemittel in einer Konzentration abgestützt ist, bei welcher das Markierungsmittel auf dem Träger unter Versuchsbedingungen sichtbar ist und wobei die zu bestimmende Substanz durch die Sichtbarkeit des Markierungsmittels in der Prüffläche bestimmt wird.