DE3423376A1 - Apparat zur elektrophorese mit polyakrilamidgel mit orientiertem stromfeld - Google Patents

Description

APPARAT ZUR ELEKTROPHORESE MIT POLYAKRYLAMIDGEL MIT ORIENTIERTEM STROMPELD

Die Erfindung betrifft einen Apparat zur Elektrophorese mit Polyakrylamidgel mit orientiertem Stromfeld, unter Zuhilfenahme dessen die Zonenverzerrungen praktisch eliminiert werden können, die Serienprüfungen mit RoutineCharakter reproduzierbar, schnell, mit einem geringen Bedarf an Chemikalien und unter Beseitigung der Berührungsschutzgefahr, die im allgemeinen infolge der zur Messung von feuchten Medien erforderlichen elektrischen Spannung besteht, durchgeführt werden können.

Aus der sich mit der Polyakrylamid-Gaselektrophorese beschäftigenden, ein weites Gebiet umfassenden Fachliteratur ist es wohlbekannt, dass beim einen Typ der sogenannten zonen-elektrophoretischen Prozesse als elektrophoretischer Träger synthetisches Polyakryl-

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amidgel verwendet wird. Mit den früher verwendeten elektrophoretischen Verfahren verglichen besteht der gröaste Vorteil der zonen-elektrophoretischen Verfahren in dem erhöhten Auflösungsvermögen, was für die Elektrophorese mit Polyakrylamidgel besonders charakteristisch ist. Da nämlich in diesem Pail neben der Trennung der aufgeladenen Makromolekülen C z.B. Proteine, Nukleinsäuren) nach netto elektrischer Aufladung tritt auch eine sogenannte molekülfiltrierende Wirkung ebenfalls auf. Für die Elektrophorese des Polyakrylamidgela ist'die molekülfiltrierende Wirkung kennzeichnend, wo die Trennung der Ionen nach Format bzw. Dimension gegenüber der Trennung nach Aufladungen in den Vordergrund tritt. Moleküle werden mit höchster Wirksamkeit im Molekülgewichts— bereich zwischen 10 und 10 filtriert, wobei deren Mass in der Abhängigkeit der Stoffkonzentration der

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Gele durch die Änderung der Porengrösse geregelt werden kann. Das Auflösungsvermögen der Methode kann durch die Anwendung der sogenannten diskontinuierlichen Puffersysteme weiter erhöht werden. In diesem Fall weist der Gelpuffer von dem Elektropuffer abweisende Eigenschaften auf, ja sogar besteht bei derartigen Systemen das Gel selbst aus mehreren Schichten mit abweichender Konzentrationen und verschiedenen pH- -Werte. Durch die Anwendung der diskontinuierlichen Puffersysteme entsteht eine elektrochemische Wirkung, die durch die hochgradige Konzentration der Komponenten der Probelösung und durch die' Entstehung von extrem dünnen Startzonen zur Geltung kommt. Als Erfolg kommt eine recht wirksame Trennung der Komponenten des makromolekularen Gemisches zustande.

Dank der vorteilhaften Eigenschaften hatte sich die Methode weitgehend verbreitet. Die wichtigsten Anwendungsmöglichkeiten sind die Trennung der Komponen-

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ten von Peptiden, Proteinen, Nukleotiden, Nukleinsäuren, sowie verschiedenen Zellenfragmenten (Mem- - branen, Ribosomen). Die Methode wird in der Praxis insbesondere bei der klinischen Laboratoriuraadiagnostik und bei Lebensmittelprüfungen verwendet.

Infolge der groasen praktischen Bedeutung sind zahlreiche Apparate in der Fachliteratur beschrieben, zahlreiche Apparate sind im Handel zu haben.

Einfache gelelektroforetische Apparate sind z.B. in den Publikationen Ann. N. Y. Acad. Sei. 121, 404 C1964) und Ann. N. Y. Acad. Sei. 121, 428 C1964), sowie in der Serie "laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology" Band "Electrophoresis of Proteins in Polyacrylamide and Starch Gels" auf der Seite 48 CAutoren: T.S. Work und E.Work; North Holland Verlag, 1972) beschrieben.

Die einzelnen Glieder der von Savants Instruments, Inc. auf den Markt gebrachten, aus Plexiglas verfertigten, vertikal angeordneten mit Polyakrylamidgel arbeitenden Apparatenfamilie des Typs DEG funktionieren mit 10-20 cm ljjngen das Gel enthaltenden Glasrohren mit einem Innendurchmesser von 6 mm. Der Innendurchmesser der zylindrischen Pufferbehälter beträgt 15 cm, die Höhe liegt zwischen, 18 und 25 cm, dementsprechend beträgt der vollkommene Pufferbedarf etwa 3-4,4 Liter. Das Selbstgewicht des Apparates beträgt etwa 1,3-1,7 Kg.

Der von Pharmacia Pine Chemicals vertriebene, aus Polycarbonat verfertigte, vertikal angeordnete, mit Polyakrylamid arbeitende elektrophoretische Apparat des Typs GE-4 funktioniert mit 16 als Gelbehälter dienenden Glasrohren mit einer Lichtweite von 2,7 oder 5 mm. Der Rauminhalt der eckigen Pufferbehälter:

der obere: etwa 0,4 Liter
der untere: etwa 2 Liter.

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Die gelelektrophoretischen Zellen des Models 150 A resp. 151 der Firma Bio-Rad Laboratories arbeiten mit einer Rohrlänge zwischen 150 mm und 300 mm, so sind diese grossdimensionierte, eine bedeutende Menge an Elektrodenpuffer beanspruchende Apparate.

Diese Apparattype entsprechen eben infolge · des äusaerst einfachen Aufbaus den Bedingungen der sicheren Arbeitsdurchführung nicht, bzw. können bei Serienprüfungen von routinmässigen Charakter die Reproduzierbarkeit der Prüfungen keineswegs sicherstellen, oder eben ihre Kompliziertheit ist der Gebrauch schwierig, sie sind überdimensioniert, je eine Prüfungsserie beansprucht eine bedeutende Menge an Chemikalien.

Bei allen bekannten Apparattypen machen die Leitungen der Elektroden die Anordnung der Elektroden asymmetrisch, wodurch das Mass der Zonenverzerrung erhöht wird. Die Zonenverzerrung zeigt.sich darin, dass die zu trennenden Komponente zusammenlaufen. Diese Erscheinung erschwert die Erkenntnis und Auswertung der äusserst dünnen Zonen, ja sogar macht sie es unmöglich.

Im Laufe der an feuchten Medien durchgeführten elektrischen Messungen, Trennverfahren muss eine besondere Aufmerksamkeit den strengen sich auf den Berührungsschutz beziehenden Vorschriften gewidmet werden. Der grundsätzliche Nachteil der bekannten Lösungen besteht darin, dass sie keinen befriedigenden Schutz gegen Schlag durch elektrischen Strom anbieten.

Viele erlitten schwere Verletzungen während der Bedienung von gelelektrophoretischen Apparaten.

Der Erfindung wurde das Ziel gesetzt, die obenerwahten liangelhaftigkeiten zu beseitigen. Wir wünschen ein gelelektrophoretischen Apparat zu entwickeln, unter Zuhilfenahme dessen dünne Zonen ohne

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Ineinanderlaufen erkannt und ausgewertet werden können, ferner infolge der kleinen Dimensionen leicht bedien-■ bar ist, die Trenngeschwindigkeit erhöht werden kann, der Bedarf an Chemikalien bei dem Durchführen je einer Serienprüfung niedrig ist, gleichzeitig alle Forderungen in der Hinsicht des BerührungsSchutzes befriedigt sind.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass in den zur Gelelektrophorese verwendeten Pufferlösungen durch die Glättung der die Ionenmobilität schädlich beeinflussenden Stromkomponenten und entsprechende Orientierung des Stroms die Zonenverzerrungen praktisch eliminiert werden können.

Im Sinne der Erfindung wird das auf der obenerwähnten Erkenntnis beruhende gesetzte. Ziel mit einem zur Elektrophorese des Polyakrylamidgels dienenden elektrophoretischen Apparates erreicht, in dessen unteren zylinderischen bzw. oberen Pufferbehälter untere und obere Elektroden angeordnet 3ind, und in den Pufferbehälter das Gel enthaltende Gefässe münden. In jedem Pufferbehälter ist ein mit der Symmetrieachse des Behälters gleichachsi^er, die Elektrode tragender Zylinder angeordnet, wobei in jedem die Elektrode tragenden Zylinder eine zentralisierte Elektrode-Spulenwelle vorgesehen ist. Die Elektroden sind aus Platinendraht · aufgewundene Spiralen, die in den an den Elektrodenspulenwellen ausgestalteten Ausnehmungen befestigt sind. An dem Mantel sämtlicher die Elektroden tragenden Zylinder .sind löcher an der den Elektroden am nähesten liegenden Strecke ausgestaltet, die in Richtung der das Gel enthaltenden Gefässe gerichtet sind, wodurch die Pufferlösung zu den Elektroden fliessen' kann, wobei die Elektroden unabhängig von dem Stand der Pufferlösung immer bis zum selben Niveau in die Lösung eingetaucht sind.. Es scheint zweckmässig die das Gel enthaltenden Gefässe in der Grund3cheibe des

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oberen Pufferbehältera abgedichtet so zu befestigen, • dass diese \on der Symmetrieachse der Scheibe in gleicher Entfernung liegen und der gegenseitige Abstand ebenfalls der gleiche sei. Die Dichtung kann mit aus Silicongummi ausgestalteten Dichtungsringen gesichert werden. Damit der Apparat auch die strengen Vorschriften des Berührungsschutzes restlos befriedige, zweckmässig werden die stromzuführenden Anschlüsse der E-lektroden so ausgestaltet, dass durch Abschliessen bzw. Öffnen der Abdeckscheibe die Stromversorgung gesichert bzw. abgestellt werden könne. Dies kann so erreicht werden, dass die obere Elektrode mit einem Anschlußstecker versehen wird, bzw. die elektrische Verbindung so hergestellt wird, dass der Stecker zu der oberen Deckplatte des oberen, die Elektrode tragenden Zylinders befestigt ist. während die untere Elektrode mit dem an der Aussenwand des unteren Pufferbehälters befestigten Stecker elektrisch verbunden wird, wobei die Anschlusshülse des oberen A_nschlußsteckers unmittelbar, die Hülse des unteren Steckers über den die Hülse tragenden Schenkel indirekt an der oberen Abdeckacheibe des oberen Pufferbehälters befestigt ist.

Die Erfindung wird anhand eines vorteilhaften Ausführungsbeispiels, mit Hilfe der beiliegenden Zeichnung - die den mit Polyakrylamidgel arbeitenden elektroforetischen Apparat teilweise im Schnitt darstellt - naher erläutert.

Wie es aus der Figur ersichtlich ist, besteht der Apparat aus zwei vertikal angeordneten Pufferbehaltern mit Kreisquerschnitt, die mit Hilfe der in der Grundscheibe 13 des oberen Pufferbehälters eingefrästen Rillen einander anpassen. Der obere Pufferbehälter besteht aus der Grundscheibe 13 und dem Behältermantel 5, der obere Pufferb'ehälter aus der Grundscheibe 15 und dem Mantel 7. In dem Mittelpunkt der Grundscheiben

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.; 13 und 15 sind die Elektroden-Spulenwellen 20 und 25 befestigt, die von den elektrodentragenden Zy-. lindern 12 und 14 - die in den von dem Mittelpunkt etwa 1 cm fern liegenden kreisförmigen Einfräsungen befestigt sind - umschlossen sind. In den auf den Elektroden-Spulenwellen 20, 25 vorhandenen Einfräsungen sind die aus Platinendraht spiralförmig gewundenen Elektroden 17 bzw. 22 befestigt. Die Elektrode 17 ist mit dem an der oberen Deckplatte des elektrodentragenden Zylinders befestigten Anschlußstecker 16 verbunden, während die Elektrode 22 über die Elektrodenleitung 23 mit dem an der Grundscheibe 15 ausser dem Pufferraum befestigten Anschlußstecker 9 elektrisch verbunden ist. Pur die Aufnahme der Elektrodenleitung 23 ist die Grundscheibe 15 mit den Bohrungen 11 versehen. In der Grundscheibe 13 sind die mit einem Radius von etwa 5 cm ausgestalteten, in einem gegenseitigen gleichmässigen Abstand vorgesehenen Durchbohrungen vorhanden, in denen die das Gel enthaltenden Gefässe 8 mit den aus Silikongummierungen ausgestalteten Dichtungen 6 befestigt- sind. Die zur Aufnahme des Gels dienenden Gefässe 8 sind an beiden Enden offene Glasrohre, in denen das Gel sich befeindet. An den Mantel der die Elektroden tragenden Zylinder 12 resp. 14 sind die Löcher 21,26, die den Gefässen 8 zugewandt sind, in der Umgebung der Elektroden 17, 24 ausgestaltet. Der obere Pufferbehälter ist mit der mit dem Deckelgriff 1 versehenen Abdeckscheibe 3 abgeschlossen, an deren Rand in vertikaler Richtung der Schenkel 4 der Steckerhülse befestigt ist, dessen unteres Ende mit der den Anschlußstecker 9 aufnehmenden Anschlusshülse 10 versehen ist, die wiederum über die mit Strom versorgende Leitung 24 einem äusseren Stromgenerator angeschlossen ist. Die den Anschlußatecker 16 aufnehmende Hülse 2 ist in der Symmetrieachse der Abdeckscheibe 3

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angeordnet und schliesst sich über die Stromveraorgimgaleitung 19 dem äuaaeren Stromgenerator an.

— Der erfindungsgemässe Apparat wird ao betätigt, indem daa Polyakrylamidgel in den Gefäaaen 8 hergeatellt wird, wonach die Gefässe mit den Dichtungen 6 in den Bohrungen der Grundscheibe 13 befestigt werden; darauffolgend werden 200 ml Pufferlösung in den unteren Pufferbehälter eingefüllt. Nun wird -der obere Pufferbehälter auf den unferen gelegt und 150 ml Pufferlösung werden auch in diesen eingefüllt. In der nächsten Arbeitsphaae wird die Abdeckscheibe 3 so auf den oberen Pufferbehälter gelegt, dasa der Anschlußatecker 16 in die Anachluashülse 2, der Anschlußstecker 9 in die Anachluashülse 10 eingeschoben werden können, wonach die stromversorgende Leitungen 19 und 24 dem stabilisierten Stromgenerator angeschlossen werden.

Im Laufe der Trennung gelangt ein quasi fokussierter Strom aus der Elektrode 17, durch die Übermittlung der hindurch das Loch 21 den Strom leitenden Pufferlösung in das Polyakrylamidgel, wovon der Strom durch die Übermittlung der Pufferlösung des unteren Behälters - das ebenfalls eine Gitterwirkung ausübende Loch 26 tangierend - zu der Elektrode 22 gelangt. Experimentell kann es festgestellt werden, dass der erfindungsgemässe Apparat auch 1 mm dicke Zonen zu trennen fähig ist. Die Zonengrenzen sind scharf, frei vom Zusammenlauf, so gibt der Apparat - mit allen bisher bekannten Lösungen verglichen ein viel zuverläaaigeres Resultat. Die Verwendung des erfindungsgemässen Apparates bringt auch den unerwarteten Vorteil mit sich, indem der Pufferbedarf je einer gelelektrophoretiachen Analyse wenigstens um eine Grössenordnung niedriger ist, als jener der bekannten handelsüblichen Apparate. Mit unserem Appa-

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rat können reproduzierbare Ergebnisse so erhalten werden, dass durch Abschliessen der oberen Abdeckscheibe 3 die unter Spannung stehenden Teile keineswegs berührt werden können, wodurch die Gefahr eines Schlags durch elektrischen Strom vollkommen ausgeschlossen ist.

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Claims (2)

REANAL FINOMVEGYSZERGYAR, Budapest / UNGARN APPARAT ZUR ELEKTROPHORESE MIT POLYAKRILAMIDGEL MIT ORIENTIERTEM STROMPELD P A' T EUTANSPRÜCHE

1. Apparat zur Elektrophorese mit PoIyakrilamidgel mit orientiertem Stromfeld, mit in zylindrischen unteren bzw. oberen Pufferbehältern angeordneter oberer und unterer Elektrode, sowie ' in die Pufferbehälter mündenden, das Gel enthaltenden Gefässen, dadurch gekennzeichnet , dass in jedem Pufferbehälter ein mit der Symmetrieachse des Behälters gleichachsiger, die Elektrode tragender Zylinder C12, 14) angeordnet ist, in jedem die Elektrode tragenden Zylinder C12, 14) eine zentierte Spulenwelle C20, 25) vorhanden ist, wobei • die Elektroden C17, 22) aus Platinendraht aufgewickelte Spiralen sind, die in in.den Spulenwellen (20, 25) ausgestalteten Ausnehmungen befestigt sind und an dem Mantel der die Elektrode tragenden Zylin-

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der C 12, 14) in der Umgebung der Elektroden C 17, 22) den das Gel aufnehmenden Gefässen (8) zugewandte Löcher C21, 26) ausgestaltet sind.

2. Apparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die das Gel aufnehmenden Gefässe (8) in der Grundscheibe C13) des oberen Pufferbehälters mit dem gleichen Radius und in dem gleichen Abstand voneinander abgedichtet befestigt sind.
3· Apparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , dass die obere Elektrode C17) mit einem Anschlußstecker elektrisch verbunden ist, der ander- oberen Deckplatte des oberen, die Elek r trode tragenden Zylinders C12) befestigt ist, während die untere Elektrode C22) mit dem an der Aussenwand des unteren Pufferbehälters befestigten .Anschlüßssstecker C9) elektrisch verbunden ist, wobei die Anschlusshülse (2) des oberen Anschlußsteckers (l6) unmittelbar, die Anschlusshülse ClO) des unteren Anschlusssteckers C 9) indirekt über den Schenkel C 4) der Anschlusshülse an der Abdeckscheibe (3) des oberen Pufferbehälters befestigt ist.

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