HU189303B - Poliacrylamide gelelectroforetic device with directed space current - Google Patents

Description

A találmány tárgya irányított áramterü poliakrilamid gélelektroforetikus készülék, amellyel a zónatorzitások gyakorlatilag megszünlethetők, a rutin jellegű sorozatvizsgálatok pedig reprodukálhatóan, gyorsan, kis vegyszerigénnyel és a nedves közegek méréséhez használt elektromos feszültség miatt általában fennálló érintésvédelmi veszély megszüntetésével végezhetők el.

A poliakrilamid gélelektroforézissel foglalkozó széles körű szakirodalomból ismeretes, hogy az az úgynevezett zóna elektroforézises eljárások egyik típusa, amely elektroforetikus hordozóként szintetikus poliakrilamid gélt használ. A zóna elektroforézises eljárások nagy előnye a korábban alkalmazott elektroforetikus eljárásokkal szemben a nagyobb felbontó képesség, és ez különösen jellemző a poliakrilamid gélelektroforézisre. Ebben az esetben ugyanis a töltéssel bíró makromolekulák (pl. fehérjék, nukleinsavak) nettó elektromos töltés szerinti elválasztása mellett fellép az ún. molekulaszűrő hatás is. Ennek lényege az ionok alak és méret szerinti elválasztása. A molekulaszürő hatás jellemzője a poliakrilamid gélelektroforézisének, ahol az ionok alak, illetve méret szerinti elválasztása előtérbe kerül a töltések szerinti elválasztással szemben. A molekulaszűrés leghatásosabban a 10⁴—10⁷ molekulasúly tartományban működik, és mértéke a gélek anyagkoncentrációjának, illetve ennek függvényében átlagos pórusnagyságuk változtatásával szabályozható. A módszer felbontóképessége tovább fokozható az ún. discontinuus pufferrendszerek alkalmazásával. Ebben az esetben a gél-puffer az elektropuffertől eltérő tulajdonságokkal rendelkezik, sőt ilyen rendszereknél általában maga a gél is több eltérő koncentrációjú és pH-jú rétegből áll. A discontinuus pufferrendszerek alkalmazásával létrejön egy elektrokémiai hatás, amely a mintaoldat komponenseinek nagyfokú betöményedésén és extrém vékonyságú startzónák keletkezésén keresztül érvényesül. Mindezek eredményeképpen, makromolekuláris elegyek komponenseinek rendkívül jó hatásfokú elválasztása jön létre.

A módszer előnyös tulajdonságai révén - széles körben elterjedt. Fő alkalmazási lehetőségei a peptidek, fehérjék, nukleotidok, nukleinsavak, valamint különböző sejtfragmentumok (pl. membránok, riboszómák) komponenseinek elválasztása. A gyakorlati életben elsősorban a klinikai laboratóriumi diagnosztikában és az élelmiszervizsgálatoknál alkalmazzák.

Nagy gyakorlati jelentősége miatt több készüléket ismertet a szakirodalom, és számos készüléktípus került kereskedelmi forgalomba is.

Egyszerű gélelektroferetikus készüléket mutat be például az Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 121, 404 (1964) és az Ann. Ν. Y. Acad. Sci. 121, 428 (1964) közlemény, továbbá a „Laboratory Techníques in Biochemistry and Molecular Biology” sorozat (szerkesztők: T. S. Work és E. Work) „Electrophoresie of Proteins in Polyacrylamide and Starch Gels című kötete a 48. lapon. (Kiadó: North-Holland, 1972).

A Savants Instruments, Inc. által forgalmazott, plexiüvegből készült, vertikális elrendezésű, DEC típusú poliakrilamid gélelektroforetikus készülékcsalád tagjai 6 mm belső átmérőjű, 10-20 cm hosszú géltartó üvegcsövekkel működnek. A henger alakú puffertartályok belső átmérője 15 cm, magasságuk 18-25 cm, ennek megfelelően teljes pufferigényük kb. 3-3,4 liter. A készülékek önsúlya kb. 1,3-1,7 kg.

A Phamacia Fine Chemicals által forgalmazott, polycarbonatból készült, vertikális elrendezésű, GE-4 típusú poliakrilamid gélelektroforetikus készülék 16 db 2,7 vagy 5 mm belső átmérőjű géltartó üvegcsővel működik. A szögletes puffertartályok térfogata: felső kb. 0,4 liter; alsó - kb. 2 liter.

A Bio-Rad Laboratories Model 150A és Model 151 típusú gélelektroforetikus cellái 150mm-től 300 mm-ig terjedő csőhosszal dolgoznak, tehát nagy méretű, jelentős mennyiségű elektródpuffert igénylő készülékek.

Ezek a készüléktípusok vagy túlzottan egyszerű voltuk miatt nem felelnek meg a biztonságos munkavégzés feltételeinek, illetve nem biztosítják a vizsgálatok megfelelő reprodukálhatóságát a rutin jellegű sorozatvizsgálatok esetén, vagy - éppen bonyolult voltuk miatt - használatuk nehézkes, méreteik nagyok, és feleslegesen sok vegyszert igényelnek egy-egy vizsgálatsorozat elvégzéséhez.

Valamennyi ismert készüléktípusnál az elektródák vezetékei aszimmetrikussá teszik az elektródák elrendezését, ami fokozza a zónatorzulás mértékét. A zónatorzulás abban nyilvánul meg, hogy az elválasztandó komponensek egymásba mosódnak. Ez a jelenség különösen a vékony zónák felismerését és kiértékelését teszi nehézkessé, sok esetben lehetetlenné.

A nedves közegeken végzett elektromos mérések, szétválasztások esetén fokozott figyelmet kell fordítani a szigorú érintésvédelmi előírásokra. Az ismert megoldások alapvető hátránya, hogy nem nyújtanak megfelelő védelmet áramütés ellen. Mind kül-, mind belföldön többen szenvedtek komoly sérülést gélelektroforetikus készülékek kezelése közben.

A találmánnyal a felsorolt hátrányok kiküszöbölése a célunk. Olyan gélelektroforetikus készüléket kívánunk szerkeszteni, amellyel a vékony zónák egymásba mosódás nélkül felismerhetők és kiértékelhetők, továbbá amely kis méreteinél fogva könnyen kezelhető, az elválasztási gyorsaság növelhető, kevés vegyszert igényel egy-egy vizsgálatsorozat elvégzéséhez, ugyanakkor messzemenően eleget tesz az érintésvédelmi követelményeknek.

Találmányunk azon a felismerésen alapul, hogy a gélelektroforézishez használt pufferoldatokban az ionmobilitást károsan befolyásoló áramkomponensek kiszűrésével és az áram megfelelő irányításával a zónatorzítások gyakorlatilag megszüntethetek.

-2189.303

A találmány értelmében a fenti felismerés alapján kitűzött célunkat olyan poliakrilamid gélelektroforetikus készülékkel érjük el, amelynek henger alakú alsó, ill. felső pufferlartályaiban alsó, ill. felső elektródák vannak elrendezve, és a puffertartályokba géltartó edények torkollnak. Mindegyik puffertartályban a tartály szimmetriatengelyével azonos tengelyű elektródatartó henger helyezkedik el, és mindegyik elektródatartó hengerben egy-egy központosított elektróda-cséveorsó van. Az elektródák platinahuzalból tekercselt spirálok, amelyek elektróda-cséveorsókon kialakított bemélyedésekben vannak rögzítve. Mindegyik elektródatartó henger palástján az elektródákhoz legközelebb eső szakaszon lyukak vannak, amelyek a géltartó edények irányába néznek, és amelyeken át a pufferoldat az elektródákhoz folyhat, és az elektródák a pufferoldat szintjétől függetlenül mindig azonos szintig merülnek az oldatba. A géltartó edényeket célszerű a felső puffertartály alapkorongjába tömítve rögzíteni, hogy azok a korong szimmetriatengelyétől azonos távolságra legyenek, és azonos legyen egymástól való távolságuk is. A tömítés szilikongumiból kialakított tömítőgyűrűkkel biztosítható. Hogy a készülék az érintésvédelmi szigorú előírásoknak is maradéktalanul megfeleljen, célszerű, ha az elektródák árambevezető csatlakozóit úgy alakítjuk ki, hogy a fedőkorong zárásával, ill. nyitásával együtt az áramellátás is biztosítható, ill. megszüntethető legyen. Ez pedig úgy érhető el, hogy a felső elektródát olyan banándugóval kötjük össze elektromosan, amely a felső elektródatartó henger felső zárólapjához van rögzítve, az alsó elektródát pedig az alsó puffertartály külső falához rögzített banándugóval kötjük össze elektromosan, amikor is a felső banándugó banánhüvelye közvetlenül, az alsó banándugó banánhüvelye pedig banánhüvelytartó száron át közvetve a felső puffertartály fedőkorongjához van rögzítve.

A találmányt részletesebben rajz alapján ismertetjük. A rajz a találmányunk szerinti poliakrilamid gélelektroforetikus készülék egy lehetséges példakénti kiviteli alakját mutatja, részben metszetben.

Amint a rajzon látható, a készülék két kör keresztmetszetű, vertikális elrendezésű puffertartályból áll, melyek a felső puffertartály 13 alapkorongjába maratott vajatokkal illeszkednek egymáshoz. A felső puffertartály a 13 alapkorongból és az 5 tartálypalástból, az alsó puffertartály pedig a 15 alapkorongból és a 7 tartálypalástból áll. A 13 és 15 alapkorongok központjába 20 és 25 elektródacséveorsók vannak rögzítve, amelyeket a középponttól kb. egy cm-re lévő kör alakú bemarásokba rögzített 12 és 14 elektródatartó hengerek vesznek körül. A 20, ill. 25 elektróda-cséveorsókon kialakított bemarásokban platinahuzalból spirál alakúra tekercselt 17, ill. 22 elektródák vannak rögzítve. A 17 elektróda a 12 elektródatartó henger felső zárólapjához rögzített 16 banándugóval, a 22 elektróda pedig 23 elektródavezetékkel a 15 alapkoronghoz a puffertéren kívül rögzített 9 banándugóval elektromosan össze van kötve. A 23 elektródavezeték részére a 15 alapkorong 11 furattal van ellátva. A 13 alapkorongban kb. öt cm-es sugárral egymástól egyenlő távolságra átfúrások vannak, amelyekben szilikongumi-gyűrüből kialakított 6 tömítésekkel 8 géltartó edények vannak rögzítve. A 8 géltartó edények mindkét végükön nyitott üvegcsövek, amelyekben a gél helyezkedik el. A 12, ill. 14 elektródatartó hengerek palástján a 17, ill. 22 elektródák környezetében 21, ill. 26 lyukak vannak, amelyek a 8 géltartó edények felé néznek. A felső puffertartályt 1 fedélfogantyúval ellátott 3 fedőkorong zárja le, amelynek széléhez függőlegesen 4 banánhüvelytartó szár van rögzítve. A 4 banánhüvelytartó szár alsó vége a 9 banándugót befogadó 10 banánhüvellyel van ellátva, mely 24 áramellátó vezetékkel külső áramgenerátorra csatlakozik. A 16 banándugót befogadó 2 banánhüvely a 3 fedökorong szimmetriatengelyében van elhelyezve, és 19 áramellátó vezetékkel csatlakozik a külső áramgenerátorhoz.

A találmány sz.erinti készüléket úgy működtetjük, hogy először a géltartó edényekben elkészítjük a poliakrilamid géleket, ezeket a 6 tömítéssel a 13 alapkorong furataiban rögzítjük, majd az alsó puffertartályba 200 ml pufferoldatot öntünk. Ezután a felső puffertartályt az alsóra helyezzük, majd abba is öntünk 150 ml pufferoldatot. A következő lépésben a 3 fedökorongot úgy helyezzük a felső puffertartályra, hogy a 16 banándugó a 2 banánhüvelybe, a 9 banándugó pedig a 10 banánhüvelybe illeszkedjék, majd a 19 és 24 áramellátó vezetéket stabilizált áramgenerátorra kapcsoljuk.

A szétválasztás során a 17 elektródából a 21 lyukon át áramot vezető pufferoldat közvetítésével mintegy fókuszált áram jut a poliakrilamid-gélbe, ahonnan az alsó tartály pufferoldatának közvetítésével jut az áram tovább az ugyancsak rácshatást kifejtő 26 lyukat érintve a 22 elektródára. A kísérlettel megállapítható, hogy készülékünk kb. egy milliméteres zónák szétválasztására is képes. A zónák határa éles, elmosódástól mentes, így készülékünk minden eddig ismert megoldáshoz képest megbízhatóbb eredményt ad. Készülékünk alkalmazása azt a nem várt, meglepő előnyt is biztosítja, hogy egy-egy gélelektroforetikus analízis pufferigénye legalább egy nagyságrenddel alacsonyabb, mint egyéb, kereskedelmi forgalomban lévő ismert készülékeké. Készülékünkkel a reprodukálható eredmények úgy érhetők el, hogy a felső 3 fedőkorong zárásával feszültség alatti részhez érni nem lehet, így az áramütés veszélye teljes biztonsággal ki van zárva.

Claims (3)

Szabadalmi igénypontok

1. Irányított áramterű poliakrilamid gélelektroforetikus készülék, henger alakú alsó, ill. felső puf-3189.303 fertartályokban elrendezett alsó, ill. felső elektródával, valamint a puffertartályokba torkolló géltartó edényekkel, azzal jellemezve, hogy mindegyik puffertartályban a tartály szimmetriatengelyével 5 azonos tengelyű elektródatartó henger (12 és 14) helyezkedik el, mindegyik elektródatartó hengerben (12 és 14) egy-egy központosított elektródacséveorsó (20 és 25) van, az elektródák (17 és 22) platinahuzalból tekercselt spirálok, amelyek az 10 elektróda-cséveorsókon (20 és 25) kialakított bemélyedésekben vannak rögzítve, amikor is mindegyik elektródatartó henger (12 és 14) palástján az elektródák (17 és 22) környezetében a géltartó edények (8) irányába néző lyukak (21 és 26) vannak, 15

2. Az 1. igénypont szerinti készülék kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a géltartó edények (8) a felső puffertartály alapkorongjába (13) azonos sugárral és egymástól azonos távolságban vannak tömítéssel rögzítve. 20

3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti készülék kiviteli alakja, azzal jellemezve, hogy a felső elektróda (17) olyan banándugóval van elektromosan összekötve, amely a felső elektródatartó henger (12) felső zárólapjához van rögzítve, az alsó elektróda 25 (22) pedig az alsó puffertartály külső falához rögzített banándugóval (9) van elektromosan összekötve, amikor is a felső banándugó (16) banánhüvelye (2) közvetlenül, az alsó banándugó (9) banánhüvelye (10) pedig banánhüvelytartó száron (4) át köz- 30 vetve a felső puffertartály fedőkorongjához (3) van rögzítve.