DE3410602C2

DE3410602C2 -

Info

Publication number: DE3410602C2
Application number: DE3410602A
Authority: DE
Inventors: Rose-Marie Handjani; Alain Paris Fr Ribier; Manlio Vaujours Fr Maurelli
Original assignee: LOreal SA
Current assignee: LOreal SA
Priority date: 1983-03-22
Filing date: 1984-03-22
Publication date: 1990-05-03
Also published as: GB2136762A; FR2543018A1; GB8407325D0; JPS6322178B2; GB2136762B; IT8467264A0; DE3410602A1; US4608211A; FR2543018B1; JPS59179146A; IT1178896B; IT8467264A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von unilamellaren Lipidkügelchen mit einem mittleren Durchmesser von mehr als 100 nm und eine Vorrichtung zur Durchführung dieses Verfahrens.

Mit den Lipidkügelchen kann eine wäßrige Flüssigkeit, z. B. eine wäßrige Lösung einer biologisch aktiven Substanz, eingekapselt werden. Bekanntlich erhält man je nach dem Verfahren, das man zur Herstellung verwendet, entweder multilamellare Kügelchen, die jeweils aus mehreren sphärischen Lipidkügelchen bestehen, oder unilamellare Kügelchen, die nur eine einzige Lipidhülle aufweisen. Im letzteren Fall erhält man je nach dem Herstellungsverfahren Kügelchen mit einem Durchmesser kleiner als 100 nm (SUV) oder mit einem Durchmesser größer als 100 nm (LUV).

Unilamellare Kügelchen besitzen gegenüber multilamellaren Vorteile, da letztere unterschiedlich groß sind und eine ungleichmäßige Anzahl von Hüllen besitzen. Von den unilamellaren Kügelchen besitzen außerdem diejenigen der zweiten Art (LUV) Vorteile gegenüber denjenigen der ersten Art (SUV), da sie größer sind und somit eine größere Fähigkeit zur Verkapselung besitzen. Außerdem können mit diesen Kügelchen Makromoleküle mit erhöhtem Molekulargewicht eingekapselt werden. Forschungsarbeiten beschäftigen sich daher damit, unilamellare Kügelchen des Typs (LUV) im industriellen Maßstab größtmöglicher Ausbeute herstellen zu können.

Zur Herstellung dieser Art von unilamellaren Kügelchen sind derzeit zwei Herstellungsverfahren bekannt: ein Dialyseverfahren zur Entfernung des Detergens und ein Verfahren zur Verdampfung von Lösungsmitteln.

In dem Artikel von David S. Cafiso (Biochemica et Biophysica Acta, 649 (1981), 129-132, mit dem Titel "Preparation of unilamellar lipid vesicles at 37°C by vaporization methods") ist ein Verfahren beschrieben, das Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt zur Herstellung von Kügelchen des Typs LUV bei physiologischen Temperaturen einsetzt. Gemäß diesem bekannten Verfahren injiziert man in eine Kolonne mit einem Wasserpuffer von 37°C Ethylmethylether- oder Dichlorfluormethan-Lösungen von 4°C, welche solubilisierte Lipide enthalten. In dieser Druckschrift sind die prinzipiellen Vorteile dieses Verfahrens beschrieben. Diese Vorteile sind einerseits, daß die hitzeempfindlichen Substanzen im Inneren des Kügelchens ohne thermische Denaturierung leichter eingeschlossen werden können und daß andererseits die Anzahl der Lipide, die in Dichlorfluormethan löslich sind, größer ist als die Zahl der Lipide, die in zahlreichen anderen Lösungsmitteln solubilisiert werden können. Obwohl dieses Verfahrens, bei dem die Injizierungsstufe in einem Milieu von 37°C durchgeführt wird, eine Verbesserung der zuvor bekannten Verfahren darstellt, bei denen das Injektionsmilieu im allgemeinen eine Temperatur von 60 bis 65°C besaß, ist dieses Verfahren jedoch nicht bei Substanzen anwendbar, die sich bei Temperaturen unterhalb 37°C zersetzen. So findet beispielsweise bei 37°C die Denaturierung von verschiedenen Proteinen oder die Inaktivierung bestimmter, aktiver Moleküle statt.

Man hat daher versucht, die obengenannten Nachteile zu vermeiden. Dies zeigt auch die europäische Patentanmeldung 55 576. In dieser Anmeldung ist ein industrielles Verfahren zur Herstellung von Kügelchen unter milden Bedingungen vorgeschlagen (d. h., unterhalb der Übergangstemperatur von Lipidbläschen und ohne daß man stark auf das aufnehmende Milieu einwirken muß). Bei diesem Verfahren verwendet man ein Lösungsmittelsystem für die Lipide. Dieses System umfaßt ein wasserlösliches Lösungsmittel S1, das aus Methanol, Ethanol, Propanol und Isopropanol ausgewählt ist, und ein hydrophobes Lösungsmittel S2, das flüchtiger ist als die wäßrige Lösung und das ausgewählt ist aus Hexan, Cyclohexan, 2,2-Dimethylbutan, Pentan, Isopentan und 1,1,2-Trichlortrifluormethan. Da der Siedepunkt von S2 höher ist als Umgebungstemperatur (28 bis 81°C), muß man die Bläschendispersion auf eine verhältnismäßig hohe Temperatur bringen, um S2 zu entfernen. Da außerdem S1 wasserlöslich ist, muß man diese Dispersion dialysieren oder über eine Kolonne filtrieren, um das Lösungsmittel S2 zu entfernen. Folglich kann auch das in der europäischen Patentanmeldung 55 556 beschriebene Verfahren nicht dazu eingesetzt werden, thermisch empfindliche Substanzen einzukapseln.

Es wurde nun gefunden, daß man Kügelchen bei niedriger Temperatur herstellen kann, wenn man den Druck vermindert, bei dem die einzukapselnde, wäßrige Phase konditioniert ist. Es wurde gefunden, daß man, wenn man mit vermindertem Ausstoß bei reduziertem Druck eine Lipidlösung, die in einem unter Druck stehenden Behälter konditioniert ist, in ein wäßriges, aufnehmendes Milieu injiziert, bei den zuvor genannten Temperaturen Kügelchen in einer sehr befriedigenden Ausbeute erhält. Das beobachtete Phänomen beruht auf der Kombination zweier Faktoren: Einerseits wird die Injektion derart durchgeführt, daß man am Anfang Tröpfchen erhält; andererseits ist derjenige Druck, bei dem die einzukapselnde, wäßrige Phase konditioniert ist, geringer als der Druck, bei dem die Lipidlösung in flüssigem Zustand konditioniert ist, und niedriger als der Dampfdruck der oder des Lösungsmittel(s) in den Tröpfchen, die sich am Injektionspunkt bei der Temperatur des aufnehmenden Milieus bilden.

Zur Erklärung der wesentlich besseren Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu den bekannten Verfahren, bei denen Lösungsmittel verdampft werden und bei denen die Lipidmilieus und die empfangenden Milieus unter normalem Druck stehen, hat man die Hypothese entwickelt, ohne jedoch an diese Erklärung gebunden zu sein, daß sich bei den bekannten Verfahren im Injektionsmilieu ein verhältnismäßig langsamer, thermischer Austausch ausbildet, so daß sich die Lipidtröpfchen teilen und zu verhältnismäßig kleinen (mittlerer Durchmesser 150 nm) Kügelchen führen. Im Gegensatz dazu wurde erfindungsgemäß gefunden, daß die in das aufnehmende Milieu eingeführten Tröpfchen praktisch unverzüglich platzen, so daß unilamellare Kügelchen mit großem Umfang gebildet werden. Folglich ist der erfindungsgemäß durch Druckverminderung im wäßrigen Milieu hervorgerufene "Blitz" ("flash") nicht vergleichbar mit dem bekannten Blitz, der auf einer Temperaturerhöhung durch Injektion in das aufnehmende Medium beruht. Erfindungsgemäß ist es außerdem möglich, bei einer beliebigen Temperatur des aufnehmenden Mediums zu arbeiten. Vorzugsweise arbeitet man bei einer Temperatur, die unterhalb 25°C liegt, damit man thermoempfindliche Substanzen einkapseln kann.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein
Verfahren zur Herstellung von unilamellaren Lipidkügelchen mit einem mittleren Durchmesser von mehr als 100 nm, in denen eine Substanz eingekapselt ist, wobei man
das (die) zur Bildung der Hülle der Kügelchen bestimmte(n) Lipid(e) in mindestens einem in Wasser unlöslichen Lösungsmittel unter Bildung einer Lipidlösung solubilisiert,
die Lipidlösung in flüssigem Zustand in einem Behälter bei einem Druck P₁ und einer Temperatur R₁ konditioniert,
die einzukapselnde Substanz unter Bildung einer wäßrigen Phase solubilisiert,
diese wäßrige, einzukapselnde Phase bei einem Druck P₂ und einer Temperatur R₂ konditioniert und
die Lipidlösung in die wäßrige Phase derart injiziert, daß sich das oder die Lösungsmittel der Lipidlösung verflüchtigt oder verflüchtigen, wenn es (sie) mit dieser wäßrigen Phase in Kontakt kommt (kommen), das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
die Lipidlösung in die einzukapselnde, wäßrige Phase derart injiziert, daß man am Anfang Tröpfchen erhält, wobei der Druck P₂ niedriger ist als P₁ und der Dampfdruck des Lösungsmittels oder der Lösungsmittel in diesen Tröpfchen bei der Temperatur R₂.

Vorzugsweise wählt man die Temperaturen R₁ und R₂ so, daß sie im wesentlichen gleich sind.

Bei einer bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform konditioniert man die Lipidlösung in einem Behälter vom Typ "Aerosolbombe", der ein Treibmittel enthält. Man wählt den Druck P₂ so, daß er unter Atmosphärendruck liegt. Aus nachstehend angegebenen Gründen verwendet man vorzugsweise ein oder mehrere Lipid(e), die in der in der Aerosolbombe enthaltenen Flüssigkeit völlig löslich sind. Der Druck P₁ in der Aerosolbombe liegt beispielsweise zwischen 1 und 8 bar (absolut). Vorzugsweise liegt der Druck P₁ zwischen 4 und 6 bar (absolut).

Zur Einkapselung von thermoempfindlichen Substanzen verwendet man als Lösungsmittel für das oder die Lipid(e) ein oder mehrere Lösungsmittel, dessen (deren) Siedepunkt unterhalb 25°C liegt. Ferner arbeitet man bei Temperaturen R₁ und R₂, die im wesentlichen Umgebungstemperatur entsprechen. Weiterhin verwendet man als Lösungsmittel für das (die) Lipid(e) ein oder mehrere Lösungsmittel mit geringer Polarität. Als Lösungsmittel, die die obengenannten Bedingungen erfüllen, kann man insbesondere halogenierte Kohlenstoffverbindungen nennen. Von diesen kann man Trichlorfluormethan, Dichlorfluormethan und Dichlordifluormethan nennen.

Das erfindungsgemäß verwendete Treibmittel kann ein komprimiertes Gas sein, das in der in der Aerosolbombe enthaltenen, flüssigen Phase löslich ist. Man kann Lachgas oder Kohlendioxid einsetzen. Das Treibmittel kann auch ein verflüssigtes Gas sein, das mit der in der Aerosolbombe enthaltenden Lipidlösung mischbar ist und im wesentlichen aus einem Kohlenwasserstoff besteht, der gegebenenfalls halogeniert ist. Als Kohlenwasserstoffe kann man Butan und Propan und als halogenierte Kohlenstoffe kann man Chlorfluoralkane, wie Dichlorfluormethan, Dichlordifluormethan und 1,2-Dichlor-1,1,2,2-tetrafluorethan, nennen. Das Treibmittel kann auch aus einem komprimierten Gas bestehen, das in der in der Aerosolbombe enthaltenen, flüssigen Phase nicht löslich ist. Dieses komprimierte Gas kann Stickstoff sein. Ist das Treibmittel ein mit der Lipidlösung der Aerosolbombe mischbares, verflüssigtes Gas, so kann sich die Löslichkeit der Lipide in dem Lösungsmittel vermindern. In diesem Fall kann man das Treibmittel und das Lösungsmittel in der Aerosolbombe mittels einem Beutel aus Plastik oder Metall trennen.

Erfindungsgemäß löst man das (oder die) Lipid(e) in dem ausgewählten Lösungsmittel in einer Konzentration von 0,01 bis 10 g/100 ml Lösungsmittel.

Falls man ein oder mehrere ionische Lipide verwendet, setzt man vorteilhafterweise ein zusätzliches Lösungsmittel ein, das polarer ist als das oder die Grundlösungsmittel. Man verbessert so die Löslichkeit des (oder der) ionischen Lipid(e). Als Beispiel für ein derartiges zusätzliches Lösungsmittel kann man Ethylmethylether nennen.

Es ist ferner möglich, in die Lipidlösung einzukapselnde, lipophile Substanzen einzuführen, wobei diese Substanzen in den Wandungen der Kügelchen bleiben, die sich zuvor gebildet haben.

Um die Lipidlösung in den die einzukapselnde, wäßrige Phase enthaltenden Behälter derart zu injizieren, daß man am Anfang Tröpfchen erhält, verwendet man vorteilhafterweise einen Mikroschieber, den man vorzugsweise derart regelt, daß er einen Ausstoß zwischen 5 ml/h und 10 ml/min liefert.

In Abhängigkeit von den anderen erfindungsgemäßen Verfahrensbedingungen wählt man den Druck P₂ so, daß er zwischen 0,1 mbar und 15 mbar liegt. Die Lipidlösung leitet man mittels eines Kapillarröhrchens in die in dem Behälter vorhandene, wäßrige Phase der einzukapselnden Substanz. Die Temperatur R₂ der einzukapselnden Phase hält man mit Hilfe eines Thermostaten konstant niedrig. Vorzugsweise arbeitet man bei einer Temperatur R₂, die niedriger ist als 25°C. Die einzukapselnde Phase bewegt man leicht. Handelt es sich bei der einzukapselnden Substanz um eine nicht abbaubare Substanz, dann bewegt man die einzukapselnde, wäßrige Phase mechanisch mit Hilfe eines Ultraschallbades. Handelt es sich bei der einzukapselnden Substanz um eine Proteinsubstanz, dann gibt man in die einzukapselnde, wäßrige Phase ein Antischaummittel.

Erfindungsgemäß kann man außerdem vorteilhafterweise die Kügelchen fortlaufend herstellen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform injiziert man die Lipidlösung in ein Kanalsystem, in dem man die Lösungsmittel, wäßrige Phase zirkulieren läßt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens regelt man zweckmäßigerweise die durch den Mikroschieber vorgegebenen Werte für den Ausstoß und den Druck P₂ in Abhängigkeit von der einzukapselnden Substanz. Bei den gelösten Stoffen, die keine Proteinsubstanzen sind, kann man einen maximalen Ausstoß verwenden und bei einem Druck P₂ von 15 mbar bis 0,1 mbar arbeiten. Zur Verkapselung und Proteinprodukten, bei denen die Gefahr besteht, daß sich ein stabilisierter Schaum bildet, arbeitet man jedoch bei einem geringen Ausstoß und bei einem geringfügig verminderten Druck.

Es wurde gefunden, daß die Heterogenität der Verteilung der Kügelchen wenig vom Ausstoß, im mittleren Maß von der Lipidkonzentration der Aerosolbombe und den Mitteln zum Bewegen bzw. Rühren der wäßrigen Lösung und stark von der einzukapselnden Substanz, insbesondere dessen Viskosität, und der Ausflockung der in bestimmten Arten von gelösten Stoffen gebildeten Bläschen abhängt.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene, Kügelchenlösung besitzt eine Konzentration an Lipiden, die zwischen 0,1 und 10 Gew.-% liegen kann. Das eingekapselte Volumen ist größer als bei den nach den bekannten Verfahren erhaltenen Kügelchen.

Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie als ersten Behälter einen Aerosolbehälter (1) mit einem Auslaßventil (3), und einen zweiten Behälter (2), in dem ein verminderter Druck aufrechterhalten werden kann, Mittel, die es ermöglichen, den Inhalt des ersten Behälters in den Inhalt des zweiten Behälters zu injizieren und einen Mikroschieber (6) zur Regulierung des zu injizierenden Flüssigkeitsstroms, aufweist.

Nach einer bevorzugten, erfindungsgemäßen Ausführungsform bestehen die Mittel, die es ermöglichen, den Inhalt des ersten Behälters in den Inhalt des zweiten Behälters zu injizieren, einerseits aus einem röhrchenförmigen Übergangsteil, das an einem seiner Enden an den Auslaßstutzen des Auslaßventils des Aerosolbehälters und an seinem anderen Ende an den Eingang des Mikroschiebers angepaßt ist, und andererseits aus einem Kapillarröhrchen besteht, dessen eines Ende an den Ausgang des Mikroschiebers angepaßt ist. Vorzugsweise ist der Mikroschieber ein Injektornadel-Mikroschieber.

Das erfindungsgemäß eingesetzte Kapillarröhrchen besitzt einen Durchmesser kleiner als ungefähr 0,3 mm. Eine Verteilervorrichtung ist am Ende des Kapillarröhrchens angebracht, um eine Verteilung zu gewährleisten. Der zweite Behälter weist einen Thermostaten auf. Der zweite Behälter ist ferner mit Mitteln ausgestattet, durch die sein Inhalt bewegt bzw. gerührt werden kann.

Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend mehrere Ausführungsformen der Erfindung beschrieben. Die Zeichnungen zeigen eine schematische Ansicht der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens dienenden Vorrichtung.

Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Gesamtansicht einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens;

Fig. 2 eine Ansicht im vergrößerten Maßstab eines erfindungsgemäßen Aerosolbehälters, auf dessen Auslaß ein Mikroschieber angebracht ist, der dazu dient, den für das erfindungsgemäße Verfahren erforderlichen, verminderten Ausstoß in Form von Tröpfchen zu gewährleisten; und

Fig. 3 eine schematische Schnittansicht eines Aerosolbehälters, der zur Aufnahme eines verflüssigten Treibmittels dient, welches die Löslichkeit der Lipide im Lösungsmittel vermindern kann.

Die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung besitzt einen ersten Behälter, der aus einer Aerosolbombe 1 besteht, und einen zweiten Behälter, der aus einem Ballon 2 besteht, in dem ein verminderter Druck P₂ aufrechterhalten werden kann.

Der Aerosolbehälter 1 weist ein Schließventil 3 und ein Röhrchen 4 auf, das in die darin enthaltene Flüssigkeit 5 taucht. Der Ausgang der Aerosolbombe ist mit einem Mikroschieber 6 verbunden, an dessen Ausgang sich ein Kapillarröhrchen 7 befindet, das in die Flüssigkeit 8 des Ballons 2 taucht. Dieses Kapillarröhrchen besitzt einen Durchmesser von ungefähr 0,3 mm und eine Länge von ungefähr 20 cm.

Bei einer besonderen Ausführungsform der Fig. 2 ist ein röhrchenförmiges Übergangsventil 9 an einem seiner Enden an die Öffnung des Auslaßventils 3 und an seinem anderen Ende an den Eingang des Mikroschiebers 6 angepaßt. Dazu greift das Teil 9 mit seinem Auslaßende in die zentrale Ausbohrung 10 eines ersten Ringes 11 ein, wobei die Ausbohrung 10 auf der gegenüberliegenden Seite die Auslaßöffnung 12 des Mikroschiebers 6 aufnimmt. Außerdem ist der Ring 11, der ein Schrumpfring ist, mit einem zweiten Ring 13 verbunden, welcher um den Hals des Aerosolbehälters 1 verläuft. Diese beiden Ringe werden durch Verschrauben der beiden konzentrischen Schürzen 11 a und 13 a verbunden, welche sich jeweils an den Ringen 11 und 13 befinden.

Der Mikroschieber 6 ist ein Injektornadel-Mikroschieber, der mittels der Schraube 14 eine sehr feine Regulierung ermöglicht. Man kann beispielsweise einen "Nupro"-Schieber (Bezeichnung SS2SG) aus rostfreiem Stahl verwenden. Das Kapillarröhrchen 7 ist mit Hilfe eines Übergangsgliedes 15 am Ausgang des Mikroschiebers 6 befestigt.

Enthält der Aerosolbehälter 1 ein Treibmittel, das aus einem verflüssigten Gas besteht, welches mit der in der Aerosolbombe enthaltenen Lipidlösung mischbar ist und welches die Löslichkeit der Lipide in den verwendeten Lösungsmitteln vermindern kann, trennt man das Treibmittel vom Lösungsmittel, in dem die Lipide solubilisiert sind, durch eine Tasche bzw. einen Beutel 17 aus einem Plastikmaterial oder aus Metall, wobei sich das Treibmittel außerhalb der Tasche bzw. des Beutels 17 befindet.

In den nachfolgenden Beispielen ist die erfindungsgemäße Herstellung von Lipidkügelchen beschrieben. Es sind auch Vergleichsbeispiele A, B und C beschrieben, in denen die Herstellung von Kügelchen identischer Lipidzusammensetzung nach bekannten Verfahren dargelegt ist. Aus Tabelle I ist ersichtlich, daß das in den erfindungsgemäß erhältlichen Kügelchen eingekapselte Volumen wesentlich größer ist als das Volumen, das in den nach den bekannten Verfahren erhaltenen Kügelchen eingekapselt werden kann.

Die für alle Beispiele verwendete Lipidzusammensetzung (ausgedrückt in Gew.%) ist die folgende:

Beispiel 1 Herstellung von unilemallaren Lipidkügelchen des Typs LUV nach dem erfindungsgemäßen Verfahren

In einen 150 ml Aerosolbehälter wiegt man 0,5 g einer Lipidmischung der zuvor genannten Zusammensetzung ein. Man gibt 100 g Trichlorfluormethan zu, verschließt den Aerosolbehälter hermetisch mit einer Einheit aus Ring-Ventil-Eintauchröhrchen, löst die Lipide in ihrem Lösungsmittel durch Bewegen des Behälters bei einer Temperatur von ungefähr 40°C und läßt dann auf Umgebungstemperatur abkühlen. Man gibt 4 g Lachgas in den Aerosolbehälter, um dort einen Druck von 6 bar zu erzeugen. Auf dem Aerosolbehälter befestigt man die Vorrichtung, die aus einem Übergangsröhrchen, einem Injektornadel-Mikroschieber mit Mikrometerschraube, einem Kapillarröhrchen mit einem inneren Durchmesser von 0,3 mm und einem Verteiler mit einem rostfreien Metallnetz mit Maschen von 2 Mikron besteht. Man taucht den Verteiler in 50 ml einer 0,3 molaren Glucoselösung, die in einem Erlenmeyerkolben enthalten ist, welcher einen flachen Boden besitzt und einem Anschlußstück zum Anlegen von Vakuum ausgestattet ist. Den Erlenmeyerkolben stellt man in ein Wasserbad, das auf 20°C thermostatisiert ist, und auf einen Magnetrührer. Man verbindet die Auslaßöffnung zum Anlegen von Vakuum des Erlenmeyerkolbens mit einer Wasserstrahlpumpe, die einen verminderten Druck von 15 mbar ermöglicht. Man regelt den Mikroschieber so, daß er einen Ausstoß in Form von Tröpfchen von 3 ml/min liefert. An die wäßrige Dispersion der so gebildeten Kügelchen legt man eine Stunde einen verminderten Druck von 0,1 mbar an, um die letzten Lösungsmittelspuren zu entfernen. Die Kügelchendispersion erhält man in einer Lipidkonzentration von 1%. Die mit Hilfe eines Korngröße-Bestimmungsgeräts auf Basis einer quasi-elastischen Diffusion (Nanosizer) gemessene, mittlere Größe beträgt 300 nm. Der durch Bestimmung der eingekapselten Glucose ermittelte Quellkoeffizient beträgt 18 µl/mg Lipide (vgl. Tabelle I).

Vergleichsbeispiel A Herstellung von multilamellaren Kügelchen durch Ultradispersion

Dieses Verfahren ist in der FR-PS 23 15 991 beschrieben.

In einen 250 ml Becher aus rostfreiem Stahl wiegt man 8 g der Lipidmischung der zuvor genannten Zusammensetzung ein und schmilzt sie bei 100 bis 120°C. Bei 80°C gibt man 20 g einer wäßrigen, 0,3 molaren Glucoselösung zu und homogenisiert die so gebildete Lipidphase (lamellare Phase) mit Hilfe eines metallischen Spatels. Danach gibt man 72 g einer wäßrigen 0,3 M Glucoselösung zu, unterwirft das Ganze einem Ultradispergierer Virtis Modell 60 K, regelt die Turbinengeschwindigkeit auf 40 000 Touren/min und bewegt 30 min. Das Erwärmen der bläschenartigen Dispersion begrenzt man dadurch, daß man sie in ein auf 20°C thermostatisiertes Wasserbad taucht. Man erhält eine Kügelchendispersion mit einer Lipidkonzentration von 8%. Die in einem Nanosizer bestimmt, mittlere Größe beträgt 300 nm. Der Quellkoeffizient beträgt 7 µl/mgl Lipide, bestimmt durch Analyse der eingekapselten Glucose (vgl. Tabelle I).

Vergleichsbeispiel B Herstellung von unilamellaren Kügelchen des Typs SUV durch das Ultraschallverfahren

In einen 100 ml Rundkolben wiegt man 0,3 g der Lipidmischung der zuvor genannten Zusammensetzung ein, löst die Mischung in 5 ml einer Chloroform-Methanol-Mischung (Verhältnis 2 : 1) und verdampft das Lösungsmittel mit Hilfe eines Rotationsverdampfers. Letztere Lösungsmittelspuren entfernt man, indem man mit einer Radialschieberpumpe einen reduzierten Druck 1 h an die Mischung der Produkte anlegt. Den erhaltenen Lipidfilm bringt man in Kontakt mit 10 ml einer 0,3 molaren, wäßrigen Glucoselösung, stellt Kolben auf eine Schüttelmaschine und schüttelt 2 h heftigt bei einer Temperatur von 60°C. Dann kühlt man, zunehmend bis zu Umgebungstemperatur. Die Kügelchendispersion behandelt man dann 20 min mit Ultraschall, indem man sie mit einer Mikrosonde in Kontakt bringt, die mit einem Branson-Generator des Typs Sonifier B 30 verbunden ist. Während der Behandlung mit Ultraschall begrenzt man das Erwärmen der Kügelchendispersion mittels eines auf 20°C thermostatisierten Wasserbades. Die erhaltene Kügelchendispersion besitzt eine Lipidkonzentration von 3%. Die im Nanosizer bestimmte, mittlere Größe beträgt 90 nm. Der Quellkoeffizient beträgt 2 µl/mg Lipide, bestimmt durch Analyse der eingekapselten Glucose (vgl. Tabelle I).

Vergleichsbeispiel C Herstellung von unilamellaren Lipidkügelchen des Typs LUV durch Dialyse

In einen 100 ml Rundkolben wiegt man 0,15 g der Lipidmischung der obengenannten Zusammensetzung ein, löst diese in 3 ml einer Chloroform-Methanol-Mischung (Verhältnis 2 : 1) und verdampft das Lösungsmittel mit Hilfe eines Rotationsverdampfers. Dann entfernt man letzte Lösungsmittelspuren, indem man an die Mischung der Produkte eine Stunde einen verminderten Druck anlegt, der durch eine Radialschieberpumpe erzeugt wird. Den erhaltenen Lipidfilm bringt man in Kontakt mit 10 ml einer 0,3 molaren, wäßrigen Glucoselösung, stellt den Kolben auf eine Schüttelmaschine und schüttelt 2 h heftig bei einer Temperatur von 60°C. Dann gibt man 600 mg Octylglucosid zu, wobei man weiter 2 h bei 60°C schüttelt. Die so erhaltene Mizellenlösung ist klar. Man gibt 5 ml dieser Lösung in eine Dialysezelle von Lipoprep Diachema "Bilayer Liposome Preparation Device". Es werden dabei folgende Bedingungen eingestellt:

- Temperatur des Dialyseabteils: 18 h 60°C, dann zunehmende Abkühlung während eines Zeitraums von 4 h von 60 auf 25°C;
- Dialyseausstoß: 2 ml/min für jede der beiden Halbzellen;
- Dialyselösung: 0,3 molare Glucose;
- Rührgeschwindigkeit des Magnetstabs in der Zelle: 100 U/min.

Die erhaltene Kügelchendispersion besitzt eine Lipidkonzentration von 1,5%. Die im Nanosizer bestimmte Größe beträgt 150 nm. Der Quellkoeffizient beträgt 4 µl/mg Lipide, bestimmt durch Analyse der eingekapselten Glucose.

Tabelle I

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von unilamellaren Lipidkügelchen mit einem mittleren Durchmesser von mehr als 100 nm, in denen eine Substanz eingekapselt ist, wobei man
das (die) zur Bildung der Hülle der Kügelchen bestimmte(n) Lipid(e) in mindestens einem in Wasser unlöslichen Lösungsmittel unter Bildung einer Lipidlösung solubilisiert,
die Lipidlösung in flüssigem Zustand in einem Behälter bei einem Druck P₁ und einer Temperatur R₁ konditioniert,
die einzukapselnde Substanz unter Bildung einer wäßrigen Phase solubilisiert,
diese wäßrige, einzukapselnde Phase bei einem Druck P₂ und einer Temperatur R₂ konditioniert und
die Lipidlösung in die wäßrige Phase derart injiziert, daß sich das oder die Lösungsmittel der Lipidlösung verflüchtigt oder verflüchtigen, wenn es (sie) mit dieser wäßrigen Phase in Kontakt kommt (kommen),
dadurch gekennzeichnet, daß man
die Lipidlösung in die einzukapselnde, wäßrige Phase derart injiziert, daß man am Anfang Tröpfchen erhält, wobei der Druck P₂ niedriger ist als P₁ und der Dampfdruck des Lösungsmittels oder der Lösungsmittel in diesen Tröpfchen bei der Temperatur R₂.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man im wesentlichen gleiche Temperaturen R₁ und R₂ wählt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in einem Aerosolbehälter, der ein Treibmittel enthält, konditioniert und daß man den Druck P₂ so wählt, daß er unter dem Atmosphärendruck liegt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Lipid oder Lipide verwendet, welches oder welche in dem flüssigen Inhalt des Aerosolbehälters vollständig löslich ist (oder sind).

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck P₁ von 1 bis 8 bar (absolut) arbeitet.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck P₁ von 4 bis 6 bar (absolut) arbeitet.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für das (die) Lipid(e) ein Lösungsmittel oder Lösungsmittel verwendet, dessen (deren) Siedepunkt unterhalb 25°C liegt, und daß man die Temperaturen R₁ und R₂ so wählt, daß sie im wesentlichen der Raumtemperatur entsprechen.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für das (oder die) Lipid(e) ein oder mehrere schwach polare Lösungsmittel wählt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 8 gemeinsam, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel halogenierte Kohlenstoffverbindungen wählt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel ein komprimiertes Gas verwendet, das in der flüssigen, in der Aerosolbombe enthaltenen Phase löslich ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel ein verflüssigtes Gas einsetzt, das mit der in der Aerosolbombe enthaltenen Lipidlösung mischbar ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel einen Kohlenwasserstoff einsetzt, der gegebenenfalls halogeniert ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel ein komprimiertes Gas einsetzt, das in der in der Aerosolbombe enthaltenen, flüssigen Phase nicht löslich ist.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß man das Treibmittel und das Lösungsmittel in der Aerosolbombe durch einen Beutel aus Plastik oder Metall getrennt hält.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lipid oder die Lipide in dem oder den Lösungsmitteln in einer Konzentration von 0,01 bis 10 g/100 ml Lösungsmittel löst.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei man ein oder mehrere ionische(s) Lipid(e) verwendet, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Verbesserung der Löslichkeit des ionischen Lipids oder der ionischen Lipide ein zusätzliches Lösungsmittel einsetzt, das polarer ist als das oder die Basislösungsmittel.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man als zusätzliches Lösungsmittel Ethylmethylether einsetzt.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß man in die Lipidlösung zusätzlich lipophile Substanzen gibt.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Injektion der Lipidlösung in die einzukapselnde wäßrige Phase einen Mikroschieber verwendet.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß man den Mikroschieber so reguliert, daß er einen Ausstoß zwischen etwa 5 ml/h und 10 ml/min ermöglicht.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck P₂ zwischen 0,1 mbar und 15 mbar arbeitet.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in den die wäßrige Phase der einzukapselnden Substanz enthaltenden Behälter mit Hilfe eines Kapillarröhrchens zuführt.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Temperatur R₂ niedriger als 25°C arbeitet.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei die einzukapselnde Substanz eine nichtabbaubare Substanz ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die einzukapselnde, wäßrige Phase mit Hilfe eines Ultraschallbades bewegt.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die einzukapselnde Substanz eine proteinartige Substanz ist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Antischaummittel in die einzukapselnde, wäßrige Phase einführt.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man die Kügelchen kontinuierlich herstellt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in ein Kanalsystem injiziert, in dem man die einzukapselnde, wäßrige Phase zirkulieren läßt.

28. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie als ersten Behälter einen Aerosolbehälter (1) mit einem Auslaßventil (3), und einen zweiten Behälter (2), in dem ein verminderter Druck aufrechterhalten werden kann, Mittel, die es ermöglichen, den Inhalt des ersten Behälters in den Inhalt des zweiten Behälters zu injizieren und einen Mikroschieber (6) zur Regulierung des zu injizierenden Flüssigkeitsstroms, aufweist.

29. Vorrichtung nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die Mittel, die es ermöglichen, den Inhalt des ersten Behälters in den Inhalt des zweiten Behälters zu injizieren, einerseits aus einem röhrchenförmigen Übergangsteil (9), das an einem seiner Enden an den Auslaßstutzen des Auslaßventils des Aerosolbehälters (1) und an seinem anderen Ende an den Eingang des Mikroschiebers (6) angepaßt ist, und andererseits aus einem Kapillarröhrchen (7) besteht, dessen eines Ende an den Ausgang des Mikroschiebers (6) angepaßt ist.

30. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroschieber (6) ein Injektornadel-Mikroschieber ist.

31. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Kapillarröhrchen (7) einen Durchmesser besitzt, der geringer ist als ungefähr 0,3 mm.

32. Vorrichtung nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß sich am Ende des Kapillarröhrchens eine Diffusoreinrichtung befindet.