DE3410602A1 - Verfahren zur herstellung von lipidblaeschen durch verdampfen von loesungsmitteln und vorrichtung zur durchfuehrung dieses verfahrens - Google Patents
Verfahren zur herstellung von lipidblaeschen durch verdampfen von loesungsmitteln und vorrichtung zur durchfuehrung dieses verfahrensInfo
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Description
« β »te«
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von unilamellaren Lipidbläschen mit einem mittleren
Durchmesser von mehr als 1OOO £ und eine Vorrichtung
zur Durchführung dieses Verfahrens.
Mit den Lipidbläschen kann eine wäßrige Flüssigkeit, z. B. eine wäßrige Lösung einer biologisch aktiven Substanz,
eingekapselt werden. Bekanntlich erhält man je nach dem Verfahren, das man zur Herstellung von Bläschen
verwendet, entweder multilamellare Bläschen (vesicules multilamellairesj MLV), die jeweils aus mehreren
sphärischen Lipidbläschen bestehen, oder unilamellare Bläschen, die nur ein einziges Lipidblättchen
aufweisen. Im letzteren Fall erhält man je nach dem Herstellungsverfahren Bläschen mit einem Durchmesser kleiner als 1OOO £ (SUV) oder mit einem Durchmesser
größer als 1000 % (LUV).
Unilamellare Bläschen besitzen gegenüber multilamellaren . Bläschen Vorteile, da letztere unterschiedlich groß
~ sind und eine ungleichmäßige Anzahl von Blättchen besitzen. Von den unilamellaren Bläschen besitzen außerdem
diejenigen der zweiten Art (LUV) Vorteile gegenüber denjenigen der ersten Art (SUV), da sie größer sind und
somit eine größere Fähigkeit zur Verkapselung besitzen. Außerdem können mit diesen Bläschen Makromoleküle mit
erhöhtem Molekulargewicht eingekapselt werden. Forschungsarbeiten beschäftigen sich daher damit, unilamellare
Bläschen des Typs (LUV) im industriellen Maßstab größtmöglicher Ausbeute herstellen zu können.
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Zur Herstellung dieser Art von unilamellaren Bläschen sind derzeit zwei Herstellungsverfahren bekannt: ein
Dialyseverfahren zur Entfernung des Detergens und ein Verfahren zur Verdampfung von Lösungsmitteln.
In dem Artikel von David S.Cafiso (Biochemica et Biophysica Acta, 649 (1981), 129-132, mit dem Titel
»Preparation of unilamellar lipid vesicles at 37°C by
vaporization methods") ist ein Verfahren beschrieben, das Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt zur Herstellung
von Bläschen des Typs LUV bei physiologischen Temperaturen einsetzt. Gemäß diesem bekannten Verfahren
injiziert man in eine Kolonne mit einem Wasserpuffer von 370C Ethylmethylether- oder Dichlorfluormethan-Lösungen
von 40C, welche solubilisierte Lipide enthalten.
In dieser Druckschrift sind die prinzipiellen Vorteile dieses Verfahrens beschrieben. Diese Vorteile
eind einerseits, daß die hitzeempfindlichen Substanzen
im Inneren des Bläschens ohne thermische Denaturierung leichter eingeschlossen werden können und daß andererseits
die Anzahl der Lipide, die in Dichlorfluormethan löslich sind, größer ist als die Zahl der Lipide, die
in zahlreichen anderen Lösungsmitteln solubilisiert werden können. Obwohl dieses Verfahren, bei dem die Injizierungsstufe
in einem Milieu von 37°C durchgeführt wird, eine Verbesserung, der zuvor bekannten Verfahren
darstellt, bei denen das Injektionsmilieu im allgemeinen
eine Temperatur von 60 bis 650C besaß, ist dieses Verfahren jedoch nicht bei Substanzen anwendbar,
die sich bei Temperaturen unterhalb 37°C zersetzen. So findet beispielsweise bei 37°C die Denaturierung von
verschiedenen Proteinen oder die Inaktivierung bestimmter, aktiver Moleküle statt.
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Man hat daher versucht, die obengenannten Nachteile zu vermeiden. Dies zeigt auch die europäische Patentanmeldung
55 576. In dieser Anmeldung ist ein industrielles Verfahren zur Herstellung von Bläschen unter milden
Bedingungen vorgeschlagen (d.h. unterhalb der Übergangstemperatur von Lipidbläschen und ohne daß man stark auf
das aufnehmende Milieu einwirken muß). Bei diesem Verfahren verwendet man ein« Lösungsmittelsystem für die
Lipide. Dieses System umfaßt ein wasserlösliches Lösungsmittel S1, das aus Methanol, Ethanol, Propanol und
Isopropanol ausgewählt ist, und ein hydrophobes Lösungsmittel S2, das flüchtiger ist als die wäßrige Lösung und
das ausgewählt ist aus Hexan, Cyclohexan, 2,2-Dimethylbutan,
Pentan, Isopentan und 1,1,2-Trichlortrifluormethan.
Da der Siedepunkt von S2 höher ist als Umgebungstemperatur (28 bis 810C),muß man die Bläschendispersion
auf eine verhältnismäßig hohe Temperatur bringen, um S2 zu entfernen. Da außerdem S2 wasserlöslich
ist, muß man diese Dispersion dialysieren oder über eine Kolonne filtrieren, um das Lösungsmittel S2 zu entfernen.
Folglich kann auch das in der europäischen Patentanmeldung 55 556 beschriebene Verfahren nicht dazu
eingesetzt werden, thermisch empfindliche Substanzen einzukapseln.
Es wurde nun gefunden, daß man Bläschen bei niedriger Temperatur herstellen kann, wenn man den Druck vermindert,
bei dem die einzukapselnde, wäßrige Phase konditioniert ist. Es wurde gefunden, daß man, wenn man mit
vermindertem Ausstoß bei reduziertem Druck eine Lipidlösung, die in einem unter Druck stehenden Behälter konditioniert
ist, in ein wäßriges, aufnehmendes Milieu injiziert, bei den zuvor genannten Temperaturen Bläschen
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• «
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in einer sehr befriedigenden Ausbeute erhält. Das beobachtete Phänomen beruht auf der Kombination zweier
Faktoren: Einerseits wird die Injektion mit einem verminderten Ausstoß durchgeführt; andererseits ist derjenige
Druck, bei dem die einzukapselnde, wäßrige Phase konditioniert ist, geringer als der Druck, bei dem die
Lipidlösung in flüssigem Zustand konditioniert ist, und niedriger als der Dampfdruck der oder des Lösungsmittels)
in den Tröpfchen, die sich am Injektionspunkt bei der Temperatur des aufnehmenden Milieus bilden.
Zur Erklärung der wesentlich besseren Leistungsfähigkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu
den bekannten Verfahren, bei denen Lösungsmittel verdampft werden und bei denen die Lipidmilieus und die
empfangenden Milieus unter normalem Druck stehen, hat man die Hypothese entwickelt, ohne jedoch an diese Err
klärung gebunden zu sein, daß sich bei den bekannten Verfahren im Injektionsmilieu ein verhältnismäßig langsamer,
thermischer Austausch ausbildet, so daß sich die ' Lipidtröpfchen teilen und zu verhältnismäßig kleinen
(mittlerer Durchmesser 150 nm) Bläschen führen. Im Gegensatz dazu wurde erfindungsgemäß gefunden, daß die in
das aufnehmende Milieu eingeführten Tröpfchen praktisch unverzüglich platzen, so daß unilamellare Bläschen mit
großem Umfang gebildet werden. Folglich ist der erfindungsgemäß durch Druckverminderung im wäßrigen Milieu
hervorgerufene "Blitz" ("flash") nicht vergleichbar mit dem bekannten Blitz, der auf einer Temperaturerhöhung
durch Injektion in das aufnehmende Medium beruht. Erfindungsgemäß ist es außerdem möglich, bei einer beliebigen
Temperatur des aufnehmenden Mediums zu arbeiten.
Vorzugsweise arbeitet man bei einer Temperatur, die un-
» β «φ«
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Al
terhalb 250C liegt, damit man thermoempfindliche Substanzen
einkapseln kann.
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Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von unilamellaren Lipidblaschen mit einem
mittleren Durchmesser von mehr als 1OOO A9 wobei jedes
dieser Bläschen aus einem sphärischen Lipidblättchen besteht, in dem sich eine einzukapselnde Substanz befindet,
wobei man das (die) zur Bildung des Blättchens der Bläschen bestimmte(n) Lipid(e) in mindestens einem
in Wasser unlöslichen Lösungsmittel solubilisiert, die Lipidlösung in flüssigem Zustand in einem Behälter bei
einem Druck P1 und einer Temperatur θ^ konditioniert,
die einzukapselnde Substanz zur Herstellung einer wäßrigen Phase solubilisiert, diese wäßrige, einzukapselnde
Phase bei einem Druck Pg und einer Temperatur Qp konditioniert und die Lipidlösung in die wäßrige
· Phase derart injiziert, daß sich das oder die Lösungsmittel der Lipidlösung verflüchtigt oder verflüchtigen,
wenn es (sie) mit dieser wäßrigen Phase in Kontakt kommt
oder kommen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Lipidlösung in die einzukapselnde, wäßrige Phase
mit einem verringerten Ausstoß injiziert, damit man am Anfang Tröpfchen erhält, wobei der Druck P2 niedriger
ist als P1 und der Dampfdruck des (oder der) Lösungsmittel^)
in diesen Tröpfchen bei der Temperatur Θ2·
Vorzugsweise wählt man die Temperaturen θ^ und Q2 so,
daß sie im wesentlichen gleich sind.
Bei einer bevorzugten, ©rfindungsgemäßen Ausführungsform
konditioniert man die Lipidlösung in einem Behälter vom Typ "Aerosolbombe", der ein Treibmittel enthält. Man
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1
wählt den Druck Ρ2 so, daß er unter Atmosphärendruck liegt. Aus nachstehend angegebenen Gründen verwendet
man vorzugsweise ein oder mehrere Lipid(e), die in der in der Aerosolbombe enthaltenen Flüssigkeit völlig löslich
sind. Der Druck P^ in der Aerosolbombe liegt bei spielsweise
zwischen 1 und 8 bar (absolut). Vorzugsweise liegt der Druck P* zwischen 4 und 6 bar (absolut).
Zur Einkapselung von thermo empfindlichen Substanzen verwendet man als Lösungsmittel für das oder die Lipid(e)
ein oder mehrere Lösungsmittel, dessen (deren) Siedepunkt unterhalb 25°C liegt. Ferner arbeitet man bei Temperatüren
Θ,. und θρ, die im wesentlichen Umgebungstemperatur
entsprechen. Weiterhin verwendet man als Lösungsmittel für das (die) Lipid(e) ein oder mehrere Lösungsmittel
mit geringer Polarität. Als Lösungsmittel, die die obengenannten Bedingungen erfüllen, kann,man insbesondere
halogenierte Kohlenstoffverbindungen nennen. Von diesen kann man Trichlorfluormethan, Dichlorfluormethan
und Dichlordifluormethan nennen.
Das erfindungsgemäß verwendete Treibmittel kann ein komprimiertes Gas sein, das in der in der Aerosolbombe enthaltenen,
flüssigen Phase löslich ist. Man kann Lachgas oder Kohlendioxid einsetzen. Das Treibmittel kann auch
ein verflüssigtes Gas sein, das mit der in der Aerosolbombe enthaltenen Lipidlösung mischbar ist und im wesentliehen
aus einem Kohlenwasserstoff besteht, der gegebenenfalls halogeniert ist. Als Kohlenwasserstoffe kann
man Butan und Propan und als halogenierte Kohlenstoffe kann man Chlorfluoralkane, wie Dichlorfluormethan,
Dichlordifluormethan und 1,2-Dichlor-1,1,2,2-tetrafluorethan,nennen.
Das Treibmittel kann auch aus einem
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/JIj.
komprimierten Gas bestehen, das in der in der Aerosolbombe enthaltenen, flüssigen Phase nicht löslich ist.
Dieses komprimierte Gas kann Stickstoff sein. Is.t das
Treibmittel ein mit der Lipidlösung der Aerosolbombe mischbares, verflüssigtes Gas, so kann sich die Löslichkeit
der Lipide in dem Lösungsmittel vermindern. In diesem Fall kann man das Treibmittel und das Lösungsmittel
in der Aerosolbombe mittels einem Beutel aus Plastik oder Metall trennen.
Erfindungsgemäß löst man das (oder die) Lipid(e) in dem
ausgewählten Lösungsmittel in einer Konzentration von 0,01 bis 10 g/100 ml Lösungsmittel.
Falls man ein oder mehrere ionische Lipide verwendet, setzt man vorteilhafterweise ein zusätzliches Lösungsmittel
ein, das polarer ist als das oder die. Grundlösungsmittel. Man verbessert so die Löslichkeit des (oder
der) ionischen Lipid(e). Als Beispiel für ein derartiges zusätzliches Lösungsmittel kann man Ethylmethylether
nennen.
Es ist ferner möglich, in die Lipidlösung einzukapselnde,
lipophile Substanzen einzuführen, wobei diese Substanzen in den Wandungen der Bläschen bleiben, die sich
zuvor gebildet haben.
Um einen verminderten Ausstoß der Lipidlösung in den die einzukapselnde, wäßrige Phase enthaltenden Behälter
sicherzustellen, verwendet man vorteilhafterweise einen Mikroschleber, den man vorzugsweise derart regelt, daß
er einen Ausstoß zwischen 5 ml/h und 10 ml/min liefert.
M/25 022 JS
In Abhängigkeit von den anderen erfindungs gemäß en Verfahrensbedingungen
wählt man den Druck P2 so, daß er zwischen 0,1 mbar und 15 mbar liegt. Die Lipidlösung
leitet man mittels eines Kapillarröhrchens in die in dem Behälter vorhandene, wäßrige Phase der einzukapselnden
Substanz. Die Temperatur Q2 der einzukapselnden
Phase hält man mit Hilfe eines Thermostaten konstant niedrig. Vorzugsweise arbeitet man bei einer Temperatur
Q2, die niedriger ist als 25°C Die einzukapselnde Phase
bewegt man leicht. Handelt es sich bei der einzukapselnden Substanz um eine nicht abbaubare Substanz,
dann bewegt man die einzukapselnde, wäßrige Phase πιει 5 chanisch mit Hilfe eines Ultraschallbades. Handelt es
sich bei der einzukapselnden Substanz um eine Proteinsubstanz, dann gibt man in die einzukapselnde, wäßrige
Phase ein Antischaummittel.
Erfindungs gemäß kann man außerdem vorteilhafterweise die Bläschen fortlaufend herstellen. Bei einer bevorzugten
Ausführungsform injiziert man die Lipidlösung in ein Kanalsystem, in dem man die einzukapselnde, wäßrige
Phase zirkulieren läßt.
Bei der Durchführung des erfindungs gemäßen Verfahrens regelt man zweckmäßigerweise die durch den Mikroschieber
vorgegebenen Werte für den Ausstoß und den Druck P2
in Abhängigkeit von der einzukapselnden Substanz. Bei den gelösten Stoffen, die keine Proteinsubstanzen sind,
kann man einen maximalen Ausstoß verwenden und bei einem Druck P2 von 15 mbar bis 0,1 mbar arbeiten. Zur Verkapselung
von Proteinprodukten, bei denen die Gefahr besteht, daß sich ein stabilisierter Schaum bildet, arbeitet
man jedoch bei einem geringen Ausstoß und bei einem geringfügig verminderten Druck.
0 9 M «β ·»
* fr
M/25 022 Jf
Es wurde gefunden, daß die Heterogenität der Verteilung der Bläschen wenig vom Ausstoß, im mittleren Maß von
der Lipidkonzentration der Aerosolbombe und den Mitteln zum Bewegen bzw. Rühren der wäßrigen Lösung und stark
von der einzukapselnden Substanz, insbesondere dessen Viskosität,und der Ausflockung der in bestimmten Arten
von gelösten Stoffen gebildeten Bläschen abhängt.
Die nach dem erfindungs gemäßen Verfahren erhaltene, endgültige Bläschenlösung besitzt eine Konzentration an
Lipiden, die zwischen 0,1 und 10 Gew.% liegen kann. Das eingekapselte Volumen ist größer als bei den nach den
bekannten Verfahren erhaltenen Bläschen.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens, die dadurch
gekennzeichnet ist, daß sie einen ersten Behälter vom Typ "Aerosolbombe11, der ein Auslaßventil besitzt,
und einen zweiten Behälter, in dem ein verminderter Druck aufrechterhalten werden kann, Mittel, die es ermöglichen,
daß die Flüssigkeiten des ersten und des zweiten Behälters miteinander derart in Verbindung stehen,
daß der Inhalt des ersten Behälters in den Inhalt des zweiten Behälters injiziert werden kann, und einen
Mikroschieber aufweist, welcher mit den-zuvor genannten
Mitteln so verbunden ist, daß der Ausstoß der Injektion reguliert werden kann.
Nach einer bevorzugten^ erfindungsgemäßen Ausführungsform bestehen die Mittel, die es ermöglichen, daß eine
Flüssigkeit vom ersten zum zweiten Behälter gelangen kann, einerseits aus einem röhrchenförmigen übergangs-
qc teil, das an einem seiner Enden an den Auslaß-
Μ/25 022
stutzen des Auslaßventils des Aerosolbehälters und an seinem anderen Ende an den Eingang des Mikroschiebers
angepaßt ist, und andererseits aus einem kapillaren Verteilungsröhrchen besteht, dessen eines Ende an den
Ausgang des Mikroschiebers angepaßt ist. Vorzugsweise ist der Mikroschieber ein Injektornadel-Mikroschieber.
Das erfindungsgemäß eingesetzte Kapillarröhrchen besitzt
einen Durchmesser kleiner als ungefähr 0,3 mm. Eine Verteilvorrichtung ist am Ende des Kapillarröhrchens
angebracht, um eine Verteilung zu gewährleisten. Der zweite Behälter weist einen Thermostaten auf. Der
zweite Behälter ist ferner mit Mitteln ausgestattet, durch die sein Inhalt bewegt bzw. gerührt werden kann.
Zum besseren Verständnis der Erfindung werden nachstehend mehrere Ausführungsformen der Erfindung beschrieben.
Die Zeichnungen zeigen eine schematische Ansicht der zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
dienenden Vorrichtung.
In den Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 eine schematische Gesamtansicht einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens;
Fig. 2 eine Ansicht im vergrößerten Maßstab eines erfindungs gemäßen Aerosolbehälters, auf dessen Auslaß
ein Mikroschieber angebracht ist, der dazu dient, den für das erfindungs gemäße Verfahren erforderlichen,
verminderten Ausstoß zu gewährleisten; und
Fig. 3 eine schematische Schnittansicht eines Aerosolbehälters, der zur Aufnahme eines verflüssigten
Treibmittels dient, welches die Löslichkeit der Lipide im Lösungsmittel vermindern kann.
M/25 022
1
1
Die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung besitzt einen ersten Behälter, der aus einer Aerosolbombe 1 besteht, und einen
zweiten Behälter, der aus einem Ballon 2 besteht, in dem ein verminderter Druck "P^ aufrechterhalten werden
kann.
Der Aerosolbehälter 1 weist ein Schließventil 3 und ein Röhrchen 4 auf, das in die darin enthaltene Flüssigkeit
5 taucht. Der Ausgang der Aerosolbombe ist mit einem Mikroschieber 6 verbunden, an dessen Ausgang sich ein
Kapillarröhrchen 7 befindet, das in die Flüssigkeit 8 des Ballons 2 taucht. Dieses Kapillarröhrchen besitzt
einen Durchmesser von ungefähr 0,3 mm und eine Länge von ungefähr 20 cm.
Bei einer besonderen Ausführungsform der Fig. 2 ist ein röhrchenförmiges Übergangsteil 9 an einem seiner Enden
an die Öffnung des Auslaßventils 3 und an seinem anderen Ende an den Eingang des MikroSchiebers 6 angepaßt. Dazu
greift das Teil 9 mit seinem Auslaßende in die zentrale Ausbohrung 10 eines ersten Ringes 11 ein, wobei die Ausbohrung
10 auf der gegenüberliegenden Seite die Auslaßöffnung 12 des Mikro Schiebers 6 aufnimmt. Außerdem ist
der Ring 11, der ein Schrumpfring ist, mit einem zweiten
Ring 13 verbunden, welcher um den Hals des Aerosolbehälters 1 verläuft. Diese beiden Ringe werden durch Verschrauben
der beiden konzentrischen Schürzen 11a und 13a verbunden, welche sich jeweils an den Ringen 11 und 13
befinden.
Der Mikroschieber 6 ist ein InJektornadel-Mikroschieber,
der mittels der Schraube 14 eine· sehr feine Regulierung ermöglicht. Man kann beispielsweise einen "Nupro"-Schie-
M/25 022 J^r xf^
ber (Bezeichnung SS2SG) aus rostfreiem Stahl verwenden. Das Kapillarröhrchen 7 ist mit Hilfe eines Ubergangsgliedes
15 am Ausgang des Mikroschiebers 6 befestigt.
Enthält der Aerosolbehälter 1 ein Treibmittel, das aus einem verflüssigten Gas besteht, welches mit der in der
Aerosolbombe enthaltenen Lipidlösung mischbar ist und welches die Löslichkeit der Lipide in den verwendeten
Lösungsmitteln vermindern kann, trennt man das Treibmittel vom Lösungsmittel, in dem die Lipide solubilisiert
sind, durch eine Tasche bzw. einen Beutel 17 aus einem Plastikmaterial oder aus Metall, wobei sich das
Treibmittel außerhalb der Tasche bzw. des Beutels 17 befindet.
In den nachfolgenden Beispielen ist die erfindungsgemäße
Herstellung von Lipidbläschen beschrieben. Es sind auch Vergleichsbeispiele A, B und C beschrieben, in denen die
Herstellung von Bläschen identischer Lipidzusammensetzung nach bekannten Verfahren dargelegt ist. Aus Tabelle
I ist ersichtlich, daß das in den erfindungsgemäß erhältlichen
Bläschen eingekapselte Volumen wesentlich größer ist als das Volumen, das in den nach den bekannten
Verfahren erhaltenen Bläschen eingekapselt werden kann.
Die für alle Beispiele verwendete Lipidzusammensetzung (ausgedrückt in Gew.#) ist die folgende:
- nichtionische Lipidverbindung der allgemeinen Formel
R fO
CH2OH
M/25 022 ^ Io
worin R einen Hexadecylrest bedeutet und
η für 3 steht (statistischer Mittelwert) 47,5%
- Cholesterin . 47,5%
- Dicetylphosphat 5 %
B eispiel 1
Herstellung von unilemallaren Lipidbläschen des Typs
LUV nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
In einen 150 ml Aerosolbehälter wiegt man 0,5 g einer Lipidmischung der zuvor genannten Zusammensetzung ein.
Man gibt 100 g Trichlorfluormethan zu, verschließt den
Aerosolbehälter hermetisch mit einer Einheit aus Ring-Ventil-Eintauchröhrchen,
löst die Lipide in ihrem Lösungsmittel durch Bewegen des Behälters bei einer Temperatur
von ungefähr 40°C und läßt dann auf Umgebungstemperatur abkühlen. Man gibt 4 g Lachgas in den Aerosolbehälter,
um dort einen Druck von 6 bar zu erzeugen. Auf dem Aerosolbehälter befestigt man die Vorrichtung, die
aus einem Übergangsröhrchen, einem Injektornadel-Mikroschieber
mit Mikrometerschraube, einem Kapillarröhrchen mit einem inneren Durchmesser von 0,3 mm und einem Verteiler
mit einem rostfreien Metallnetz mit Maschen von 2 Mikron besteht. Man taucht den Verteiler in 50 ml einer
0,3 molarenGlucoselösung, die in einem Erlenkolben
enthalten ist, welcher einen flachen Boden besitzt und einem Anschlußstück zum Anlegen von Vakuum ausgestattet
ist. Den Erlenkolben stellt man in ein Wasserbad, das auf 200C thermostatisiert ist, und auf einen Magnetrührer.
Man verbindet die Auslaßöffnung zum Anlegen von Vakuum des Erlenkolbens mit einer Wasserstrahlpumpe,
die einen verminderten Druck von 15 mbar ermöglicht. Man regelt den Mikroschieber so, daß er einen Ausstoß von
Μ/25 022
3 ml/min liefert. An die wäßrige Dispersion der so gebildeten Bläschen legt man eine Stunde einen verminderten
Druck von 0,1 mbar an, um die letzten Lösungsmittelspuren zu entfernen. Die Bläschendispersion erhält man
in einer Lipidkonzentration von 1%. Die mit Hilfe eines Korngröße-Bestimmungsgeräts auf Basis einer quasi-elastischen
Diffusion (Nanosizer) gemessene, mittlere Größe beträgt 300 nm. Die durch Analyse der eingekapselten Glucose
bestimmte Ausdehnung beträgt 18/ul/mg Lipide.
Herstellung von multilamellaren Bläschen durch Ultradispersion
Dieses Verfahren ist in der FR-PS 2 315 991 beschrieben.
In einen 250 ml Becher aus rostfreiem Stahl wiegt man 8 g der Lipidmischung der zuvor genannten Zusammensetzung
ein und schmilzt sie bei 100 bis 1200C. Bei 800C gibt
man 20 g einer wäßrigen, 0,3 molaren Glucose lösung zu
und homogenisiert die so gebildete Lipidphase (lameHare
Phase) mit Hilfe eines metallischen Spatels. Danach gibt man 72 g einer wäßrigen 0,3 M Glucoselösung zu, unterwirft
das Ganze einem Ultradispergierer Virtis Modell 60 K, regelt die Turbinengeschwindigkeit auf 40000 Touren/min
und bewegt 30 min. Das Erwärmen der bläschenartigen Dispersion begrenzt man dadurch, daß man sie in
ein auf 200C thermostatisiertes Wasserbad taucht. Man erhält eine Bläschendispersion mit einer Lipidkonzentration
von 896. Die in einem Nanosizer bestimmte, mittlere
Größe beträgt ^300 nm. Die Ausdehnung be-
trägt 7 /Ul/mg Lipide, bestimmt durch Analyse der eingekapselten
Glucose.
»VW • · W W VV „ « « «
M/25 022 45" γι
Herstellung von unilamellaren Bläschen des Typs SUV durch das Ultraschallverfahren
In einen 100 ml Rundkolben wiegt man 0,3 g der Lipidmischung der zuvor genannten Zusammensetzung ein, löst
die Mischung in 5 ml einer Chloroform-Methanol-Mischung (Verhältnis 2:1) und verdampft das Lösungsmittel mit
Hilfe eines Rotationsverdampfers. Letztere Lösungsmittelspuren entfernt man, indem man mit einer Radiaischieberpurape
einen reduzierten Druck 1 h an die Mischung der Produkte anlegt. Den erhaltenen Lipidfilm bringt man in
Kontakt mit 10 ml einer 0,3 molaren, wäßrigen Glucoselösung, stellt den Kolben auf eine Schüttelmaschine und
schüttelt 2 h heftig bei einer Temperatur von 600C. Dann
kühlt man, zunehmend bis zu Umgebungstemperatur. Die Bläschendispersion behandelt man dann 20 min mit Ultraschall,
indem man sie mit einer Mikrosonde in Kontakt bringt, die mit einem Branson-Generator des Typs
Sonifier B 30 verbunden ist. Während der Behandlung mit Ultraschall'begrenzt man das Erwärmen der Bläschendispersion
mittels eines auf 200C thermostatisierten Wasserbades. Die erhaltene Bläschendispersion besitzt eine
Lipidkonzentration von 3%· Die im Nanosizer bestimmte,
mittlere Größe beträgt 90 nm. Die Ausdehnung beträgt 2/ul/mg Lipide, bestimmt durch Analyse der
eingekapselten Glucose.
30
30
Herstellung von unilamellaren Lipidbläschen des Typs
LUV durch Dialyse .
In einen 100 ml Rundkolben wiegt man 0,15 g der Lipid-
M/25 022 *6~ Th
mischung der obengenannten Zusammensetzung ein, löst diese in 3 ml einer Chloroform-Methanol-Mischung (Verhältnis
2:1) und verdampft das Lösungsmittel mit Hilfe eines Rotationsverdampfers. Dann entfernt man letzte
Lösungsmittelspuren, indem man an die Mischung der Produkte eine Stunde einen verminderten Druck anlegt, der
durch eine Radialschieberpumpe erzeugt wird. Den erhaltenen Lipidfilm bringt man in Kontakt mit 10 ml einer
0,3 molaren, wäßrigen Glucoselösung, stellt den Ballon
auf eine Schüttelmaschine und schüttelt 2 h heftig bei einer Temperatur von 600C. Dann gibt man 600 mg Octylglucosid
zu, wobei man weiter 2 h bei 600C schüttelt.
Die so erhaltene Mizellenlösung ist klar. Man gibt 5 ml dieser Lösung in eine Dialysezelle von Lipoprep
Diachema "Bilayer Liposome Preparation Device". Es werden dabei folgende Bedingungen eingestellt:
- Temperatur des Dialyseabteils: 18 h 60°C, dann zunehmende
Abkühlung während eines Zeitraums von 4 h von 60 auf 25°C;
- Dialyseausstoß: 2 ml/min für Jede der beiden Halbzellen;
- Dialyselösung: 0,3 molare Glucose;
- Rührgeschwindigkeit des Magnetstabs in der Zelle: 100 U/min.
Die erhaltene Bläschendispersion besitzt eine Lipidkonzentration von Λ ,5%. Die im Nanosizer bestimmte Größe beträgt
150 mn. Die Ausdehnung beträgt 4 /ul/mg
Lipide, bestimmt durch Analyse der eingekapselten Glucose.
M/25 022
1 | Tabelle I | Bläschen- Verfahren art |
Ultradispersion | Mittl. Größe |
Eingekaps. Unverträglich Volumen mit |
temperaturempf. |
Beispiel A | (nm) | ( /Ul/mg 'Lipide) |
Substanzen und | |||
MLV | 300 | 7 | mechanischer Be | |||
5 | wegung | |||||
Ultraschall | dito | |||||
Beispiel B | ||||||
SUV | Dialyse | 90 | 2 | thermoempfindli | ||
Beispiel C | chen Substanzen | |||||
LUV | erfindungs gern. | 150 | 4 | nichts | ||
η | Verfahren | |||||
υ | LUV | Beispiel 1 | 300 | 18 | ||
Bestimmt durch enzymatische Mikroanalyse einer eingekapselten,
gelösten Glucosemenge. Die in einer 0,3 M Glucoselösung gebildeten Bläschen werden über eine GeI-Kolonne-Pharmacia
des Typs Sephadex G5Q Coarse filtriert, die mit einer 0,15 molaren, wäßrigen Natrium-Chloridlösung
eluiert wird. Die so von jeglichen, nichteingekapselten Glucosespuren freigewaschenen Bläschen
werden dann mit einem oberflächenaktiven Mittel, z.B. Triton X 1OO (Octylphenoxypolyethoxyethanol) mizellisiert.
Dies führt dazu, daß die zuvor eingekapselte
Glucose befreit wird und anschließend analysiert werden kann.
Claims (36)
1. Verfahren zur Herstellung von unilamellaren
Lipidbläschen mit einem mittleren Durchmesser von mehr als 1OOO &, wobei jedes dieser Bläschen aus einem sphärischen
Lipidblättchen besteht, in dem sich eine einzukapselnde Substanz befindet, wobei man
das (die) zur Bildung des Blättchens der Bläschen bestimmte(n) Lipid(e) in mindestens einem in
Wasser unlöslichen Lösungsmittel solubilisiert,
die Lipidlösung in flüssigem Zustand in einem Behälter bei einem Druck P^ und einer Temperatur Q^ konditioniert,
die einzukapselnde Substanz zur Herstellung einer wäßrigen Phase solubilisiert,
diese wäßrige, einzukapselnde Phase bei einem Druck Pp und einer Temperatur Qp konditioniert und
die Lipidlösung in die wäßrige Phase derart injiziert, daß sich das oder die Lösungsmittel der Lipidlösung
verflüchtigt oder verflüchtigen, wenn es (sie) mit dieser wäßrigen Phase in Kontakt kommt oder kommen,
dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in die einzukapselnde, wäßrige Phase mit einem verringerten Ausstoß injiziert, damit
man am Anfang Tröpfchen erhält, wobei der Druck P2
niedriger ist als P1 und der Dampfdruck des (oder der)
Lösungsmittels in diesen Tröpfchen bei der Temperatur Q2.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man im wesentlichen gleiche Temperaturen Θ..
und θ2 wählt.
6 WO
M/25 022 2
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in einem
Behälter vom Typ "Aerosolbombe", der ein Treibmittel
enthält, konditioniert und daß man den Druck P2 so
wählt, daß er unter dem Atmosphärendruck liegt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Lipid oder Lipide verwendet, welches
oder welche in dem flüssigen Inhalt der Aerosolbombe vollständig löslich ist (oder sind).
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck P^ von
1 bis 8 bar (absolut) arbeitet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck P1 von 4 bis 6 bar (absolut)
arbeitet.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für
das (die) Lipid(e) ein Lösungsmittel oder Lösungsmittel verwendet, dessen (deren)Siedepunkt unterhalb 25°C liegt,
und daß man die Temperaturen Q* und θ~ so wählt, daß
sie im wesentlichen der Raumtemperatur entsprechen.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7» dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel für
das (oder die) Lipid(e) ein oder mehrere schwach polare Lösungsmittel wählt.
9. Verfahren nach den Ansprüchen 7 und 8 gemeinsam, dadurch gekennzeichnet, daß man als Lösungsmittel halogenierte
Kohlenstoffverbindungen wählt.
M/25 022 3
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel ein komprimiertes
Gas verwendet, das in der flüssigen, in der Aerosolbombe enthaltenen Phase löslich ist.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel ein verflüssigtes
Gas einsetzt, das mit der in der Aerosolbombe enthaltenen Lipidlösung mischbar ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel einen Kohlenwasserstoff
einsetzt, der gegebenenfalls halogeniert ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Treibmittel ein komprimiertes
Gas einsetzt, das in der in der Aerosolbombe enthaltenen, flüssigen Phase nicht löslich ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12,
dadurch gekennzeichnet, daß man das Treibmittel und das Lösungsmittel in der Aerosolbombe durch einen Beutel aus
Plastik oder Metall trennt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß man das Lipid oder die Lipide
in dem oder den Lösungsmitteln in einer Konzentration von 0,01 bis 10 g/100 ml Lösungsmittel löst.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei
man ein oder mehrere ionische(s) Lipid(e) verwendet, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Verbesserung der
Löslichkeit des ionischen Lipids oder der ionischen Li-
M/25 022 4
pide ein zusätzliches Lösungsmittel einsetzt, das polarer
ist als das oder die Basislösungsmittel. 5
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet,
daß man als zusätzliches Lösungsmittel Ethylmethylether einsetzt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch
gekennzeichnet, daß man in die Lipidlösung einzukapselnde, lipophile Substanzen einführt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch
gekennzeichnet, daß man einen Mikroschieber verwendet,
um den verminderten Ausstoß der Lipidlösung in den die einzukapselnde, wäßrige Phase enthaltenden Behälter
zu gewährleisten.
20. Verfahren nach Anspruch 19» dadurch gekennzeichnet,
daß man den Mikroschieber so reguliert, daß er einen Ausstoß zwischen etwa 5 ml/h und 10 ml/min ermöglicht.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einem Druck P2 zwischen
0,1 mbar und 15 mbar arbeitet.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, dadurch
gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in den die wäßrige Phase der einzukapselnden Substanz enthaltenden
Behälter mit Hilfe eines Kapillarröhrchens zuführt.
Μ/25 022 5
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß man die Temperatur Qp der
einzukapselnden, wäßrigen Phase mit Hilfe eines Thermostaten konstant und niedrig hält.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß man bei einer Temperatur Q2
niedriger als 25°C arbeitet.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß man die einzukapselnde, wäßrige
Phase leicht bewegt.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei die einzukapselnde Substanz eine nichtabbaubare
Substanz ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die einzukapselnde, wäßrige Phase mit Hilfe eines Ultraschall-
Substanz ist, dadurch gekennzeichnet, daß man die einzukapselnde, wäßrige Phase mit Hilfe eines Ultraschall-
bades mechanisch bewegt.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 26, wobei die einzukapselnde Substanz eine proteinartige Substanz
ist, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Anti-
schaummittel in die einzukapselnde, wäßrige Phase einführt.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bläschen fortlaufend
herstellt.
29« Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lipidlösung in ein .Kanalsystem injiziert,
in der man die einzukapselnde, wäßrige Phase zirkulieren läßt.
β ο - · * tt W 9 · O V
U W V W * W O « φ
M/25 022 6
30. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 29, dadurch gekennzeichnet,
daß sie einen ersten Behälter vom Typ "Aerosolbombe" (1), der ein Auslaßventil (3) besitzt, und einen
zweiten Behälter (2), in dem ein verminderter Druck aufrechterhalten werden kann, Mittel, die es ermöglichen,
daß die Flüssigkeiten des ersten und des zweiten Behälters miteinander derart in Verbindung stehen, daß
der Inhalt des ersten Behälters in den Inhalt des zweiten Behälters injiziert werden kann, und einen Mikroschieber
(6) aufweist, welcher mit den zuvor genannten Mitteln so verbunden ist, daß der Ausstoß der Injektion
reguliert werden kann.
31. Vorrichtung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet,
daß die Mittel, die es ermöglichen, daß die Flüssigkeiten des ersten und des zweiten Behälters miteinander
in Verbindung stehen, einerseits aus einem röhrchenförmigen übergangsteil (9), das an einem
seiner Enden an den Auslaßstutzen des Auslaßventils des Aerosolbehälters (1) und an seinem anderen Ende an
den Eingang des Mikroschiebers (6) angepaßt ist, und anderer-
·seits aus einem kapillaren Verteilungsröhrchen (7) besteht, dessen eines Ende an den Ausgang des MikroSchiebers
(6) angepaßt ist.
32. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 oder 31,
dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroschieber (6) ein Injektornadel-Mikroschieber ist.
33· Vorrichtung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet,
daß das Kapillarröhrchen (7) einen Durchmesser besitzt, der geringer ist als ungefähr 0,3 mm.
M/25 022
34. Vorrichtung nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet,
daß sich am Ende des kapillaren Verteilungsröhrchens eine Diffusoreinrichtung befindet.
35. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 34,
dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Behälter einen Thermostaten aufweist.
36. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 30 bis 35,
dadurch gekennzeichnet, daß der zweite Behälter Mittel aufweist, mit denen sein Inhalt bewegt werden kann.
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