DE3341772A1

DE3341772A1 - Hohler glaskugel-mikrotraeger zur zuechtung von zellkulturen und verfahren zur zuechtung von zellkulturen

Info

Publication number: DE3341772A1
Application number: DE19833341772
Authority: DE
Inventors: Raymond Leroy Ann Arbor Mich. Downs; Robert Lee Round Rock Nolen
Original assignee: KMS Fusion Inc
Current assignee: KMS Fusion Inc
Priority date: 1981-12-21
Filing date: 1983-11-18
Publication date: 1985-05-30
Also published as: SE452892B; GB2112377A; GB8501770D0; SE8300990D0; SE8300990L; GB2151610B; FR2518569A1; GB2151610A; GB2112377B; CA1206900A

Description

BESCHREIBUNG: ' ^δ"

Die Erfindung betrifft einen hohlen Glaskugel-Mikroträger zur Züchtung von Zellkulturen und ein Verfahren zur Züchtung von Zellkulturen·

Es ist bekannt, beim Züchten von verankerungsabhängigen Zellgewebskulturen die herkömmlichen Trommelflaschen und Petrischalen durch sogenannte Mikroträger zu ersetzen, welche für die Zellen eine größere Befestigungsfläche bereitstellen. Beispielsweise werden nach der US Patentschrift 4 189 534 massive Plastikkügelchen verwendet. Es hat sich jedoch herausgestellt, daß bei derartigen Kunststoffmikroträgern zur Förderung der Zellenhaftung abwechselnd elektrisch geladene Oberflächenbestandteile benötigt werden. Diese Abwechslung läßt sich bei der Herstellung schwierig kontrollieren und ist für manche Zellkulturen, wenn sie nicht richtig kontrolliert wird toxisch.

Es ist außerdem schwierig, bestimmte Zellarten von diesen Kunststoffkügelchen zu entfernen. Es ist auch bekannt, massive Glaskügelchen als Zellen-Mikroträger zu verwenden. Ein überblick über die Verwendung von Mikroträgern bei der Züchtung von Zellkulturen von Lebewesen findet sich in "Third General Meeting of ESACT¹,¹ Oxford, 1979, Develop. Biol. Standard, 46, p.p. 109-294 (S.Karger, Basel 1980).

Ein weiterer beträchtlicher Nachteil bekannter Mikroträger, einschließlich massiver Kunststoff- oder Glaskügelchen, besteht in der Schwierigkeit bzw. Unmöglichkeit, die Dichte der Mikroträger zu steuern und derjenigen des gewählten Kulturmediums anzupassen. Herkömmliche Zellkulturmedien sind wässrig und besitzen Dichten im Bereich zwischen 1,03 und 1,09 g pro Kubikzentimeter. Kunststoffkügelchen jedoch,

die nach dem oben genannten US Patent oder anderen Verfahren hergestellt wurden, lassen sich innerhalb dieses Dichtebereiches, geschweigedenn auf die genaue Dichte eines bestimmten Mediums, nicht einstellen. Glaskügelchen haben typischerweise eine Dichte in der Größenordnung von 2,3 g pro Kubikzentimeter, je nach der Glaszuammensetzung. Damit ein Absetzen und eine Kompaktierung der Mikroträger im Wachstumsmedium verhindert wird, was das Zellenwachstum behindern würde, muß das Kulturmedium geruht oder in anderer

_ Weise dauernd in Bewegung gehalten werden. Die heftige Bewegung selbst wirkt jedoch destruktiv auf viele Zellenarten.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Mikroträger der eingangs genannten Art zu schaffen, der sich leicht an die Dichte eines bestimmten Kulturmediums anpassen läßt, so daß er leicht mit sehr wenig Bewegung in diesem suspendierbar ist und/oder der kein Aminsalz oder andere Formen von Oberflächenbehandlung benötigt, mit denen potentiell toxische Oberflächen-Kopplungsagentien oder geladene Kom-2Q ponenten gebildet werden.

Diese Aufgabe wird durch die im Kennzeichen des Anspruchs beschriebene Erfindung gelöst; vorteilhafte Weiterbildungen des erfindungsgemäßen Mikroträgers sind in den Ansprüchen 2g und 3 angegeben.

Ein erfindungsgemäßes Verfahren zur Züchtung verankerungsabhängiger Zellen unter Verwendung derartiger Mikroträger ist in den Ansprüchen 4 und 5 angegeben.

Erfindungsgemäß wurde erkannt, daß hohle Glaskugelschalen

oder Mikrokugeln aus Silikat sich vorteilhaft als Mikroträger in verankerungsabhängigen Zellkulturen von Lebewesen einsetzen lassen. Insbesondere hat sich herausgegg stellt, daß Silikatglas-Mikrokugeln, welche unter Ver-

Wendung des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden/ keine elektrisch geladenen Oberflächen-Kopplungsagentien benötigen und Zellenmengen in den getesteten Kulturen ergeben, die denjenigen vergleichbar sind, welche erhalten werden, wenn die oben beschriebenen geladenen Plastikkügelchen verwendet werden. Außerdem lassen sich die Zellkulturen von den Glasschalenflächen unter Verwendung herkömmlicher Verfahren leicht entfernen.

Die Herstellung hohler Glasmikrokugeln mit homogener, integraler und im wesentlichen isotroper Schalenwand bestimmter Dicke wurde für andere Einsatzzwecke entwickelt. Insbesondere wurde eine Anzahl von Verfahren, einschließlich eines besonderen Metall-Organisches-Gelverfahrens, zur Herstellung von Glaskugeln eingesetzt, welche als Brennstoffbehälter zum Einsatz in der Laser-Fusion verwendet werden sollten. Diese Schalen haben im allgemeinen einen Durchmesser in der Größenordnung von Millimetern oder Zehntelmillimetern und eine "Aspektverhältnis" - d.h., ein Verhältnis von Durchmesser zur Wanddicke - in der Größenordnung von 100. Dies bedeutet eine Schalendichte in der Größenordnung von einigen Zehnteln Gramm pro Kubikzentimetern für typische Silikatglase, was für den Einsatz als Mikroträger in wässrigen Lösungen nicht geeignet wäre. Es war daher notwendig, ein Verfahren zur Herstellung einstückiger bzw. isotroper hohler Silikatglas-Mikrokugeln zu entwickeln, welches das Metall-Organisches-Gelverfahren verwendet und in der Lage ist, Schalen zu erzeugen, deren Dichte über 1 g pro Kubikzentimeter, insbesondere im Bereich zwischen 1,03 und 1,09 g pro Kubikzentimeter, der charakteristisch für herkömmliche Zellkulturmedien ist, liegt.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich hohle Glasmikrokugeln herstellen, die ein Aspektverhältnis in der Größenordnung von 12 aufweisen, verglichen mit Aspektverhältnissen in der Größenordnung von 100, wie sie beim bekannten Metall-Organisches-Gelverfahren erhalten werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren läßt sich außerdem die Dichte der vorgeformten Glasschalen anpassen.

Das erfindungsgemäße Verfahren besteht im wesentlichen J^q darin, daß anfänglich Schalen gebildet werden, deren Dichte über der gewünschten Dichte liegt und daß danach die Oberfläche der vorgeformten Schalen abgeätzt wird, bis die gewünschte Dichte erreicht wird. Die vorgeformten Schalen werden dazu in eine Ätzlösung eingetaucht, deren Dichte -^§ gleich der gewünschten Schalendichte ist und werden aus der Lösung entfernt, wenn sie aufzuschwimmen beginnen. In der speziellen Anwendung auf Zellen-Mikroträger kann die Ätzlösung eine wässrige Lösung umfassen, deren Dichte gleich derjenigen ist, in welcher die Mikroträger verwendet werden sollen.

Ein Ausführungsbeispiel· der Erfindung wird nachfolgend ausführlich beschrieben.

Der Stand der Technik, der die Herste^ung von isotropen hohlen Glas-Mikrokugeln betrifft, ist in den US-Patentschriften 3 330 215, 3 365 315 und 4 017 290 dokumentiert. (Der Ausdruck "Isotrop" soll sich auf alle Schalen beziehen, die als homogen integrale oder einstückige Struktür gebildet werden, und zwar im Unterschied beispielsweise zu solchen Schalen, welche aus zwei aneinander geklebten Halbschalen bestehen). Weitere Literatur findet sich in "Fabrication of the Glass Microballoon Laser Target", UCRL-51609, 2 6.Sept. 1974, von Souers et al· sowie in "1977 Annual Report of Laser Fusion Research", KMS Fusion, Inc., Seiten 1-12 bis 1-15. Von besonderem und zusätzlichem

Interesse im Blick auf die Herstellung von Silikat-Mikrokugeln aus einem Metall-Organischen-Gel und Gelpulver sind die US-Patentschriften 4 021 253 und 4 336 338.

Im allgemeinen wird beim Verfahren der Glaskugelherstellung nach dem Metall-Organischen-Gel-Verfahren ein Gel erzeugt, welches oxidierbare metallische glasbildende Komponenten, beispielsweise Silizium, Bor, Kalium, Natrium usw. sowie ein Blähmittel enthält. (Der Ausdruck "Silikatglas",

IQ wie er hier verwendet wird, betrifft ein Glas, welches Oxide von Silizium mit oder ohne weitere Metalloxide enthält.) Das Gel wird getrocknet und zertrümmert, wobei sich Gelteilchen bilden. Üblicherweise und auch bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung können die Gelteilchen der Größe nach durch einen Siebvorgang sortiert werden. Die Gelteilchengröße zu diesen Zeitpunkt, die normalerweise mit der endgültigen Schalengröße und anderen Kriterien korreliert ist, ist bei der vorliegenden Erfindung nicht kritisch, die sich mehr mit der letztendlichen Schalendichte befaßt.

Bei dem bekannten Verfahren werden die zertrümmerten und gesiebten Gelteilchen dann in hohle Mikrokugeln bei einem Blähvorgang umgeformt, indem sie durch einen Turmofen der Bauweise fallengelassen werden, wie er beispielsweise in der oben genannten US Patentschrift 4 021 253 beschrieben ist. Der Ofen wird auf höherer Temperatur oberhalb der Gel-Erweichungstemperatur auf einem solchen Wert gehalten, bei welchem sich das Blähmittel verflüchtigt. Die Schalen bilden sich, während die Gelteilchen durch den Ofen hindurchfallen. Erfindungsgemäß werden jedoch zur Verringerung des Aspektverhältnisses der sich ergebenden Schalen die zertrümmerten und gesiebten Gelteilchen zunächst einer Entgasung unterzogen, damit etwas Blähmittel ausgetrieben wird.

Im einzelnen wird zunächst eine bestimmte Menge zertrümmerter und gesiebter Gelteilchen in einen Ofen gebracht und aufgeschmolzen/ bis sich ein schaumartiges Aggregat bildet. Dieses Aggregat wird dann erneut zertrümmert und erneut in einer ähnlichen Operation gesiebt, indem das Aggregat in einem Stapelsieb untergebracht wird, welches an jeder Siebschicht eine Anzahl von Kugellager aufweist. Eine derartig "sanfte" erneute Zertrümmerung wird für wichtig gehalten, damit die Bildung von nutzlosem Staub verhindert

IQ wird. Die erneut zertrümmerten und erneut gesiebten Teilchen werden dann durch den Turmofen fallengelassen, wobei sich das Schalen-Zwischenprodukt bildet. Die Schmelztemperatur und die Dauer des Entgasungsvorganges werden empirisch bestimmt, je nach dem gewünschten endgültigen

"L5 bzw. maximalen Aspektverhältnis des Schalenzwischenproduktes bei jeder bestimmten Glaszusammensetzung. Bei dem hier im einzelnen beschriebenen Beispiel liegt die gewünschte endgültige Schalendichte im Bereich zwischen 1,0 und 1,04 g pro Kubikzentimeter.Dies bedeutet bei einer Dichte der Glaszusammensetzung von 2,3 g pro Kubikzentimetern ein Aspektverhältnis von gleich oder weniger 12. Durch Versuch und Irrtum wurde gefunden, daß eine Entgasungstemperatur von 900 C und eine Dauer von 15 Minuten zu zufriedenstellenden Ergebnissen führt. Die erneut zertrümmerten Gelteilchen, die dann in den Ofen (1500 C) gebracht wurden, lagen im Größenbereich zwischen 90 und 180 Mikron. Das Schalen-Zwischenprodukt hatte bei diesem Beispiel einen Größenbereich zwischen 75 und 250 Mikron und ein Aspektverhältnis von 8 bis 44.

Das Schalen-Zwischenprodukt, welches aus dem Blähvorgang erhalten wird, wird dann ausgelesen, wobei' diejenigen identifiziert werden, bei denen eine dichte Einstellung vorgenommen werden soll. Im einzelnen werden diese Schalen zunächst in eine Lösung eingetaucht, deren Dichte am unteren

Ende des gewünschten Bereiches liegt. In diesem Falle wurde Wasser mit einer Dichte von 1,0 g pro Kubikzentimetern verwendet. Aufschwimmende Schalen, deren Dichte geringer als 1,0g pro Kubikzentimeter ist, werden weggeworfen. Die übrigen werden dann auf die gewünschte Größe, in diesem Falle 106 bis 200 Mikron gesiebt und in eine zweite Lösung eingetaucht, deren Dichte am oberen Ende des gewünschten Bereiches liegt. In diesem Falle ist eine 5 %-ige wässrige Lösung von schwefeliger Säure geeignet, deren Dichte bei 1,04g

IQ pro Kubizentimetern -liegt. Die aufschwimmenden Schalen besitzen bereits eine Dichte im gewünschten Bereich und werden von den anderen getrennt. Die in der Lösung mit einer Dichte von 1,04 g pro Kubikzentimetern absinkenden Schalen werden dann einem Ätzvorgang unterworfen. Dabei wird deren Dichte auf 1,04 g pro Kubikzentimeter verringert. Im einzelnen werden die Schalen zunächst in reinen Tetrachlorkohlenstoff (1,59 g pro Kubikzentimeter) eingetaucht. Die absinkenden Schalen,deren Dichte über 1,59g pro Kubikzentimeter liegt, werden zur Seite gelegt oder weggeworfen.

Die Schalen, die in Tetrachlorkohlenstoff aufschwimmen, werden dann in eine Lösung aus 15%iger schwefliger Säure (1,10 g pro Kubikzentimeter) und 4% Fluorwasserstoff (letzterer als Ätzmittel) eingetaucht. Wenn die Schalen aufschwimmen, was die Entfernung von Oberflächenglas und ein Absinken der Dichte auf 1,10 g pro Kubikzentimeter anzeigt, werden sie entfernt und in eine Lösung aus 5%iger schwefeliger Säure (1,04 g pro Kubikzentimeter) und 2%igem Fluorwasserstoff eingetaucht. Wiederum werden die Schalen entfernt, wenn sie aufschwimmen, d.h., bei einerDichte von 1,04 g pro Kubikzentimeter. Die sich ergebenden Schalen werden in Azeton gewaschen und getrocknet. Sie bilden das Endprodukt mit einer Größe im Bereich zwischen 81 und 200 Mikron sowie einer Dichte im gewünschten Bereich zwischen 1,0 und 1,04 g pro Kubikzentimetern. Das resultierende Produkt wurde erfolgreich als

^ Mirkoträger bei der Züchtung der nachfolgenden Zellen verwendet. Menschliche Vorhaut-Vibroplasten und Hühnerembrio-Vibroplasten in DMEM-Medien mit 5%igen fötalem Bovinserum sowie Muren-Vibrosarkome und Walker-Karζinoc sarkome in RPMI-Medien mit 10%igem fötalem Kalbserum. Die Mikroträger-Schalen schweben im wesentlichen in dem Kulturmedium und können durch geringfügige Bewegung leicht im suspendierten Zustand gehalten werden. Es kann beispielsweise durch milde Belüftung unter Verwendung von Kohlendioxidblasen bewirkt werden, die auch zur Einstellung des pH-Wertes des Mediums von Nutzen sind. Die Glasschalen-Mikroträger können mit Aminosalzen behandelt werden, damit sich die Oberflächenladungsbestandteile ergeben. Gegenwärtig wird dies jedoch nicht

,j- für nötig gehalten. Die Schalen lassen sich außerdem leicht mit jedem gewünschten Material unter Verwendung herkömmlicher Verfahren überziehen. Selbstverständlich muß die Dicke und die Dichte eines etwaigen Überzuges bei der Abstimmung der Dichte in Betracht gezogen werden.

Bei der Massenproduktion von Glasschalen-Mikrokugeln werden die verschiedenen Verfahrensschritte, die oben beschrieben wurden, vollständig oder zumindest teilweise automatisiert. Beispielsweise können Abschöpfvorrichtungen bei jedem Auslese- bzw. Ätzvorgang zur automatischen Entfernung der aufschwimmenden Schalen eingesetzt werden. Je nach der Kontrollgenauigkeit bei den verschiedenen Vorgängen und der Toleranz beim gewünschten endgültigen Dichtebereich kann der zweistufige Ätzvorgang, der oben beispielhaft beschrieben wurde, durch eine Stufe eresetzt werden oder hierzu auch auf drei oder mehr Stufen ausgeweitet werden. Die Stärke des Ätzmittels in der Lösung und demzufolge die erforderliche Ätzzeit wurde bei dem Beispiel zur Erzielung der besten Chargenkontrolle gewählt. Sie

kann von den jeweiligen Umständen abhängen. Es können auch andere Ätz- und/oder Ausleselösungen verwendet werden.

Es ist zu erkennen, daß die endgültige Schalendichte auch genauer eingestellt werden kann als auf den exemplarischen, hier beschriebenen Bereich zwischen 1,0 und 1,04 g pro Kubikzentimetern. Wann beispielsweise Schalen hergestellt werden sollen, deren Dichte eng um den Wert 1,04 g pro Kubikzentimetern herum liegen soll, kann der anfängliche Ausleseschritt in Wasser weggelassen werden. Das Schalen-Zwischenprodukt kann dann in eine 5%ige wässrige Schwefelsäurelösung eingetaucht werden. Aufschwimmende Schalen, deren Dichte unter 1,04 g pro Kubikzentimetern liegt, werden weggeworfen; absinkende Schalen werden dem Ätzvorgang unterzogen. In diesem Zusammenhang ist anzumerken, daß der Schritt des Aufschwimmens in Tetrachlorkohlenstoff beim beschriebenen Beispiel (1,59 g pro Kubikzentimeter) den Zweck hatte, den Bereich der Dichten, welcher dem Ätzvorgang unterzogen werden sollte, einzuengen, und auf diese Weise die Qualitätskontrolle der Charge zu verbessern. In der speziellen Anwendung auf Mikroträger bei der Zellenzüchtung hat sich herausgestellt, daß die Schalendichte nur auf einen verhältnismäßig weiten Bereich von 0,04 g pro Kubikzentimetern genau eingestellt werden muß.

Was die Einstellung der Dichte auf einen bestimmten Wert angeht, sind andere Anwendungsbereiche des beschriebenen Verfahrens als bei der Zellzüchtung denkbar.Hierzu sei beispielsweise auf "Shedding Pounds in Plastics: Micros are moving," Mechanical Engineering, Oktober 1978, Seiten 58 bis 63 verwiesen. Die Dichte der endgültigen Schale kann dabei sehr weit von dem exemplarischen Bereich zwischen 1,0 und 1,04 g pro Kubikzentimetern und auch von dem Bereich zwischen 1,03 und 1,09 g pro Kubikzentimetern für typische Zellkulturmedien abweichen. Höhere Dichten lassen sich

leicht dadurch, erzielen, daß die Dichte der Ätzlösung auf die höhere gewünschte Dichte eingestellt wird. Wie zuvor erwähnt, werden die Parameter der Gel-Entgasung (welche das Schalen-Aspektverhältnis verringert) empirisch je nach dem gewünschten Aspektverhältnis, welches dem Blähvorgang folgt, bestimmt. Dieses seinerseits bestimmt sich mathematisch aus der Dichte der verwendeten Glaszusammensetzung und der gewünschten endgültigen Schalendichte und -größe.

Claims

PATENTANSPRÜCHE:

1. Mikroträger zur Verwendung als Wachstumsstelle für verankerungsabhängige Zellen in einer Zellkultur mit einem Kulturmedium bestimmter Dichte, dadurch gekennzeichnet, daß er eine hohle kugelige Schale umfaßt, die eine homogene, einstückige und kontinuierliche äußere Schalenoberfläche aus Silikatglas und eine Dichte besitzt, die im wesentlichen gleich der Dichte des Kulturmediums ist, derart, daß der Mikroträger im wesentlichen in dem Medium schwebt.

2. Mikroträger nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichte der Schale im Bereich zwischen 1,03 und 1,09 g pro Kubikzentimeter liegt.

3. Mikroträger nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis des Außendurchmessers der Schale zur Wanddicke nicht größer als 12 ist.

4. Verfahren zur Züchtung verankerungsabhängiger Zellen unter Verwendung von Mikroträgern in einem Zellkulturmedium bestimmter Dichte, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroträger verwendet werden, welche aus hohlen Kugelschalen bestehen, die eine kontinuierliche äußere Fläche aus im wesentlichen homogenem Silikatglas aufweisen und deren durchschnittliche Dichte im wesentlichen gleich der Dichte des Kulturmediums ist, derart, daß der Mikroträger im wesentlichen schwebend in dem Medium suspendiert ist.

5. Verfahren zur Züchtung verankerungsabhängiger Zellen in einem Zellkulturmedium mit einer bestimmten Dichte, die über einem Gramm pro Kubikzentimeter liegt unter Ver-Wendung von einer Vielzahl von Mikroträgern im Kultur-

medium als Zellenverankerungsplätze, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroträger eine Vielzahl hohler Kugelschalen aus im wesentlichen isotropem Silikatglas umfassen, deren durchschnittliche Dichte, bestimmt durch die Schalenzusammensetzung, Wanddicke und Durchmesser, im wesentlichen gleich der Dichte des Kulturmediums ist, und daß die Mikroträger im wesentlichen eine neutrale Schwimmfähigkeit in dem Medium aufweisen.