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Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues carcinosta-
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tisches Mittel mit immunverstärkender carcinostatischer Wirkung bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.
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Gegenstand der Erfindung ist ein carcinostatisches Mittel mit irunverstärkender
carcinostatischer Wirkung, das als Wirkstoff Eisenin enthält. Dieses ist ein durch
Extraktion aus dem Seetang Eisenia bicyclis oder auf synthetischem Weg erhältliches
Tripeptid. Die Erfindung betrifft somit ein carcinostatisches Mittel mit immunverstärkender
carcinostatischer Wirkung, das als Wirkstoff Eisenin, ein Tripeptid mit der Sequenz
L-Pyroglu-L-Glu-L-Ala enthält, in der Pyroglu, Glu und Ala Pyroglutaminsäure, Glutaminsäure
bzw. Alanin bedeuten.
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Eisenin ist ein Tripeptid, das aus dem Seetang Eisenia bicyclis extrahiert
werden kann. In jüngster Zeit ist auch seine Synthese gelungen. Es hat die Form
von farblosen langen Nadeln mit dem Glanz von Seidenfäden, zeigt positive Biuret-Reaktion,
eine gewisse Schrumpfung beim Schmelzpunkt von 1800C und zersetzt sich beim Schmelzen
bei 225 bis 2260C.
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Seine wäßrige Lösung reagiert sauer.
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Die amWitumo-wirkung von Eisenin ist vermutlich keine direkte Wirkung,
sondern sie zeigt sich derart, daß die nicht spezifische Abwehrkraft des lebenden
Körpers verstärkt wird. Da
Eisenin eine einfache Tripeptid-Struktur
hat, kann es leicht synthetisiert werden. Ferner kann es, da es kristallin ist,
als feines Pulver erhalten werden und kann infolge seiner Wasserlöslichkeit zu verschiedenen
pharmazeutischen Zubereitungsarten, wie Injektionspräparaten, Tabletten, Salben
und Suppositorien verarbeitet werden, wobei pharmakologisch anwendbare Träger- und
Hilfsstoffe benutzt werden, die üblicherweise in der pharmazeutischen Praxis eingesetzt
werden.
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In der beiliegenden Zeichnung zeigen: Figur 1 in graphischer Darstellung
die Antitumorwirkung von Eisenin gegen einen isologen allogenen Tumor; Figur 2 in
graphischer Darstellung die lebensverlängernde Wirkung von Eisenin beim Einsatz
gemäß Fig. 1; Figur 3 in graphischer Darstellung die Antitumorwirkung ohne Beteiligung
von T-Zellen; Figur 4 in graphischer Darstellung die lebensverlängernde Wirkung
von Eisenin beim Einsatz gemäß Fig. 3; und Figur 5 in graphischer Darstellung die
Antitumorwirkung von Eisenin gegen einen isologen xenogenen Tumor.
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Eisenin, das durch Extraktion aus dem Seetang Eisenia bicyclis oder
durch Synthese erhalten wurde, zeigte sich als wirksames carcinostatisches Mittel
mit immunverstärkender (immunopotentierender) carcinostatischer Wirkung. Die Ergebnisse
von Tierversuchen, die im Hinblick auf die immunverstärkende carcinostatische Wirkung
von Eisenin durchgeführt wurden, sind nachstehend beschrieben. In den Figuren und
Tabellen bedeuten die Begriffe "mit Eisenin behandelt" bzw. "nicht behandelt", daß
Eisenin verabreicht bzw. nicht verabreicht wurde.
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(1) Tierversuche Als Versuchstiere werden Bulb/C-Mäuse und nackte
Mäuse verwendet. Die eingesetzten Tumoren sind Colon (Balb/C Colon-Krebs) und Sarcoma
180.
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a) 1 000 000 Zellen Colon 26 werden subcutan auf Balb/C-Mäuse transplantiert.
Das Eisenin wird intraperitoneal den Mäusen jeden zweiten Tag dreimal in einer Menge
von 5 mg/Tier gegeben. Das Gewicht der Tumoren und die Überlebensrate werden ermittelt.
Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 angegeben.
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b) 1 000 000 Zellen Colon 26 werden subcutan nackten Mäusen eingesetzt.
Eisenin wird intraperitoneal den Mäusen jeden zweiten Tag in einer Menge von 5 mg/kg
gegeben. Das Gewicht der Tumoren und die Uberlebensrate werden bestimmt. Die Ergebnisse
sind in den Figuren 3 und 4 angegeben.
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c) 1 000 000 Zellen Sarcoma 180 werden subcutan Balb/C-Mäusen eingesetzt.
Eisenin wird intraperitoneal und oral den Mäusen jeden zweiten Tag dreimal in einer
Menge von 5 mg/Tier gegeben. Das Gewicht der Tumoren wird bestimmt.
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Die Ergebnisse sind in Figur 5 angegeben.
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d) 106 rote Blutzellen vom Schaf (S R bc) werden Balb/C-Mäusen intravenös
injiziert. 4 Tage danach werden 10 rote Blutzellen vom Schaf und Phosphatpufferlösung
(PBS) subcutan in die linke Fußsohle injiziert. Gleichzeitig wird Phosphatpufferlösung
(PBS) allein subcutan in die rechte Fußsohle injiziert. 2 Tage später wird die Dicke
beider Füße zur Prüfung auf verzögerte Hypersensitivität gemessen. Die Ergebnisse
sind in Tabelle I angegeben.
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Tabelle I - Verzögerte Hypersensibilität
| Gruppe 1 T (+). E (+) Gruppe, 2 T (+). # (-) Gruppe 3 T (-).
E (-) Gruppe 4 T (-). E (+) |
| L R L-R L-R/RX100 L R L-R L-R/RX100 L R L-R L-R/RX100 L R L-R
L-R/RX100 |
| 1.59 1.57 0.02 1 1.91 1.69 0.22 13 1.90 1.85 0.05 3 2.09 1.86
0.23 12 |
| 1.56 1.54 0.02 1 1.83 1.83 0 0 1.85 1.85 0.10 5 2.18 1.98 0.20
10 |
| 1.87 1.68 0.19 11 1.91 1.80 0.11 6 2.08 1.92 0.16 8 1.84 1.86
0.02 0 |
| 1.95 1.49 0.46 31 1.86 1.67 0.19 11 1.89 1.78 0.11 6 1.93 1.81
0.12 7 |
| 1.75 1.67 0.08 5 1.78 1.69 0.09 5 1.91 1.82 0.09 5 1.87 1.72
0.15 9 |
| 1.54 1.57 0.03 0 1.96 1.72 0.24 14 2.01 1.78 0.23 13 1.93 1.61
0.32 20 |
| 1.58 1.54 0.04 3 1.71 1.52 0.19 13 1.97 1.91 0.06 3 1.87 1.88
0.01 0 |
| 1.90 1.65 0.25 15 1.82 1.69 0.13 8 1.99 1.80 0.19 11 1.93 1.87
0.06 3 |
| - - - - 1.83 1.87 0.04 0 1.92 1.82 0.10 5 - - - - |
| - - - - 1.77 1.77 0 0 1.92 1.75 0.17 10 - - - - |
| Durchschnitt 8 Durchschnitt 7 Durchschnitt 7 Durchschnitt 8 |
Bemerkungen: 1. T(+) =Tumor transplantiert; (T(-) = kein Tumor transplantiert.
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2. E(+) = mit Eisenin behandelt; E(-) = nicht mit Eisenin behandelt.
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3. L = Dicke der linken Pfote (mm); R = Dicke der rechten Pfote (mm)
(2)
In vitro Versuch (a) Sensibilitätstest Colon 26 wird gewebekultiviert und mit Eisenin
in verschiedenen Konzentrationen 3 Tage in Berührung gebracht.
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Dem Medium wird Tritium-Thymidin, Uridin bzw. Leucin zugesetzt, und
ihr Einbau in die Zellen wird untersucht, um den Hemmindex zu bestimmen. Die Ergebnisse
der Prüfung des Einflusses von Eisenin auf die DNS-, RNS- und Proteinsynthese sind
in Tabelle II angegeben.
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Tabelle II Sensibilitätstest
| Eisenin- |
| Konzentration 1.0 0.1 0.01 0.001 0.0001 Vergleic |
| (mg/ml |
| zählungen pro 140430 190120 207474 220010 231236 218622 |
| min im Fall 171170 203872 229569 213816 219336 220775 |
| von |
| Tritium- 163554 201151 240628 221170 224786 245962 |
| Thymi;iin 176167 223845 246273 213017 233612 226495 |
| (C M |
| Durchschritt 170297 198381 238823 218332 229878 221964 |
| 1.1. (,a),, ! 23 11 8 2 0 |
| Zählungen pro 27033 32774 37043 39415 32836 32553 |
| min im Fall 20903 25271 33211 31675 29585 31801 |
| von |
| Uridin 19954 24222 31498 28671 24135 30304 |
| (cMP) 22463 26786 34408 33161 29958 1 27653 |
| l |
| Durchschnitt 21107 25426 33039 31169 30793 31553 |
| 1.1. (%) 33 19 0 0 2 |
| zählungen pr 6826 13311 12285 13620 12952 14674 |
| -min im Fall |
| von . 6150 12566 11020 14230 11936 11382 |
| Leucin - 8076. 12097 13379 11808 12690 |
| (CPUM)in ~ 8076. 12097 13379 11808 12690 |
| 6587 7076 11318 11355 10952 14350 |
| !. Durchschnitt 6521 11318 11478 13743 12232 13905 |
| 1.1. (%) 53 19 17 1 12 |
Bemerkungen: (l) Der Hemmindex (I.I.) wird nach folgender Gleichung berechnet. Wenn
der I.I. 75 % überschreitet, wird das Mittel als wirksam bewertet.
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CPM (Vergleich) - CPM (Arzneistoff) I.I. = x 100 CPM (Vergleich)
(2) Die Messing wird mit einem Scintillationszäher durchgeführt
(b)
Cytotoxizitätstest Balb/C-Mäusen wird intraperitoneal 15 mg Eisenin verabreicht.
Einer Kontrollgruppe wird Stärke gegeben. Die verwendete Zielzelle ist BW 5174 (Thymoma
der AKR-Maus).
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Milzzellen und intraperitoneale Zellen werden in anhaftende bzw.
nicht anhaftende Zellen unterteilt und die Cytotoxizität wird in jedem Fall gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
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Tabelle III Cytotoxizitätstest
| Eisenin Eisenin Vergleichs- |
| verabreicht gruppe |
| Milzzellen |
| Gesamt 24% 23% |
| nicht anhaftende Zellen 13% 15% |
| (Natürliche Killer) |
| anhaftende Zellen (Makrophager) 10% 10% |
| ~ |
| I Tntwaperitoieale~~Zell en |
| Gesamt 24% -88 |
| Nicht anhaftende Zellen |
| (natürliche Killer) 32% 2% |
| anhaftende Zellen |
| (Makrophagen) 178 -5% |
Bemerkungen: (1) Die prozentuale Cytotoxizität in Tabelle III beruht auf folgender
Gleichung: Prozentuale = Testzählung - geringste Zählung x 100 Cytotoxizität Stärkste
Zählung - geringste Zählung (2) Die Messungen werden nach dem 51Cr-FreisetungsversUch
durchgeführt.
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(c) Akute Toxizität 9 Balb/C-Mäusen mit einem durchschnittlichen Körpergewicht
von 20 g wird Eisenin intraperitoneal gemäß Tabelle IV verabreicht.
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Tabelle IV Akute Toxizität
| Zahl Zahl der |
| < toten Tiere |
| Eisenin- 6 7 / 9 |
| Dosierung |
| (gjkg) 3 1/9 |
Bei der Zusammenfassung der Ergebnisse der vorstehend beschriebenen Versuche zeigt
sich aus den Tabellen I und II im Fall von isologen allogenen Tumoren, wie Colon
26 bei Balb/C-Mäusen ein deutlicher Unterschied zwischen der mit Eisenin behandelten
und der nicht behandelten Gruppe. Eine Antitumorwirkung von Eisenin ist deutlich
zu erkennen. Die Figuren 3 und 4 zeigen auch im Fall von nackten Mäusen ohne T-Zellen,
daß ähnliche Ergebnisse erhalten werden. Eine ähnliche Antitumorwirkung wird auch
im Fall von isologen xenogenen Tumoren, wie Sarcoma 180 bei Balb/C-Mäusen festgestellt,
wie in Figur 5 zu sehen ist. Andererseits kann aus den Ergebnissen der Prüfung der
verzögerten Hypersensibilität bei Balb/C-Mäusen gemäß Tabelle I kaum ein Unterschied
zwischen den Durchschnittswerten der vier Gruppen von Kombinationen aus Gegenwart
und Abwesenheit von Tumortransplantation und Gegenwart und Abwesenheit einer Behandlung
mit Eisenin festgestellt werden. Eisenin hat also keine Wirkung
auf
die Aktivierung einer immunologischen Reaktion, an der T-Zellen teilnehmen. Aus
den in Tabelle II enthaltenen Ergebnissen der Sensibilitätsprüfung, bei der der
Hemmindex in allen Fällen niedrig ist, was auf fehlende Hemmwirkung durch Eisenin
hindeutet, kann erkannt werden, daß Eisenin keine direkte Wirkung auf Tumorzellen
hat.
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Bei den Ergebnissen der in Tabelle III dargestellten Cytotoxizitätsprüfung
zeigt sich zwar kein nennenswerter Unterschied im Fall von Milzzellen, jedoch ein
deutlicher Unterschied im Fall der interperitonealen Zellen. Dies erlaubt den Schluß,
daß der durch Eisenin verursachte Immunitätseffekt hauptsächlich auf die Aktivierung
der anhaftenden Zellen und der nicht anhaftenden Zellen in der Peritonealhöhle zurückzuführen
ist. Nach der Prüfung der akuten Toxizität liegt der LD50-Wert von Eisenin bei etwa
5 g/kg, während die wirksame Dosis aufgrund der vorstehenden Prüfungen vermutlich
bei etwa 15 mg pro 20 g liegt, bezogen auf das durchschnittliche Körpergewicht der
in den Versuchen verwendeten Balb/C-Mäuse. Die Dosierung beträgt somit etwa 75 mg/kg
und eine solche Dosis kann günstigerweise mehrmals verabreicht werden.