DE3322120A1

DE3322120A1 - Verfahren zur umwandlung von 1,2-gesaettigten 3-ketosteroiden in 1,2-dehydrosteroide

Info

Publication number: DE3322120A1
Application number: DE19833322120
Authority: DE
Inventors: Timothy Wendell Michigan Evans; Leo Alyosius Kominek; Holly Jo Wolf
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1982-07-30
Filing date: 1983-06-20
Publication date: 1984-02-02
Also published as: GB2123833B; NL8302596A; FR2531101B1; GB2123833A; IE55533B1; JPH0614874B2; GB2131811B; JPS5939299A; DD213242A5; CH657871A5; GB8317422D0; IE831767L; JPH06225792A; GB2131811A; GB8402640D0; DE3322120C2; JPH0824596B2; FR2531101A1

Description

Verfahren zur Umwandlung von 1,2-gesättigten 3-Ketosteroiden in 1,2-Dehydrosteroide

über den ersten therapeutischen Einsatz von Corticosteroiden wurden in den fünfziger Jahren berichtet. Hierbei handelte es sich um die Durchführung einer Cortisonacetatbehandlung von rheumatischer Arthritis. Weitere Untersuchungen zeigten, daß der Einbau einer ungesättigten Bindung in 1,2-Stellung von Hydrocortison und Cortison dazu führte, daß die erhaltenen Steroide Prednisolon und Prednison eine verstärkte Wirkung erhalten und eine geringere arzneimittelreduzierte Salzretention hervorrufen. Danach wurden auch die meisten anderen Steroide, die bei der Behandlung von auf Corticoide ansprechenden Erkrankungen eingesetzt wurden, mit einer Doppelbindung in 1,2-Stellung des Steroidmoleküls versehen. Seit 1977 sind zwei Versuche zur Synthese von Corticosteroiden aus Sterinvorläufern bekannt geworden. Aus der US-PS . 4 035 236 ist beispielsweise ein Verfahren zur Herstellung von 9a-Hydroxyandrostendion über eine Fermentation von Sitosterin, Stigmasterin oder Cholesterin bekannt. Aus der US-PS 4 041 055 ist ein Verfahren zur Synthese medizinisch wertvoller Corticosteroide aus Androsten bekannt. Hierbei auftretende Zwischenprodukte können 3-Keto-A⁴ '^{9 (11} * -Konfiguration aufweisen.

QOLL IZU

Bekannte Verfahren zur biologischen Umwandlung 1,2-gesättigter Steroide in die entsprechenden 1,2-Dehydrosteroide sind:

US-PS 2 837 464 "Verfahren zur Herstellung von Dienen durch Corynebacterium".

Beschrieben wird eine 1-Dehydrierung von Steroiden in verschiedenen Fermentationsbrühen durch Arthrobacter (Corynebacterium) simplex.

US-PS 3 360 439 "Verfahren zur Herstellung von 2-Dehydrosteroiden".

Beschrieben wird eine 1-Dehydrierung von Steroiden mit Hilfe von A. simplex-Zellen, die vor dem Vermischen des

· : -

Substrats mit einem Wasserstoffträger mit einem kurzkettigen Alkanol oder kurzkettigen Alkanon, z.B. Aceton, vorbehandelt wurden.

W.Charney und H.Herzog "Mikrobielle Umwandlung von Steroiden", Verlag Academic Press,. Inc., New York, Seiten 4-9, 236-261 (1967).

In letzterer Literaturstelle werden der historische Hintergrund biologischer Steroidumwandlungen und eine taxonomische Auflistung von zur Durchführung einer 1-Dehydrierung geeigneten Mikroorganismen angegeben.

T.Yamane, H.Nakatani, E.Sada, T.Omata, A.Tanaka und S.Fukui "Biotechnology and Bioengineering", 21, 1979.

Die Autoren untersuchten die 1-Dehydrierung von 4-Androsten-3,17-dion mittels Nocardia rhodocrous in einem Gemisch aus 50 % Benzol und 50 % Heptan. Durch die Zugabe dieses Losungsmittelgemischs zu dem biologischen Umwandlungsgemisch soll die Reaktionsgeschwindigkeit

um einen Faktor von 180 erhöht werden» Benzol ist jedoch bekanntlich krebserregend. Der bevorzugte Elektronenakzeptor für die Nocardia rhodocrous-Äktivität war bei den durchgeführten Versuchen Phenazinmethosulfat. Dieser Elektronenakzeptor ist zu teuer und zu instabil, um bei großtechnologischen biologischen Umwandlungsverfahren diese Mikroorganismusaktivität praktisch ausnutzen zu können. Das Nocardia rhodocrous-Enzym war in Gegenwart von Menadion, dem Elektronenakzeptor der Wahl für Ärthrobacter simplex, nicht-aktiv. Somit muß sich das von N. rhodocrous gebildete Enzym von dem von A.simplex gebildeten Enzym unterscheiden. Die Umsetzung wurde in einem mit einem Steroid gesättigten Lösungsmittelsystem mit lediglich 20 % an organischem Lösungsmittel durchgeführt. Es zeigte sich, daß mit steigender Konzentration an dem Steroid die Reaktionsgeschwindigkeit abnahm. Sauerstoff bildet ein wesentliches Reagens bei der 1-Dehydrierungsreaktion. Das Lösungsmittel (50 % Benzol/50 % Heptan) ist in Gegenwart von Sauerstoff brennbar. Wie der Sauerstoff in den Reaktor ohne Entstehen einer explosiven Umgebung eingeführt wurde, ist in der genannten Literaturstelle nicht erläutert.

K.Sonomoto, I.Jin, A.Tanaka und S.Fukui "Agric. Biol. Chem.", 44, 1119-1126 (1980).

Die genannten Autoren untersuchten die 1-Dehydrierung von Hydrocortison mittels A.simplex. Es wurden zwei mit Wasser nicht mischbare Lösungsmittel, nämlich n-Butanol und η-Amylalkohol getestet. In Gegenwart dieser Lösungsmittel erfolgt jedoch keine Bioumwandlung. Als. bevorzugte Lösungsmittel wurden mit Wasser mischbare Lösungsmittel, ZoB. Gemische aus 10 % Methanol und 90 % Wasser und 10■ % Propylenglykol und 90 % Wasser eingesetzt.

OO LL IZU

Die genannten Literaturstellen beschreiben weder das erfindungsgemäße Verfahren noch legen sie dieses nahe.

Unter Verwendung luftgetrockneter oder wärmegetrockneter Mikroben- oder Mikroorganismenzellen/ die zur Katalyse einer 1-Dehydrierung von Steroiden fähig sind, erreicht man eine wirksamere Umsetzung von 1,2-gesättigten Steroiden in ihre entsprechenden 1,2-Dehydroderivate als im Rahmen der in wäßriger Umgebung, insbesondere in Gegenwart eines exogenen Elektronenakzeptors arbeitenden bekannten Verfahren.

Die Erfindung betrifft darüber hinaus auch noch ein Verfahren, bei dem ein aromatischer Kohlenwasserstoff als mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel einer wäßrigen Aufschlämmung von A.simplex-Zellen, eines exogenen Elektronenakzeptors und des zu dehydrierenden Steroids zugegeben wird. Die Aufschlämmung wird bewegt. Die Sauerstoffzufuhr erfolgt derart, daß der Sauerstoffgehalt im Gasraura unter der Mindestsauerstoffkonzentration für eine Verbrennung bleibt. Andererseits kann die Umsetzung auch (bei einer Temperatur) unterhalb des Flammpunkts des organischen Lösungsmittels durchgeführt werden.

Diese Maßnahmen sind der bekannten Technologie einer Steroiddehydrierung durch Mikroorganismen in folgendem überlegen:

a) Die Bioumwandlung führt zu niedrigeren Gehalten an ° nicht umgewandeltem Steroidsubstrat;

b) das erfindungsgemäße Verfahren kann bei höheren Steroidkonzentrationen durchgeführt werden;

c) zur Umwandlung einer gegebenen Steroidmenge benötigt man weniger Mikroorganismenzellen, z.B. A.simplex-Zellen;

d) das erfindungsgemäße Verfahren ist weniger empfindlich gegenüber in dem Steroid, in den Mikroorganismenzellen oder in dem durch die Zellen gebildeten Steroid enthaltenen organischen löslichen Verunreinigungen und

e) eine Verminderung oder vollständige Eliminierung von in den Mikrobenzellen enthaltenen steroidabbauenden Enzymen führt zu höheren Ausbeuten an dem gewünschten Reaktionsprodukt.

ίο '.■■-■

Die Lösungsmittelmaßnahmen sind der bekannten Technologie einer Steroiddehydrierung mit anderen Mikroorganismenaktivitäten, z.B. Nocardia rhodocrous, überlegen, da die durch A.simpelx katalysierte Umsetzung mit stabileren und preisgünstigeren Elektronenakzeptoren, wie Menadion, durchgeführt werden kann.

Mikroorganismen:

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können als

Mikroorganismen die zahlreichen, für eine 1-Dehydrierung bekannten Mikroorganismen eingesetzt werden. Solche Mikroorganismen werden von W.Charney und H.Herzog in "Microbial Transformation of Steroids", Verlag

Academic Press, Inc., New York, (1967) beschrieben. 25

Die Bakterien, die Steroide in 1-Stellung dehydrieren, fallen generell in zwei Gruppen, vgl. "Bergey's Manual of Determinative Biology", 8.Ausgabe. Das aaO beschriebene Verfahren konnte erfolgreich an Arten aus Arthrobacter und Corynebacterium-Gattungen von "Teil 17, Actinomycetes & Related Organisms" demonstriert werden. Die 1-dehydrierendai Arten verschiedener anderer Gattungen in Teil 17, z.B. Nocardia, Mycobacterium, Streptomyces und Bacterium sind wahrscheinlich ebenfalls brauchbar.

4ο.

Zwei für die Öffentlichkeit verfügbare Mikroorganismen, von denen bekannt ist, daß sie Steroide in 1-Stellung dehydrieren, haben sich als bei dieser Art von Verfahren einsetzbar erwiesen. So wurde beispielsweise das aus der US-PS 3 065 146 als 1-dehydrierendes Bakterium bekannte Bacterium cyclooxydans (ATCC-Nr. 12673) getestet und als brauchbar befunden. Ein Bakterium, das zur 1-Dehydrierung von Steroiden noch weit intensiver untersucht wurde, ist das aus der US-PS 2 837 464 bekannte Bakterium Arthrobacter simplex (ATCC-Nr. 6946) . Im folgenden wird also zur Veranschaulichung des erfindungsgemäßen Verfahrens weitestgehend dieser Mikroorganismus herangezogen. Selbstverständlich läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren aber auch mit anderen 1-dehydrierenden Mikroorganismen durchführen.

Wachstum des Mikroorganismus:

Die Mikroorganismen werden in einem wäßrigen Nährmedium mit:

a) anorganischen Verbindungen, z.B. Nitraten oder

Ammoniumsalzen, oder organischen stickstoffhaltigen Verbindungen, z.B. Hefeextrakt, Pepton, Maiseinweichflüssigkeit u.dgl. (Stickstoffquelle' für das Wachstum) j
25

b) einer Kohlenstoff- und Energiequelle z.B. Kohlenhydraten und Zuckerderivaten, öl, Fettsäuren und deren Methylestern, Alkoholen, Aminosäuren oder organischen Säuren_; und

c) Ionen und Spurenelementen, z.B. Natrium, Kalium, Magnesium, Phosphaten, Sulfaten, Mangan, Kupfer, Kobalt, Molybdän u.dgl» in Mengen, wie sie mit Leitungswasser oder weniger gereinigten Bestandteilen des Nährmediums, z.B. der Maiseinweichflüssigkeit, zugeführt werden,

wachsen gelassen.

ft ο β α
« β » ti
ο ο «

Für das Wachstum benötigen die Organismen in der Atmo Sphäre enthaltenen Sauerstoff. Der Temperaturbereich für das Wachstum beträgt 10 - 45°C bei einem optimalen Bereich von 28 bis 37°C für Ä.simplex. Der optimale pH-Wert für das Wachstum liegt etwa am Neutralpunkt.

Gewinnung der Steroid-1-Dehydrogenase:

Die Zellen werden durch Zusatz einer 1,2-gesättigten 3-Ketosteroidverbindung, z.B. von Androsta-4-en-3 ,1 7-diori oder Cort.isonacetat in einer Menge von 0,005 % (w/v) des Mediums oder darüber zu einer Steroid-1-Dehydrogenaseaktivität angeregt. In Gegenwart des "Anregungsmittels" wird noch mindestens 6 h lang inkubiert, bevor die Zellen zur Trocknung geerntet werden.

■

Das "Anregungsmittel" kann zu einem beliebigen Zeitpunkt während des Wachstumszyklus zugesetzt werden. Kulturen, die auf Nährmedien, wie Specköl, wachsen gelassen wurden, beginnen mit der Synthese der Steroid-1-Dehydro-

20' genäse rasch, während Kulturen, die auf Glucose wachsen gelassen wurden, eine Substratabreicherung erfordern, bevor eine Enzymsynthese erfolgt. Nach Zugabe des "Anregungsmittels" wird δ h oder langer weiter inkubiert, danach werden die Zellen zur Verwendung, bei dem Lösungsmittelverfahren oder zur Trocknung geerntet.

Maßnahmen zur Sammlung von Zellen zum Trocknen:

Die Zellen werden aus dem Nährmedium abgetrennt und in üblicher.bekannter Weise, z.B. .durch Zentrifugieren oder

³^ Flockung und Filtration und Ultrafiltration konzentriert. Danach werden die abgetrennten Zellen getrocknet, indem sie unter vermindertem Druck bei 1° bis 85°C, vorzugsweise 55 bis 7 5°Ci durch Lufttrocknung unter Erwärmen, durch Sprühtrocknen oder durch Trommeltrocknung auf einen Feuchtigkeitsgehalt von etwa 1 bis etwa 10 % ge-

<J <J <L Z. I /L U

getrocknet warden. Vorzugsweise beträgt der Feuchtigkeitsgehalt etwa 5 %. Die Zellen werden dann bei 5°C gelagert, bis sie zur Bioumwandlung eingesetzt werden. Aktive getrocknete Zellen erhält man auch durch Immobilisieren getrockneter Zellen nach Standardverfahren, z.B. durch Einschluß in ein Polyacrylamidgel und Collagen oder durch kovalente Kupplung der Zellen an.einen Polyelektrolytträger, vgl. "Methods in Enzymology", Band XLIV, 1976, Verlag Academic Press, Inc., New York, Seiten 11-317.

Biologische Umwandlung:

Die Bioumwandlung erfolgt durch Einwirkenlassen der Zellpräparate auf das Steroidsubstrat. In typischer 5 Weise werden die Zellen und das Steroid in einer schwachgepufferten wäßrigen Lösung eines pH-Werts im Bereich von 6 - 10, vorzugsweise 7,25 - 8,5, suspendiert. Die Zellenroenge beträgt 0,1 - 50 g/l. Das Steroid kann in einem Gewichtsverhältnis (Steroid:Zellen) von 0,05 bis 5,0 zugesetzt werden. Zellenmengen von 8-10 g/l bei 5-10 g/l Steroid werden bevorzugt, wenn die biologische Umwandlung in wäßriger Umgebung vonstatten geht. Zur Stimulierung der Reaktion wird ein exogener Eletronenträger in katalytischer Menge (beispielsweise

-4
5 χ 10 " M Menadion) zugesetzt. Geeignete Verbindungen sind Menadion-(2-methyl-1,4-naphthochinon), Phenazinmethosulfat, Dichlorphenol-indophenol, 1,4-Naphthochinon, Menadionbisulfit, Ubichinone (Coenzym Q) und Verbindungen vom Vitamin K-Typ. Die Mischungen werden bei einer Temperatur von 5 - 45 C 0 bis 14 Tage lang inkubiert. .Während der Inkubation ist ein Zutritt von molekularem Sauerstoff zu dem Gemisch möglich. Vorzugsweise wird das Gemisch während der Inkubation gerührt. Die Geschwindigkeit der 1-Dehydrierung nimmt in typischer Weise im Laufe der Zeit ab. Bei Verwendung

von 10 g/l Substrat kann die Bioumwandlung in weniger als h 98 - 100 % vollständig sein.

Im folgenden werden Beispiele für verschiedene durchführbare Verfahrensmaßnahmen angegeben:

a) Suspension des Steroids und von Menadion in einer schwach gepufferten wäßrigen Lösung und anschließende Zugabe der getrockneten Zellen. Zur Verbesserung der Steroidsuspension können oberflächenaktive Mittel, z.B. Tween 80 in niedriger Konzentration, beispielsweise einer Konzentration von 0 - 5 %, zugegeben werden. . -

b) Suspension der Zellen in einem wäßrigen Puffersystem bei anschließender Zugabe des in Ethanol, Methanol oder Aceton (nicht mehr als 5 % des Endvolumens) gelösten Elektronenträgers. Das Steroidsubstrat kann als trockenes Pulver oder in einem mischbaren organisehen Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Ethanol, Methanol, Aceton oder Dimethylsulfoxid, oder in einem nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie Toluol, gelöst oder suspendiert zugegeben werden.

c) Rehydratisierung der getrockneten Zellen in einem geringen Puffervolumen und anschließende Zugabe von mehr Puffer oder eines organischen Lösungsmittels. Hierbei wird so viel Ethanol, Aceton, Xylol, Butylacetat, Methylenchlorid oder Toluol zugegeben, daß der Endgehalt an organischem Lösungsmittel 0 - 95 % (Vol/Vol) beträgt. Die Menge an verwendetem aromatischem Kohlenwasserstoff reicht von etwa der Hälfte der zum Auflösen des am besten löslichen Ausgangssteroids oder gebildeten Steroids erforderlichen Menge bis zur etwa vierfachen Menge der zum Auflösen

Δ. Ι Λ U

des am wenigsten löslichen Ausgangssteroids oder gebil deten Steroids erforderlichen Menge. Das Steroid und der Elektronenträger werden zur Einleitung der Umsetzung zugegeben. Der Zusatz des aromatischen Kohlen-Wasserstoffs erfolgt vorzugsweise zusammen mit dem Steroid, er kann jedoch auch früher oder später erfolgen.

d) Suspension eines nassen Zellenkuchens oder Verdünnen einer Fermentationsbrühe mit einer schwach gepufferten wäßrigen Lösung und anschließende Zugabe eines exogenen Elektronenträgers, eines Steroids und eines aromatischen Kohlenwasserstoffs.

Substratbereich:

Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendbare

4
Verbindungen gehört zur 3-Keto—Δ -androsten- und 3-Keto-Δ -pregnenreihe der Steroide. Substrate für die Steroid-1-Dehydrogenase sind bekanntlich zwischen den Kohlenstoffatomen C₁ und CU des Rings A gesättigt und besitzen in 3-Stellung des Rings A eine Hydroxy- oder Ketogruppe. Beispiele für Verbindungen der Androstenreihe sind:

1} Androsta-4-en-3,17-dion und

„5- 2) Androsta-4 ,9 (11). -dien-3 ,1 7-dion und seine 6a-Fluor-, 6a-Methyl- oder 16-Methylderivate;

3) 11ß-Hydroxyandrosta-4-en-3,17-dion und seine Derivate .

4
Verwendbare Steroide der 3-Keto-A -pregnen-Reihe sind:

1. 17a-Hydroxy-pregn-4-en-20-yn-3-on und seine 16-Methylderivate;

2. 11ß,21-Dihydroxy-pregn-4,17(20)-dien-3-on und seine 6a-Methylderivate;

* P
ft ■» *

χ is*

3. 20-Chlor-pregn-4,9(11),17(20)-trien-21-al-3-on;

4 4. verschiedene Gruppen von 3,20-Diketo-A -Pregnenen, wie

a) 11,17,21-Tr^hydroxyverbindungen, z.B. Hydro-

cortison und sein 6a-Methy!derivat;

b) 9ß,11ß-Epoxy-17, 21-dihydroxyverbindungen, z.B.

9 ß , 11ß-Epoxy-17,21-dihydroxy-16 ß-methyl-pregn-4-en-3,20-dion;

c) 3,20-Diketo-4,9(11)-pregnediene, z.B. 17a,21-Dihydroxy-pregn-4,9(11)-dien-3,20-dion und sein 16a-Methyl-, 16ß-Methyl- oder 16a-Kydroxyderivat oder der 17a-Äcetatester;.

d) 3,20-Diketo-4,9(11) , 4,9 (11)., 16-pregnetriene, z.B 2.1-Hydroxy-pregh-4,9 (11) , 1 6-trien-3 , 20-dion und sein 6a-Fluorderivato

Als Substrate eignen sich ferner die 21-Esterderivate derjenigen Steroide, die in 21-Stellung eine Hydroxygruppe aufweisen (Nr. 2 und Nr. 4). Die bevorzugten 21-Ester enthalten kurzkettige Alkyl- oder Arylgruppen von kurzkettigen Fettsäuren, z.B. Essigsäure, und monocyclischen Carbonsäuren, z.B. Benzoesäure.

Die biologischen Umwandlungsprodukte und nicht umgewandeltes Substrat können aus den Reaktionsgemischen in üblicher bekannter Weise isoliert werden. Die Steroide werden in typischer Weise abfiltriert, worauf der FiIterkuchen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Aceton oder Methylenchlorid, extrahiert wird. Andererseits kann das gesamte biologische Urawandlungsgemisch durch Vermischen mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, z.B. Butylacetat oder Methylenchlorid, extrahiert werden. Das Reaktionsprodukt wird dann aus dem organischen Lösungsmittel isoliert.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Beispiel

Herstellung der getrockneten Zellen:

Die Beimpfung mit Bacterium cyclooxydans (ATCC Nr.12673)

erfolat in Schüttelflaschen mit einem Medium aus Cerelose, 10

Pepton und Maiseinweichflüssigkeit (jeweils 6 g/l) eines pH-Werts von 7,0. Die Kulturen werden bis zum Auftreten einer Glucoseerschöpfung auf einem Drehrüttler bei 28°C inkubiert. Beim Auftreten der Glucoseerschöpfung erfolgt

eine Zugabe von 0,5 g/l Cortisonacetat, worauf die 15

Schüttelflaschen erneut 16h lang inkubiert werden. Die

Ernte der Zellen erfolgt durch Zentrifugieren. Die abzentrifugierten Zellen werden zweimal mit Wasser gewaschen und dann in einem ein niedriges Vakuum aufweisenden Ofen bei 4 5°C gelagert, bis sie getrocknet sind. 20

Bioumwandlung von βα-Methylhydrocortison.

Ein halbes Gramm der in der geschilderten' Weise hergestellten getrockneten Zellen wird unter Rühren in 50 ml eines 50 mM Phosphatpuffers eines pH-Werts von 7,5 rehydratisiert. Zu der Zellensuspension wird Menadion als ethanolische Lösung (8,6 mg/ml Ethanol) in einer Menge von 0,025 ml/50 ml zugegeben. Die Substratzugabe erfolgt als Lösung in Dimethylformamid (100 mg 6a-Methylhydro-

gg cortison/ml Dimethylformamid) bis zu einer Endbioumwandlungskonzentration von 0,5 g/l. Nun wird das Gemisch unter Bewegen bei 28 C inkubiert. Nach 4-stündiger Inkubation ist das Steroid zu 91 % umgewandelt. Das 6a-Methylprednisolon wird in üblicher bekannter Weise

gg gewonnen.

Beispiel

Herstellung von Androsta-1,4,9(11)-trien-3,17-dion

a) Herstellung des Biokatalysators:

Arthrobacter simplex (ATCC Nr. 6946) wird in Schüttelflaschen in einem Medium mit 6 g/l Glucose, 6 g/l Maiseinweichflüssigkeit und 6 g/l sprühgetrockneten Speckwassers wachsen gelassen. Die Kulturen werden so lange auf einem Drehrüttler bei 28°C inkubiert, bis eine Glucoseverarmung eintritt. Zu diesem Zeitpunkt erfolgt eine Zugabe von 0,15 g/l Cortisönacetat zur Einleitung der Steroid-1-Dehydrogenasesynthese. Nach einer Inkubation über Nacht werden die Zellen durch Zentrifugieren mit niedriger Geschwindigkeit geerntet. Die Zellenpellets werden dann zum Trocknen 24 h lang in einen ein niedriges Vakuum aufweisenden Ofen einer Temperatur von 55°C gelegt. 24 h später wird das getrocknete Material in einen luftdichten Behälter überführt und darin bis zum Gebrauch zur biologischen Umwandlung bei 5°C gelagert.

b) Biologische Umwandlung von Androsta-4,9(11)-dien-3,17-dion:
.

10 g/l getrocknete Zellen werden unter 30-minütigem Rühren in 50 mM Phosphatpuffer eines pH-Werts von 7,5 rehydratisiert. Danach wird die Zellensuspension mit so viel trockenem pulverförmiger Menadion versetzt, daß ein.e Endkonzentration von 86 mg/1 erreicht wird. Ferner wird mikronisiertes Androsta-4,9(11)-dien-3,17-dion in Dimethylformamid aufgeschlämmt und in Form der Aufschlämmung dem biologischen Umwandlungsgemisch in einer Menge von 2,5 g Steroid/1 und 2 %

qc (v/v) Dimethylformamid zugegeben. Nun wird das Gemisch

unter Bewegen in Gegenwart von Luft 24 h lang bei 31 C inkubiert. Nach beendeter Inkubation wird das Androsta-1, 4 , 9 (11)-trien-3,17-dion in üblicher bekannter Weise rein dargestellt.

Beispiel

In entsprechender Weise wie in Beispiel 2 werden auf folgende Steroide:

1. Androsta-4-en-3,17-dion

2. 6a-Fluor-androsta-4,9(11)-dien-3,17-dion

3. 6a-Methyl-androsta-4,9(11)-dien-3,17-dion

.- 4. 16ß-Methyl-androsta-4,9(11)-dien-3,17-dion

5. T7a-Kydroxy-pregn-4-en-20-yn-3-on.

6. 17a-Hydroxy-pregn-4,9(11)-dien-20-yn-3-on

7 . 17oc-Hydroxy-16ß-methyl-pregn-4,9 (11) -dien-20-yn- _2D 3-on

8. 11ß,21-Dihydroxy-pregn-4,17(20)-dien-3-on

9. 21-Acetoxy-11ß-hydroxy-pregn-4,17(20)-dien-3-on

10. 6a-Methyl-11ß,21-dihydroxy-pregn-4,17(20)-dien-3-on 11. 20-Chlor-pregn-4,9(11),17(20)-trien-21-al-3-on

12. Hydrocortison

13. 6a-Methylhydrocortison

14. 21-Acetoxy-11ß,17-dihydroxy-16ß-methyl-pregn-4-en-. 3,20-dion

15. 21-Acetoxy-9a-fluor-11ß,17-dihydroxy-16ß-methylpregn-4-en-3,20-dion

16. 21-Acetoxy-9ß,11ß-epoxy-17-hydroxy-16ß-methyl-pregn-4-en-3,20-dion

17o 21-Acetoxy=17-hydroxy-pregn-4,9(11)-dien-3_f20-dion

18. 21-Acetoxy-16a,17-dihydroxy-pregn-4,9(11)-dien-3,20-dion

19. 21-Acetoxy-17-hydroxy-16a-methyl-pregn-4,9(11)-dien-3,20-dion

20. 21-Benzoyloxy-17-hydroxy-16ß-methyl-pregn-4,9(11)-dien-3,20-dion

21. 2i-Acetoxy-17-hydroxy-16ß-methyl-pregn-4,9(11)- · dien-3, 20-dion

22. 21-Acetoxy-pregn-4,9(11),16(17)-trien-3,20-dion und

23. 21-Acetoxy-6a-fluor-pregn-4,9(11),16-trien-3,20-dion ·

zur Gewinnung der entsprechenden 1,2-Dehydroderivate: 1a Androsta-1,4-dien-3,17-dion 2a 6a-Fluor-androsta-1,4,9(11)-trien-3,17-dion 3a 6a-Methyl-androsta-1,4,9(11)-trien-3,17-dion 4a 16ß-Methyl-androstä-1,4,9(11)-trien-3,17-dion 5a 17cL-Hydroxy-pregn-1 ,4-dien-20-yn-3-on 6a 17a-Hydroxy~pregn-1,4,9(11)-trien-20-yn-3-on

.

7a 17a-Hydroxy-16ß-methyl~pregn-1,4,9(11)-trien-20-yn-

3-on
8a 11ß,21-Dihydroxy-pregn-1,4,17(20)-trien-3-on

9a 21-Acetoxy-11ß-hydroxy~pregn-1,4,17(20)-trien-3-one und

11ß,21-Dihydroxy-pregn-1,4,17(20)-trien-3-on

1Oa 6a-Methyl-11ß,21»dihydroxy-pregn-1,4,17(20)-trien-3-on

11a 20-Chlor-pregn-1,4,9(11),17(20)-tetraen-21-al-3-on

12a Prednisolon

13a 6a-Methylprednisolon

14a 21-Acetoxy-11ß,17-dihydroxy-16ß-methyl-pregn-1, 4-

dien-3,20-dion und
5

11ß,17,21-Trihydroxy-16ß-methyl-pregn-1,4-dien-3,20-dion

15a 21-Acetoxy-9a-fluor-11ß,u7-dihydroxy-16ß-methylpregn-1 ,4-dien-3,20-dion und

9a-Fluor-11ß,17,21-trihydroxy-16ß-methyl-pregn-1,4-dien-3,20-dion

16a 21-Acetoxy-9ß,11ß-epoxy-17-hydroxy-16ß-methyl-pregn-1,4-dien-3,20-dion und

9ß,11ß-Epoxy-17,21-dihydroxy-16ß-methyl-pregn-1,A-dien-3,20-dion

17a 21-Acetoxy-17-hydroxy-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20 dion und
17,21-Dihydroxy-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion

18a 21-Acetoxy-16a, 17-dihydroxy-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion und

16a,17,21-Trihydroxy-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion

19a 21-Acetoxy-17-hydroxy-16α-methyl-pregn-1,4,9(11)-²^ trien-3,20-dion und

17,21-Dihydroxy-16a-methyl-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion

20a 21-Benzoyloxy-17-hydroxy-16ß-methyl-pregn-1,4,9(11)-

trien-3,20-dion
30

21a 21-Acetoxy-17-hydroxy-16ß-methyl-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion und

17,21-Dihydroxy-16 ß-methyl-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion

22a 21-Acetoxy-pregn-1,4,9(11),16-tetraen-3,20-dion und 2i-Hydroxy-pregn-1,4,9(11),16-tetraen-3,20-dion

:3 3 2 2 1 2

23a 2T-Acetoxy-6a-fluor-pregn-1,4,9(11),16-tetraen-3,20 dion und 6a-Fluor~21-hydroxy-pregn-1,4,9(11),16-tetraen-3", 20-dion

trockene Zellen von A„simplex einwirken gelassen.

Beispiel

Mit Zellen von A.simplex in einer Gärbrühe und mit ge-. trockneten A.siraplex-Zellen werden zwei verschiedene Steroide einer biologischen Umwandlung unterworfen. Nachdem jede biologische Umwandlung als beendet angesehen wurde (keine weitere Abnahme der Restsubstratmenge)j wird das in jedem Gemisch enthaltene Steroid

extrahiert und isoliert (um Daten für die einzelnen Versuche zu gewinnen). Die folgende Tabelle faßt die gewonnenen Ergebnisse zusammen:

Vergleich der isolierten Ausbeuten aus verschiedenen Arten biologischer Umwandlungen

Substrat

g/l

Art der biologischen Chemische Ausbeute % Δ¹ %-Rest Bemerkung Umwandlung an wertvollem Verbin-

Steroid (a) dung

Fermentation

getrocknete Zellen

77,2 % erste Charge 2,6

2,8 % zweite Charge 10,4

82,6 % erste Charge 100,0 9,9 % zweite Charge 95,0

87,4

89,6

5,0

schlechte 1-Dehydrierung

g/l

OAc Fermentation

getrocknete Zellen 18,1 % erste Charge 59,1 keine zweite Charge

79,6 % ersteCharge 97,8

keine zweite Charge

40,9

2,1

(b)

(a) Als "brauchbares Steroid" ist eine bei einer weiteren Synthese verwendbare Δ" -Verbindung oder das 1,2-Dihydrosubstrat, das in eine weitere biologische Umwandlung zur Produktgewinnung rückgeführt werden kann, zu verstehen.

(b) Es werden auch beträchtliche Mengen an sonstigen unerwünschten Steroidmolekülen gefunden.

■ '

Beispiel 5

Arthrobacter simplex wird in einem 5 1 fassenden "Microferm"-Fermentiergefäß wachsen gelassen, zu einer Steroid-1 Dehydrogenasesynthese angeregt und durch Zentrifugieren geerntet. Teile der erhaltenen Zellenpaste· werden nach zwei verschiedenen Verfahren aufgearbeitet. Beim ersten Verfahren werden die Zellen unter vermindertem Druck bei 55 C getrocknet. Beim zweiten Verfahren werden entsprechend der US-PS 3 360 439 acetongetrocknete Zellen hergestellt. Die Zellen werden hierbei mit Aceton gemischt, geerntet und bei 5 C unter vermindertem Druck getrocknet.

Danach werden die trockenen Zellenpräparate zur biologi-

9 11
sehen Umwandlung von Δ ' -Androstendion in Schüttelflaschen bei Konzentrationen von 10 g/l Zellen und 10 g/l Steroid eingesetzt.

Vergleich der biologischen Umwandlungskapazität von A.simplex-Zellen, die nach unterschiedlichen Verfahren getrocknet wurden

Zellenart

Versuchsdauer (h)

% Rest- Biologische Umwandsubstrat lungsaktivität+

(g gebildetes Produkt)

h/g Zellen

acetonge- trocknet	1 4	98,7 95,5	0,013 0,011.
	24	84,1*	0,007
wärmege trocknet	1 4	85,1 23,2	0,149 0,192
	24	7,2*	0,039

(+) Die biologische Umwandlungsaktivität errechnet sich wie folgt:

% gebildetes Produkt χ g zugesetztes Substrat

100

= g gebildetes Produkt

g gebildetes Produkt/Dauer der Inkubation in h/ g zugesetzte Zellen = Aktivität

(*) Die Restsubstratmengen sinken bei weiterer Inkubation nicht mehr.

Beispiel 6

Beim Ersatz von 6a-Methylhydrocortison in Beispiel 1 bzw. Androsta-4,9(11)-dien-3,17-dion in Beispiel 2 durch folgende Substrate:

1„ 21-Äcetoxy-9a-fluor-11ß,16a,17-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion;

2. 21-Acetoxy-6a,9a-difluor-11ß,16a,17-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-16,17-acetonid;

3_O 21-Acetoxy-öa-fluor-11ß-hydroxy-16a-methyl-pregn-4-en-3,20-dion;

4. 21-Acetoxy-6a-fluor-11ß,17-hydroxy-pregn-4-en-3,20-dion;

5. 21-Acetoxy-6a,9a-difluor-11ß,17-dihydroxy-16a-methylpregn-4-en-3,20-dion;

6 ο 21-Acetoxy-9a-fluor-11ß,16a,17-trihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-16,17-acetonid;

7. 21-Acetoxy-9ß,11ß-epoxy-6a-fluor-16a,17-dihydroxypegn-4-en-3,20-dion-16,17-acetonid;

8. 21-Acetoxy-9ß,11ß-epoxy-16a-hydroxy-pregn-4-en-3,20-dion und

9. 21-Acetoxy-9ß,11ß-epoxy-16a,17-dihydroxy-pregn-4-en-3,20-dion-16,17-acetonid

erhält man die folgenden Produkte:

1„ 21-Acetoxy-9a-fluor-11ß,16a-17-trihydroxy-pregn-1,A-dien-3,20-dion und

9a-Fluor-11ß,16a,11,21-tetrahydroxy-pregn-1,4-dien-3,20-dion;

2". 21 -Acetoxy-6a, 9a-dif luor=11 ß, 1 6a, 1 7-trihydroxy-pregn-1,4-dien-3,20-dion-16,17-acetonid und 6a, 9a-Fluor-11 ß„ 16öS, 17 _f 21-tetrahydroxy-pregn-1 , 4-dien-3,20-UiOn=Io^I7-acetonid;

h.

3. 21-Acetoxy-6a-fluor-11ß-hydroxy-16a-methyl-pregn-1_f4 dien-3,20-dion und

6a-Fluor-118,21-dihydroxy-16a-methy1-pregn-1,4-dien-3,20-dion;

4. 21-Acetoxy-6a-fluor-11ß,17-hydroxy-pregn-1,4-dien-3_f20-dion und
6a-Fluor-11ß,17,21-trihydroxy-1,4-dien-3_f20-dion;

5. 21-Acetoxy-βα,9a-difluor-11ß,17-dihydroxy-16a-methyl pregn-1,4-dien-3,20-dion und

6a,9a-Difluor-11ß,1Ί,21-trihydroxy-1,4-dien-3,20-dion ;

. 21 -Acetoxy-90., f luor-11 ß, 1 6a, 1 7-trihydroxy-pregn-1,4-dien-3,20-dion-16,17-acetonid;

IS 7, 21-Acetoxy-96,11S-epoxy-6a-fluor-16a,17-dihydroxypregn-1,4-dien-3,20-dion-16,17-acetonid;

8. 21-Acetoxy-9ß,11ß-epoxy-16-hydroxy-pregn-1,4-dien-3,20-dion und

9ß,11ß-Epoxv-16a,21-dihydroxy-pregn-1,4-dien-3,20-dion;

9. 21-Acetoxy-9ß,11ß-epoxy-16a,17-dihydroxy-pregn-1,4-dien-3,20-dion-16,17-acetonid.

Beispiel 7

Biologische Umwandlung von 11ß-Hydroxyandrosta-4-en-3,17-dion.

Ein Gramm entsprechend Beispiel 2 getrockneter A.simplex-Zellen wird in 100 ml 50 mM Phosphatpuffer eines pH-Werts von 7,5 resuspendiert. Danach erfolgt eine Zugabe von in 3A Ethanol gelöstem Menadion in einer Endkonzentration von 86 mg/1. Nach Zugabe von 1/2 g 11ß-Hydroxyandrosten-

dion in die Flasche wird das Gemisch auf einem Drehrütt-35

2?

lex bei einer Temperatur von 31°C inkubiert. „ Werden nach 1-tägiger Inkubation Proben gezogen, erscheinen auf eines Dünnschichtchromatogrämm eines Methylenchloridextrakifs ^Λ· ' zwei Produkte. Etwa 95 % des Steroids bestehen aus 11ß-Hydroxyandrosta»1_f4-dien-3,17-dion, der Rest aus nicht umgewandeltem Substrat,

Beispiel 8

Entsprechend Beispiel 7 lassen sich folgende am C₁--modifizierte ..Ändrostendione T.—dehy drier en:

Substrat ■» Produkt

(1) 1 1ß-Hydroxy-T6ß-methylandrosta-4-en-3₍,17-dion ■> 11ß-Hydroxy-1β ß-methylandrosta-1,4-dien-3,17-dion

(2) 11 ß-Hydro2sy~J.6a—methylandrosta-4-en-3,17-dion - ■* 11 ß-Hydroxy-1 6a-methylandrosta-1,4-dien-"3,1 7-dion

(3) 6a-Fluor-nß"=-hydroxyatidros"ta™-4-en-3,17-dion -»

6a-Fluor-11ß-hydroxyandrosta-1,4-dien-3,17-dion

(4) 6a-Methyl-11 ß-hydroxyandrosta-4-en-3,1 7-dion ·* 6a-Methyl-11 ß-hydroxyandrosta~-1,4-dien-3 ,17-dion

^: T1 a-Hydrosyandrosi©-^^:^-ea-3/17—dion 11 &=Hydroxyandrosta-1 _ff4-?4ien—3,17-dion und

(6) Androsta-4-en-3,11„17-trion

Ädot1,4-dien-r3^ 1 X₄ 17-trion.

Beispiel 9
1.. In einsm ReaktionsgefäJS werden /!auf .1 Liter-Basis) fol-

gende Bestandteile kombiniert:

a) 0,9 1 50 mM KPO.-Puffer eines pH-Werts von 7,5

b) 3,66 g trockene A.Simplex-Zellen

c) 0,08 g Menadion

d) 8 g 21-Acetoxy-pregn-4,9(11),16-trien-3,20-dion e) 100 ml Toluol.

2. Es wird mit 15 cal/1 min bewegt.

3. Zutritt von so viel Luft, daß der Sauerstoffgehalt im Gasraum des Reaktionsgefäßes etwa 3—6 %. beträgt. ·

4. Die Temperatur wird auf 28° — 1°C gehalten. 5. Hach 25 h wird die Toluolphase abgetrennt.

In diesem Beispiel bestebt>:das Steroid in der Toluolphase aus

94,3 % 21-ÄcetO3cy-pxegn-1V4_T9<T1| , 16-tetraen-r3 „20-dion, 4,2 % 21-Hydroxy-pxegnr-V,i|,9(1t)-_f 16-te±xaen-3_r20-dion und " 1_f5 % 21-Acetoxy-pregn-4,9(11),16-trien-3,20-dion.

"" Die verschiedenen beschriebenen Stufen können wie folgt

" variiert werden:
■25

Stufe 1 ■

a) Pxiffer-pH-Bereichs € — '10. - ■

b) Die Jlenge an A-s±niple* wird.so weit verringert, daß

. .

■ ' sie gerade ausreicht* die. Reaktion vollständig.ablaufen- . ·■ -

lassen. Typische^Ä.simplex-Mengen sind O,O5 --1,0 g/g-Steroid. Der mikrobiologische Enzymlieferant ist: Arthrobacter (Corynebacterium) simplex (ATCC .Nr. 6946) oder Bacterium cyclooxydans (ATCCNr. 12573).

Herstellung der Mikroorganismens Di« A^ siaplex-Zellen

können in der Gärbrühe verwendet oder durch Sammeln der . Zellen, Trocknen, Äcetonbehandlung oder Immobilisieren in üblicher bekannter Weise modifiziert werden. 5

c) Als Elektronenakzeptor eignen sich Menadion-(2-methyl-1,4-naphthochinon), Menadionbisulfit, 1,4-Naphthochinon oder sonstige Vitamin K-artige Verbindungen. ■

Der Gehalt des Elektronenakz^ptors wird, durch dessen Kosten und Erwägungen bezüglich der Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt. Die Reaktionsgeschwindigkeit ist linear proportional zur Menadionkonzentration.

Typische Mengen sind etwa 5 bis etwa 40 g/kg Steroid.

d| Die Steroidkonzentration sollte so hoch wie möglich se±n„ solange nur -eine wirksame .Umwandlung abläuft.

Als:Steroide eignen.sich solche dar 3-Ket.o-&*-androsten-

4
oder 3^Keto-& -pregnen-Reihe. Vorzugsweise sollte das..

Steroid eine Löslichkeit in dem organischen Lösungsmittel von mehr als 5 g/l aufweisen.

2b e) Als-'aromatische Kohlenwasserstoffe eignen sich Toluol, Benzol" unä/oder Xylol. Diese" Lösungsmittel können .allein, in Mischung untereinander oder in Verdünnung mit anderen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln, wie Heptan

·-· - ■ oder Methylenchlorid„· zum Einsatz gelangen.

' Die "Menge an aroseti.0chem -Kohlenwasserstoff reicht von etwa der Hälfte Tier zum Auflösen des am besten löslichen Äusgangssteroids oder gebildeten Steroids, erforderlichen Menge bis zur etwa vierfachen Menge der .zum. Auflösen des aas wenigsten löslichen Äusgangssteroids oder gebildeten

ί. L. I C\J

Steroids erforderlichen Menge.

Im vorliegenden Beispiel wird gerade so viel Toluol zugegeben, daß das Steroid bei Beendigung der Umsetzung eben gelöst wird.

Die Zugabe des' aromatischen Kohlenwasserstoffs erfolgt vorzugsweise zusammen mit dem Steroid. Der aromatische Kohlenwasserstoff kann jedoch auch später oder früher zugegeben werden.

Stufe 2

." Man kann auch mit hoher Bewegungsenergie bewegen. Die

Reaktionsgeschwindigkeit steht in deutlicher Beziehung ° zur Bewegungsenergie.

Stufe 3

Die Umsetzung erfordert'-Sauerstoff als endgültigen Wasserstoff— (Elektronen -und ProtonÄ^-AJczeptor. Infolge " · -

Anwesenheit des aromatischen Kohlenwasserstoffs existiert jedoch im Gasraum des Reaktors eine explosive Umgebung. Um diese Gefahr der Sauerstoffkonzentration im Gasraum auszuschalten oder weitestgehend zu mindern, sollte die

Sauerstoffkonzentration unter der zur Verbrennung er-25

forderlichen Mindestkasizentration gehalten werden. Für Benzol beträgt die- Mindestsauerstoffkonzentration 11,2 %. ■ Bei Xylol ist es auch möglich, die Umsetzung unterhalb des Flammpunkts durchzuführen. Die Flammpunkte für

sa-Xylol, o-Xylol, und p-Xylol sind 29._r 32 und 39°C. 30

Stufe 4

Die Temperatur der Umsetzung kann von-0 bis 45 C reichen.
35

322120

Stufe 5

Die Umsetzung dauert typischerweise 2 Tage, sie Jcann jedoch auch einige h bis einige Wochen durchgeführt werden.

Beispiel 10

Vergleich von Versuchen in Toluol und wäßriger Phase.

A. Maßnahmen:

Zunächst werden 0,4 g A„srmplex-Zellen mit 50 ml 50 mM KPO.-Puffer eines pH-Werts von 7,5 kombiniert, worauf das Ganze 2 h lang oder, bis zum Erreichen einer gleichmäßigen Aufschlämmung bewegt wird. Es werden nun zwei 25 ml-Fraktionen entnommen und in 125 ml fassende Flaschen überführt. In jede Flasche werden dann 0,25 ml 5 mM Menadion in 3A-Alkohol und 0,2 g Androsta-4,9(11)-dien-3,1 7—dion eingetragenes" Irt eine der mit Stopfen versehenen Flaschem werden 2 ml''Toluol gefüllt, worauf die Flaschen 4 ^ag<s^i.ang mittels·, eines Gelenkrüttiers be- ■ wegt "werden» Uach 4 Tagen erfolgt eine Extraktion mit 25 ml Toluol. Eine Analyse der Extrakte ergibt folgende Ergebnisse.

B„ Ergebnisse:

Verfahren

in wäßrigem in Toluol Medium

.30 .!Substrat) ^;

(Produkt) .
Ändrosta-4,9(11)-trien-3,17-dion 82,3 % 100,00 %

Beispiel 11

Entsprechend Beispiel 9 werden mit Hilfe getrockneter · Zellen von A.simplex folgende Steroide:

_ 1. Androsta-4-en-3,17-dion

2. 6a-Fluor-androsta-4,9(11)-dien-3,17-dion

3. 6a-Methyl-androsta-4,9(11)-dien-3,17-dion

4. 16ß-Methyl-androsta-4,9(11)-dien-3,17-dion

5. 17a-Hydroxy-pregn-4-en-20-yn-3-on

6. 17a-Hydroxy-pregn-4,9(11)-dien-20-yn-3-on

7. 17a-Hydroxy-16ß-roethyl—pregn-4,9(11)-dien-2O-yn-3—on

8. 21 -Aeetoxy-i1 ß-tiydroxy-pregn-4,1 7 (20) -dien-3-on

9. 20-Chlor-pregn-4,9(11),17(20)-trien-21-al-3-on

10. 21 -Acetoxy-17-hydroxy-pregn-4,9(11 )--dien-3 , 20-dion

11. 21-Acetoxy-1 7-hydroxy-1 6a-methyl-pr.egn-4 ,9(11) -dien-3,20-dion

12. 21-Benzoyloxy-17-hydroxy-16ß-metnyl-pregn-4,9(11)-dien-3,2O-dipn _r .

13.- 21-Acetoxy-i l^*hydroxy-1 68-methyl-pregn-4, 9(11)-dien-3,20-dion:

14. 21-Acetoxy-pregn—41S111)>36-txien-3,20-dion

15. 21-Acetoxy-6a-fluor-pregn-9V9(11) , 16(1-7 )-trien-3 , 20-dion

in folgende Produkte:
1a Androsta-1/4-dien-3,17-dion

-²S 2a. 6a-_Fluor-androsta-1,4_f 9 {11 )-txien-3,17-dion 3a 6ct-Methyl-ändrosta— 1,4,9(11)—trien-3,17-dion 4a 16ß-Methyl-androsta-1 _f4_f 9(11)-trien-3,17-dion

5a 17a-Hydroxypregn-1,4-dien-2O-yn-3-on

6a 17a-Hydroxy-pregn-1♦4,9 <11)-trien—2O-yn-3-on · ,

7a 17a-Hydroxy-16£-methy1-pregn-1,4,9(11)-trien-2O-yn-3-on

. 8a 21-Acetoxy-1iß-hydroxy-pregn-1,4,17(20)-trien-3-on 35

11ß,21-Dihydroxy-pregn-1,4,17(20)-trien-3-on

9a 2Q-Chlpr.-pregn-1, 4, 9 (11) , 17 (20)-tetraen-21-al-3-on

10a 2 i-Acetoxy-^-hydroxy-pregn-1,4,9{11)-trien-3,20-dion und

17,21-Dihydroxy-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion 5

11a 21-Acetoxy-17-hydroxy-16α-methyl-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion und

17,21-Dihydroxy-1öa-methyl-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion

12a 21-Benzoyloxy-17-hydrqxy-16B-methyl-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion

13a 21-Acetoxy-i7-hydroxy-l6ß-inethyl-pregn-1,4,9 (11)-trien-3,20-dion und

17,21-Dihydroxy-16ß-methyl-pregn-1,4,9(11)-trien-3,20-dion

14a 21-Acetoxy-pregn-i,, ·4# 9i 11) -tetraen-3, 20-dion und 21-Hydroxy-ira:egn-1i4_/9<1'1,) , T6—tetraen-3,.20-dion

15a 21- Acetoxy^.Sa*f lnor-s: g-1 _r4_#9<11)._#1£ -tetraen-3,20—.dion.. und ·.·"·. .^' i . -■ ' - .

6a»Flupr-21-hydroxy-pregn-1,4,9'Mi) ,16-teträen-3,20-dion

überführt.

²^ Die Verwendbarkeit von 1,2-Dehydrosteroidenist-' bekannt.

So ist es beispielsweise aus der US-PS 3. 284 .447 bekannt, Δ ' ^r · -Pregnetriene beirdex Synthese diuretisch wirksamere, am C^g substituierter Corticosteroide einzusetzen. Aus der US-PS 4 041 055 ist ein Verfahren zur Synthese

30. von Cortl cos te roxcfen aus \£**. ·.—Ändrosteadlonderi vat en .bekannt, d.h. 1,2-Dehydroandrostene stellen wichtige Zwi-r ■schenprodukte bei der Herstellung medizinisch wertvoller Steroide dar.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zur Umwandlung von 1,2-gesättigten 3-Ketcsteroiden in 1,2-Dehydrosteroide, dadurch gekenn-. zeichnet, daß man auf die 1,2-gesättigten Steroide luftgetrocknete oder wärmegetrocknete Zellen von 1-dehydrierenden Mikroorganismen einwirken läßt.

2. Verfahren nach Anspruch 1-, dadurch gekennzeichnet, daß man luftgetrocknete oder wärmegetrocknete Mikroorganismenzellen eines Feuchtigkeitsgehalts von etwa 1 bis etwa 10 % verwendet.

3.. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als 1-dehydrierende Mikroorganismen Arthrobacter simplex und/oder. Bacterium cyclooxydans verwendet.

■4. Verfahren zur Umwandlung von 1,2-gesättigten Steroiden in 1,2-Dehydrosteroide, dadurch gekenn-. zeichnet, daß man auf die 1,2-gesättigten Steroide luftgetrocknete oder wärmegetrocknete Bakterienzellen von 1-dehydrierenden Mikroorganismen in Gegenwart eines exogenen Elektronenträgers einwirken läßt. ■

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als exogenen Elektronenträger Menadion, Phenazinmethosulfat, Dichlorphenolindophenol, 1,4-Naphthochinon, Menadionbisulfit, Ubichinone (Co-

i- i. I C \J

enzym Q) oder Verbindungen vom Vitamin K-Typ verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,

daß man luftgetrocknete oder wärmegetrocknete Mikroorganismenzellen eines Feuchtigkeitsgehalts von etwa 1 bis etwa 10 % verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als 1-dehydrierende Mikroorganismen Arthrobacter simplex und/oder Bacterium cyclooxydans verwendet.

8. Verbessertes Verfahren zur Umwandlung von 1,2-gesättigten Steroiden in 1,2-Dehydrosteroide, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die 1,2-gesättigten Steroide in Gegenwart eines exogenen Elektronenträgers und eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels in Form eines aromatischen Kohlenwasserstoffs Arthrobacter simplex und/oder Bacterium cyclooxydans einwirken läßt.

9. Verfahren nach Anspruch 8,-dadurch gekennzeichnet, daß man als Elektronenträger Menadion, 1,4-Naphthochinon, Menadionbisulfit oder eine sonstige Verbindung vom Vitamin K-Typ und als aromatischen Kohlenwasserstoff Toluol und/oder Xylol verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man so viel mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel in Form eines aromatischen Kohlenwasserstoffs verwendet, daß dessen Menge etwa die Hälfte der zum Auflösen des am besten löslichen Steroidsubstrats oder gebildeten Steroids erforderlichen Menge bis zur etwa vierfachen Menge der zum Auflösen des am wenig-

sten löslichen Steroidsubstrats oder gebildeten Steroids erforderlichen Menge beträgt.

11. Verbessertes Verfahren zur Umwandlung von 1,2-gesättigten Steroiden in 1,2-Dehydrosteroide, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die 1,2-gesättigten Steroide in Gegenwart eines exogenen Elektronenträgers und eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels in Form eines aromatischen Kohlenwasser-Stoffs unter Zugabe einer unterhalb der zur Verbrennung erforderlichen Mindestsauerstoffkonzentration liegenden Sauerstoffmenge Arthrobacter simplex und/oder Bacterium cyclooxydans einwirken läßt.

12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elektronenträger Menadion,- 1,4-Naphthochinon, Menadionbisulfit und eine sonstige Verbindung vom Vitamin K-Typ und als aromatischen Kohlenwasserstoff Benzol, Toluol und/oder Xylol verwendet.

13. Verbessertes Verfahren zur Umwandlung von 1,2-gesättigten Steroiden in 1,2-Dehydrosteroide, dadurch gekennzeichnet, daß man auf die 1,2-gesättigten Steroide in Gegenwart eines exogenen Elektronenträgers und eines mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittels in Form eines aromatischen Kohlenwasserstoffs Arthrobacter simplex und/oder Bacterium cyclooxydans einwirken läßt und die Umsetzung (bei einer Temperatur) unterhalb des Flammpunkts des organischen Lösungsmittels durchführt»

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als Elektronenträger Menadion, Phenazinmethosulfat, 1 ,4»NaphÜhochinon, Menadionbisulfit oder eine sonstige Verbindung vom Vitamin K-Typ und

U L· L· IZU

1 als aromatischen Kohlenwasserstoff Xylol verwendet,

15. Verfahren nach Ansprüchen 8, 11 oder 13, dadurch

gekennzeichnet, daß man das mit Wasser nicht misch-5 bare Lösungsmittel mit einem weiteren, mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel verdünnt.