DE3300366C2

DE3300366C2 -

Info

Publication number: DE3300366C2
Application number: DE3300366A
Authority: DE
Inventors: Teruo Sakagami; Masuhiro Shoji; Noriyuki Arakawa; Naohiro Iwaki Fukushima Jp Murayama
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1982-01-13
Filing date: 1983-01-07
Publication date: 1989-04-27
Also published as: DE3300366A1; SE457797B; FR2519762A1; GB2113226B; SE8207467L; GB2113226A; GB8300650D0; FR2519762B1; SE8207467D0

Description

Die Erfindung betrifft ein poröses Substrat aus Methylol gruppen aufweisenden Kügelchen-Copolymeren auf Basis von vernetzten Styrolen, wobei die äußere Oberfläche des Sub strats hydrophil und die Porenoberfläche des Substrats hydrophob oder weniger hydrophil als die äußere Substratober fläche sind, einschließlich Verfahren zu seiner Herstellung und seiner Anwendung. Es eignet sich als Adsorptionsmittel für chromatographische Trennverfahren, insbesondere zum Ana lysieren hydrophiler Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht.

Es ist bereits ein Substrat bekannt, das mit bestimmten Substanzen in einer Körperflüssigkeit spezifisch in Wechsel wirkung treten kann, beispielsweise in einer leistungsfähigen Flüssigchromatographie, derer man sich häufig zum Analysieren von Substanzen in Körperflüssigkeiten, besonders von Urin, Serum u. ä., bedient. Ein solches Substrat, das in Urin, Serum u. ä. dispergiert wird und mit der spezifischen Substanz in Wechselwirkung treten kann, ist bei der Affinitätstrennung der Substanzen und/oder der Antigen-Antikörper-Reaktion an wendbar.

Es ist ferner bekannt, daß ein poröses, vernetztes Styrol polymeres durch Suspensionspolymerisation von Styrol und einem Vernetzungsmittel in Wasser in Gegenwart eines Poren regulators copolymerisiert werden kann. So ist in J. Polymer. Sci. Part A-2, 835 (1964) die Herstellung eines Styrol-Di vinylbenzol-Copolymeren beschrieben, und zwar durch Polymeri sieren eines Gemischs aus 21,8 Gew.% Styrol, 18,2 Gew.% handelsüblichem (55%) Divinylbenzol und 60 Gew.% Verdünnungs mittel (Toluol, n-Dodecan). Diese allgemeine Abhandlung lehrt nicht die Einführung der Methylolgruppen in das Copolymere und sagt nichts aus über den Status der Kügelchen und der Poren. Zwar können bei diesem Verfahren kleine Kügelchen durch Verwendung eines wasserlöslichen Polymeren als haupt sächlichem Suspensionsmittel erhalten werden, doch haftet dieses auf der Oberfläche der kleinen Kügelchen und ist selbst durch wiederholtes Waschen nur schwierig vollständig zu entfernen. Die nach diesem bekannten Verfahren erhaltenen kleinen Kügelchen wurden nicht in der Gelpermeationschro matographie unter Verwendung eines organischen Lösungsmittels eingesetzt, da der Druck infolge der Viskosität des anhaften den Polymeren ansteigt und bestimmte unerwünschte Wechselwir kungen stattfinden können.

Man hat auch bereits relativ reine vernetzte Styrolpolymere dadurch erhalten, daß man als Suspensionsmittel ein in Wasser schwer lösliches Phosphat einsetzt wie beispielsweise Cal ciumphosphat und Magnesiumphosphat, da das Phosphat leicht durch Waschen der erhaltenen kleinen Kügelchen mit Säure u. dgl. entfernt werden kann. Das erhaltene Polymere ist jedoch wegen seiner hydrophoben Oberfläche nicht gut in Wasser, verschiedenen Pufferlösungen, Serum, Urin u. dgl. dispergier bar.

Bekannt ist außerdem aus FR-PS 9 55 354 ein Verfahren zur Polymerisierung von ungesättigten organischen Verbindungen durch Erwärmen in Anwesenheit von organischen Peroxiden als Katalysatoren, wobei die Polymerisierung in Anwesenheit von mindestens zwei Polymerisationskatalysatoren durchgeführt wird und wobei diese Katalysatoren verschiedene organische Peroxide darstellen, deren maximale katalytische Wirksamkeit bei deutlich verschiedenen Temperaturen liegt. Die Polymeri sation wird dabei in einem Temperaturbereich durchgeführt, in dem die beiden Katalysatoren wirksam sind und vorzugsweise ihre maximale Wirksamkeit besitzen. Es werden hier auch verschiedene vernetzende Mittel genannt, die zur Herstellung des erfindungsgemäßen Copolymeren ebenfalls verwendbar sind. Das Methylolgruppen aufweisende Copolymere der Erfindung wird jedoch nicht geoffenbart.

Ferner bringt "Makromolekulare Chemie", Band 98, Seite 42 (1966) eine allgemeine Übersicht über Gelchromatographie und beschreibt aus Styrol und Divinylbenzol hergestellte Gele, deren ausgezeichnete Trennleistungen erwähnt werden. Die Einführung der Methylolgruppe gemäß Erfindung wird hier ebenfalls nicht erwähnt.

In "Kunststoffe" 1960, Band 50, Seite 375 bis 380 wird in dem Artikel "Chemische Umsetzungen an Polystyrol" von D. Braun und anderen über die Chlormethylierung berichtet sowie über die Umsetzung dieser in p-Stellung chlormethylierten Styrole mit Aminen und Mercaptoverbindungen. Substratkügelchen aus Hydroxymethylpolystyrol zur Trennung von Molekülen werden hier nicht beschrieben, insbesondere wird kein Substrat beschrieben, das eine hydrophile Außenfläche und eine weniger hydrophile oder hydrophobe Poreninnenfläche aufweist.

Bekannt ist darüber hinaus die Hydrolyse der durch Chlorme thylierung erhaltenen Produkte unter Erhalt der entsprechen den Alkohole.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Substrat zu schaffen, das zum Analysieren hydrophiler, niedermolekularer Substanzen geeignet ist, insbesondere ein poröses Substrat, dessen äußere Oberfläche sehr hydrophil ist, während die innere Oberfläche der Substratporen weniger hydrophil als die äußere Oberfläche des Substrats ist.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein poröses Substrat gemäß dem kennzeichnenden Teil von Anspruch 1.

Dabei ist es bevorzugt, daß der gemäß Anspruch 1 angewandte übliche Porenregulator aus der Gruppe aus aromatischen Kohlenwasserstoffen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlorkohlenwasserstoffen ausgewählt ist.

Demnach besteht das erfindungsgemäße poröse Substrat aus einem vernetzten Copolymeren mit Methylolgruppen. Die äußere Oberfläche des Substrats ist durch ein darauf angebrachtes wasserlösliches Polymeres hydrophil. Die innere Oberfläche der Poren des Substrats ist dagegen hydrophob oder weniger hydrophil als die äußere Oberfläche des Substrats.

Das poröse Substrat gemäß Erfindung wird hergestellt, indem man in erster Stufe in Suspension unter sonst üblichen Bedingungen ein Monomeres mit einem mit dem Monomeren copolymerisierbaren Vernetzungsmittel in einer Lösung von Methylcellulose als wasserlöslichem Polymeren in Gegenwart eines üblichen Porenregulators copolymerisiert, wobei als Monomeres Styrol, α-Methylstyrol und/oder Chlormethylstyrol, als mit dem Monomeren copolymerisierbares Vernetzungsmittel Divinylbenzol, Trivinylbenzol und Triallylisocyanurat verwen det werden. Von diesen wird Divinylbenzol besonders bevor zugt, da in diesem Fall Methylolgruppen leicht eingeführt werden können. Die Menge an Vernetzungsmittel liegt vorzugs weise im Bereich von 30 bis 70 Gew.%, bezogen auf die Gesamtmenge an Monomerem und Vernetzungsmittel. Ganz beson ders bevorzugt wird als erfindungsgemäßes Copolymeres ein Styrol-Divinylbenzol-Copolymeres.

Das Monomere und das Vernetzungsmittel werden erfindungsgemäß in Gegenwart eines in hoher Konzentration vorliegenden wasserlöslichem Polymeren, nämlich Methylcellulose, einer Radikalpolymerisation unterworfen. Die Menge an wasserlös lichem Polymerem liegt im Bereich von 5 bis 60 Gewichtstei len, bevorzugt im Bereich von 10 bis 40 Gewichtsteilen je 100 Gewichtsteilen der Mischung aus Monomerem und Vernet zungsmittel. In diesen Bereichen erhält man Copolymere mit guten hydrophilen Eigenschaften. Wenn weniger als 5 Gewichts teile des wasserlöslichen Polymeren eingesetzt werden, erhält man Copolymere mit ungenügenden hydrophilen Eigenschaften, und wenn mehr als 60 Gewichtsteile des wasserlöslichen Polymeren eingesetzt werden, dann werden keine vollständig kugelförmigen Teilchen erhalten, und es treten wegen der gestiegenen Viskosität des Systems Schwierigkeiten auf bei Einführung der Methylolgruppen in die erhaltenen Kügelchen. In die wäßrige Lösung des wasserlöslichen Polymeren kann man außerdem auch eine kleine Menge an Phosphat-Suspensionsmittel wie z. B. Hydroxyapatit u. dgl. oder ein anionisches Tensid zufügen.

Der Durchmesser der Copolymerteilchen kann erfindungsgemäß durch die Art und Menge des zugesetzten wasserlöslichen Polymeren, durch das Verhältnis der Menge an Monomerem und Wasser, durch die Rührintensität, die Menge an Tensid u. ä. gesteuert werden. Bevorzugt werden erfindungsgemäße Substrate mit einem Durchmesser der kugelförmigen Teilchen im Bereich von 1 bis 30 µm.

Der Porenregulator, der zur Steuerung der Porengröße der Substratteilchen dient, kann ein in dem Monomeren lösliches, inertes organisches Lösungsmittel sein. Geeignete Porenregu latoren sind aromatische Kohlenwasserstoffe wie z. B. Benzol, Toluol, Xylol u. dgl., Chlorkohlenwasserstoffe wie z. B. Trichlorethylen, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff u. dgl., aliphatische Kohlenwasserstoffe wie z. B. n-Hexan, n-Heptan, n-Octan, n-Dodecan u. dgl. sowie Mischungen derselben. Die Porengröße in dem erfindungsgemäßen Substrat ist leicht durch die Art und/oder Menge des Porenregulators steuerbar. Üblicherweise werden Mengen von 20 bis 300 Gewichtsteilen Porenregulator je 100 Gewichtsteilen der Mischung aus Monomerem und Vernetzungsmittel angewandt.

Je nach Verwendungszweck läßt sich die Porengröße des erfindungsgemäßen Substrats variieren. Sollen hydrophile Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht ohne gleichzeitige Adsorption von Proteinen mit hohem Molekulargewicht analy siert werden, dann besitzt das erfindungsgemäße Substrat ein Ausschlußmolekulargewicht von vorzugsweise weniger als 30 000, d. i. kleiner als das Molekulargewicht von Serumpro tein. Andererseits wird ein Ausschlußmolekulargewicht des erfindungsgemäßen Substrats von wenigstens 30 000 bevorzugt, wenn bei der Analyse hydrophiler niedermolekularer Substanzen Proteine mit einem Molekulargewicht von 30 000 oder mehr adsorbiert werden sollen.

Als Polymerisationsinitiatoren können die zur Suspensions polymerisation von Vinylmonomeren üblichen Initiatoren ver wendet werden, beispielsweise ein organisches Peroxid wie Benzoylperoxid und Butylperbenzoat, sowie eine Azoverbindung wie Azo-bis-isobutyronitril u. dgl., wobei Benzoylperoxid besonders bevorzugt wird, da das wasserlösliche Polymere leicht pfropfpolymerisieren kann.

Wird das in dieser ersten Stufe erhaltene poröse vernetzte Copolymere, auf dessen Oberfläche das wasserlösliche Polymere haftet oder aufgepfropft ist, als Substrat verwendet, dann ist es schwierig, eine hydrophile Substanz in die Poren diffundieren zu lassen, da die Hydrophilie noch nicht ausreichend stark genug ist, obwohl das Copolymere in Wasser dispergiert werden kann. Darüber hinaus ist das Copolymere infolge des auf der Oberfläche desselben vorliegenden wasser löslichen Polymeren hochviskos, der Druck in einer damit gepackten Säule steigt bei der Elution an, was zu einer niedrigen Fließgeschwindigkeit des Elutionsmittels und zu einer geringen Reproduzierbarkeit der Elution führt.

Aus diesem Grund werden nach einer Trocknungsstufe als zweite Stufe erfindungsgemäß in einer dritten und vierten Stufe Methylolgruppen in das Copolymere eingeführt und dadurch die oben beschriebenen Nachteile vermieden.

Verfahren zur Einführung von Methylolgruppen sind wie bereits erwähnt an sich bekannt, beispielsweise ein Verfahren zur Chlormethylierung des Copolymeren mit nachfolgender Hydroly se. Die Chlormethylierung zur Herstellung des erfindungsge mäßen Substrats wird mit Chlormethyl-Methylether in Gegenwart von wasserfreiem Zinntetrachlorid als Katalysator durchge führt. Bei der Chlormethylierung kann auch das wasserlösliche Polymere auf der Oberfläche des Copolymeren reagieren, wobei sich das Copolymere stärker als ohne Einsatz eines wasser löslichen Polymeren verfärbt und sich eine braune Substrat oberfläche bildet. Das chemisch umgesetzte wasserlösliche Polymere wird teilweise aus dem Substrat freigesetzt, wodurch sich eine niedrige Viskosität des Produkts ergibt.

Bei der Chlormethylierung mit Chlormethyl-Methylether werden 2 bis 20 Gewichtsteile Chlormethyl-Methylether je Gewichts teil vernetztem Copolymeren eingesetzt. Wegen der Möglich keit, durch Rühren eine homogene Mischung zu erzielen und wegen des Verlusts an Chlormethyl-Methylether durch Ver dampfen während der Reaktion werden 3 bis 10 Gewichtsteile Chlormethyl-Methylether bevorzugt. Ein besonders bevorzugtes Gewichtsverhältnis von Chlormethyl-Methylether zu vernetztem Copolymeren liegt bei etwa 5 : 1. Die Katalysatormenge liegt üblicherweise im Bereich von 0,5 bis 30 Gewichtsteilen je 100 Gewichtsteilen Chlormethyl-Methylether und kann je nach dem gewünschten Chlormethylierungsgrad ausgewählt werden. Die Reaktion wird bei einer Temperatur im Bereich von 0 bis 58° C (Siedepunkt des Chlormethyl-Methylethers) durchgeführt.

Der hierbei erfindungsgemäß zu erzielende Chlormethylierungs grad des Copolymeren beträgt etwa 0,2 Chlormethylgruppen oder mehr je aromatischem Teil.

Nach der Chlormethylierung werden die Chlormethylgruppen durch Hydrolyse unter alkalischen Bedingungen bei Raum temperatur oder darüber in Methylolgruppen (-CH₂OH) über geführt. Da die Reaktionsgeschwindigkeit in dem H₂O/NaOH- System nierig ist, kann sie durch Zugabe von Methanol erhöht werden. Die Alkalikonzentration, die Methanolmenge, die Temperatur und die Reaktionszeit können je nach der gewünschten Einführung von Methylolgruppen ausgewählt werden.

Der Grad der Hydrolyse der Chlormethylgruppe liegt bei 50% oder mehr. Dementsprechend beträgt die Zahl der in das Substrat eingeführten Methylolgruppen 0,1 bis 0,5 je aroma tischem Teil.

Das erfindungsgemäß erhaltene Substrat besitzt eine äußere Oberfläche, die stark hydrophil ist, weshalb das Substrat in wäßrigem Medium gut dispergiert werden kann. Die innere Porenoberfläche im Substrat ist zwar auch hydrophil, jedoch weniger als die äußere Oberfläche, so daß niedermolekulare hydrophile Substanzen frei in die Poren eindringen können. Die innere Oberfläche der Poren ist nur mit Methylolgruppen, nicht jedoch mit den wasserlöslichen Polymeren ausgerüstet, und sie ist hydrophober als die äußere Oberfläche des Substrats. Die Viskosität des erfindungsgemäßen Substrats ist so niedrig, daß eine hohe Strömungsgeschwindigkeit in einer mit dem Substrat gepackten Säule einer leistungsfähigen Flüssig-Chromatographie erhalten werden kann. Darüber hinaus ist in einer solchen schnellaufenden Flüssig-Chromatographie die Reproduzierbarkeit ausgezeichnet, und niedermolekulare hydrophile Substanzen können gut fraktioniert werden.

Das erfindungsgemäße Substrat mit einem Ausschlußmolekular gewicht von weniger als 30 000 und einer Teilchengröße von 1 bis 30 µm ist bevorzugt zur Analyse hydrophiler niedermole kularer Substanzen einsetzbar, insbesondere dann, wenn diese zusammen mit hochmolekularen Substanzen wie beispielsweise Serumprotein vorliegen, da das Substrat derartige hochmole kulare Substanzen nicht adsorbieren kann.

Das erfindungsgemäße Substrat kann zur kontinuierlichen Analyse solcher Proben eingesetzt werden.

Andererseits kann das erfindungsgemäße Substrat mit einem Ausschlußmolekulargewicht von mindestens 30 000 hergestellt und in vielen Bereichen eingesetzt werden, beispielsweise zur Abtrennung hydrophiler niedermolekularer Substanzen, zur Entfernung von Proteinen in einer Vorsäule, zum Einsatz in einer Antigen-Antikörper-Reaktion u. ä., da ein solches erfindungsgemäßes Substrat hochmolekulare Substanzen wie hydrophile Proteine vollständig adsorbieren kann. In diesem Fall kann der Durchmesser der Substratteilchen im Bereich von 1 bis 300 µm, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 30 µm, liegen, wobei der bevorzugte Bereich insbe sondere in einer Säule für die Analyse niedermolekularer hydrophiler Substanzen eingesetzt wird.

Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele im einzelnen weiter erläutert, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.

Beispiel 1

In einen Autoklaven wurde eine Lösung von 12,5 g Methyl cellulose in 625 g Wasser, die 0,125 g Natriumlaurylsul fat enthielt, gegeben und danach 21,8 g Styrol, 18,2 g Divinylbenzol und 60 g Toluol als Porenregulator zugegeben. Die Polymerisation wurde durch Zusatz von Benzoylperoxid in Gang gesetzt und bei 60° C 17 Stunden lang unter kräf tigem Rühren durchgeführt. Das erhaltene Polymere wurde gründlich mit Wasser und anschließend mit Aceton gewaschen. Dann wurde das gewaschene Polymere unter vermindertem Druck bei 40° C getrocknet. Der Durchmesser der getrock neten Polymerteilchen lag im Bereich von 3 bis 20 µm. Durch Sieben wurden Kügelchen von 10 bis 20 µm Durchmesser aussortiert. Das Ausschlußmolekulargewicht des Polymeren lag bei etwa 7000; es wurde bestimmt unter Verwendung von Poly styrol mit bekanntem Molekulargewicht und Tetrahydrofuran als Elutionsmittel.

Zu 35 ml Chlormethyl-Methylether wurden 5 g der Kügel chen und 1,5 ml wasserfreies Zinntetrachlorid zugefügt. Die Mischung wurde bei etwa 50 bis 60° C 6 Stunden lang am Rückflußkühler erhitzt. Die Farbe der Kügelchen wurde dunkler, und mit dem Fortschreiten der Reaktion wurde sie schwarz-braun. Nach Beendigung der Reaktion wurden die Kügelchen mehrmals mit methanolhaltiger Salzsäure und danach mit Aceton gewaschen, bis sie gelb-ockerfarben waren. Der Chlormethylierungsgrad der Kügelchen betrug etwa 0,62 Chlormethylgruppen pro aromatischem Teil, wobei der Chlormethylierungsgrad durch Vergleich der infraroten Absorptionsbande bei 1600 cm^-1 für die Aromaten und bei 1260 cm^-1 für die Chlormethylgruppe bestimmt wurde. Für die Eichkurve wurde eine Mischung aus Cumol und p-Isopro pylbenzylchlorid verschiedener Mischungsverhältnisse ver wendet.

Die chlormethylierten Kügelchen wurden in einer wäßrigen 10%igen Natriumhydroxidlösung bei 60° C 9 Stunden lang hydrolysiert. In den hydrolysierten Kügelchen wurde die Intensität der IR-Absorptionsbande bei 1260 cm^-1 für die Chlormethylgruppe reduziert; dagegen tauchte eine Absorp tionsbande bei 1090 bis 1100 cm^-1 auf, die die C-O-Gruppie rung anzeigt. Vom Ausmaß der Intensitätsabnahme der Bande bei 1260 cm^-1 entnahm man, daß etwa 55% der Chlormethyl gruppen in Methylolgruppen umgewandelt worden waren, was bedeutet, daß etwa 0,34 Methylolgruppen pro aromatischem Teil in die Kügelchen eingeführt worden waren.

Die erfindungsgemäß erhaltenen Kügelchen ließen sich außer ordentlich gut in Wasser und verschiedenen Pufferlösungen dispergieren, ohne daß eine erkennbare Koagulation oder Agglomeration stattfand.

Mit dem erfindungsgemäßen Substrat wurde ein Rohr aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 4 mm und einer Länge von 500 mm gepackt. Dann wurden 20 µl einer Mischung aus p-Aminobenzoesäure, Kreatinin und Harnsäure auf dieser Säule chromatographiert unter Verwendung einer wäßrigen ½₀ molaren Phosphorsäure-Pufferlösung als Elutionsmittel. Die Chromatographie wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: UV-Detektor bei 250 nm, Elutionsgeschwin digkeit 1 ml/min, Druck 20 kg/cm². Die Elutionszeit betrug 10,4 Minuten für p-Aminobenzoesäure, 7,5 Minuten für Krea tinin und 5,5 Minuten für Harnsäure.

Ferner wurde eine Mischung aus Rinderserum-Albumin und den drei oben genannten Komponenten auf der gleichen Säule chromatographiert. Das Albumin wurde zuerst eluiert, und die vier Komponenten wurden vollständig voneinander getrennt (s. Fig. 1, die die Elutionskurve zeigt). Bei Wiederholung der Chromatographie wurde beobachtet, daß Albumin nur bei der ersten und der zweiten Wiederholung etwas absor biert wurde, jedoch nicht mehr danach, d. h. es wurde dann immer das gleiche Ergebnis erhalten.

Es wurde gefunden, daß das erfindungsgemäße Substrat für die Analyse wasserlöslicher niedermolekularer Substanzen außerordentlich gut geeignet ist und kein hochmolekulares Protein absorbiert.

Vergleichsbeispiel 1

Die gleiche Säule aus rostfreiem Stahl wurde mit dem nach Beispiel 1 hergestellten, jedoch noch nicht chlormethylier ten Polymeren gepackt und danach die gleiche Probe wie in Beispiel 1 chromatographiert. Bei einer Strömungsgeschwin digkeit von 1 ml/min zeigte sich ein Druck von mehr als 80 bar, wodurch sich die große Wirkung der Viskosität der an der inneren Oberfläche der Poren des Polymeren haftenden Methylcellulose bemerkbar machte. Die vier Be standteile der Probe wurden praktisch nicht voneinander getrennt und sehr rasch eluiert.

Vergleichsbeispiel 2

5 g des nach Beispiel 1 hergestellten Polymeren wurden nach dem gleichen Verfahren chlormethyliert, wie in Bei spiel 1 beschrieben, mit dem Unterschied, daß die Reaktions zeit statt 6 Stunden nunmehr 24 Stunden betrug. Man erhielt Kügelchen mit einem Chlormethylierungsgrad von etwa 64%. Die Kügelchen wurden in einer Lösung von 25 g Natrium hydroxid in 100 g Methanol bei 60° C 15 Stunden lang hydro lysiert, wobei man ein Substrat mit im Mittel etwa 0,58 Methylolgruppen pro aromatischem Teil erhielt.

Die gleiche Säule aus rostfreiem Stahl wurde wie in Bei spiel 1 mit dem Substrat gepackt und eine Mischung aus Rinderserum-Albumin, p-Aminobenzoesäure, Kreatinin und Harnsäure an dieser Säule chromatographiert, und zwar mit einer Strömungsgeschwindigkeit des gleichen Elutions mittels von 1 ml/min. Es ergaben sich folgende Elutions zeiten: 6,4 Minuten für p-Aminobenzoesäure, 5,9 Minuten für Kreatinin und 4,8 Minuten für Harnsäure.

Die Elutionszeiten waren kürzer als im Beispiel 1, und p-Aminobenzoesäure und Kreatinin konnten nicht voneinander getrennt werden. Die Elutionskurve der Chromatographie ist in Fig. 2 wiedergegeben. Die Ergebnisse zeigen, daß die Wechselbeziehungen zwischen den niedermolekularen hydrophilen Substanzen und der inneren Oberfläche der Poren in dem Substrat für das erfindungsgemäße Substrat größer waren als bei dem Substrat des Vergleichsbeispiels 2.

Beispiel 2

In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 wurden 21,8 g Styrol und 18,2 g Divinylbenzol in Gegenwart von 56,4 g Toluol und 3,6 g n-Dodecan als Porenregulator polymerisiert wobei ein Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres mit einem Ausschlußmole kulargewicht von etwa 16 000 erhalten wurde. Das Copolymere wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 der Chlormethylierung unterworfen, mit dem Unterschied, daß die Reaktionszeit anstelle von sechs Stunden nunmehr nur zwei Stunden betrug. Es wurde ein chlormethyliertes Copolymeres mit etwa 0,42 Chlormethylgruppen pro aromati schem Teil erhalten. Das chlormethylierte Copolymere wurde bei 60° C in einer wäßrigen 10%igen Natriumhydroxid lösung fünf Stunden lang hydrolysiert, wobei ein Substrat erhalten wurde, das im Mittel etwa 0,2 Methylolgruppen pro aromatischem Teil enthielt.

Die gleiche Säule aus rostfreiem Stahl wie in Beispiel 1 wurde mit dem erhaltenen erfindungsgemäßen Substrat gepackt und zeigte bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min einer wäßrigen ½₀ molaren Phosphorsäure-Puf ferlösung einen Druck von 25 bar. Die gleiche Menge von 20 µl einer Mischung aus Harnsäure, Kreatinin und p-Amino benzoesäure wurde auf dieser Säule chromatographiert. Die drei Komponenten wurden vollständig voneinander ge trennt. Ein Versuch mit einer Mischung aus Rinderserum- Albumin und den drei oben genannten Bestandteilen zeigte, daß das Albumin überhaupt nicht auf der Säule adsorbiert wurde.

Beispiel 3

2 g Methylcellulose wurden in 125 g Wasser gelöst und 0,025 g Natriumlaurylsulfat zugefügt. Diese Mischung wurde in eine 300 ml-Ampulle eingefüllt und danach 3,27 g Sty rol, 2,73 g Divinylbenzol und 6,75 g Toluol sowie 2,25 g n-Dodecan als Porenregulator zugefügt. Die Mischung wurde dann bei 60° C 17 Stunden lang unter Verwendung von Benzoyl peroxid als Initiator gerührt und umgesetzt. Die erhaltenen Kugeln wurden mit Wasser und Aceton gewaschen und anschlie ßend bei Raumtemperatur unter vermindertem Druck getrock net. Der Durchmesser der kugelförmigen Teilchen war im wesentlichen einheitlich und lag bei 20 µm.

Das Ausschlußmolekulargewicht der Kugeln betrug etwa 100 000, wobei dieser Wert durch Eluierung von Polystyrol mit verschiedenen vorbestimmten Molekulargewichten auf einer mit den Kügel chen gepackten Säule gemessen wurde.

5 g der Kugeln wurden in einem Reaktionsgefäß mit 35 ml Chlormethyl-Methylether und 1,5 ml wasserfreiem Zinntetra chlorid versetzt. Die Mischung wurde anschließend bei 50 bis 60° C sechs Stunden lang am Rückfluß erhitzt, wobei die Kugeln chlormethyliert wurden. Die Kugeln verfärbten sich fortschreitend mit der Reaktion zu einer dunkelbraunen Farbe. Nach der Umsetzung wurden die Kugeln mit methanol haltiger Salzsäure wiederholt und schließlich mit Aceton gewaschen. Die Farbe der Kugeln war schließlich gelb-braun. Nach der Chlormethylierung zeigten die Kugeln im IR-Spek trum neue Absorptionsbanden bei 1260 cm^-1 und 670 cm^-1. Der Chlormethylierungsgrad lag bei etwa 0,5 Chlormethyl gruppen pro aromatischem Teil.

Die chlormethylierten Kugeln wurden in eine Lösung von 25 g Natriumhydroxid in 100 g Methanol gebracht und die Lösung 15 Stunden lang bei einer Temperatur von 60° C gehalten, wobei die Umsetzung stattfand. Es zeigte sich eine neue IR-Absorptionsbande bei 1090 cm^-1 für die Ein führung der -CH₂OH-Gruppen. Das Produkt enthielt 0,3 Methylolgruppen pro aromatischer Einheit.

Die erhaltenen Kugeln ließen sich sehr gut in Wasser, verschiedenen Pufferlösungen, Urin u. dgl. dispergieren, ohne daß eine Aggregation auftrat.

Mit den Kugeln wurde eine Säule aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 4 mm und einer Länge von 500 mm für eine rasch laufende Flüssig-Chromatographie gepackt. Eine Lösung aus Rinderserum-Albumin in ½₀ molarer Phos phorsäure-Pufferlösung wurde unter Verwendung der Phos phorsäure-Pufferlösung als Elutionsmittel mit einer Strö mungsgeschwindigkeit von 1 ml/min chromatographiert. Es wurde kein Albumin eluiert, selbst dann nicht, nachdem 50 µl von 10%igem Rinderserum-Albumin 50mal die Säule passiert hatten.

20 µl einer Lösungsprobe aus Harnsäure, Kreatinin, p-Amino benzoesäure und Albumin in ½₀ molarer Phosphorsäure- Pufferlösung ließ man durch die Säule laufen. Harnsäure, Kreatinin und p-Aminobenzoesäure wurden vollständig voneinan der getrennt, während kein Albumin eluiert wurde. In Fig. 3 sind im Diagramm die Elutionsbanden bei einer Geschwindig keit des Registrierstreifens von 1 cm/3 min aufgezeich net, wobei bei einer Wellenlänge von 250 nm gemessen wurde. Bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml/min betrug der Druck 25 bar.

Beispiel 4

Es wurde ein Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres in der glei chen Weise wie in Beispiel 1 hergestellt, mit dem Unter schied, daß anstelle von 60 g Toluol nunmehr 45 g Toluol und 15 g n-Dodecan als Porenregulatoren eingesetzt wurden. Das Ausschlußmolekulargewicht des erhaltenen Polymeren betrug etwa 100 000. Es wurden Methylolgruppen in der gleichen Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, in das Polymere eingeführt, wobei etwa 0,4 Methylolgruppen pro aromatischer Einheit erhalten wurden.

Das gleiche Rohr wie in Beispiel 1 wurde mit dem erhal tenen Substrat gepackt und dann Albumin über diese Säule chromatographiert. Dabei wurde festgestellt, daß das Albumin von der Säule adsorbiert und nicht eluiert wurde.

Vergleichsbeispiel 3

Ein Styrol/Divinylbenzol-Copolymeres wurde in der gleichen Weise wie in Beispiel 3 hergestellt unter Verwendung von 13,9 g Calciumphosphat und 4,07 mg Natrium-n-dodecylbenzol sulfonat anstelle von Methylcellulose und Natriumlaurylsul fat des Beispiels 3. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Copolymere gesiebt, wobei Kugeln mit einem Durchmesser von 10 bis 20 µm erhalten wurden. Die Verteilung der Kugeldurchmesser ist jedoch breit. Das Ausschlußmolekulargewicht des erhaltenen Copolymeren betrug etwa 100 000.

Die erhaltenen Kugeln wurden gründlich mit Salzsäure ge waschen, um das Calciumphosphat zu entfernen. Die Kugeln ließen sich überhaupt nicht in Wasser dispergieren, sondern klebten aneinander.

Nach dem Trocknen wurden die Kugeln in der gleichen Weise, wie in Beispiel 3 beschrieben, chlormethyliert. Dabei verfärbten sich die Kugeln nur schwach bis zu einem hellen Gelb. Die Chlormethylgruppen wurden zu Methylolgruppen umgewandelt, wie in Beispiel 3 beschrieben. Die erhaltenen Kugeln waren weniger hydrophil als diejenigen, die nach Beispiel 3 erhalten worden waren, und sie dispergierten nicht gut in Wasser oder Urin. In einer Säule, die mit diesen Kugeln gepackt war, wurde Albumin nicht vollstän dig adsorbiert, es wurde vielmehr eine sehr breite Bande des Albumins erhalten. Der Grund hierfür wird darin ge sucht, daß die Kugeln weniger hydrophil als diejenigen des Beispiels 3 sind und daß das Protein nicht in die Poren eindringen kann.

Beispiel 5

Poröse Kügelchen aus Styrol/Divinylbenzol-Copolymerem mit einem Ausschlußmolekulargewicht von 300 000 wurden in der glei chen Weise wie in Beispiel 3 hergestellt, wobei 4,5 g Toluol und 4,5 g n-Dodecan als Porenregulatoren einge setzt wurden. Die Kugeln wurden in der gleichen Weise behandelt, wie in Beispiel 3 beschrieben, wobei man ein Substrat mit Methylolgruppen erhielt. Das erhaltene Substrat ließ sich sehr gut in Serum und Urin dispergieren. Aus der Säule, die mit dem Substrat gepackt war, wurde Albumin nicht eluiert, selbst nachdem 50 µl einer 10%igen Rinder serum-Albumin-Lösung 50mal durch die Säule geschickt worden waren.

Claims

1. Poröses Substrat aus Methylolgruppen aufweisenden Kügel chen-Copolymeren auf Basis von vernetzten Styrolen, wobei die äußere Oberfläche des Substrats hydrophil und die Porenoberfläche des Substrats hydrophob oder weniger hydrophil als die äußere Substratoberfläche sind, dadurch gekennzeichnet, daß es durch

a) Copolymerisation unter sonst üblichen Bedingungen einer wäßrigen Suspension von
- - mindestens einem Styrolmonomeren der Gruppe aus Styrol, α-Methylstyrol und/oder Chlormethylstyrol, und
- - mindestens einem Vernetzungsmittel der Gruppe aus Divinylbenzol, Trivinylbenzol und Triallylisocyanu rat in Anwesenheit von wasserlöslichem Polymeren, nämlich Methylcellulose, und eines üblichen Poren regulators, wobei die Menge des wasserlöslichen Polymeren 5 bis 60 Gewichtsteile und die Menge des Porenregulators 20 bis 300 Gewichtsteile pro 100 Gewichtsteile der Gesamtmenge an Monomerem und Vernetzungsmittel beträgt,
b) Trocknen,
c) Chlormethylierung der erhaltenen Kügelchen unter An wendung von 2 bis 20 Gewichtsteilen Chlormethyl-Me thylether je Gewichtsteil vernetztem Copolymeren und wasserfreiem SnCl₄ als Katalysator in einer Menge von 0,5 bis 30 Gewichtsteilen je 100 Gewichtsteilen Chlor methyl-Methylether bei einer Temperatur von 0 bis 58° C, sowie
d) anschließende Hydrolisierung der chlormethylierten Kügelchen unter alkalischen Bedingungen, wobei der Hydrolysegrad der Chlormethylgruppen 50% oder mehr und die Zahl der in das Substrat eingeführten Methylol gruppen 0,1 bis 0,5 pro aromatischem Teil beträgt,

hergestellt worden ist.

2. Substrat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Porenregulator aus der Gruppe aus aromatischen Kohlenwas serstoffen, aliphatischen Kohlenwasserstoffen und Chlor kohlenwasserstoffen ausgewählt ist.