DE3231767C2 - Nachweis selbstblockierender Antikörper - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum qualitativen und quantitativen Nachweis selbstblockierender Antikörper, sowie ein zu dessen Durchführung geeignetes Analysepaket.

In einer Reihe normaler biologischer Vorgänge in lebenden Organismen werden verschiedene Stoffe über Rezeptorstellen gebunden. Bisweilen erzeugt das Immunsystem des Organismus eine Selbstimmunität für einen dieser Stoffe (oft ein Bindemittel oder ein Rezeptorprotein) durch blockierende Antikörper (sog. selbstblockierende Antikörper). Diese blockierenden Antikörper werden im Wettbewerb von den komplementären Bindestellen des Rezeptors angezogen, wodurch die Zahl der für den Komplementärstoff (der sog. Ligand) zur Verfügung stehenden freien Bindestellen entsprechend verringert wird.

Ein bekanntes Beispiel für derartige selbstblockierende Antikörpersysteme ist das Verhältnis zwischen dem Innenfaktor und Cobalamin (Vitamin B₁₂).

Der Innenfaktor ist ein Glycoprotein das für die Absorption von Vitamin B₁₂ durch den Magen-Darmkanal verantwortlich ist. Nach Vereinnahme wird Vitamin B₁₂ an den Innenfaktor über spezifische Rezeptorstellen gebunden und der Komplex über Rezeptoren im Magen-Darmkanal absorbiert. Vermutlich enthält der Innenfaktor wenigstens zwei Arten von Bindestellen, von denen aber nur eine für die Komplexbildung mit Vitamin B₁₂ in Frage kommt.

Im Falle pathologischer Anämie nimmt die Fähigkeit zur Erzeugung und Sekretion des Innenfaktors ab, und verschwindet schließlich ganz. Es besteht ein Zusammenhang zwischen pathologischer Anämie und der Anwesenheit selbstblockierender Antikörper, insbesondere der den Innenfaktor blockierenden Antikörper.

In derartigen Fällen ist der Nachweis blockierender, insbesondere den Innenfaktor (IF) blockierender Antikörper wünschenswert.

Spezifisch für das Verhältnis Innenfaktor-Vitamin B₁₂ sind Radioaktivanalyseverfahren zum Nachweis IF blockierender Antikörper bekannt. All diese bekannten Verfahren verwenden die Ansatzstoffe in Lösung oder wenigstens in freier Suspension in einer Flüssigkeit. Sie beruhen auf die Fähigkeit der IF blockierenden Antikörper die Bindung des radioaktiv gekennzeichneten Vitamins B₁₂ an den Innenfaktor zu hemmen. Meist wird der Innenfaktor (oder den Innenfaktor enthaltenden Magensaft) mit einer dem Patienten entnommenen flüssigen Probe (es serum) gemischt und dann das gekennzeichnete Vitamin B₁₂ im Überschuß zugesetzt. Sodann muß das gebundene Vitamin B₁₂ von dem freien Vitamin B₁₂ getrennt werden. Hierfür wurden Dialyse, Gelfiltrierung, Holzkohleabsorption und Zirkonylphosphat-Gelabsorption vorgeschlagen. Diese Trennung ist umständlich und zeitraubend. Schwierigkeiten bereitet auch der Umstand, daß viele Proben von Patienten endogene Vitamin B₁₂-Bindemittel enthalten. Daher muß ein zusätzlicher Kontrollversuch durchgeführt werden, um dem endogenen Vitamin B₁₂-Bindestoff Rechnung zu tragen, oder der endogene Bindestoff muß entfernt werden.

In der US 40 39 652 werden in Spalte 3, Zeile 23 bis Spalte 5, Zeile 22, verschiedene Immunoassays beschrieben, die wie folgt ablaufen:

• aa) Der Antikörper (bzw. das Antigen) bildet den immobilisierten Bestandteil des Systems.
• bb) Die immobilisierte Phase wird mit einem Überschuß an markiertem Antikörper und einem Überschuß an nicht-markiertem Antikörper in Kontakt gebracht.
• cc) Die Menge an ungebundenem, markiertem Antigen wird bestimmt.
• dd) Die Menge an nicht-markiertem Antigen wird mittels einer Kalibrierungs-Referenzkurve bestimmt, die auf der Grundlage bekannter Antigenmengen erstellt wurde.

Es wird also ein Sättigungsassay beschrieben, wobei die markierte Komponente eine markierte Form der zu bestimmenden Substanz darstellt. In Spalte 4, Zeile 4 ff. wird ein Gleichgewichtsassay beschrieben, wobei die markierte Komponente eine markierte Form der zu bestimmenden Substanz darstellt. Die in Spalte 4, Zeilen 43 ff. beschriebene "Direct Assay Technic" verwendet als markierte Komponente eine markierte Form eines spezifischen Bindungspartners der zu bestimmenden Substanz.

Die US 39 80 764 betrifft die Herstellung einer Tablette, bestehend aus einem unlöslichen Copolymer mit Globulin und einen gegen ein biologisches Material gerichteten Antikörper, der durch einen kompetitiven Radioimmunoassay bestimmt wird. Erfindungsgemäß werden weder Globuline noch Antikörper noch ein kompetitiver Immunoassay zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens vorgeschlagen.

Die US 36 15 222 betrifft primär eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Durchführung eines kompetitiven Immunoassays, wobei das Adsorbens den einen Teil der Vorrichtung bildet und ein zweiter Teil der Vorrichtung (a) eine markierte Form der zu messenden Verbindung und (b) eine Verbindung, die sowohl mit der markierten als auch mit der nicht-markierten Form der zu messenden Verbindung reagiert, enthält. Die Vorrichtung wird zur Durchführung eines kompetitiven Assays verwendet und das Adsorbens kann dazu verwendet werden, die gebundene und die nicht-gebundene markierte Komponente voneinander zu trennen.

Die Erfindung hat ein Verfahren zur qualitativen und quantitativen Analyse selbstblockierender Antikörper sowie ein zu dessen Durchführung geeignetes Analysepaket zur Aufgabe, welches einfacher und weniger zeitraubend als bekannte Analyseverfahren ist.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das im Anspruch 1 gekennzeichnete Verfahren und das im Anspruch 9 gekennzeichnete Analysepaket gelöst.

Erfindungsgemäß wird in der Weise vorgegangen, daß eine fluide biologische Probe mit einer selektiven Bindestelle für die selbstblockierenden Antikörper enthaltenden, auf einem leblosen Träger immobilisierten Rezeptor gemischt, die Mischung unter Bedingungen inkubiert wird, welche ausreichen, um alle vorhandenen selbstblockierenden Antikörper an die Rezeptoren zu binden, wodurch eine feste Phase aus dem leblosen Träger und den an ihn gebundenen selbstblockierenden Antikörper, und eine flüssige Phase aus der fluiden biologischen Probe ohne die selbstblockierenden Antikörper entsteht, die feste von der flüssigen Phase getrennt wird, eine Flüssigkeit, die vom selbstblockierenden Antikörper verschiedene, markierte Liganden für die selektiven Bindestellen enthält, mit der abgetrennten festen Phase gemischt wird, diese Mischung unter Bedingungen inkubiert wird, welche ausreichen, um die markierten Liganden an die freien, nicht mit den selbstblockierenden Antikörpern gebundenen selektiven Bindestellen zu binden, wodurch eine zweite feste Phase, bestehend aus dem leblosen Träger mit an ihn gebundenen selbstblockierenden Antikörpern und/oder markierten Liganden und eine die ungebundenen markierten Liganden enthaltende flüssige Phase entsteht, die zweite feste Phase von der zweiten flüssigen Phase getrennt und die Menge des in der zweiten festen Phase und/oder der zweiten flüssigen Phase enthaltenen, markierten Liganden bestimmt wird.

Vorzugsweise ist der Rezeptor ein Protein, insbesondere z. B. der Innenfaktor, wobei dann der gekennzeichnete Ligand Vitamin B₁₂ ist.

Nach weiterer günstiger Ausgestaltung wird ein negativer Kalibrator und ein positiver Kalibrator vorgesehen und verwendet. Besonders günstig als lebloser Träger ist Glas, insbesondere Glaspartikel oder -perlen, an die der Rezeptor kovalent gebunden ist.

Die Erfindung ist zum quantitativen oder qualitativen Nachweis selbstblockierender Antikörper geeignet. Nur als Beispiel erfolgt die weitere Erläuterung an Hand des Nachweises IF-Stellenblockierender Antikörper. Statt dessen können aber auch andere, selbstblockierende Antikörper nachgewiesen werden, z. B. für die Grave′sche Krankheit (selbstblockierende Antikörper für Schilddrüsen stimulierende Hormone), Addison′sche Krankheit u.s.w., soweit der Rezeptor physikalisch und/oder chemisch an einen leblosen Träger gebunden und zusammen mit einem gekennzeichneten Ligand inkubiert werden kann. Hierfür bietet die Erfindung nicht nur ein geeignetes Analyseverfahren, sondern darüber hinaus praktische Analysevorrichtungen oder -pakete, die in besonders günstiger Ausgestaltung zwei Kalibratoren und gewünschtenfalls eine positive Kontrolle enthalten.

Der Erfindungsgedanke beruht auf der Verwendung eines immobilisierten Rezeptors, meist in Gestalt eines Proteins. Der Rezeptor enthält die selbstblockierenden Antikörper in der biologischen Probe anziehende Bindestellen. Oft ist er der gleiche Stoff, der normalerweise in biologischen in vivo Umsetzungen an den Ligand gebunden wird. Der vom Patienten erzeugte selbstblockierende Antikörper hemmt oder blockiert die in vivo erfolgende Komplexbildung von Ligand und Rezeptor durch Bindung an wenigstens einige der sonst für die Rezeptor-Ligandbindung zur Verfügung stehenden Bindestellen.

Die Bindung von Proteinen oder anderen Rezeptorstoffen an leblose Träger dürfte dem Fachmann inszwischen geläufig sein und keiner näheren Erläuterung bedürfen. Verschiedene Träger sind geeignet, z. B. Partikel, Perlen- oder flächenartige Träger, synthetische Stoffe, z. B. organische Polymere, Keramiken, anorganische Pulver, natürliche Polymere, Cellulosen, Agarosen und dergleichen. Bevorzugt wird Glas, z. B. die im Immunanalysen häufig verwendeten Glaspartikel, die oft mit Aminosilan behandelt werden und geregelte Porengrößen haben. Der Rezeptor wird an den Träger meist kovalent, mit oder ohne abstandsbildende Einheit je nach den vorhandenen Umsetzungsgruppen gebunden. Beispielsweise kann der Innenfaktor durch Aminsilankopplung und Glutaraldehyd mit Glas geregelter Porengröße umgesetzt werden, vgl. hierzu die US-PS 36 69 841.

Geeignetenfalls können Ionenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen, von der Waalskräfte und dergleichen in Frage kommen, so z. B. bei Bindung durch einfache Adsorption, um auf diese Art und Weise den Rezeptor auf dem leblosen Träger zu immobilisieren.

Der Rezeptor soll im wesentlichen den in lebenden Organismen natürlich vorkommenden Rezeptoren entsprechen, oder diese nachahmen. Bei der Extraktion, der Stabilisierung und dergleichen entstehen Veränderungen, welche annehmbar sind, solange die für die Analyse benötigten Bindungsstellen nicht beeinträchtigt werden. Häufig wird der Rezeptor als Analogmaterial aus tierischen Organismen genommen. Verwendbar sind auch andere, natürlich vorkommende oder synthetische Stoffe, sofern die Bindestellen denen der natürlich vorkommenden Rezeptoren funktionsgleich sind. Er kann aus nichtproteinhaltigen Stoffen bestehen, wie z. B. Ionen-Austauschharzen, hydrophoben Stoffen und dergleichen, an die der vermutete, selbstblockierende Antikörper gebunden werden kann. Bisweilen erfolgt auch im Falle von Proteinen die Bindung über einen nichtproteinhaltigen Teil des Proteins, wie eingeschlossene Kohlenwasserstoffe, Lipid- und/oder Peptidteile. Ferner haben Versuche in vitro gezeigt, daß gewisse Glaspartikel die Proteinrezeptorflächen nachahmen.

Eine zweite wesentliche Komponente ist der gekennzeichnete Ligand. Wie im Falle des Rezeptors entspricht der Ligand vorzugsweise den in lebenden Organismen vorkommenden Liganden, aber veränderte oder sogar synthetische Stoffe sind geeignet, auch wenn sie im lebenden Organismus nicht funktionsfähig wären, soweit sie die erforderlichen Bindestellen für den Rezeptor haben.

Die dem Patienten zu entnehmende Probe besteht aus einer die Antikörper normalerweise enthaltenden biologischen Flüssigkeit, meistens Blutserum oder Plasma, aber auch andere Körperflüssigkeit, z. B. Rückenmarksflüssigkeit, Urin, Magensaft, ganzes Blut u.s.w., je nach den Umsetzungsstoffen und Antikörpern.

Ein Analysepaket der Erfindung enthält den immobilisierten Rezeptor und den gekennzeichneten Liganden für das Verfahren, bei dem die dem Patienten entnommene biologische Flüssigkeit mit dem immobilisierten Rezeptor gemischt und dann mit dem gekennzeichneten Liganden versetzt wird. Zum qualitativen oder quantitativen Nachweis der jeweiligen selbstblockierenden Antikörper wird die anteilige Menge des mit dem immobilisierten Rezeptor bindenden gekennzeichneten Liganden bestimmt.

Der Ligand kann in beliebiger, bekannten Weise gekennzeichnet werden, z. B. mit radioaktiven, enzymatischen, oder fluoreszenten Kennzeichen.

Vorzugsweise enthält das Analysepaket wenigstens einen negativen Kalibrator, von dem bekannt ist, daß er die in Frage kommenden selbstblockierenden Antikörper nicht enthält. Am günstigsten werden ein negativer und ein positiver Kalibrator beigegeben und mitbehandelt. Der positive Kalibrator enthält die für einen positiven Meßwert gerade noch ausreichende Menge selbstblockierender Antikörper. Eine auf die positive Seite des positiven Kalibrators fallende Meßprobe ist demnach positiv hinsichtlich selbstblockierender Antikörper. Eine zwischen den positiven und den negativen Kalibrator fallende Meßprobe liegt in einer grauen (unbestimmten) Zone und kann positiv oder negativ sein.

Zur Kontrolle kann ein stark positiver Ansatz behandelt werden, der ein stark positives Ergebnis liefert. Je nach Art des Kennzeichens für den Ligand sollte ferner ein Kontrollversuch für den Hintergrund durchgeführt werden, besonders wenn der Ligand radioaktiv gekennzeichnet ist.

Beispiel

In einem Radioaktivversuch für IF-Stellenblockierende Antikörper wurde ein Analysepaket mit den folgenden sechs Komponenten verwendet:

• A. Innenfaktor (Immobilisiertes Rezeptorprotein)
  Gereinigter Innenfaktor vom Schwein wurde kovalent an Glaspartikel gebunden, die in 60 ml 0,03M phosphatgepufferter Salzlösung (0,15M), pH 7,4, mit 0,2% Natriumazid als Konservierungsmittel suspendiert waren.
• B. [⁵⁷Co] Vitamin B₁₂ (Radioaktivligand)
  [⁵⁷Co] Vitamin B₁₂ wurde in 120 ml 0,1M Boratpuffer, pH 9,3, enthaltend 0,001% Kaliumcyanid, Amaranthrot (2 µg/ml) als Pipettierhilfe, und 0,2% Natriumazid als Konservierungsmittel gelöst.
• C. Dithiothreitol (wahlweise zur Verbesserung unspezifischer Bindung)
  Verwendet wurde eine 1 ml Ampulle mit für den Versuch optimierter Konzentration.
• D. Negativer Kalibrator
  Dieser bestand aus entfibriniertem Humanplasma, das vor Gebrauch lyophilisiert und rekonstituiert werden kann.
• E. Positiver Kalibrator
  Verwendet wurde verdünntes Humanplasma, da blockierende Antikörper für den Innenfaktor in einer dem Schnittpunkt von Antikörpernegativen und Antikörperpositiven entsprechenden Konzentration enthält. Als Plasmaverdünner dient entfibriniertes Humanplasma, welches keine den Innenfaktor blockierende Antikörper enthält. Der Schnittpunkt bzw. Abschneidepunkt wird durch Auswertung von annähernd 800 Normalproben ohne Antikörper und annähernd 100 Proben mit blockierenden Antikörpern ermittelt, und definiert als der bei drei Standardabweichungen von dem Durchschnitt der Normalproben erhaltene Meßwert. Die positiven Proben sollen nicht in diesen Bereich fallen.
• F. Positive Kontrolle
  Der positive Kontrollansatz besteht aus den gleichen Stoffen wie der positive Kalibrator, jedoch wird zur Erzielung eines stark positiven Meßwerts eine höhere Menge blockierender Antikörper zugesetzt.
  Lagerung, Rekonstituierung und Handhabung dieser Stoffe erfolgt in der dem Fachmann geläufigen Weise. Bei Gebrauch befinden sich die Ansatzstoffe auf Zimmertemperatur.

Versuchsverfahren

Es empfiehlt sich, den maschinellen Hintergrund, 100 µl negativen und 100 µl positiven Kalibrator vierfach, und 100 µl andere Proben zweifach laufen zu lassen. Der Durchschnittswert jeder Probenart wird in eine weiter unten näher erörterte Berechnung eingesetzt.

Der Versuch wird dann wie folgt angesetzt:

Glas-Nr.
nhaltt
1- 4
leer (für Hintergrund)
5- 8	negativer Kalibrator
9-12	positiver Kalibrator
13-14	positive Kontrolle
15-16	Serumprobe des Patienten

Zu Versuchsbeginn enthalten die Gläser 5-8 also je 100 µl Ansatzstoff D, die Gläser Nr. 9-12 je 100 µl Ansatzstoff E, die Gläser Nr. 13-14 je 100 µl Ansatzstoff F und die Gläser Nr. 15-16 je 100 µl biologische Flüssigkeit.

Sodann wird eine bekannte Menge (0,5 ml) des immobilisierten Innenfaktors (Ansatzstoff A) in die Gläser Nr. 5-16 gegeben, gerührt oder geschüttelt, und bei einer Temperatur inkubiert, bei welcher eine Komplexbildung des Innenfaktors mit den Antikörpern möglich ist, z. B. etwa 2 Stunden bei Zimmertemperatur. Dann werden die Gläser zentrifugiert und abgegossen. Hierbei wird etwaiges in der Probe enthaltenes, endogenes Vitamin B₁₂ bindendes Protein abgegossen. In die Gläser 5-16 wird eine bekannte Menge (1 ml) des Radioaktivliganden (Ansatzstoff B) gegeben, und wiederum inkubiert, z. B. etwa 1 Stunde bei Zimmertemperatur, dann zentrifugiert und abgegossen und für jedes Glas die Radioaktivität gemessen.

Ist einem Patienten Vitamin B₁₂ verabreicht worden, so kann durch geeignete Behandlung während des Versuchs etwaiges freies Vitamin B₁₂ entfernt werden, z. B. durch vorherigen Zusatz von Vitamin B₁₂-Bindemittel zum Ansatzstoff A, oder das Bindemittel kann vor Beigabe des immobilisierten Innenfaktors in die Gläser 15-16 gegeben werden. In der Regel enthalten selbst Serumproben mit 2000 pg/ml Vitamin B₁₂ nicht genug freies Vitamin B₁₂ um den Versuch zu stören.

Wird Dithiothreitol verwendet, so wird dieses den Proben gleichzeitig mit dem Radioaktivligand als Komponente der radioaktiven Vitamin B₁₂ Lösung zugesetzt; das ist wahlweise und dient der Verbesserung der unspezifischen Bindung.

Probenberechnungen

Bei allen Werten handelt es sich um Durchschnittswerte, von denen der durchschnittliche Hintergrundszählwert abgezogen wurde. Da es sich um die qualitative Bestimmung handelte war die Berechnung einfach. Der Nettozählwert pro Minutenwert des negativen Kalibrators wird durch den Nettozählwert pro Minutenwert des positiven Kalibrators geteilt, um so einen Wert (A) größer als 1 zu erhalten. Die durchschnittlichen Nettozählwerte jeder unbekannten Probe werden dann in den negativen Kalibrator geteilt, um für jede Unbekannte einen Zahlenwert zu erhalten. Dieser Zahlenwert wird mit dem Wert (A) verglichen. Nach der Erfindung muß (A) gleich oder größer als 1,15 sein, damit der Versuch gültig ist. Ist der Wert einer Unbekannten gleich oder kleiner als (A), so ist die Unbekannte vermutlich Antikörpernegativ, während diese positiv ist, wenn der Wert der Unbekannten größer als (A) ist. Dazwischen gibt es zwischen (A) und 1 eine unbestimmte graue Zone.

Abwandlungsmöglichkeiten erschließen sich dem Fachmann. Die Inkubationsbedingungen können sehr verschieden sein; gewünschtenfalls kann wahlweise gewaschen werden, die Trennung kann anders als durch Zentrifugieren und Abgießen erfolgen, die Berechnung kann in anderer Weise erfolgen; auch können Meßwerte für nicht an das immobilisierte Substrat gebundene Liganden zur Errechnung der positiven und negativen Meßwerte verwendet werden.

Claims (12)

1. Verfahren zum Nachweis selbstblockierender Antikörper, bei dem eine fluide biologische Probe mit einem selektive Bindestellen für die selbstblockierenden Antikörper enthaltenden, auf einem leblosen Träger immobilisierten Rezeptor gemischt, die Mischung unter Bedingungen inkubiert wird, welche ausreichen, um alle vorhandenen selbstblockierenden Antikörper an die Rezeptoren zu binden, wodurch eine feste Phase aus dem leblosen Träger und den an ihn gebundenen selbstblockierenden Antikörpern, und eine flüssige Phase aus der fluiden biologischen Probe ohne die selbstblockierenden Antikörper entsteht, die feste von der flüssigen Phase getrennt wird, eine Flüssigkeit, die vom selbstblockierenden Antikörper verschiedene, markierte Liganden für die selektiven Bindestellen enthält, mit der abgetrennten festen Phase gemischt wird, diese Mischung unter Bedingungen inkubiert wird, welche ausreichen, um die markierten Liganden an die freien, nicht mit den selbstblockierenden Antikörpern gebundenen selektiven Bindestellen zu binden, wodurch eine zweite feste Phase, bestehend aus dem leblosen Träger mit an ihn gebundenen selbstblockierenden Antikörpern und/oder markierten Liganden und eine die ungebundenen markierten Liganden enthaltende flüssige Phase entsteht, die zweite feste Phase von der zweiten flüssigen Phase getrennt und die Menge des in der zweiten festen Phase und/oder der zweiten flüssigen Phase enthaltenen, markierten Liganden bestimmt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor ein Protein ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß je ein bekannter negativer und positiver Kalibrator als Vergleichsstandard verwendet wird.

4. Verfahren nach Ansprüchen 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor der Innenfaktor und der Ligand Vitamin B₁₂ ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor der Innenfaktor, der Ligand Vitamin B₁₂ ist, der negative Kalibrator aus Humanplasma und der positive Kalibrator aus den selbstblockierenden Antikörper enthaltendem Humanplasma präpariert ist.

6. Verfahren nach Ansprüchen 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Glaspartikeln besteht.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor kovalent an das Glas gebunden ist.

8. Verfahren nach Ansprüchen 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Markierung radioaktiv, fluoreszent oder enzymatisch ist.

9. Analysepaket zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1-8, dadurch gekennzeichnet, daß es einen selektive Bindestellen für die selbstblockierenden Antikörper aufweisenden, auf einem leblosen Träger immobilisierten Rezeptor und einen markierten Liganden für den Rezeptor enthält, wobei der markierte Ligand vom selbstblockierenden Antikörper verschieden ist.

10. Analysepaket nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor ein Protein oder Innenfaktor, der Ligand Vitamin B₁₂ ist, der negative Kalibrator aus Humanplasma und der positive Kalibrator aus den Antikörper enthaltendem Humanplasma präpariert ist.

11. Analysepaket nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es einen aus Humanplasma präparierten Vergleichsstandard aufweist, welcher die blockierenden Antikörper in größeren Mengen als der positive Kalibrator enthält.

12. Analysepaket nach Ansprüchen 9, 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus Glaspartikeln besteht, an die der Rezeptor kovalent gebunden ist.