DE3143625A1

DE3143625A1 - Verfahren und vorrichtung zum aufnehmen zweidimensionaler kernresonanzspektren

Info

Publication number: DE3143625A1
Application number: DE19813143625
Authority: DE
Inventors: Richard Prof. Winterthur Ernst; Slobodan Dr. Belgrad Macura; Kurt Prof. Wallisellen Wüthrich
Original assignee: Spectrospin AG
Current assignee: Bruker Switzerland AG
Priority date: 1981-11-04
Filing date: 1981-11-04
Publication date: 1983-05-19
Also published as: JPS627495B2; GB2109116A; JPS58100744A; FR2515824A1; GB2109116B; US4510449A; CH660794A5; DE3143625C2; FR2515824B1

Description

Anmelderin: Stuttgart, den 12.10.1981

Firma P 4-126 S/Lö

Spectrospin AG Industriestraße 26

CH 8117 .Fällanden-Zürich

Vertreter:

Kohler - Schwindling - Späth Patentanwälte Hohentwielstraße 41

7000 Stuttgart 1

Verfahren und Vorrichtung zum Aufnehmen zweidimensionaler Kernresonanzspektren

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Aufnehmen zweidimensionaler KernresonanzSpektren, bei dem das zu untersuchende Kernspinsystem mit drei in zeitlichem Abstand aufeinanderfolgenden 90°-Impulsen angeregt und das nach dem dritten 90°-Impuls erhaltene Interfero-

gramm einer Fourier-Analyse unterworfen wird, bei dem weiterhin eine Vielzahl solcher Messungen mit unterschiedlichen Abständen (Entwicklungszeit t^) zwischen 'dem ersten und dem zweiten 9O°-Iⁱap^uls ausgeführt werden und die dadurch erhaltenen, unterschiedlichen Amplitudenwerte der durch die Fourier-Analyse gewonnenen Resonanzlinien als Augenblickswerte eines weiteren Interferogramms gespeichert und einer v/eiteren Fourier-Analyse unterworfen x<srerden„

Die zweidimensionale Kernresonanz-Spektrometrie ist in einem Aufsatz von J. Jeener, B„H„ Meier, P. Bachmann und R.R. Ernst im J.Chem.Phys. J 1, 4-546 (1979) beschrieben. Mit ihrer Hilfe lassen sich Austauschvorgänge in einem Molekül beobachten, die zur Folge haben, daß sich die Resonanzfrequenz eines Kernspins ändert= Die Fourier-Analyse des ersten Interferogrammes liefert eine Aussage über die Resonanzfrequenz nach dem Austausch, während die Fourier-Analyse des durch Verändern der Entwicklungszeit gewonnenen Interferogrammes eine Aussage über die ursprüngliche Resonanzfrequenz des gleichen angeregten Spinmoments ergibt. Auf diese Weise lassen sich vollständige Netzwerte bezüglich der nichtkohärenten Übertragung von Magnetisierungen auf dem Wege chemischen Austausches und einer Dipol-Dipol-Kreuzrelaxation gewinnen. Eine besonders bedeutende Anwendung liegt in der Bestimmung der Gestalt von biologischen Makromolekülen. Zur Bestimmung der Geschwindigkeitskonstanten, welche den Magnetisierungs-Austausch beherrschen, ist es erforderlich, Untersuchungen bei verschiedenen Zeitabständen zwischen dem zweiten und dem dritten 90°-Impuls (Mischzeit t_m) durchzuführen, einschließlich sehr

kurzer Werte der Mischzeit t . Unter diesen Bedingungen können Kreuzlinien im 2D-Spektrum auftreten, die durch eine kohärente Übertragung der Magnetisierung bedingt sind (S. Macura, T. Huang, D. Suter und R.R. Ernst, J. Magn. Resonance^, 259 (1981) ). Eine genaue Analyse des Spektrums ist jedoch nur dann möglich, wenn die von einem kohärenten und einem inkohärenten Austausch stammenden Linien unterschieden werden können.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Methode anzugeben, welche eine solche Unterscheidung ermöglicht.

Diese Aufgabe kann nach der Erfindung dadurch gelöst werden, daß bei jeder Wiederholung der Messung mit einer anderen Entwicklungszeit t^ ..gleichzeitig der zeitliche Abstand zwischen dem zweiten und dem dritten 90°-Impuls (Mischzeit t ), ausgehend von einem Anfangswert t «, proportional zur Entwicklungszeit t^ geändert wird (t^ = t Q + Jft^), derart, daß bei der vorgesehenen Anzahl von η Messungen die gegenüber t ~ kleine zeitliche Variation der Mischzeit t - t_mQ etwa gleich der Periode von durch skalare oder kohärente Kopplung bedingten Frequenzverschiebungen ist, und das so erhaltene 2D-Spektrum einer Dreieckmultiplikation oder Symmetrierung unterworfen wird, bei der alle Linien eliminiert werden, die zur Hauptdiagonale nicht spiegelbildlich sind.

Die Änderung der Mischzeit t ist bei dem erfindungsgemäßen Verfahren so gering, daß dadurch die von der Mischzeit abhängige Amplitude der einzelnen Linien,

deren Variation, über den zeitlichen Ablauf der nichtkohärenten Austauschvorgänge Aufschluß gibt, praktisch unverändert bleibt«, Dagegen werden die periodischen, relativ schnellen Austauschvorgänge, die durch eine kohärente oder skalare Kopplung bedingt sind, gegenüber der Diagonalen einseitig verschoben, daß sie nach der Symmetrierung in dem Spektrum nicht mehr in Erscheinung treten.

Ein gleichartiger Effekt tritt auf, wenn gleichfalls nach der Erfindung zwischen dem zweiten und dem dritten 90°-Impuls ein 180°-Impuls erzeugt und bei jeder Wiederholung der Messung mit einer anderen Entwicklungszeit t^, gleichzeitig der zeitliche Abstand t des 180°-Impulses von dem zweiten 90 -Impuls, ausgehend von einem Anfangswert t q, proportional zur Entwicklungszeit t.^ geändert wird (t =\*_Όο ⁺ X^i)> derart, daß bei der vorgesehenen Anzahl von η Messungen die gegenüber t kleine zeitliche Variation der Positionszeit t - t _Q in der Größenordnung der Periode von durch skalare oder kohärente Kopplung bedingten Frequenzverschiebungen ist, und das so erhaltene 2D-Spektrum einer Dreieckmultiplikation oder Symmetrierung unterworfen wird, bei der alle Linien eliminiert werden, die zur Hauptdiagonale nicht spiegelsymmetrisch sind.

Bei beiden Formen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden also aus dem zweidi'mensionalen Kernresonanz Spektrum Dopellinien eliminiert, die auf eine skalare oder kohärente Kopplung zurückzuführen sind, so daß nichtkohärente Austauschvorgänge und insbesondere der Overhauser-Effekt (NOE) störungsfrei beobachtet werden können. Die dazu

3U3625

notwendige Dreieckmultiplikation oder Symmetrierung ist von R. Baumann, Anil Eumar, R.R. Ernst und K. Wüthrich in J. Magn. Resonance 44, 76 (1981) bzw. von R. Baumann, G. Wider, R.R. Ernst und K. Wüthrich in J. Magn. Resonance 44, 402 (1981) behandelt.

Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich mit allen Kernresonanzspektrometern durchführen, die einen Generator zur Erzeugung von drei bzw. vier aufeinanderfolgenden HF-Impulsen mit einstellbaren zeitlichen Abständen aufweisen. Gegenstand der Erfindung ist jedoch auch eine für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders vorteilhafte Ausbildung eines solchen Kernresonanz spektrometer s, die darin besteht, daß es zur Einstellung eines sich proportional zu dem Abstand t. zwischen dem ersten und dem zweiten Impuls ändernden Abstandes t bzw. t zwischen dem zweiten und dem dritten Impuls durch Wah.1 eines ersten zeitlichen Abstandes txj, eines Anfangswertes t q bzw. t ~ des Abstandes zwischen dem zweiten und dem dritten Impuls und eines Proportionalitätsfaktors X eingerichtet ist, derart, daß

Die Erfindung wird im folgenden anhand der in der Zeich nung dargestellten Diagramme näher beschrieben und erläutert. Es zeigen

Fig. 1 das Zeitdiagramm der bei der ersten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens angewendeten Impulsfolge,

3H3625

Pig. 2 das Zeitdiagramm der durch die An

regung eines Spinsystems erhaltenen Signale, und zwar für ein System mit einer Null- und einer Doppel-Quantenkoharenz,

Pig. 3 ein zweidimensionales Austauschspek

trum einer 1:1-Mischung von 1,1,2-Trichlorethan und N,N~Dimethylacetamid bei 297 K und einer Variation der Austauschzeit t von 100 bis 132 ms nach der Erfindung,

Pig. 4· das gleiche Spektrum wie Pig» 3₅ jedoch nach der Symmetrierung,

Pig. 5 einen Querschnitt durch das Spektrum

nach Pig_o 3₉

Pig. 6 einen Querschnitt durch das Spektrum

nach

ig. 7 ein NOESY-Spektrum des basischen

pankreatischen Trypsin-Inhibitors (BPTI) unter Verwendung einer festen Mischzeit t_ffi = 30ms nach dem Stand der Technik,

Hg. 8 ein Spektrum des gleichen BPTI bei

Variation der Mischzeit von 30ms bis 37,8ms nach der Erfindung,

Fig. 9 zwei- und dreidimensionale Darstel

lungen des Ausschnittes A des Spektrums nach Fig. 7 ■>

"Pif.r. IO zwei- und dreidimensionale Darstellungen des entsprechenden Ausschnittes des A¹ des Spektrums nach Fig. 8 und

Fig. 11 das Zeitdiagramm der bei der zweiten

Varianbe des erfindungsgemäßen Verfahrens angewendeten Impulsfolge.

Die grundlegenden Vorgänge bei der 2D-Austauschspektroskopie sind in den Fig. 1 und 2 veranschaulicht. Wie Fig. 1 zeigt, wird zunächst ein 90°-Impuls angelegt, um eine Quermagnetisierung zu erzeugen. Die Entwicklungszeit t^ dient dazu, den verschiedenen Magnetisierungs-Komponenten in Form ihrer Larmor-Präzessionsfrequenzen ein "Frequenz-Etikett" aufzuprägen. Wie bekannt, wird bei der 2D-Spektroskopie die Entwicklungszeit t* von Messung zu Messung bis zum Abschluß des vollständigen 2D Experimentes erhöht. Nach Ablauf der Entwicklungszeit t^ verdreht ein zweiter 90°-Impuls die x-Komponente der Magnetisierung längs der z-Achse, wonach während der folgenden Mischzeit t_m der zu untersuchende, langsame Austauschprozess stattfinden kann. Ein dritter 90°-Impuls erzeugt erneut eine Quermagnetisierung. Das Ergebnis des Austauschprozesses wird dann durch die Präzessionsfrequenzen der Komponenten der Magnetisierung während der Detektionszeit t~ festgestellt. Eine zweidimensionale Fourier-Transformation des erhaltenen Signals s(t„., t führt endlich zu dem gewünschten 2D-Austausch- oder NOE-Spektrum. Die Intensitäten a_A1-, und a-r,. der Austausch-Kreuzlinien für ein System mit zwei austauschenden Kernen steigen mit der Magnetisierungs-Austauschrate R_ß bis zu einem Gleichgewicht an, wenn die Misch-

■-β·"--ff. 3H3625

zeit zunimmt, während gleichzeitig die Leckrate E- die Intensität der Kreuzlinien vermindert» Nach SoMacura und R.R. Ernst in Mol. "Fhys. j^1_, 95 (1980) lassen sich diese Vorgänge beschreiben durch

7Γ C

Bei der vorstehenden Beschreibung wurden die Komponenten der Quermagnetisierung vernachlässigt, die nach dem zweiten 90°-Impuls Verbleibens Außerdem ist es bekannt, daß in gekoppelten Spinsystemen zwei im zeitlichen Abstand t^ aufeinanderfolgende 90°-Impulse auch eine Null-, Doppel« und Mehrfach-Quantenkohärenz erzeugen (Aue et al in J. Chem. Phjs, 64- , 2229 0976))· Diese Kohärenz-Komponenten entwickeln sich während der Mischzeit t 3 wie es in Fig. 2 schematisch angedeutet ist. Die dritten 90°<=Impulse transformieren diese Komponenten teilweise in eine beobachtbare Quermagnetisierung. Diese zusätzlichen Wege einer Kohärenz-Übertragung sind für das Auftreten von sogenannten J-Kreuzlinien im 2D-Austauschspektrum verantwortlich. Daher können Kreuzlinien gleichzeitig Anteile eines inkohärenten Magnetisierungstransfers über einen willkürlichen Austauschprozess sowie Anteile eines Kohärenztransfers über ein J-Kopplungsnetzwerk enthalten.

Zur Vereinfachung der Interpretation ist die Unterdrückung von J-Kreuzlinien im 2D-Austauschspektrum erwünscht. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Unter-

drückung dieser J-Kreuzlinien beruht auf der charakteristischen Abhängigkeit der kohärenten und inkohärenten Transferprozesse von der Dauer der Mischzeit. Während der inkohärente Austausch'nach Gl. (1) ein langsam variierender Vorgang ist, zeigt der Kohärenz-Transfer eine oszillierende Abhängigkeit von der Mischzeit.

Nach der Erfindung wird die Mischzeit t parallel zur Entwicklungszeit t,. nach folgender Beziehung geändert:

Die maximale Erhöhung der Mischzeit wird ausreichend klein gewählt, um eine nennenswerte Störung des inkohärenten Austausches zu vermeiden. Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu einer Verschiebung aller J-Kreuzlinien von ihren ursprünglichen Positionen längs der &i--Richtung. Diese Verschiebung zerstört die den J-Kreuz linien-Mustern eigene Symmetrie. Die längs derω^-Richtung verschobenen Kreuzlinien weisen keine Gegenstücke in der spiegelsymmetrischen Stellung in Bezug auf die Hauptdiagonale des 2D-Spektrums auf. Daher können sie durch eine Dreieck-Multiplikation oder Symmetrierung eliminiert werden, die nur in symmetrischen Paaren vorliegende Linien bestehen läßt.

Zur weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens sei eine Magnetisierungskomponente betrachtet, die ursprünglich zum Übergang a gehörte und vor dem Austausch die Präzessionsfrequenz (P_Q besaß. Es sei angenommen, daß der Mischvorgang diese Magnetisierungs-

komponente in Kohärenz mit einem anderen Übergang b mit der Frequenz oJ, bringt. Der Weg während des Mischens kann über alle möglichen Übergänge k mit den Präzessionsfrequenzen 6ü, führen, einschließlich einer Null-, Einzel- und Mehrfach-Quantenkohärenz (Fig. 2)_e Diese Prozesse führen dann zur beobachtbaren Magnetisierungs-Komponente

In dieser Gleichung sind R. und R,, Matrixelemente des Rotations=Operators,welcher den kohärenten Austausch vom Übergang a zum Übergang k und vom Übergang k zum Übergang b darstellt, der von den HF-Impulsen ausgelöst wird«. Die Summierung über k führt über alle erlaubten und verbotenen Übergänge, einschließlich Übergängen, die sich lediglich durch ihr Vorzeichen unterscheiden.

Wird die Mischzeit t proportional zu t^ erhöht, wie in Gl. (2) angegeben, erhält man

3H3625

Die zweidimensionale Fourier-Transformation für eine feste Mischzeit t würde zu einzelnen Kreuzlinien bei

in

oi. = u) undto 2 ^saJb führen* Bei einer Erhöhung von t_ffl wird jedoch eine eindimensionale Liniengruppe bei ω ^. = ω +#<υ, und ω_ο "^u erzeugt, die in der W.-Richtung eine Linienbreite V^o₈₁ +VT^ ^aufwei^sen· ^Es ^⁰* wesentlich zu beachten, daß alle unerwünschten Übertragungswege mit Schwingungsverhalten (ω, /O) zu verschobenen Kreuzlinien führen, und in der Stellung Iu^ = ω_& und OJg = ω ausschließlich Kreuzlinien mit zufälligen Austausch-Intensitäten verbleiben. Das Ausmaß der Verschiebung der J-Kreuzlinien kann durch den Wahl des Parameters )6 bestimmt werden.

Der inkohärente Magnetisierungs-Transfer wird durch die schrittweise Erhöhung der Mischzeit nicht nennenswert beeinflußt, so lange der die schrittweise Erhöhung bestimmende Parameter")6 und die Gesamtvariation der Mischzeit t ausreichend klein gehalten werden, m

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung werden anschließend experimentelle Daten wiedergegeben, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens an zwei Systemen erhalten wurden, von denen das erste aus kleinen und das zweite aus sehr großen Molekülen besteht.

Austauschspektren einer Mischung von 1,1,2-Trichlorethan und IfjlT-Dimethylacetamid

Um die Bedeutung des kohärenten und inkohärenten Magnetisierungs-Transfers zu veranschaulichen, wurde eine

3H3625

Mischung von Λ _t1,2~Trichlorethan (TCE) und N₉N~Dimethylacetamid (DMA) gewählt. Das Protonen-Resonanzspektrum von TGE besteht aus einem J-gekoppelten AX^-Spinsystem, das zu einem kohärenten Transfer führt» Andererseits hat der chemische Austausch, der auf eine verhinderte Rotation im DMA zurückzuführen ist, einen inkohärenten Magnetisierungs-Transfer zur Polge. Pig. 3 zeigt ein nach der Erfindung aufgenommenes 2D-Spektrum in Form eines Konturendiagrammes der Absolutwerte einer Mischung gleicher Anteile von TCE und DMA. Die sechs Linien des eindimensionalen Spektrums, welche für die chemischen Verschiebungen von TCE, für das Lösungsmittel und für DMA charakteristisch sind, sind längs der Hauptdiagonalen ω^ = ω^ dargestellt. Die Multiplett-Struktur der TCE-Linien ist wegen der begrenzten digitalen Auflösung nicht erkennbar. Die beiden Kreuzlinien 1 und 2 zwischen den beiden N=Methyl-Linien 3 und 4- des DMA veranschaulichen den Austausch zwischen den Methylgruppen, der durch eine interne Rotation bedingt ist_o Die Austausch-Kreuzlinien sind in dem vergrößerten Ausschnitt besser erkennbar. Die beiden J-Kreuzlinien bei (αν] =^a> ^ω2 χ) und (a^ =-"-_χ, ^2 ⁼^

TCE zu erwarten wären, erscheinen aufgelöst in ihre Mehrfach-Quantenkomponenten, die längs der Linien (tip -tu., und (JJo ⁼^x verteilt sind. Es sind längs beider Linien vier Paare J-Kreuzlinien erkennbar, die in der ta.-Richtung symmetrisch positiv und negativ um die ent sprechenden, »it fie® faktor skalierten Mehrfachquanten-Präsessionsfrequenzen verschoben sind. Die vier Paare J-Kreuislinien gehören zn swei Ein-Qnsten-Übergängen 1QT^ und IQTjr, einem Null-Quanten-Übergang ZQT und tu einem Zwei-Quanten-Übergang 2QT.-Des Mehrfach-Quantenmuster der

in Fig. 3 links unten gelegenen J-Kreuzlinie ist durch Signalfaltung bei der Frequenz ü)^ = O gestört. Die beiden Diagonallinien von TCA, die durch J-Kopplungen verknüpft sind, sind ebenfalls in ihre Mehrfach-Quantenkomponenten aufgeteilt, analog zu den J-Kreuzlinien. Axiallinien erscheinen längs dera^-Achse (o^ = 0), und zwar infolge einer teilweisen Erholung der Longitudinalmagnetisierung während der Mischzeit. Linien, die auf der Geraden U^ =Y,(n^ liegen, stammen von einer Longitudinal-Magnetisierung, die während der Entwicklungszeit aufgebaut wurde. Diese Magnetisierung wird durch den zweiten 90°-Impuls in die Querebene gedreht und entwickelt sich nur während der. Mischzeit. Daher ist ihre ακ-Frequenz mit dem Faktor^ behaftet. Zwei Gruppen von Linien, die sich auf den Geraden tu* = (1 + )6 ) cuo und ω = (1 -)L) ü^2 befinden, gehören zu einer sowohl während der Entwicklungszeit als auch der Mischzeit transversalen Magnetisierung. Die beiden erreichten Präzessionswinkel <uA;. undo^X/fc^ können infolge der Wirkung des zweiten 90 -Impulses additiv oder subtraktiv sein.

Fig. 4· zeigt das Spektrum der Fig. 3 nach einer Symmetrierung. Alle Linien, die in Bezug auf die Hauptdiagonale unsymmetrisch sind, wurden eliminiert. Daher bleiben nur Diagonallinien und Austausch-Kreuzlinien übrig. Dies geht auch klar aus den Fig. 5 und 6 hervor, die Querschnitte parallel zuiü, füro^o ⁼Q-a durch die Diagramme nach den Fig. 3 und 4 zeigen. Es ist wichtig festzustellen, daß bei der Frequenz Q._Y imΏ«-Querschnitt (und entsprechend auch bei der Frequenz Q. imbc_T-Querschnitt bei Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens keine Linie existiert. Diese Tatsache ist die Grundlage

3H3625

für die vollständige Unterdrückung von J-Ereuzlinien durch die Symmetrierung. Zwei entsprechende Querschnitte parallel zu.ü. bei O^ ⁼ ^\ durch die Spektren Fig. 3 und Fig. 4 sind in Fig. 5 und Fig. 6 dargestellt und zeigen die Wirksamheit der Methode zur Unterdrückung von J-Kreuzlinien eindrücklich.

NOE-Spektrum für einen basischen, panfereatischen Trypsin-Inhibitor (BPTI)

Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Untersuchung biologischer Makromoleküle sollen anhand der Spektren von BPTI veranschaulicht werden, dessen J-Kopplungs- und Kreuz-Relaxations-Netzwerte recht gut verstanden werden (siehe z.B. K. Wüthrich und G. Wagner in J. Mol. BoI. IJO, 1 (1979)). Die Fig. ? und 8 zeigen ein mit fester Mischzeit bzw_ö mit erfindungsgemäß schrittweise erhöhter Mischzeit aufgenommenes NOE-Spektrum«, Beide Spektren wurden symmetrisiert«, Die folgende Diskussion konzentriert sich auf die Unterschiede zwischen den Spektren nach den Fig* 7 und 8 in den Bereichen A bzw. A¹, die mehr im einzelnen in den Fig. 9 und 10 wiedergegeben sind.

Fünf der J-Kreuzlinien, die im Bereich A des Spektrums nach Fig. 7 erscheinen, werden durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eliminiert, wie es der Abschnitt A¹ in Fig. 8 deutlich zeigt. Eine genauere Untersuchung der gleichen Bereiche zeigt jedoch, daß nach der Eliminierung der J-Kreuzlinien damit koinzidente NOE-Kreuzlinien sichtbar werden. Die Möglichkeit, zusammenfallende J- und NOE-Kreuzlinien zu trennen, ist für die quantitative Interpretation der NOE-Daten von Proteinen sehr wichtig, da in Spektren, die mit sehr

3U3625

kurzen Mischzeiten aufgenommen werden, NOΕ-Kreuzlinien, die zu Protonen des gleichen Aminosäurerestes gehören, durch damit zusammenfallende J-Kreuzlinien überdeckt sein können. Beispielsweise ist die .Kreuzlinie zwischen G"% und NH des Restes P 33 (Pig. 9) eine typische J-Kreuzlinie, die die damit zusammenfallende NOE-Kreuzlinie überdeckt. Nachdem jedoch durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die J-Kreuzlinie eliminiert wurde, wird die NOE-Kreuzlinie sichtbar und quantitativ meßbeir (Fig. 10). Andererseits werden reine

CC

NOE-Kreuzlinien, wie diejenige zwischen C H von T 32 und NH von F 33 c.urch die schrittweise Erhöhung von t_ffl nicht berührt. E:.n gleiches Verhalten wurde für die Bindungen aller fünf Amid-Protonresonanzen beobachtet, die in den Pig. S¹ und 10 bezeichnet sind, nämlich für die NH-Gruppen von F 4-5, F 22, P 33, Y 21 und Q 31. Jedes dieser Amid -Protonen gibt Veranlassung zu zwei Kreuzlinien in dem in den Pig. 9 und 10 wiedergegebenen Spektralbereich. In jedem Pail hat die reine NOE-Kreuzlinie mit demoie -Proton des vorhergehenden Restes in der Aminosäurenfolge im wesentlichen die gleiche Intensität in den Spektren r.ach den Pig. 9 und 10. Im Gegensatz dazu wurde als Konsequenz der Erhöhung der Mischzeit die Intensität der Kreuzlinie mit dem benachbarten efr-Proton des gleichen Restes in Pig. 10 reduziert, so daß die restliche Intensität vollkommen auf den inkohärenten NOE-Austausch zuiückzuführen ist.

Die in der Zeichnung wiedergegebenen Spektren wurden unter Verwendung eines Kernresonanz-Spektrometers der Firma Bruker-Analytik GmbH vom Typ CXP 300 aufgenommen.

Dieses Spektrometer erlaubt die Erzeugung von 9O°-Impulsfolgen, bei denen die Impulsabstände unabhängig voneinander einstellbar bzw. programmierbar sind. Speziell zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein solches Spektrometer in dor Weise ausgebildet werden, daß anstatt der Eingabe der Zeitpaare t^, t als Variable nur die Zeiten t- eingegeben zu werden brauchen, während die Anfangs-Mischzeit t ~ und der Proportionalitätsfaktor ")£ fest eingestellt bzw. bei programmiertem Ablauf des Meßvorganges eingegeben werden können, so daß das Spektrometer den zweiten Impulsabstand t = t _Q + Yt,. selbstständig bildet. Wie bereits aus dem Vorstehenden hervorgeht, ist unter "Einstellen" auch das Eingeben eines entsprechenden Befehls in die Steuereinrichtung eines solchen Spektrometers zu verstehen.

Anstatt, wie vorstehend beschrieben, bei ,jeder Wiederholung des Experimentes den zeitlichen Abstand zwischen zweitem und drittem 90°-Impuls (Mischzeit t_ffi) proportional zur Entwicklungszeit t^ zu ändern, ist es mit gleicher Wirkung möglich, innerhalb der Mischperiode einen zusätzlichen 180°-Impuls zu erzeugen, dessen Position t proportional zur Entwicklungszeit t^ inkrementiert wird (t = t ₀ + Xt₁), wie es in Fig. 11 dargestellt ist. Dabei muß die gesamte Mischzeit t_m konstant gehalten werden. Die Position des 180°-Impulses beeinflußt ausschließlich die Präzession der zu den J-Kreuzlinien führenden Magnetisierung, während der inkohärente Magnetisierungsaustausch, dessen Messung das Ziel des Experimentes ist, unbeeinflußt bleibt.

Der zeitlich verschobene I80⁰-Impuls hat den gleichen Verschiebungs-Effekt auf die J-Kreuzlinien wie die Inkrementierung der Mischzeit t , so daß die J-Kreuzlinien durch die Dreieckmultiplikation oder Symmetrierung wieder eliminiert werden. Der i80°-Impuls beeinflußt jedoch den inkohärenten Austausch nicht im mindesten, so daß diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens in kritischen Situationen für das Erzielen höchster Präzision zu bevorzugen ist.

ZI

Leerseite

Claims

Patentansprüche

1.!Verfahren zur Aufnahme zweidimensionaler Kernresonanz-Spektren, bei dem das zu untersuchende Kernspinsystem mit drei in zeitlichem Abstand aufeinanderfolgenden-90°-Impulsen angeregt und das nach dem dritten 90 Impuls erhaltene Interferogramm einer Fourier-Analyse unterworfen wird, bei dem weiterhin eine Vielzahl solcher Messungen mit unterschiedlichen Abständen (Entvricklungszeit t^) zwischen dem ersten und dem zweiten 90°~Inipuls ausgeführt werden und die dadurch erhaltenen, unterschiedlichen Amplitudenwerte der durch die Fourier-Analyse gewonnenen Resonanzlinien als Augenblickswerte eines zweiten Interferogrammes gespeichert und einer weiteren Fourier-Analyse unterworfen werden, dadurch gekennzeichnet, daß bei jeder Wiederholung der Messung mit einer anderen Entwicklungszeit t. gleichzeitig der zeitliche Abstand zwischen dem zweiten und dem dritten 90°-Impuls (Mischzeit *_m)₉ ausgehend von einem Anfangsv/ert t_mQ, proportional zur Entwicklungszeit t^ geändert wird (t = tf) ^t/t.), derart, daß bei der vorgesehenen Anzahl von η Messungen die gegenüber t _Q kleine zeitliche Variation der Mischzeit t - t „ in der Größenordnung der Periode von durch skalare oder kohärente Kopplung bedingten Frequenzverschiebungen ist, und das so erhaltene 2D=Spektrum einer Dreieckmultiplikation oder Symmetrierung unterworfen wird, bei der alle Linien eliminiert werden, die zur Hauptdiagonale nicht spiegelsymmetrisch sind.

- 3H3625

2. Verfahren zur Aufnahme zweidimensionaler Kernresonanzspektren, bei dem das zu untersuchende Kernspinsystem mit drei in zeitlichem Abstand aufeinanderfolgenden 90 -Impulsen angeregt und das nach dem dritten 90°-Jmpuls erhaltene Interferogramm einer ?ourier-Analyse unterworfen wird, bei dem weiterhin eine Vielzahl solcher Messungen mit unterschiedlichen Abständen (Entwicklungszeit t.) zwischen dem ersten und dem zweiten 90 -Impuls ausgeführt werden und die dadurch erhaltenen, unterschiedlichen Amplitudenwerte der durch die Fourier-Analyse gewonnenen Resonanzlinien als Augenblickswerte eines zweiten Interferogrammes gespeichert und einer weiteren Fourier-Analyse unterworfen werden, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen dem zweiten und dem dritten 90°-Impuls ein I80⁰-lmpuls erzeugt und bei Jeder Wiederholung der Messung mit einer anderen Entwicklungszeit t^, gleichzeitig der zeitliche Abstand t des 180°-Impulses von dem zweiten 90°-Impuls , ausgehend von einem Anfangswert t -., proportional zur Entwicklungszeit t. geändert wird (t = t - + X^), derart, daß bei der vorgesehenen Anzahl von η Messungen die gegenüber t kleine zeitliche Variation der Positionszeit t

pn

t Q in der Größenordnung der Periode von durch skalare oder kohärente Kopplung bedingten Frequenzverschiebungen ist, und das so erhaltene 2D-Spektrum einer Dreieckmultiplikation oder Symmetrierung unterworfen wird, bei der alle Linien eliminiert werden, die zur Hauptdiagonale nicht spiegelsymmetrisch sind.

3. Kernresonanzspektrometer zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, das einen Generator zur Erzeugung von drei bzw. vier aufeinanderfolgenden EF-Impulsen mit einstellbaren zeitlichen Abständen aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Einstellung eines sich proportional zu dem Abstand t,, zwischen dem ersten und dem zweiten Impuls ändernden Abstandes t bzw. t zwischen dem zweiten und dem dritten Im-

P
puls durch Wahl eines ersten zeitlichen Abstandes t., eines Anfangswertes t_mQ bzw„ t _Q des Abstandes zwischen dem zweiten und dem dritten Impuls und eines Proportionalitätsfaktors % eingerichtet ist, derart, daß t_ffl = t_mQ +Xt₁ bzw= t = t _Q +