DE3143625C2 - Verfahren zur Aufnahme von Kernresonanzspektren von Molekülen in einem zweidimensionalen Frequenzbereich und Kernresonanzspektrometer zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents

Abstract

Bei der Aufnahme zweidimensionaler Kernresonanzspek tren treten häufig sogenannte J-Kreuzlinien auf, die auf eine skalare oder kohärente Kopplung zwischen ein Spinmoment aufweisenden Kernen entstehen. Diese J-Kreuzlinien erschweren die Interpretation des Spektrogrammes und können außerdem Kreuzlinien von inkohärenten Austauschvorgängen oder Transfers überdecken, deren Untersuchung das aufgenommene Spektrogramm eigentlich dienen soll. Nach einer ersten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens werden solche J-Kreuzlinien dadurch eliminiert, daß bei jeder Wiederholung der Messung mit einer anderen Entwicklungszeit t ↓1 zwischen dem ersten und dem zweiten von zwei aufeinanderfolgenden 90 °-Impulsen auch der zeitliche Abstand zwischen dem zweiten und dem dritten 90 °-Impuls (Mischzeit t ↓m) eines solchen Experimentes geändert wird, und zwar ausgehend von einem Anfangswert t ↓m ↓0 und proportional zur Entwicklungszeit t ↓1, derart, daß bei der vorgesehenen Anzahl von n Messungen die gegenüber td2m ↓0 kleine zeitliche Variation der Mischzeit t ↓m ↓n - t ↓m ↓0 in der Größenordung der Periode von durch skalare oder kohärente Kopplung bedingten Frequenzverschiebungen ist, und das so erhaltende 2D-Spektrum einer Dreieckmultiplikation oder Symmetrierung unterworfen wird, bei der alle Linien eliminiert werden, die zur Hauptdiagonale nicht spiegelsymmetrisch sind. Bei einer zweiten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens wird zu demselben Zweck bei konstanter Mischzeit t ↓m zwischen dem

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Aufnahme von Kernresonanzspektren von Molekülen In einem zwei-

dimensional"" Frequenzbereich, 2D-Spektren, bei dem das zu untersuchende Kernspinsystem mit drei in

Sehern Abstand aufeinanderfolgenden 90°-Im_Pulsen angeregt und das nach dem dritten 90=- mpuls erhaltene

η e fSramrn einer Four.er-Analyse unterworfen wird, bei dem weiterhin eine Vielzahl solcher Messungen

« m urne schTdllchen zeltlichen Abständen, der Entwicklungszeit ,„ zwischen dem ersten und dem zweiten 90 rmpüls ausgeführt wird und die dadurch erhaltenen, unterschiedlichen Amplitudenwerte der durch die Fourier-Analyse gewonnenen Resonanzlinien als Augenblickswerte eines zweiten Interferogrammes gespeichert und eine weiteren Fourier-Analyse unterworfen werden, und bei dem endlich entweder bei jeder Wiederholung der Messung Z einer anderen"Entwick.ungsze.t „ gleichzeitig der zeitliche Abstand *^«?«*Τ%«$

w, dem dritten 90°-Impuls, die Mischzeit /„, oder aber zwischen dem zweiten und dem dritten 90 -Impuls ein 180 Impuls erzeugt und bei jeder Wiederholung der Messung mit einer anderen Entwicklungszelt /, gleichzeitig der Sehe Abstand ,, des lSOMmpulses von dem zweiten 90°-Impuls um kleine Beträge variiert wird welche einen durch die Periode der Frequenzverschiebungen von Resonanzlinlen, die durch skalare oder kohärente Kopplungen bedingt sind, definierten Bereich abdecken.

„ Solche Verfahren sind aus Journal of Magnetic Resonance. Vol. 43, 1981, Nr. 2, Selten 259 bis 281, bekannt Bei den bekannten Verfahren erfolgt die Variation der Mischzeit ;,„ bzw. des zeitlichen Abstandes I₁, nach Zulallswerten um eine statistische Ausmlttlung zu erhalten. Diese Variation nach Zufallswerten bewirkt cm Versehmieren tier Intensitäten der J-Kreuzlinien in Richtung einer der beiden Frequenzachsen des zwcldlmen-

sionalen Frequenzbereiches sowie auch das Entstehen von niedrigen Wellen oder Rippen, welche Austauschlinien geringer Intensität verdecken können.

l)cr Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die bekannten Verfahren zur Aufnahme von 2D-Spektren derart weiterzubilden daß eine Ellmlnlerung der J-Kreuzlinien erreicht wird, ohne daß irgendwelche Wirkungen eintreten, durch die das Spektrum verfälscht und Insbesondere Austauschlinien geringer Intensität verdeckt

wiese Aufgabe wird nach der Erfindung dadurch gelöst, daß im ersten Fall die Mischzeit t_m ausgehend von einem Anfangswert u. proportional zur Entwicklungszeit /, gemäß der Beziehung t„ - U + *'> geändert wird, wobei y einen Proportionalitätsfaktor darstellt, der derart gewählt wird, daß bei der vorgesehenen Anzahl von π Messüigen die Tffenüber U kleine ze-tliche Variation der Mischzelt t„ - _U In der Größenordnung der ,0 Periode · "n durch skalare oder kohärente Koppiung bedingten Frequenzverschiebungen 1st, und das so erhaltene 2D-Spektrum einer Dreieckmultiplikation oder Symmetrierung unterworfen wird, bei der alle Linien eliminiert werden die zur Hauptdiagonale des 2D-Spektrums nicht spiegelsymmetrisch sind.

Bei dem anderer* der beiden oben erwähnten Verfahren wird zur Lösung der Aufgabe in analoger Weise der zeitliche Abstand r„ ausgehend von einem Anfangswert ^ proportional zur Entwicklungszeit /, gemäß der i» Re7 tehuiwf = / + XU geändert wobei χ einen Proportionalitätsfaktor darstellt, der derart gewählt wird, daß bei der vorgesehenen Anzahl von η Messungen die gegenüber I_n, kleine zeitliche Variation der Positionszeit /,„ - fc, in der Größenordnung der Periode von durch skalare oder kohärente Kopplung bedingten Frequenzverschlebuneen ist und das so erhaltene 2D-Spektrum einer Dreieckmultiplikation oder Symmetrierung unterworfen wird, bei der'alle Linien eliminiert werden, dir zur Hauptdiagonale des 2D-Spektrums nicht spiegelsymmetrisch sind.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird durch die proportionale Änderung von t_m bzw. t„ lediglich ein Verschieben der J-Kreuzltnlen bewirkt, während Ihre Schärfe im Gegensatz zum Stand der Technik erhalten bleibt. Daher können die J-Kreuzlinlen durch Symmetrieren leicht eliminiert werden. Auf diese Welse wird eine bedeutende Verbesserung der Qualität der aufgenommenen Spektren erzielt.

Bei beiden Formen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden also aus dem zweldimensionalen Kernresonanzspektrum Doppelllnlen eliminiert, die auf eine skalare oder kohärente Kopplung zurückzuführen sind, so daß nicht-kohärente Austauschvorgänge und insbesondere der Overhausereffekt (NOE) störungsfrei beobachtet werden können Die zu diesem Zweck verwendete Dreieckmultiplikation ist aus Journal of Magnetic Resonance, VoI 44 1981 Selten 76 bis 83 und 402 bis 406 bekannt. Die ebenfalls verwendbare Symmetrierung Ist in J Chem Phy's., Vol. 71, 1979, Nr. 11, S. 4404 bis 4415 behandelt.

' Das erfindungsgemäße Verfahren läßt sich mit allen Kemresonanzspektrometern durchführen, die einen Generator zur Erzeugung von drei bzw. vier aufeinanderfolgenden HF-Impulsen mit einstellbaren zeitlichen Abständen aufweisen. Ein solches Spektrometer Ist beispielsweise im Bruker-Report, 1980, Nr. 2, S. 10 bis 13,

Gegenstand der Erfindung ist jedoch auch eine für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens besonders vorteilhafte Ausbildung eines solchen Kernresonanzspektrometers, die darin besteht, daß es zur Einstellung eines sich proportional zu dem zeltlichen Abstand t, zwischen dem ersten und dem zweiten Impuls ändernden zeltlichen Abstandes i_m oder t„ zwischen dem zweiten und dem dritten Impuls durch Wahl eines ersten zeitlichen Abstandes /,, eines Anfangswertes U oder t^ des zeitlichen Abstandes zwischen dem zweiten und dem dritten Impuls und eines Proportionalitätsfaktors χ eingerichtet ist, derart, daß I_n, = f_m0 + χι, oder /„ =

^DIe Erfindung wird Im folgenden anhand der In der Zeichnung dargestellten Diagramme näher beschrieben

und erläutert. Es zeigt
FI g. 1 das Zeitdiagramm der bei der ersten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens angewendeten

Impulsfolge, .

Fig. 2 das Zeltdiagramm der durch die Anregung eines Spinsystems erhaltenen Signale, und zwar lür ein System mit einer Null- und einer Doppel-Quantenkohärenz,

Flg. 3 ein zweldlmenslonales Austauschspektrum einer l:l-Mischung von 1,1,2-Trlchlorethan und N,N-Dimethylacetamid bei 297 K und einer Variation der Mischzelt i_m von 100 bis 132 ms,

FI g. 4 das gleiche Spektrum wie FI g. 3, jedoch nach der Symmetrierung,

Flg. 5 einen Querschnitt durch das Spektrum nach Fig. 3,

FIg 6 einen Querschnitt durch das Spektrum nach Fig. 4,

Flg. 7 ein NOE-Spektrum des basischen pankreatlschen Trypsln-Inhlbltors (BPTI) unter Verwendung einer festen Mischzelt t_m = 30 ms nach dem Stand der Technik,

Flg. 8 ein Spektrum des gleichen BPTI bei Variation der Mischzelt von 30 ms bis 37,8 ms nach der Erfin-

Fig. 9 zwei- und dreidimensionale Darstellungen des Ausschnittes A des Spektrums nach Fig. 7,
Fig. 10 zwei- und dreidimensionale Darstellungen des entsprechenden Ausschnittes des A' des Spektrums

nach Flg. 8 und
Flg. U das Zeltdiagramm der bei der zweiten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens angewendeten ω

Impulsfolge.

Die grundlegenden Vorgänge bei der 2D-Austauschspektroskopie sind In den Fig. 1 und 2 veranschaulicht. Wie Fig. 1 zeigt, wird zunächst ein 90°-Impu!s angelegt, um eine Quermagnetisierung zu erzeugen. Die Entwicklungszelt t, dient dazu, den verschiedenen Magnetisierungs-Komponenten In Form ihrer Larmor-Präzessionsfrequenzen ein »Frequenz-Etikett« aufzuprägen. Wie ber>annt, wird bei der 2D-Spektroskople die Entwicklungszelt /ι von Messung zu Messung bis zum Abschluß des vollständigen 2D-Experlmentes erhöht. Nach Ablauf der Entwicklungszelt r, verdreht ein zweiter 90°-Impuls die x-Komponente der Magnetisierung längs der r-Achse. wonach während der folgenden Mischzeit i„ der zu untersuchende, langsame Austauschprozeß stattfin-

den kann. Ein dritter 90°-Impuls erzeugt erneut eine Quermagnetisierung. Das Ergebnis des Austauschprozesses wird dann durch die Präzessionsfrequenzen der Komponenten der Magnetisierung während der Detektlonszclt I, festgestellt. Eine zweidimensional Fourier-Transformation des erhaltenen Signals s (r,, r₂) führt endlich zu dem gewünschten 2D-Austausch- oder NOE-Spektrum mit den Frequenzachsen ω, und coj. Die Intensitäten a_AB und a_8A der Austausch-Kreuzllnien für ein System mit zwei austauschenden Kernen steigen mit der Magnetlslerungs-Austauschrate R₁- bis zu einem Gleichgewicht an, wenn die Mischzelt zunimmt, wahrend gleichzeitig die Leckrate R_L die Intensität der Kreuzlinien vermindert. Diese Vorgänge lassen sich beschreiben durch

Um) = asA (im)

— [\-ecp(-R_ct_m)\ exp(-R_Lt_m)

(I)

Bei der vorstehenden Beschreibung wurden die Komponenten der Quermagnetisierung vernachlässigt, die nach dem zweiten 90°-Impuls verbleiben. Außerdem 1st es bekannt, daß In gekoppelten Spinsystemen zwei Im zeitlichen Abstand t, aufeinanderfolgende 90°-Impulse auch eine Null-, Doppel- und Mehrfach-Quantenkohärenz erzeugen. Diese Kohärenz-Komponenten entwickeln sich während der Mischzelt f_m, wie es In Flg. 2 schcmaüsch angedeutet ist. Die dritten. 90°-!mpu!se transformieren diese Komponenten teilweise In eine beobachtbare Quermagnetisierung. Diese zusätzlichen Wege einer Kohärenz-Übertragung sind für das Auftreten von sogenannten J-Kreuzlinlen Im 2D-Austauschspektrum verantwortlich. Daher können Kreuzllnlen gleichzeitig Anteile eines Inkohärenten Magnetisierungstransfers über einen willkürlichen Austauschprozeß sowie Anteile eines Kohärenztransfers über ein J-Kopplungsnetzwerk enthalten.

Zur Vereinfachung der Interpretation Ist die Unterdrückung von J-Kreuzllnlen Im 2D-Austauschspektrum erwünscht. Das erfindungsgemäße Verfahren zur Unterdrückung dieser J-Kreuzllnlen beruht auf der charakteristischen Abhängigkeit der kohärenten und inkohärenten Transferprozesse von der Dauer der Mischzelt. Während der Inkohärente Austausch nach Gl. (1) ein langsam variierender Vorgang Ist, zeigt der Kohärenz-Transfer eine oszillierende Abhängigkeit von der Mischzelt.

Nach der Erfindung wird die Mischzelt t_m parallel zur Entwicklungszelt ι, nach folgender Beziehung geändert:

'„ = '»,o + Xh ⁽²⁾

Die maximale Erhöhung der Mischzelt wird ausreichend klein gewählt, um eine nennenswerte Störung des Inkohärenten Austausches zu vermeiden. Das erfindungsgemäße Verfahren rührt zu einer Verschiebung aller J-Kreuzlinien von Ihren ursprünglichen Positionen längs der ci^-Richtung. Diese Verschiebung zerstört die den J-Kreuzllnlen-Mustern eigene Symmetrie. Die längs der ω,-Rlchtung verschobenen Kreuzllnlen weisen keine Gegenstücke In der spiegelsymmetrischen Stellung in bezug auf die Hauptdiagonale des 2D-Spektrums auf. Daher können sie durch eine Dreieck-Multiplikation oder Symmetrierung eliminiert werden, die nur In symmetrischen Paaren vorliegende Linien bestehen läßt.

Zur weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens sei eine Magnetisierungskomponente betrachtet, die ursprünglich zu einem Übergang α gehörte und vor dem Austausch die Präzessionsfrequenz ω_α besaß. Es sei angenommen, daß der Mischvorgang diese Magnetisierungskomponente in Kohärenz mit einem anderen Übcrgang b mit der Frequenz w_b bringt. Der Weg während des Mischens kann über alle möglichen Übergänge k mit den Präzessionsfrequenzen w_k führen, einschließlich einer Null-, Einzel- und Mehrfach-Quantenkohären? (F I g. 2). Diese Prozesse führen dann zur beobachtbaren Magnetisierungs-Komponente

t„, h) = Ai₀,, exp {-iu)„ ti -

exp {-/&>**„ -

· exp \-iu>_b h - hlT_u)\ (3)

In dieser Gleichung sind R_ka und R_bk Matrixelemente des Rotations-Operators, welcher den kohärenten Austausch vom Übergang α zum Übergang k und vom Übergang k zum Übergang b darstellt, der von den HF-Impulsen ausgelöst wird. Die Summierung über k führt über alle erlaubten und verbotenen Übergänge, einschließlich Übergängen, die sich lediglich durch ihr Vorzeichen unterscheiden.

Wird die Mischzelt i_m proportional zu t, erhöht, wie In Gl. (2) angegeben, erhält man

Uu fmo + xtu ti) = M_0o ^Rtk Rh, exp H(w_e + xw_k) fi - »i (\/T_2a + \-iu)_k t^lTn} exp {-ic*_b ti - hlT_u}

Die zweidimensional Fourier-Transformation für eine feste Mischzeit t_m würde zu einzelnen Kreuzlinien bei cüi = ω_α und ω₂ = ω₆ führen. Bei einer Erhöhung von t_m wird jedoch eine eindimensionale Liniengruppe bei <», = ω_αΛ-y.oj_k und ω₂ = w_h erzeugt,die in der ω,-Richtung eine Linienbreite l/7*_2o + 1/Γ_Μaufweist. Es Ist wesentlich zu beachten, daß alle unerwünschten Übertragungswege mit Schwingungsverhalten (iu_k Φ O) zu verschobenen Kreuzlinien führen, und In der Stellung ω, = ω_α und ω₂ = ω_Α ausschließlich Kreuzllnlen mit zufälligen Austausch-Intensitäten verbleiben. Das Ausmaß der Verschiebung der J-Kreuzlinien kann durch die Wahl des Parameters χ bestimmt werden.

Der inkohärente Magnetisierungs-Transfer wird durch die schrittweise Erhöhung der Mischzelt nicht nennenswert beeinflußt, solange der die schrittweise Erhöhung bestimmende Parameter χ und die Gesamtvariation der Mischzeit i,„ ausreichend klein gehalten werden.

Zur weiteren Erläuterung der Erfindung werden anschließend experimentelle Daten wiedergegeben, die mil

Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens an zwei Systemen erhalten wurden, von denen das erste aus kleinen und das zweite aus sehr großen Molekülen besteht.

Austauschspektren einer Mischung von 1,1,2-Trlchlorethan und N.N-Dlmethylaceiamld

Um die Bedeutung des kohärenten und inkohärenten Magnetisierungs-Transfers zu veranschaulichen, wurde eine Mischung von 1,1,2-Trichlorethan (TCE) und N.N-Dimethylacciamid (DMA) gewählt. Das Protonen-Resoruin/spektrum von TCE besteht aus einem J-gekoppelten AX₂-Spinsystem, das zu einem kohärenten Transfer führt. Andererseits hat der chemische Austausch, der auf eine verhinderte Rotation im DMA zurückzuführen ist, einen inkohärenten Magnetlslerungs-Trarssfer zur Folge. Fig. 3 zeigt ein unter Variation der Mischzelt I_n, w aufgenommenes 2D-Spektrum in Form eines Konturendlagrammes der Absolutwerte einer Mischung gleicher Anteile von TCE und DMA. Die sechs Linien des eindimensionalen Spektrums, welche für die chemischen Verschiebungen von TCE, für das Lösungsmittel und für DMA charakteristisch sind, sind längs der Hauptdiagonalen w\ = wi dargestellt. Die Multiplett-Struktur der TCE-Linlen Ist wegen der begrenzten digitalen Auflösung nicht erkennbar. Die beiden Kreuzlinien 1 und 2 zwischen den beiden N-Methyl-Llnien 3 und 4 des is DMA veranschaulichen den Austausch zwischen den Methylgruppen, der durch eine Interne Rotation bedingt ist. Die Austausch-Kreuzllnlen sind in dem vergrößerten Ausschnitt besser erkennbar. Die beiden J-Kreuzlinien bei (ω, = il_A, Wi = H_x) und (ω, = Ω*, W₁ = Ώ._Α), die für das AX₂-Spinnsystem des TCE zu erwarten wären, erscheinen aufgelöst In Ihre Mehrfach-Quantenkomponenten, die längs der Linien w₂ = i1_A und w₂ = H_x verteilt sind. Es sind längs beider Linien vier Paare J-Kreuzllnlen erkennbar, die in der cui-Rlchtung symmetrisch posi-Uv und negativ um die entsprechenden, mit dem Faktor χ skalierten Mehrfachquanten-Präzessionsfrequenzen verschoben sind. Die vier Paare J-Kreuzlinien gehören zu zwei Eln-Quanten-Übergängen \QT_A und 107V einem Null-Quanten-Übergang ZQT und zu einem Zwel-Quanten-Übergang 2QT. Das Mehrfach-Quantenmuster der in Fig. 3 links unten gelegenen J-Kreuzlinle ist durch Signalfaltung bei der Frequenz ω, = 0 gestört. Die beiden Diagonallinien von TCE, die durch J-Kopplungen verknüpft sind, sind ebenfalls in ihre Mehrfach-Quantenkomponenten aufgeteilt, analog zu den J-Kreuzllnien. Axiallinien erscheinen längs der co₂-Achse (ω. = 0), und zwar infolge einer teilweisen Erholung der Longitudlnalmagnetislerung während der Mischzeit. Linien, die auf der $5

Geraden ω, = χω₂ liegen, stammen von einer Longltudinal-Magnetlslerung, die während der Entwicklungszeit %

aufgebaut wurde. Diese Magnetisierung wird durch den zweiten 90°-Impuls In die Querebene gedreht und ^

entwickelt sich nur während der Mischzeit. Daher ist ihre ω,-Frequenz mit dem Faktor χ behaftet. Zwei Grup- 3« |

pen von Linien, die sich auf den Geraden Wi = (I+χ) ω₂ und ω, = (\-χ) ω₂ befinden, gehören zu einer a

sowohl während der Entwicklungszeit als auch der Mischzelt transversalen Magnetisierung. Die beiden erreich- Λ

ten Präzessionswinkel ω,/, und wah können infolge der Wirkung des zweiten 90°-!mpulses additiv oder §

subtraktiv sein. !■

Fig. 4 zeigt das Spektrum der Flg. 3 nach einer Symmetrierung. Alle Linien, die In bezug auf die Haupt- 35 A

diagonale unsymmetrisch sind, wurden eliminiert. Daher bleiben nur Diagonallinien und Austausch-Kreuzlinien >

übrig. Dies geht auch klar aus den Flg. 5 und 6 hervor, die Querschnitte parallel zu ω, für ω₂ = il_A durch die )

Diagramme nach den Fig. 3 und 4 zeigen. Es ist wichtig festzustellen, daß bei der Frequenz H_x im Ω,,-Quer- ■

schnitt (und entsprechend auch bei der Frequenz Ω,, im Ω^-Querschnitt) bei Anwendung des erfindungs- ί,

gemäßen Verfahrens keine Linie existiert. Die In den Fig. 5 und Fig. 6 dargestellten Querschnitte zeigen die <m ||

Wirksamkeit der Methode zur Unterdrückung von J-Kreuzlinlen eindrücklich. |f

NOE-Spektrum für einen basischen, pankreatischen Trypsln-Inhibltor (BPTI) i|

Die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Untersuchung biologischer Makromoleküle sollen 45 §|

anhand der Spektren von BPTI veranschaulicht werden, dessen J-Kopplungs- und Kreuz-Relaxations-Netzwerte

recht gut verstanden werden. Die Fig. 7 und 8 zeigen ein mit fester Mischzelt bzw. mit schrittweise erhöhter ||

Mischzelt aufgenommenes NOE-Spektrum. Beide Spektren wurden symmetrisiert. Die folgende Diskussion konzentriert sich auf die Unterschiede zwischen den Spektren nach den Fig. 7 und 8 in den Bereichen A bzw. A', die mehr im einzelnen In den Flg. 9 und 10 wiedergegeben sind.

Fünf der J-Kreuzllnien, die Im Bereich A des Spektrums nach Fig. 7 erscheinen, werden durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens eliminiert, wie es der Abschnitt A' In Flg. 8 deutlich zeigt. Eine genauere Untersuchung der gleichen Bereiche zeigt jedoch, daß nach der Eiiminierung der J-Kreuzlinien damit koinzidente NOE-Kreuzllnlen sichtbar werden. Die Möglichkeit, zusammenfallende J- und NOE-Kreuzllnlen zu trennen, ist für die quantitative Interpretation der NOE-Daten von Proteinen sehr wichtig, da in Spektren, die mit sehr kurzen Mischzelten aufgenommen werden, NOE-Kreuzlinien, die zu Protonen des gleichen Aminosäurerestes gehören, durch damit zusammenfallende J-Kreuzllnien überdeckt sein können. Beispielswelse 1st die Kreuzlinie zwischen CH und NH des Restes F33 (Fig. 9) eine typische J-Kreuzllnie, die die damit zusammenfallende NOE-Kreuzlinle überdeckt. Nachdem jedoch durch Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens die J-Kreuzllnie eliminiert wurde, wird die NOE-Kreuzllnle sichtbar und quantitativ meßbar (Fig. 10). Andererseits ω werden reine NOE-Kreuzllnlen, wie diejenige zwischen CH von T 32 und NH von F 33 durch die schrittweise Erhöhung von i_m nicht berührt. Ein gleiches Verhalten wurde für die Bindungen aller fünf Amid-Protonresonanzen beobachtet, die in den Fig. 9 und 10 bezeichnet sind, nämlich für die NH-Gruppen von F 45, F22, F 33, Y 21 und Q 31. Jedes dieser Amid-Protonen gibt Veranlassung zu zwei Kreuzlinien in dem in den Flg. 9 und 10 wiedergegebenen Spektralbereich. In jedem Fall hat die reine NOE-Kreuzllnie mit dem «-Proton des M vorhergehenden Restes In der Aminosäurenfolge im wesentlichen die gleiche Intensität in den Spektren nach den Flg. 9 und 10. Im Gegensatz dazu wurde als Konsequenz der Erhöhung der Mischzeit die Intensität der Kreuzlinie mit dem benachbarten α-Proton des gleichen Restes In Flg. 10 reduziert, so daß die restliche Intensi-

tat vollkommen auf den Inkohärenten NOE-Austausch zurückzuführen Ist.

Die in der Zeichnung wiedergegebenen Spektren wurden unter Verwendung eines Kernresonanz-Spekirometers der Firma Bruker-Anaiytlk GmbH vom Typ CXP 300 aufgenommen.

Dieses Spektrometer erlaubt die Erzeugung von 90°-Impulsfolgen, bei denen die Impulsabstände unabhängig voneinander einstellbar bzw. programmierbar sind. Speziell zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann ein solches Spektrometer in der Welse ausgebildet werden, daß anstatt der Eingabe der Zeltpaare Ί, i„ als Variable nur die Zeiten t, eingegeben zu werden brauchen, während die Anfangs-MIschzelt t^ und der Proportionalitätsfaktor χ fest eingestellt bzw. bei programmiertem Ablauf des Meßvorganges eingegeben werden können, so daß das Spektrometer den zweiten Impulsabstand t_m = t_m0 + χΐ\ selbstständig bildet. Wie bereits aus i" dem Vorstehenden hervorgeht, ist unter »Einstellen« auch das Eingeben eines entsprechenden Befehls In die Steuereinrichtung eines solchen Spektrometer zu verstehen.

Anstatt, wie vorstehend beschrieben, bei jeder Wiederholung des Experimentes den zeitlichen Abstand zwischen zweitem und drittem 90°-Impuls (Mischzelt t_m) proportional zur Entwicklungszelt I_x zu ändern. Ist es mit gleicher Wirkung möglich, innerhalb der Mischperiode einen zusätzlichen 180° !mpuls zu erzeugen, dessen i> Position t_p proportional zur Entwicklungszelt t\ lnkrementiert wird (r„ = t^ + χΐιΐ, wie es In Flg. 11 dargestellt Ist. Dabei muß die gesamte Mischzeit /„ konstant gehalten werden. Die Position des 180°-Impulses beeinflußt ausschließlich die Präzession der zu den J-Kreuzllnlen führenden Magnetisierung, während der inkohärenten Magnetisierungsaustausch, dessen Messung das Ziel des Experimentes ist, unbeeinflußt bleibt.

Der zeitlich verschobene 180°-Impuls hat den gleichen Verschiebungs-Effekt auf die J-Kreuzllnlen wie die 2» Inkrementlerung der Mischzelt t_m, so daß die J-Kreuzllnlen durch die Dreieckmultlpllkatlon oder Symmetrierung wieder eliminiert werden. Der 180°-Impuls beeinflußt jedoch den inkohärenten Austausch nicht im mindesten, so daß diese Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens In kritischen Situationen für das Erzielen höchster Präzision zu bevorzugen Ist.

Hierzu 8 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

1. Patentansprüche:

   1 Verfahren zur Aufnahme von Kernresonanzspektren von Molekülen In einerr zweldlmensionalen Freouenzbereich 2D-Spektren, bei dem das zu untersuchende Kernspinsystem mit drei in zeltlichem Abstand

   aufeinanderfolgenden 90°-Impulsen angeregt und das nach dem dritten 90°-Impuls erhaiiene Interferogramm einer Fourieranalyse unterworfen wird, bei dem weiterhin eine Vielzahl solcher Messungen mit unterschiedlichen zeitlichen Abständen, der Entwicklungszeit r„ zwischen dem ersten und dem zweiten 90 -Impuls ausgeführt wird und die dadurch erhaltenen, unterschiedlichen Amplitudenwerte der durch die Fourier-Analyse gewonnenen Resonanzlinien als Augenblickswerte eines zweiten Interferogrammes gespel-

   Seit und einer weiteren Fourier-Analyse unterworfen werden, und bei dem endlich bei jeder Wiederholung der Messung mit einer anderen Entwicklungszelt /, gleichzeitig der zeitliche Abstand zwischen dem zweiten und dern dritten 90Mmpuls, die Mischzelt ,„, um kleine Beträge variiert wird, welche einen durch die Periode der Frequenzverschiebungen von Resonanzlinlen, die durch skalare oder kohärente Kopplungen beZt sind dSEten Bereich abdecken, dadurch gekennzeichnet, daß die Mischzelt t_m ausgehend

   von einem Anfangswert I_-0 proportional zur Entwicklungszelt /, gemäß der Beziehung Xt_n, = U + Xh «ändert wird wöSl / e.rTen Proportionalitätsfaktor darstellt, der derart gewählt wird, daß bei der vorgesehenen Anzahl von «Messungen die gegenüber u kleine zeltliche Variation der Mischzelt t_m„ - ^ in der Größenordnung der Perlode von durch skalare oder kohärente Kopplung bedingten Frequenzverschiebungen tound das so erhaltene 2D-Spektrum einer Dreleckmultlpllkatlon oder Symmetrierung unterworfen wird bei

   2» der alle Linien eliminiert werden, die zur Hauptdiagonale des 2D-Spektrums nicht spiegelsymmetrisch sind
2. 2 Verfahren zur Aufnahme von Kernresonanzspektren von Molekülen in einem zweidimensional« Frpmienzbereich 2D-Spektren, bei dem das zu untersuchende Kernspinsystem mit drei In zeitlichem Absland aufeinanderfolgenden 90Mmpulsen angeregt und das nach dem dritten OT-Impuls erhaltene Interferogramm e"ne FourTei-Analyse unterworfen wird, bei dem weiterhin eine Vielzahl solcher Messungen mit unterschied-

   's liehen zeitlichen Abständen, der Entwicklungszeit /,, zwischen dem ersten und dem zweiten 90-Impuls ausgeführt wird und die dadurch erhaltenen, unterschiedhchen Amplitudenwerte der durch die Fourler-Analvse gewonnenen Resonanzlinien als Augenblickswerte eines zweiten Interferogrammes gespeichert und einer weiteren Fourieranalyse unterworfen werden, und bei dem endlich zwischen dem zweiten und dem dritten 90Mmpuls ein lSOMmpuls erzeugt und bei jeder Wiederholung der Messung mit einer anderen

   v, Entwicklungszeit /, gleichzeitig der zeitliche Abstand t, des 180°-Impulses von dem zweiten 90Mmpuls um kleneBeträge variiert wird, welche einen durch die Periode der Frequenzverschiebungen von Roonanzllnlen die durch skalare oder kohärente Kopplungen bedingt sind, definierten Bereich abdecken, dadurch eekennzelchnet daß der zeitliche Abstand /„ ausgehend von einem Anfangswert _Γ/Λ proportional zur Entwlckfungszelt „ gemäß der Beziehung /, = f„ ₊ Xh geändert wird, wobei χ einen Proport.onalltätsfaktor darstellt.

   !5 der derart Bewählt wird daß bei der vorgesehenen Anzahl von η Messungen die gegenüber t_m kleine zeitliche Variation der Positionszelt ,„ - t# in der Größenordnung der Perlode von durch skalare oder kohärente Koplng bedingten Frequenzverschiebungen ist, und das so erhaltene 2D-Spektrum einer Dreleckmulllpllkatlon öder Symmetrierung unterworfen wird, bei der alle Linien eliminiert werden, die zur Hauptdiagonale des

   ^r^ÄiSTSnSÄnrun. des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2 das einen Generator zur Erwägung von drei oder vier aufeinanderfolgenden HF-Impulsen mit einstellbaren zeitlichen Abstanden aufweist dadurch gekennzeichnet, daß es zur Einstellung eines sich proportional zu dem zeltichen Abst nd „ zwischen dem ersten und dem zweiten Impuls ändernden zeitlichen Abstande, , oder , zwischen dem zweiten und dem dritten Impuls durch Wahl eines ersten zeitlichen Abstandes /, c ncs AnSgswerTs /,„„ oder _lp0 des zeltlichen Abstandes zwischen dem zweiten und dem dritten Impuls und eines Proportlonalitätsfaktors χ eingerichtet Ist, derart, daß i_m = r_m0 + Xh oder f, = V> + xU-