DE3133020A1

DE3133020A1 - Verfahren zum zuechten anaerober bakterien

Info

Publication number: DE3133020A1
Application number: DE19813133020
Authority: DE
Inventors: Toshio Komatsu; Takanari Nawata; Hideyuki Tokyo Takahashi
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1980-08-20
Filing date: 1981-08-20
Publication date: 1982-03-18
Also published as: JPS5739776A; GB2083496B; GB2083496A; DE3133020C2

Description

Henkel, Kern, Feiler & Hänzel Patentanwälte

Registered Representatives

before the

European Patent Office

MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC. TOKIO, JAPAN

Möhlstraße 37 D-8000 München 80

Te!.: 089/982085-87 Telex: 0529802 hnkl d Telegramme: ellipsoid

FP/M-14-218 Dr.F/sm

20. Auqust 1981

VERFAHREN ZUM ZÜCHTEN ANAEROBER BAKTERIEN

BESCHREIBUNG

VERFAHREN ZUM ZÜCHTEN ANAEROBER BAKTERIEN

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten anaerober Bakterien.

Die Züchtung anaerober Bakterien gewinnt immer mehr an Bedeutung, weswegen ein steigender Bedarf nach geeigneten Züchtungsverfahren für anaerobe Bakterien gegeben ist. Die Züchtung anaerober Bakterien erfordert jedoch spezielle Vorrichtungen oder Instrumente und darüber hinaus heikle Verfahrensmaßnahmen.

Zum Züchten anaerober Bakterien gibt es bereits (1) das sog. Abdeckverfahren (overlay method) und (2) das sog. Tiefrohrverfahren (deep tube method). Ferner ist es zu diesem Zweck bekannt, (3) die Luft durch ein Inertgas, beispielsweise N„ + CO₂, zu ersetzen, (4) Sauerstoff chemisch zu absorbieren, (5) zu dem Kulturmedium ein Reduktionsmittel und dgl. zuzusetzen und (6) die Züchtung auf biologischem Wege durchzuführen.

Bei sämtlichen bekannten Verfahren bereitet die Erzeugung einer anaeroben Atmosphäre Schwierigkeiten.

Von den bekannten Verfahren bedient man sich am liebsten im Rahmen des Verfahrens (4) der sog. Gaspackmethode. Bei der Gaspackmethode wird auf chemischem Wege in der ein Kulturmedium umgebenden Atmosphäre Wasserstoff und Kohlendioxid erzeugt, worauf der Wasserstoff unter Verwendung eines metallischen Palladiumkatalysators mit dem Sauerstoff

3133D20

unter Bildung einer anaeroben Atmosphäre reagieren gelassen wird.

Nachteilig hieran ist jedoch:

(1) Nach der Reaktion mit dem Sauerstoff verbleibt in der - Atmosphäre des Mediums brennbarer Wasserstoff in hoher Konzentration (bis zu 10 %) , was gefährlich ist.

(2) Die Temperatur des Katalysators steigt bis über 100°C, was unerwünscht ist.

(3) Der Katalysator muß regeneriert werden und

(4) das Verfahren arbeitet unwirtschaftlich. 15

Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Züchten anaerober Bakterien mit Hilfe einer Verbindung oder eines Mittels mit Sauerstoffabsorptions- und Kohlendioxidbildungs- oder -freigabeeigenschaften zu schaffen.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zum Züchten anaerober Bakterien, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen gasundurchlässigen Verpackungsbeutel bzw. einen luftdichten Behälter mit (i) einem mit dem betreffenden anaeroben Bakterium beimpften Kulturmedium und (ii) einer in einem gasdurchlässigen Beutel abgepackten Material mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und dfer Fähigkeit zum Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid beschickt, den gasundurchlässigen Beutel bzw. luftdichten Behälter hermetisch versiegelt, in dem gasundurchlässigen Beutel bzw. luftdichten Behälter innerhalb von 10h soviel Sauerstoff absorbiert, daß dessen Konzentration unter 0,1 Volumenprozent sinkt, und gleichzeitig Kohlendioxid sich bilden läßt bzw. freisetzt und schließlich das Bakterium bei einer Kohlendioxidkonzentration von 5 bis 15, vorzugsweise 8 bis 12 Volumenprozent, und einer Sauerstoffkonzentration von unter 0,1 Volumenprozent wachsen läßt.

Unter einem "Sauerstoffabsorptionsmittel" ist eine Verbindung bzw. ein Mittel zu verstehen,.die bzw. das Sauerstoff absorbiert und kein Kohlendioxid bildet.

Erfindungsgemäß kann man ohne spezielle Vorrichtungen oder Katalysatoren anaerobe Bakterien züchten _r indem man einen Beutel oder Behälter einer Sauerstoffdurchlässigkeit von weniger als 100 ml/m²-24 h Atom mit einam Material mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid und einem mit dem zu züchtenden anaeroben Bakterium beimpften Kulturmedium beschickt. Im Rahmen des Verfahrens gemäß der Erfindung kommt es im allgemeinen nicht zu einer exothermen Freisetzung von Wärme. Selbst wenn eine Erwärmung stattfindet, ist diese nur gering. Darüber hinaus ist die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung einfach. Gegebenenfalls kann man einen Sauerstoffindikator mitverwenden, um feststellen zu können, ob sich eine anaerobe Atmosphäre gebildet hat oder nicht.

in der Regel soll die SauerStoffabsorptionsfähigkeit der Verbindung bzw. des Mittels mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid das 1- bis 20-fache der in dem gasundurchlässigen Beutel oder luftdichten Behälter, in dem das mit dem anaeroben Bakterium beimpfte Kulturmedium eingeschlossen ist, vorhandenen Sauerstoffmenge betragen. Das Verhältnis der Menge an gebildetem bzw. freigesetztem Kohlendioxid (a) zur Menge des durch die Verbindung bzw. das Mittel freigesetzten Sauerstoffs (b) sollte in dem gasundurchlässigen Beutel bzw. luftdichten Behälter zwischen 0,2 und 0,7, vorzugsweise zwischen 0,35 und 0,55 liegen.

Materialien mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid sind beispielsweise:

2.1 ein gasdurchlässiger Beutiil mit einer Verbindung oder einem Mittel mit Sauerstcrzfabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid;

2.2 ein gasdurchlässiger Beul al mit einer Verbindung oder einem Mittel mit Sauerste ffäbsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid in Kombination mit einem weiteren gasdurchlässigen Beutel mit einem Sauerstoffabsorptionsmittel

10 und

2.3 ein gasdurchlässiger Beutel mit einem Sauerstoffabsorptionsmittel in Kombinaticn mit einem weiteren gasdurchlässigen Beutel pit einem Kohlendioxidlieferanten.

Beispiele für Mittel m:^: t Sauerstof fäbsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid sind:
(i) Mischungen aus Eisen(II)-carbon it und einer alkalisch^ η

Substanz;
(ii) Mischungen aus Eisen (II)-carbonat., einer alkalischen

Substanz und einem Sauerstoffabsorptionsmittel; (iii) Mischungen aus Eisen(II)-carbonat und einem Sauerstoffabsorptionsmittel;

(iv) Mischungen aus einer organischen Substanz mit Sauerstof fabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung \on Kohlendioxid und einer alkalischen Substanz;

. (v) Mischungen aus einer organischen Substanz mit Sauerstof fäbsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung \on Kohlendioxid, mindestens einer alkalischen Subsianz und einem Sauerstoffabsorptionsmittel ;
35

(vi) Mischungen aus einer organischen Substanz mit Sauerstoff absorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid und einem Sauerstoffabsorptionsmittel;

(vii) Mischungen aus einem anderen Carbonat (als Eisen (H)-carbonat) oder einem Bicarbonat und einem Sauerstoffabsorptionsmittel und
(viii) Mischungen aus einem anderen Carbonat (als Eisen(II)-carbonat) oder einem Bicarbonat, einem Säuerstoffabsorptionsmittel und einer festen Säure.

Ferner können die Mischungen einen Elektrolyten enthalten. Von den genannten Mitteln eignen sich besonders gut die Mittel (i) , (ii), (v) und (vii). Bevorzugt werden folgende Mischungen:

(1) Mischungen aus Eisen(II)-carbonat und Calciumhydroxid;

(2) Mischungen aus Eisen(II)-carbonat, Calciumhydroxid, Eisenpulver und einem Elektrolyten;

(3) Mischungen aus einer organischen Verbindung, wie Ascorbinsäure, Erysorbinsäure oder deren Natrium- oder Kaliumsalze, Calciumhydroxid, Natriumcarbonat und/oder Natriumbicarbonat und Brenzkatechin und/oder Resorcin und/oder Hydrochinon;

(4) Mischungen aus Natriumcarbonat und/oder Natriumbicarbo-

nat, Brenzkatechin und/oder Resorcin und/oder Hydrochinon.

Beispiele für alkalische Substanzen sind Alkalimetallhydroxide, Alkalimetallbicarbonate, Alkalimetallcarbonate und Erdalkalimetallhydroxide.

Die Sauerstoffabsorptionsmittel enthalten als aktiven Bestandteil ein Reduktionsmittel, nämlich ein Sulfit, Hydrogensulfit, Thiosulfat, Dithionit, Oxalat, Hydrochinon, Brenzkatechin, Resorcin, Pyrogallol, Rongalit, Gallussäure, Glukose, Sorbose, Lignin, Dibutylhydroxytoluol, Butylhydroxyanisol, Eisenpulver oder andere Eisen(II)-salze als Eisen(II)-carbonat.

Ferner können die Sauerstoffabsorptionsmittel einen Elektrolyten enthalten. Bevorzugte Sauerstoffabsorptionsmittel sind solche, die als aktiven Bestandteil Eisenpulver, Brenzkatechin, Resorcin oder Hydrochinon enthalten.

Organische Substanzen mit Sauerstoffabsorptionsfahigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid sind beispielsweise Ascorbinsäure, Erysorbinsäure und deren Natrium- oder Kaliumsalze.

Andere Carbonate als Eisen(II)-carbonat und Bicarbonate, die Kohlendioxid bilden oder freisetzen und/oder als alkalische Substanz wirken, sind vorzugsweise Natrium- oder Kaliumcarbonat oder -hicarbonat.

Beispiele für feste Säuren sind Fumar-, Oxal-, Zitronen-, Bernstein-, Apfel-, Wein- und Borsäure.

Das erfindungsgemäß zu verwendende Eisen(II)-carbonat erhält man durch Umsetzung eines Eisen(II)-salzes, wie Eisen-(II)-sulfat, mit einem Carbonat, wie Natriumcarbonat. Das Eisen(II)-carbonat kann auch aus dem Naturprodukt Siderit bestehen. Als Eisen(II)-carbonat kann auch ein Gemisch aus einem gemahlenen Eisen (II)-salz und einem gemahlenen .Carbonat verwendet werden. In der Regel enthält Eisen-(II)-carbonat 5 bis 20 Gew.-% Wasser. Auch ein solches wasserhaltiges Eisen(II)-carbonat kann erfindungsgemäß eingesetzt werden.

Der Verbindung bzw. dem Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid können auch noch andere Zusätze, z. B. teilchenförmige Aktivkohle, Talkum, Titanoxid, Eisenoxidpulver, gefälltes Siliziumdioxid, Zeolith, Aluminiumoxid, feintei-

35 lige Füllstoffe und dgl., einverleibt werden.

-S-

Die Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und die Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid der Verbindung bzw. des Mittels können durch Mitverwendung eines der genannten Zusätze oder durch Ändern der Menge an dem jeweiligen Zusatz eingestellt werden.

Der Verbindung oder dem Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid kann auch Wasser zugesetzt werden. Auch ¹^ durch Ändern der zugesetzten Wassermenge lassen sich die Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und die Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid der betreffenden Verbindung bzw. des betreffenden Mittels einstellen. Bezogen auf das Gewicht der Verbindung bzw. des Mittels können weniger als 50 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 30 Gew.-%, Wasser zugesetzt werden. Wenn die Mischung eine feste Säure enthält, sollte zweckmäßigerweise kein Wasser zugesetzt werden.

Die folgende Tabelle I enthält Beispiele für erfindungsgemäß einsetzbare Verbindungen bzw. Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid.

ω
σι

co
ο

to
ο

0ϊ O Oi

Tabelle I . (Einheit: Gewichtsteile)

Nr.	FeCO₃	©Cot	L-Ascor- binsäure	Na₂S₂O₄	Fe	Ca(OH)₂	NaHCO₃	Na₂CO₃	Zitronen säure	CaCl-- ^2H2°	Aktivkoh lepulver	H₂O
1	10					0,3						(1.3) *
2	8	1				0,3						(1) *
. 3	8				6	0,1				0,2		(D *
4	8				10					0,35		(1) *
5	8	2						2				(D *
6			6				6	3			6	5
7			6			0,1	6				6	5
8		2	4			0,1	4	2			6	5
9			4		6		4	2		0,2	6	5
10					20		1		3,5	3,5		0
11				5		3	3				4	1
12				5			4				2	0,5

* Wasserrnenge in FeCC₁

Erfindungsgemäß wird eine Verbindung oder ein Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid in einen Beutel aus einem Verpackungsmaterial, der teilweise oder vollständig aus einem gasdurchlässigen Film oder einer gasdurchlässigen Folie besteht, eingefüllt. In der Regel besitzt der gasdurchlässige Film bzw. die gasdurchlässige Folie eine Luftdurchlässigkeit nach Gurley (bestimmt nach der japanischen Industriestandard-Vorschrift P 8117: Zylindergewicht: 570 g) von weniger als 1000 s/100 ml Luft, vorzugsweise von weniger als 100 s/100 ml Luft. Beispiele für gasdurchlässige Filme oder Folien sind perforierte, mit Kunststoffilmen kaschierte Papiere, mikroporöse Filme oder Verbundgebilde aus mikroporösen Filmen und gasdurchlässigen Filmen oder Folien, Das gasdurchlässige Material braucht lediglich, einen Teil des gasdurchlässigen Beutels zu bilden. In anderen Worten gesagt, kann eine Seite des gasdurchlässigen Beutels aus einem gasdurchlässigen Material bestehen, während die andere Seite aus einem gasundurchlässigen Material gebildet

20 ist.

Erfindungsgemäß wird ein gasdurchlässiger Beutel mit einer Verbindung, einem Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid zusammen mit einer mit dem zu züchtenden anaeroben Bakterium beimpften Kultur in einem gasundurchlässigen Beutel bzw. luftdichten Behälter untergebracht (Einpackverfahren) .

Wenn eine Verbindung mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und eine Verbindung mit der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid in einem Beutel untergebracht werden, besteht die Gefahr, daß unter bestimmten Bedingungen die Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und/oder die Fähigkeit .

^^ zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid beeinträchtigt

wird (werden). Um diesem Nachteil zu begegnen, können die das Mittel bildenden Bestandteile in zwei oder mehr gasdurchlässigen Beuteln untergebracht werden. In diesem Falle werden dann die zwei oder mehr Beutel mit den das Mittel bildenden Bestandteilen getrennt zusammen ir.it dem Medium in einem gasundurchlässligen Beutel oder luftdichten Behälter untergebracht (Doppelpackverfahren).

Beim Doppelpackverfahron weiden als Verbindungen oder Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid vorzugsweise Eisen(II)-carbonat, Mischungen aus Eisen(II)-carbönat und Calciumhydroxid, Mischungen aus Ascorbinsäure oder Erysorbinsäure einer alkalischen Substanz und einem Alkalimetallsalz der Ascorbinsäure oder Erysorbinsäure verwendet.

Als Sauerstoffabsorptionsmittel können beim Doppelpackverfähren dieselben wie bein· Einpackverfahren verwendet werden*

Beim Doppelpackverfahren veiwendbare Kohlendioxidlieferanten sind beispielsweise Carbonate, Bicarbonate und Mischungen aus Carbonaten oder Bicarbonaten mit festen Säuren. Bevorzugt werden Natriumcarbonat oder -bicarbonat und Kaliumcarbonat oder -bicarbonat.

Dem Sauerstoffabsorptionsmittel bzw. dem Kohlendioxidlieferanten können auch Verbindungen oder Mittel mit Sauer- ^ stoffstoffabsorptionsfähigkoit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid zugesetzt werden.

Die Sauerstoffabsorptionsfähigkeit des Sauerstoffabsorptionsmittels und die Fähigk-it zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid des Kohlendioxidlieferanten können durch Mitverwendung der genannten Zusätze oder Ändern der Menge

30

• · V

an den verwendeten Zusätzen eingestellt werden.

10

Dem Sauerstoffabsorptionsmittel oder dem Kohlendioxid^ lieferanten kann auch Wasser zugesetzt werden. Auch durch den Wasserzusatz lassen sich die Sauerstoffabsorptionsfähigkeit bzw. die Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid der Verbindung bzw. des Mittels einstellen. Bezogen auf.das Gewicht der Verbindung bzw. des Mittels kann Wasser in einer Menge von weniger-als 50, vorzugsweise weniger als 30 Gew.-%, zugesetzt werden.

15 20 25

Beispiele für verwendbare Sauerstoffabsorptionsmittel finden sich in der folgenden Tabelle II.

Tabelle II (Einheit: Gewichtsteile)

Nr.	Fe	2	Na₂S₂O₄	FeSO₄	CaCl₂ 2H₂O	Ca(OH)₂	Na₃PO₄	äktivkoh- lepulver	H₂O
1	6	2			0,7			2	2
2							2	4	3
3						2		4	3
4		5			20		2	0,5
5			20"			10	10	7

35

Beispiele für Kohlendioxidlieferanten finden sich in der folgenden Tabelle III.

Tabelle III (Einheit: Gewichtsteile)

Nr.	NaHCO₃	Na₂CO₃	Zitronen säure	Wein säure	Apfel säure	Fumar säure
1	8		7
2	8			8
3	8				7
4	8					• 6
5		10	7
6		10		8
7		10			7
8		10				6

Beim Doppelpackverfahren werden vorzugsweise verwendet:

(1) eine Kombination aus einem gasdurchlässigen Beutel mit Eisen(II)-carbonat und einem weiteren gasdurchlässigen Beutel mit Eisenpulver und einem Elektrolyten;

(2) eine Kombination aus einem gasdurchlässigen Beutel mit einem Gemisch aus Ascorbinsäure oder Erysorbinsäure und einer alkalischen Substanz oder einem Alkalimetallsalz der betreffenden Säure und einem weiteren gasdurchlässigen Beutel mit Eisenpulver und einem Elektrolyten und

(3) eine Kombination aus einem gasdurchlässigen Beutel mit Eisenpulver und einem Elektrolyten und einem weiteren gasdurchlässigen Beutel mit einem Carbonat oder Bicarbonat und einer festen Säure.

Verwendbare Elektrolyse sind beispielsweise Metallhalogenide. Die Metallkomponente der betreffenden Metallhalogenide kann aus einem Alkali- oder Erdalkalimetall, aus Kupfer, Zink, Aluminium, Zinn, Mangan, Eisen, Kobalt oder Nickel bestehen. Der Halogenidanteil besteht aus Chlorid, Bromid oder Jodid.

Beim Doppelpackverfahren werden die Komponenten in einer solchen Menge verwendet, daß die Sauerstoffabsorptionsfähigkeit des Mittels das 1- bis 20-fache der Menge des in dem gasundurchlässigen Beutel oder luftdichten Behälter enthaltenen Sauerstoffs beträgt und daß das Verhältnis der Menge an freigesetztem Kohlendioxid zur Menge an durch das Mittel absorbiertem Sauerstoff in dem gasundurchlässigen Beutel oder luftdichten Behälter zwischen 0,2 und 0,7, vorzugsweise zwischen 0,35 und 0,55, liegt.

Die Verbindung bzw. das Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid bzw. ein Sauerstoffabsorptionsmittel wird in einen Beutel aus einem Verpackungsmaterial, der teilweise oder vollständig aus einem gasdurchlässigen Film oder einer gasdurchlässigen Folie besteht, gefüllt. In der Regel besitzt der gasdurchlässige Film bzw. die gasdurchlässige Folie eine Luftdurchlässigkeit nach Gurley (bestimmt nach der japanischen Industriestandard-Vorschrift P 8117: Zylindergewicht: 570 g) von weniger als 1000 s/100 ml Luft, vor-

zugsweise von weniger als 100 s/100 ml Luft. Beispiele für gasdurchlässige Filme oder Folien sind perforierte, mit Kunststoffilmen kaschierte Papiere, mikroporöse Filme oder Verbundgebilde aus mikroporösen Filmen und gasdurchlässigen Filmen oder Folien. Das gasdurchlässi-

ge Material braucht lediglich einen Teil des gasdurchlässigen Beutels zu bilden. In anderen Worten gesagt, kann eine Seite des gasdurchlässigen Beutels aus einem

-y</IT-.

gasdurchlässigen Material bestehen, während die andere Seite aus einem gasundurchlässigen Material gebildet ist.

Die Verbindung bzw. das Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid wird in einen einzigen Beutel gefüllt (und alleine verwendet) oder gegebenenfalls zusammen mit in getrennten Beuteln untergebrachten Sauerstoffabsorptionsmitteln oder Kohlendioxidlieferanten eingesetzt, um innerhalb von 10 h die Sauerstoffkonzentration der Atmosphäre, in der sich das mit dem zu züchtenden anaeroben Bakterium beimpfte Kulturmedium befindet, auf 0,1 Gew.-% zu reduzieren, und um die Kohlendioxidkonzentration in der betreffenden Atmosphäre auf 5 bis 15 Gew.-% zu erhöhen. In dieser Atmosphäre wird dann das anaerobe Bakterium wachsen gelassen. Zur weiteren Einstellung der aus der Atmosphäre absorbierten Sauerstoffmenge und der in die Atmosphäre entlassenen Kohlendioxidmenge kann (können) der Verbindung bzw. dem Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid, dem Sauerstoffabsorptionsmittel oder dem Kohlendioxidlieferanten Wasser und/oder sonstige Zusätze einverleibt

25 werden.

Der gasundurchlässige Beutel bzw. luftdichte Behälter zur Aufnahme des mit dem zu züchtenden anaeroben Bakterium beimpften Kulturmediums besitzt eine Sauerstoffdurchlässigkeit von weniger als 500 ml/m² χ 24 h Atom, vorzugsweise von weniger als 100 ml/m² χ 24 h Atom. Die Form des gasundurchlässigen Beutels bzw. luftdichten Behälters ist nicht kritisch.

³^ In der Regel kann der (gasundurchlässige) Beutel bzw. (luftdichte) Behälter aus einem mit Vinylidenchlorid

kaschierten Film (KOP, KON, KPET und dgl.) oder

Vinylon, bestehen. Nach dem Einfüllen des mit dem ■ zu züchtenden anaeroben Bakterium beimpften Kulturmediums und eines festen Materials mit Sauerstoff-

5 absorptionsfähigkeit und Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid in den gasundurchlässigen Beutel bzw. luftdichten Behälter wird dieser hermetisch versiegelt.

10 Wenn als Beutel oder Behälter zur Züchtung des anaeroben Bakteriums ein durchsichtiger Film verwendet wird, läßt sich der Wachstumszustand des Bakteriums überwachen .

15 Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher veranschaulichen.

Die in den Beispielen verwendete GAM-Brühe besitzt folgende Zusammensetzung:
20

Pepton 10,0 g

Sojabohnenpepton 3,0 g

Proteosepepton 10,0 g

Verdauungsserum 13,5 g

Hefeextrakt 5,0 g

Fleischextrakt 2,2 g

Leberextrakt 1 / 2 g

Glukose 3,0 g

Kaliumdihydrogenphosphat 2,5 g

Natriumchlorid 3,0 g

Lösliche Stärke 5,0 g

L-Cysteinhydrochlorid 0,3 g

.Natriumthioglykolsäure 0,3 g

Mit Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

pH-Wert 7,3 +0,1

Der in den Beispielen verwendete GAM-Agar besitzt folgende Zusammensetzung:

Pepton 10,0g

Sojabohnenpepton 3,0 g

Proteosepepton 10,0 g

Verdauungsserum 13,5 g

Hefeextrakt 5,0 g

Fleischextrakt 2,2 g

Leberextrakt 1,2 g

Glukose 3,0 g

Kaliumdihydrogenphosphat 2,5g

Natriumchlorid 3,0 g

Lösliche Stärke 5,0 g

L-Cysteinhydrochlorid 0,3 g

Natriumthioglykolsäure 0,3 g

Agar 15,0g

Mit Wasser aufgefüllt auf 1 Liter

Beispiel 1

Bacteroides fragilis wird in GAM-Brühe (Bouilloii unter anaeroben Bedingungen 24 h lang wachsen gelassen, worauf 1 ml des erhaltenen Kulturmediums in einer Petrischale

mit GAM-Agar gemischt wird.

In einem gasdurchlässigen,, perforierten, mit Polyethylen kaschierten Papierbeutel wird ein Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung ^O oder Freisetzung von kohlendioxid aus 8 g Eisen(II)-carbonat, 0,1 g Calciumhydroxid, 6 g Eisenpulver und 0,2 g Calciuinchloriddihydrat abgepackt.

Die Petrischale und der das Mittel enthaltende Beutel 35 werden in einen durchsichtigen Beutel aus mit Vinylidenchlorid kaschiertem, orientiertem Polypropylen gefüllt, worauf der Beutel wärmeverschweißt wird. In 3 h steigt

die Kohlendioxidkonzentration in deir. klaren Beutel auf 12 %, während die Sauerstoffkonzentration auf unter 0,1 % gesenkt wird. Die Züchtung wird über 48 h lang bei 37⁰C fortgesetzt. Danach erfolgt eine Zählung der Kolonien.

Zu Vergleichszwecken wird das Beispiel 1 wiederholt, wobei jedoch kein Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid mitverwendet wird (Vergleichsversuch 1). Weiterhin wird das Beispiel zu Vergleichszwecken nochmals wiederholt, wobei lediglich ein Sauerstoffabsorptionsmittel verwendet wird (Vergleichsversuch 2).

Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle IV.

Tabelle IV

	Kolonienzahl *
Vergleichsversuch 1	0
Vergleichsversuch 2	60
Beispiel 1	245

* 10⁶ Anzahl der Bakterien in 0,1 ml verdünntem Medium

Beispiel 2

Fusobacterium nucleatum wird 24 h lang unter anaeroben Bedingungen in der GAM-Brühe gezüchtet, worauf 0,1 ml einer verdünnten Lösung des erhaltenen Mediums in einer Petrischale nit GAM^Agarmedium gemischt wird.

In einem gasdurchlässigen, perforierten, kaschierten Papierbeutel wird ein Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid aus 8 g Eisen(II)-carbonat und 0,1 g

Calciumhydroxid abgepackt. In einen weiteren Beutel aus demselben Material wird ein Sauerstoffabsorptionsmittel aus 6 g Eisenpulver, 0,7 g Calciumchloriddihydrat, 2 g Aktivkohlepulver und 2 ml Wasser gefüllt. Danach werden die Petrischale und die beiden Beutel in einen durchsichtigen Beutel aus einem mit Vinylidenchlorid kaschierten Verbundfilm aus orientiertem Polypropylen und Polyethylen gefüllt, worauf der Beutel wärmeverschweißt wird. Die Kohlendioxidkonzentration in dem durchsichtigen Beutel steigt auf 8 %, während die Sauerstoffkonzentration in 2,5 h auf unter 0,1 % sinkt.

Die Züchtung wird nun 48 h lang bei 37⁰C fortgesetzt, worauf eine Zählung der Kolonien erfolgt.

Zu Vergleichszwecken wird das Beispiel 2 ohne das Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Bildung oder Freisetzung von Kohlendioxid wiederholt (Vergleichsversuch 3). Weiterhin wird das Beispiel 2 zu Vergleichszwecken wiederholt, wobei Iediglich das Sauerstoffabsorptionsmittel verwendet wird (Vergleichsversuch 4).

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle V zusam- · mengefaßt.

Tabelle V

	Kolonienzahl *
Vergleichsversuch 3	0
Vergleichsversuch 4	125
Beispiel 2	180

* 10⁶ Anzahl der lebenden Bakterien in verdünnter Lösung

1 Beispiel 3

Propionibacterium acnes wird 24 h lang unter anaeroben Bedingungen in GAM-Brühe gezüchtet, worauf 0,1 ml einer verdünnten Losung.des erhaltenen Mediums in einer Petri-

5 schale mit GAM-Agarmedium gemischt wird.

In einen gasdurchlässigen, perforierten, kaschierten Papierbeutel wird ein Sauerstoffabsorptionsmittel aus 12 g Eisenpulver, 1,4 g Natriumchlorid, 4 g Aktivkohlepulver und 4 ml Wasser gefüllt. In einen weiteren Beutel aus demselben Material wird ein Kohlendioxidlieferant aus 1,6 g Natri umbi<*arbonat und 1,4 g Zitronensäure gefüllt. Danach werden die Petrischale und die beiden Beutel in einen durchsichtigen Beutel aus einem mit Vinylidenchlorid kaschierten Verbuhdfilm aus orientiertem Polypropylen und Polyethylen gefüllt, worauf der Beutel wärmeverschweißt wird. Die Kohlendioxidkonzentration in dem durchsichtigen Beutel steigt auf 8 %, während die Sauerstoffkonzentration in 3 h auf unter 0,1 % sinkt. Die Züchtung wird bei 37⁰C 48 h lang fortgesetzt, worauf eine Zählung der Kolonien erfolgt.

Zu Vergleichszwecken wird Beispiel 3 ohne das Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur BiI-dung oder Freisetzung von Kohlendioxid wiederholt (Vergleichsversuch 5) .

Zu Vergleichszwecken wird ferner das Beispiel 3 nochmals mit lediglich dem Säuerstoffabsorptionsmittel wiederholt (Vergleichsversuch 6).

Die Ergebnisse finden sich in der folgenden Tabelle VI.

Tabelle VI

	Kolonienzahl *
Vergleichsversuch 5	0
Vergleichsversuch 6	175
Beispiel 3	210

* 10 Anzahl der Bakterien in 0,1 ml verdünntem Medium

Claims

PATENTANSPRÜCHE

1. Verfahren zum Züchten anaerober Bakterien, dadurch gekennzeichnet, daß man einen gasundurchlässigen Verpackungsbeutel oder einen luftdichten Behälter mit

1 . einem mit dem betreffenden anaeroben Bakterium be-1 0 impften Kulturmedium und

2.1 einem gasdurchlässigen Beutel mit einer Verbindung oder einem Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Erzeugung oder Freigabe von Kohlendioxid,

15 oder

2.2 einem gasdurchlässigen Beutel mit einer Verbindung oder einem Mittel mit Sauerstoffabsorptionsfähigkeit und der Fähigkeit zur Erzeugung oder Freigabe von Kohlendioxid

und einem anderen gasdurchlässigen Beutel mit einem Sauerstoff absorptionsmittel, oder

2.3 einem gasdurchlässigen Beutel mit einem Sauerstoffabsorptions mittel und einem weiteren gasdurchlässigen Beutel mit einem

25 Kohlendioxidlieferanten

beschickt, wobei die Sauerstoffabsorptionsfähigkeit der betreffenden Verbindung bzw. des betreffenden Mittels so groß ist, daß die Sauerstoffkonzentration in dem 'gasundurchlässigen Beutel bzw. dem luftdichten Behälter innerhalb
von 10h auf weniger als 0,1 Vol.-% vermindert wird, und
die Kohlendioxidfreigabefähigkeit der betreffenden Verbindung bzw. des betreffenden Mittels oder Lieferanten so groß ist,

daß die Kohlendioxidkonzentration in dem gasundurchlässigen Beutel bzw. luftdichten Behälter auf 5 bis 15 Vol.-% erhöht wird; daß man den gasundurchlässigen Beutel bzw. luftdichten Behälter hermetisch versiegelt und daß man das Bakterium unter einer Atmosphäre einer Kohlendioxidkonzentration von 5 bis 15 Vol.-% und einer Sauerstoffkonzentration von weniger als 0,1 Vol.-% hält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

man eine Verbindung bzw. ein Mittel verwendet, deren bzw. dessen Sauerstoffabsorptxonsfähigkeit die 1- bis 20-fache Menge des in dem gasundurchlässigen Beutel bzw. luftdichten Behälter, indem das mit dem anaeroben Bakterium beimpfte Kulturmedium eingeschlossen ist, vorhandenen Sauerstoffs beträgt und daß das Verhältnis der (a) Menge an entstandenem bzw. freigesetztem Kohlendioxid zur (b) Menge an durch die Verbindung bzw. das Mittel in dem gasundurchlässigen Beutel bzw. luftdichten Behälter absorbierten Sauerstoffs zwischen

0,2 und 0,7 liegt. 20

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in den gasundurchlässigen Verpackungsbeutel bzw. luftdichten Behälter ein Mittel entsprechend 2.1 einbringt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß

man in den gasundurchlässigen Verpackungsbeutel bzw. luftdichten Behälter ein Mittel ^entsprechend 2.2 einbringt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in den gasundurchlässigen Verpackungsbeutel bzw. luftdichten Behälter ein Mittel entsprechend 2.3 einbringt.