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Beschreibung
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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Keimzahl in
mit aeroben Mikroorganismen kontaminierten Proben, wie arzneilichen Zubereitungen
und Lebensmitteln.
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Zur Bestimmung der Keimzahl in derartigen Proben bediente man sich
bisher der Plattenprüfmethode oder des Reihenverdünnungs tests nach USP XX. Beide
Verfahren benötigen jedoch bis zur Auswertung eine Zeit von 24 bis 48 Stunden. Diese
lange Bebrütungszeit stellt häufig einen erheblichen Nachteil dar, da erst nach
dieser verhältnismässig langen Zeit eine Aussage darüber gemacht werden kann, in
welchem mikrobiologischen Zustand sich ein Präparat zum Zeitpunkt der Probenahme
befand.
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Es muss nämlich beispielsweise bei der Herstellung von arzneilichen
Zubereitungen aus stark kontaminierten Ausgangsmaterialien, wie pflanzlichen Drogen,
möglichst kurzfristig entschieden werden können, welche Massnahmen zur Minderung
der Keimzahl ergriffen werden sollen. Entsprechendes gilt auch bei der Herstellung
von Lebensmitteln.
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Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Bestimmung der Keimzahl
in mit aeroben Mikroorganismen kotaminierten Proben zur Verfügung zu stellen, bei
dem im Vergleich zu herkömmlichen Methoden ein wesentlich kürzerer Zeitraum bis
zur Auswertung der Ergebnisse erforderlich ist.
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Gelöst wird diese Aufgabe erfindungsgemäss dadurch, dass man - die
Probe in einen in einem Messgefäss befindlichen, mit Sauerstoff gesättigten, flüssigen
Nährboden einbringt, - in das Gefäss eine Sauerstoffmessvorrichtung einbringt, -
das defäss gasdicht verschliesst, - die Geschwindigkeit des Sauerstoffverbrauchs
im Gefäss misst und - die Keimzahl anhand einer entsprechenden Eichkurve ermittelt.
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Der Sauerstoffverbrauch kann manometrisch anhand der Druckabnahme
gemessen werden. Hierzu eignet sich insbesondere eine Warburg-Apparatur, wobei entstehendes
Kohlendioxid in einer mit Kalilauge gefüllten Kammer adsorbiert wird. Möglich ist
auch eine manometrische Messung unter Verwendung geeigneter Druckaufnehmer, z. B.
piezoelektrischer Art oder einer Membran, deren Durchbiegung von einem induktiven
Wegaufnehmer erfasst wird. Der Sauerstoffverbrauch kann auch auf elektrochemischem
Wege mit Hilfe einer sauerstoffsensitiven Elektrode, die eine einfache und genaue
Messing {rmöglieht, gemessen werden.
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Vorzugsweise wird das erfindungsgemässe Verfahren zur Bestimmung der
Keimzahl in pflanzlichen arzneilichen Zubereitungen angewendet. In derartigen Zubereitungen
überwiegen als Kontaminanten die aeroben, d.h. sauerstoffverbrauchenden, Mikroorganismen.Im
erfindungsgemässem geschlossenen System ist deshalb der Sauerstoffverbrauch durch
das mikrobielle Wachstum ein Mass für-die bei der Probennahme je Gewichts- oder
Volumeneinheit vorhandene Keimzahl.
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In der Zeichnung zeigen: Fig. 1 in schematischer Darstellung eine
zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignete Messvorrichtung; Fig.
2 in allgemeiner Form ein Diagramm des Sauerstoffverbrauchs von Bacillus cereus
bei verschiedenen Keimzahlen in den Proben (vgl. Beispiel 1); Fig. 3 entsprechend
Fig. 2 den Sauerstoffverbrauch von Bacillus subtilis (vgl. Beispiel 2); und Fig.
4 eine aus den Werten von Fig. 3 ermittelte Eichgerade.
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Im Messgefäss 1 befindet sich ein mit Sauerstoff gesättigter, flüssiger
Nährboden 2. Das Messgefäss 1 ist mit dem Deckel 3 gasdicht verschlossen. Der Deckel
3 weist ebenfalls gasdicht verschliessbare Durchlassöffnungen für eine Sauerstoffelektrode
4 und einen Rührer 5 auf. Der Rührer wird von aussen mittels
eines
Motors 6 betrieben. An die Sauerstoffelektrode 4 ist ein Messverstärker 7 mit Anzeige
angeschlossen. Der Messverstärker 7 ist seinerseits mit einem Schreiber 8 und einem
Rechengerät 9 verbunden.
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Bei der praktischen Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens
kommen alle Nährböden in Frage, die ein ausreichendes Wachstum der in den Proben
zu erwartenden Mikroorganismen gewährleisten. Diese Nährböden enthalten die erforderlichen
Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie gegebenenfalls anorganische Salze, Spurenelemente
und Wachstumsfaktoren. Die Bebrütung wird unter vorsichtigem Rühren bei geeigneten
Temperaturen durchgeführt. Im allgemeinen sind Temperaturen von 30-40 C geeignet.
Eine Bebrütungstemperatur von etwa 35 0C wird bevorzugt.
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Auf dem Schreiber wird zunächst als sogenannte Nullinie der von der
Elektrode angezeigte Sauerstoffgehalt des Ansatzes registriert. Ein Abheben der
Kurve von der Nullinie zeigt mikrobielles Wachstum an, da mit fortschreitender Teilung
(Vermehrung) der Mikroorganismen in zunehmendem Masse Sauerstoff verbraucht wird.
Sobald die Wachstumsgeschwindigkeit der Mikroorganismen die logarithmische Phase
(exponentielle Vermehrung) erreicht hat, geht die Kurve in eine Gerade über.
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Durch Anlegen einer Tangente kann auf die Ausgangskeimzahl rückgeschlossen
werden. Hierzu ist es erforderlich, das zuvor eine Eichung der Versuchsanordnung
durch Inokulieren von an sich keimfreien Proben mit bekannten Keimzahlen vorgenommen
worden ist. Die in Fig. 1 angedeutete Recheneinrichtung 9 ist zwar nicht unbedingt
erforderlich, erlaubt es jedoch, das vorstehend geschilderte Anlegen der Tangenten
durch programmierte Rechenschritte (Hyperbelapproximation) zu ersetzen, wodurch
das Verfahren weiter verkürzt werden kann. Das Abheben der Kurve von der Nullinie
ist unter standardisierten Bedingungen abhängig von der Ausgangskeimzahl, d.h. je
stärker das zu untersuchende Gut kontaminiert ist, desto früher werden die Ergebnisse
sichtbar. Dies bedeutet wiederum, dass
eventuell notwendige keimzahlmindernde
Massnahmen rascher ergriffen werden können.
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Wie eingangs bereits angedeutet, lässt sich das erfindungsgeässe Verfahren
nicht nur auf arzneiliche Zubereitungen anwenden, sondern ist ganz allgemein bei
Materialien einsetzbar, bei denen eine Kontamination durch aerobe Mikroorganismen
befürchtet wird. Somit kommt auch die Untersuchung von Lebensmitteln aller Art in
Frage.
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Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden zur Bestimmung der Ausgangskeimzahl
des Ausgangsmaterials (z.B. pflanzliche Drogen), bei denen die zu zählenden Mikroorganismen
durch Abschwemmen von der Probe in ein flüssiges Medium überführt werden müssen
(was in den seltensten,Fällen quantitativ möglich ist), kann beim erfindungsgemässen
Verfahren das Prüfgut direkt in das Nährmedium eingebracht und auf die vorbeschriebene
Weise behandelt werden. Dadurch werden mit Sicherheit alle vermehrungsfähigen aeroben
Keime erfasst.
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Durch Einsatz selektiver Nährmedien lässt sich die Erfindung auch
auf die Bestimmung pathogener Keime und sogenannter Indikatorkeime (Enterobakterien)
ausdehnen. Ferner ist auch die selektive Bestimmung von Hefen und Pilzen möglich.
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B e i s p i e 1 1 Bacillus cereus wird in verschiedenen Konzentrationen
in 1 ml Phosphatpuffer nach Sörensen suspendiert. Als Nährmedium wird jeweils 1
ml Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon (Merck Nr.
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5459) verwendet. Die Versuchstemperatur beträgt 350C. Die Sauerstoffmessung
wird manometrisch mit einer Warburg-Apparatur durchgeführt. Als C02-Adsorbens werden
0,2 ml 20-prozentige Kalilauge verwendet. Die Ergebnisse sind in allgemeiner Form
in Fig. 2 dargestellt.
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Beispiel 2 Sporen von Bacillus subtilis werden in den in nachstehender
Tabelle angegebenen Konzentrationen jeweils in 1 ml Phosphatpuffer nach Sörensen
suspendiert. Als Nährmedium wird jeweils 1 ml Caseinpepton-Sojamehlpepton-Bouillon
(Merck Nur.5459) verwendet. Die Versuchstemperatur beträgt 35 0C. Die Sauerstoffmessung
wird manometrisch mit einer Warburg-Apparatur unter Verwendung von 0,2 ml 20-prozentiger
Kalilauge als C02-Adsorbens durchgeführt. Die Kurven werden manometrisch als Druckdifferenz
in mm erhalten. Am Rechner wird diese Druckdifferenz unter Berücksichtigung einer
Gefässkonstanten in vll 02 umgerechnet. Fig. 3 gibt die geplotteten Kurven wieder.
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Die Keimzahlen werden nach dem Reihenverdünnungstest analog USP XX
bestimmt. Die nachstehende Tabelle gibt die Ergebnisse wieder.
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Tabelle Probe Nr. Keimzahl/ml Log Keimzahl (min) 1 3,3 . 106 6,52
386 2 3,3 . 105 5,52 487 3 3,3 . 104 4,52 577 4 2,3 . 103 3,36 660 Fig. 4 zeigt
die aus den Werten dieser Tabelle aufgestellte Eichgerade. Zur Ermittlung einer
unbekannten Probe ist die Kurve gemäss Fig. 3 aufzunehmen, der Schnittpunkt der
Tangente zu bestimmen und die entsprechende Keimzahl aus der Eichgeraden von Fig.
4 zu entnehmen.