DE3045995C2 - Kontrollstandard zur Bestimmung von glycosyliertem Hämoglobin - Google Patents
Kontrollstandard zur Bestimmung von glycosyliertem HämoglobinInfo
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Description
Hämoglobin kommt in 2 allosterischen Formen vor, nämlich in der gespannten T-Form und in der entspannten
R-Form. Diese Formen weisen unterschiedliche chemische und physikalische Eigenschaften auf.
hrhöhte Konzentrationen an glycosyliertem Hämoglobin
treten bei Diabetes mellitus auf. Glycosyliertes Hämoglobin isl bei Nichtdiabetikern in einer Konzentration
von etwa 5 Prozent des gesamten Hämoglobins vorhanden, während bei Diabetikern die 2- bis 4-fache
Menge auftritt; vgl Science 7. April 1978. 200. Die Konzentration ·ιη glycosvliertem Hämoglobin stellt
einen Lang/eitindcx für die durchschnittliche Glucosekon/cntration
im Blut eines Patienten dar. Dieser Index wird nicht durch kurz/eitige Blutzuckerschwankungen
(von einer Stunde /ur anderen) beeinflußt und gibt daher ein relativ genaues Bild über den Zustand de.-Glucosekontrolle
im Blut von Diabetikern.
Glycosyliertes Hämoglobin wird allgemein als HbA
oder als schnelles Hämoglobin bezeichnet, da es auf einer chromatographischen Säule schneller wandert. Fs
wird im allgemeinen chromatographisch oder elektrophoretisch
gemessen.
Kürzlich wurde; festgestcjit (PEfQS 29 50 457), daß
eier prozentuale Anteil von giycösyliertem Hämoglobin
im Blut gemessen werden kann, indem fflan die
Verschiebung im Gleichgewicht der allosierischeri R'
ütid T^Förniöh Von Hämöglöbifien feststellt, die eintritt,
wenn nicht-'glycösylidrfes Hämoglobin mit einer Bindung
mit der allosterischen Stelle eingehenden Substanz umgesetzt wird. Diese Reaktion verursacht eine
Verschiebung von der R- zur T-Allosterieform im nichi-glycosylierten Anteil von Hämoglobin. Glycosyliertes
Hämoglobin im Blut trägt zur Gleichgewichtsverschiebung der allosterischen Formen nicht bei. da die
Glycosylierung die allosterische Bindungsstelle blokkiert.
Je höher also der prozentuale Anteil an giycösyliertem Hämoglobin in einer Blutprobe ist, desto
to geringer ist die Verschiebung unter den allosterischen Formen, die nach Umsetzung der Hämoglobine mit
einer eine Bindung mit der allosterischen Stelle eingehenden Substanz eintritt. Dabei wird die Reaktivität
der allosterischen Bindungsstelle, die bei nicht-glycosyliertem Hämoglobin zugänglich ist, und die Verschiebung
im Gleichgewicht der allosterischen Formen in einem Gemisch aus glycosyliertem und nicht-glycosy·
liertem Hämoglobin, die sich ergibt, wenn eine eine Bindung mit der allosterischen Stelle .-ingehende
Substanz mit dem nichtgiycosyliertem Hämoglobinanteil umgesetzt wird, ausgenutzt. Dabei kann Hämoglobin
auch zu Methämoglobin oxidiert sein.
Nachstehend wird ein typisches Verfahren gemäß der DE-OS 29 50 457 näher erläutert.
1 ml eines Reagens, das aus Puffer vom pH-Wert 6,8 besteht und 0,1 ml Imidazol, 0,2 millimolar Kaliumhexacyanoferrat(III)
(K1Fe(CN)6) und 0,05 Volumenprozent
Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (Triton X-100) als Detergens enthält, wird zu 10 bis 20 μΙ Vollblut
gegeben. Dieses Gemisch wird 10 Minuten inkubiert.
Kaliumhexacyanoferrat(III) oxidier' Hämoglobin zu Methämoglobin. Octylphenoxypolyäthoxyäthanol (Triton
X-1 00) ist ein neutrales Detergens, das ein Lysis der Zellen unter Freisetzung der Hämoglobine bewirkt.
Iniida/ol geht eine Koordination mit dem Eisen ein und
verschiebt das Gleichgewicht der allosterischen Isomeren zur (R)-Form.
Das Absorptionsspektrum dieses Gemisches wird bei 560 und 635 nm aufgezeichnet. Anschließend werden
•to 2 μι einer 0.1 m Inosilhexaphosphatlösung vom
pH-Wert 6.8 zugesetzt. Das letztgenannte Reagens reagiert mit der allosterischen Bindungsstelle von
nichtgiycosyliertem Hämoglobin und verschiebt das Gleichgewicht der allosterischen Isomeren zur
(T)-Form. Sodann wird wieder das Absorptionsspektrum
bei 560 und 635 nm gemessen. Die Konzentration an glycosyliertem Hämoglobin ergibt sich durch eine
Abnahme der Absorption bei 560 nm und einer Zunahme der Absorption bei 635 nm.
Reagens A:
0.1 m Imidazol. 0.2 millimolar K1Fe(C N)h. 0.05
Prozent (Vol./Vol.) Octylphenoxypolyäthoxyäthanol
(Tnti.n X-IOO) <ils Detergens. in Wasser.
« pH Wert 6.8
Reagens B
0.1 m Inosithexaphosphat (IHP). in Wasser.
pH Wert 6.8
1.0 ml Reagens A wird bei 25"C /u 10 bis 20 μΙ
Vollblut gegeben Sodann wird 10 Minuten inkubiert, um
die Lysis der Zellen und eine Oxidation von Hämoglobin
:zu Methamogiobin zu bewirken. Das Spektrum im
sichtbaren Bereich von 450 bis 7ÖÖ nm wird aufgezeictv
net, wobei speziell die Absorption bei 560 Und 635 hm
festgehalten wird; Sodann werden 2 μΙ Reagens B zum
Reakliönsgemisch gegeben. Hierauf wird, wie vorste^ hencf erläutert, nochmals das Absorptionsspektrum
aufgenommen.
Aufgabe der Erfindung ist es, Kontrollstandards zur
Verfügung zu stellen, die in einem Verfahren mr Bestimmung von glycosyüertem Hämoglobin der
vorstehend erläuterten Art eingesetzt werden können, ϊ
Gemäß einer Ausführungäform der Erfindung enthält ein derartiger Kontrollstandard ein Gemisch aus
Hämoglobin und I bis 25 Prozent eines 2,4-Dinitrophenylderivats von Hämoglobin, wobei eine 2,4-Dinitrophenylgruppe
die allosterische Bindungsstclle im Hämoglobin
blockiert.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung enthält der Kontrollstandard ein Gemisch aus
Methämoglobin und 1 bis 25 Prozent eines 2,4-Dinitrophenylderivats
von Methämoglobin, wobei eine 2,4-Dinitrophenylgruppe die allosterische Bindungsstelle im
MethäniOglobin blockiert. Dieses Standardreagens wird
aufgrund der besonderen Stabilität des 2,4-Dinitrophenylderivats von Methämoglobin bevorzugt.
Die Gemische der genannten Art liegen vorzugsweise in einer Konzentration von 5 bis 15 millimolar in
wäßriger Lösung vor.
Gemäß einer dritten Ausführungsform der Erfindung enthält der Kontrollstandard eine Suspension von roten
Blutkörperchen, wobei 1 bis 25 Prozent der roten Blutkörperchen Hämoglobin aufweisen, das in 2,4-Dinitrophenylhämoglobin
überführt worden ist, wobei eine 2,4-Dinitrophenylgruppe die allosterische Bindungsstelle
im Hämoglobin blockiert. Dabei liegt als Suspens: msmedium
vorzugsweise eine 10- bis ^0-prozentige Lösung von Glycerin in Kochsalzlösung vor.
Zur Herstellung der Kontrollstandards der Erfindung werden Hämoglobin oder Methämoglobin mit HaIogen-2,4-dinitrobenzol
umgesetzt, wobei als Halogenatc/fn
Chlor, Fluor, Brom oder Jod vorliegt Durch diese Umsetzung wird das 2,4-DinitrophenyIderivat von
Hämoglobin oder Methämoglobin gebildet
O2N
NOj
Halogen + H2N-P
O2N-
NH-P
P = Protein von Hämoglobin oder Methämoglobin
Hämoglobin in Zellen oder in Lösung reagiert mit überschüssigem Halogen^-dinitrobenzol, vorzugsweise
Fluor^/t-dinitrobenzol. Geht man bei dem
Verfahren von roten Blutkörperchen aus. werden diese mit überschüssigem 24-Dinitrobenzol umgesetzt. Iy
siert, und das Hämoglobin wird zu Meihamoglobin
oxidiert Bei diesem Verfahren '.erden mehrere
2,4-Dinitrophenylgruppen an dus Hämoglobin gebun- v>
den. Es ist wesentlich, daß mindc; ens eine der 2.4-Dinitrophenylgruppen die allosterische Bindungsstelle blockiert. Geht man bei dem Verfahren von einer
Hämoglobinlösung aus, wird diese Lösung beispielsweise mit überschüssigem Fluor-2,4-dinitrobenzol behandelt.
Das erhaltene ProduKt wird entweder isoliert oder zu Methämoglobin oxidiert.
Die Umsetzung von l-Fluor-2.4-dinitrobenzol mit
Humanhämoglobin ist bekannt; vgl. E. Antonini und M. Brunoni. North Holland Publishing Company. Amster·
dam und London 1971, S. 295 bis 296. Nicht bekannt ist jedoch das 2.4-Dinitrophenylderivat von Methämoglobin,
bei dem eine 2.4-Dinitrophenylgruppe die allosterische
Bindungsstelle von Methämoglobin blockiert. Ferner sind auch Standardgemische oder Standardlysungen
des 2.4-Dinitrophenylderivats von Hämoglobin
oder Methämoglobin. wobei die allosterische Bindungsstelle von Hämoglobin oder Methämoglobin mit einer
2.4-Dinitrophen>lgruppe blockiert ist. nicht bekannt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden ■>■>
zur Verwendung in Testpackungen Gemische aus Methämoglobin mit J. 11 bzw. 20 Prozent des
2,4-Dinitrophenylderivats von Methämoglobin. wobei die allosterische Rindungsstelle von Methämoglobin mit
einer 2,4-Dinitrophenylgruppe blockiert ist. in einer 5 bis
15 millimolaren Lösung des Proteins in Phosphatpuffer
Vom pH-Wert 6 bis 8 oder wäßriger Lösung zur Verfügung gestellt»
Öäs Gemisch kann auch als lyophiHsiertes Standardi
gemisch eingesetzt Werden,
Die Kontrollstandards der Erfindung werden anstelle
von Gemischen aus Hämoglobin Und giycösyliertem
Hämoglobin verwendet, Glycosyliertes Hämoglobin muß aus Blut abgetrer-nt oder durch enzymatische
Umsetzung von Glycose und Hämoglobin hergestellt werden. Die Kontrollstandards der Erfindung sind
synthetische Derivate von Hämoglobin oder Methämoglobin, die sich einfach herstellen lassen und sich als
stabile Kontrollstandards für die Bestimmung von glycosyüertem Hämoglobin eignen.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
3 Liter menschliches Vollblut werden 10 bis 15 Minuten gerührt und in 6 Aliquotproben unterteilt, die
jeweils in ein Zentrifugenrohr gebracht -;nd 30 Minuten bei 1800 bis 2000 χ £ bei 25°C zentrifugiert werden.
Nach dem Absaugen des Überstands werden jeweils 300 ml normale Kochsalzlösung zugegeben. Die Zellen
werden durch leichtes Rühren resuspendiert. Zentrifugation, Absaugen und Resuspendieren werden 3 mal
wiederholt. Die Zellen werden schließlich in 250 ml mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung vom pH-Wert 12
suspendiert. Die Suspensionen werden vereinigt und mit 15ml l-Fluor-2.4dinitrobenzol versetzt. Das Reaktionsgemisch
wird 2 Stunden bei etwa 25 C inkubiert. Die mit dem 1-Fluor-2.4-dinitrobenzol umgesetzte
Suspension wird wieder in 6 Fraktionen unterteilt und 15 Minuten bei 1800 bis 2000 χ g zentrifugiert. Der
Überstand wird dekantiert und verworfen. Die Zellen werden mit Wasser etwa 1 Stunde bei 25" C oder über
Nach bei 4"C lysiert. Sodann wird 30 Minuten bei 15 000
bis 17 000 χ # zentrifugiert Der Überstand wird
aufbewahrt und bei 2 bis 8°C gelagert. Das Hämoglobinderivat
im Überstand wird durch Behandlung mit 11.0g Kaliumhexacyanoferrat(HI) zu Methämoglobin
oxidiert.
Das 2,4-DinitrophenylderiVat von Methämoglobin
Wird an einem Mischbett-lonenäüsläuscherharz isoliert
und mit I/2Ö Volumen 1 m Kaiiumphosphatpuffer vom
pH'Wert 6,2 versetzt Die Lösung wird durch Dialyse mit einem Amicön-Höhlfäser-Dialysätör-Könzenlralof-Gerät
konzentriert·.
Das 2,4jDinitröphenylderivat von Methämoglobin
wird mit MethS^oelobin zu Kontrollstandards mit
einem Gehalt an 2,4-Dinitrophenylderivat von Methämoglobin von 1 bis 25 Prozent vermischt. Kontrollstandards
weisen einen Proteingehalt von 5 bis 15 millimolar in Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,8 auf, wobei das
2,4-Dinitrophenylderivat von Methämoglobin in einer Konzentration von 3,11 oder 20 Prozent vorliegt
Das 2,4-Dinitrophenylderivat von Hämoglobin wird gemäß dem verfahren von Beispiel 1 hergestellt, wobei
die Oxidation mit Kaiiumhexacyanoferrat(III) unterbleibt.
Die gemäß den Beispielen 1 und 2 hergestellten Derivate werden gebildet, indem man von einer
Hämoglobinlösung anstelle von roten Blutkörperchen ausgeht oder die roten Blutkörperchen vor der
Derivatbindung lysiert.
Gemäß dem Verfahren von Beispieler. 1 wird das
Hämoglobin in roten Blutkörperchen mit l-Fluor-2,4-Dinitrobenzol
umgesetzt. Die roten Blutkörperchen werden aber nicht lysiert, sondern mit nicht-umgesetzten
roten Blutkörperchen vereinigt, gewaschen und in einer 10- bis 30-prozentigen Lösung von Glycerin in
Kochsalzlösung gelagert, wodurch man ein stabiles Standardreagens erhält. Es ergibt sich eine wäßrige
Suspension von roten Blutkörperchen, wobei bei 1 bis 25 Prozent der roten Blutkörperchen das Hämoglobin
unter Bildung von 2,4-Dinitrophenylhämoglobin umgesetzt
ist und wobei eine 2,4-Dinitrophenylgruppe die allosterische Bindungsstelle von Hämoglobin blockiert.
Vorzugsweise werden 3-, 11- bzw. 20prozentige Suspensionen in einer Lösung von 10 bis 30 Prozent
Glycerin in Kochsalzlösung Testpackungen einverleibt.
Claims (6)
1. Kontrollstandard zur Bestimmung von glycosyliertem
Hämoglobin, enthaltend ein Gemisch aus Hämoglobin und 1 bis 25 Prozent eines 2,4-Dinitrophenylderivats
von Hämoglobin, wobei eine 2,4-Dinitrophenylgruppe die allosterische Bindungsstelle
im Hämoglobin blockiert
2. Kontrollstandard nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch in einer Konzentration
von 5 bis 15 millimolar in wäßriger Lösung
vorüegt-
3. Kontrollstandard zur Bestimmung von glycosyliertem
Hämoglobin, enthaltend ein Gemisch aus Methämoglobin und 1 bis 25 Prozent eines 2,4-Dinitrophenylderivats von Methämoglobin, wobei
eine 2,4-DinitrophenyIgruppe die allosterische Bindungsstelle im Methämoglobin blockiert.
4. Kontrollstandard nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gemisch in einer Konzentration
von 5 bis 15 millimolar in wäßriger Lösung vorliegt
5. Kontrollstandard zur Bestimmung von glycosyliertem Hämoglobin, enthaltend eine Suspension
von roten Blutkörperchen, wobei 1 bis 25 Prozent der roten Blutkörperchen Hämoglobin aufweisen,
das in 2.4 Dinitrophenylhämoglobin überführt worden
ist, wobei eine 2.4-Dinitrophenylgruppe die allosterische Bindungsstelle im Hämoglobin blokkiert.
6. Kontrollstandard nach Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, daß als Suspensionsmedium eine
10- bis 30-prozentige Lösung von Cilycerin in Kochsalzlösung vorliegt.
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