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Verfahren zur Herstellung von Escherichia coli-Mutanten
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Von Escherichia coli sind spontane Mutationen beschrieben worden;
vgl. z.B. Farabaugh et al., J. Mol. Biol., 126: 847. Auch lassen sich Mutationen
kRostlich induzieren; vgl.
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z.B. Berg, io Bukhari et al., Insertion and excision of the transposable
kanamycin resistance determinant Tun5, in DNA insertion elements, plasmids, and
episomes, Cold Spring Harbor 1977, Seite 205, insbesondere 211. Escherichia coli
ist ein Mikroorganismus, der sich leicht kultivieren läßt, und es ist daher erwünscht,
ein Verfahren durchführen zu können, bei dem man eine noch höhere Mutationsrate
erzielt.
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Gegenüber Verfahren, bei denen die gesamte DNS statistisch mutiert
ist, ist es insbesondere erwünscht, daß beim Mutieren wesentliche Eigenschaften
beibehalten werden, daß die DES also nur in einem begrenzten Bereich mutiert wird.
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Durch ein Verfahren mit einer höheren Mutationsrate unter Mutierung
eines begrenzten DNA-Bereichs würde die Wahrscheinlichkeit der Bildung brauchbarer
Mutationen in vorteilhafter Weise erhöht.
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Erfindungsgemäß wird nun ein Verfahren zur Herstellung von Escherichia
coli-Mutanten vorgesehen, bei dem Plasmid-oder Bakteriophagen-DNS verwendet wird,
die ein Transposon enthält, bei dem zwei sich spiegelsymmetrisch zueinander verhaltende
Bereiche durch einen nicht-symmetrischen Bereich getrennt sind.
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Über das Verhalten von spiegelsymmetrischer DNS finden sich in der
Literatur widersprüchliche Angaben. Perricaudet et al. (Science, 196 (1977) 208)
spalteten lambda-DNS mit einer Ligase und bauten drei DNS-Fragmeate in der Reihenfolge
t ein. Sie gaben an, daß der spiegelsymmetrische Bereich sehr instabil war und exakt
herausgeworfen wurde.
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Bolivar et al. (pro. Natl. Acad. Sci ., 74 (1978) 5265) spalteten
einen Plasmid-Vektor mit einer Ligase und bauten zwei DNS-Fragmente mit jeweils
29 Basenpaaren spiegelsymmetrisch in der Reihenfolge t ein. Der kleine spiegelsym
metrische Bereich war stabil. Gellert et al. ( Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.
(1978) 35 - 40) synthetisierten eine ringförmige DNS mit zwei spiegelsymmetrischen
Hälften, die instabil war. Schließlich wurde von Berg (loc. cit.) das Transposon
Tn5 in ein Plasmid eingebaut. Das Produkt wurde in Escherichia ooli sehr langsam
mutiert.
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Bei der Erfindung zugrundeliegenden Untersuchungen wurde nun überraschenderweise
festgestellt, daß spiegelsymmetri sche DNS derart instabil ist, daß nicht nur dieser
Bereich, sondern auch andere angrenzende DNS-Bereichemutiert werden.
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Davon ausgehend wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung
von Escherichia coli-Mutanten vorgeschlagen, bei dem man (a) Plasmid- oder Bakteriophagen-DNS
herstellt, die ein Transposon enthält, bei dem zwei sich spiegelsymmetrisch zueinander
verhaltende Bereiche durch einen nicht symmetrischen Bereich getrennt sind, (bl)
aus der erhaltenen transposonhaltigen DNS mit einer Restriktionsendonukleaseden
nicht-symmetriachen Bereich
des Transposons vollständig herausschneidet
und (b2) die Transposonenden der erhaltenen DNS mit einer Ligase verbindet und DNS
mit einem Spiegelsymmetriebereich herstellt oder (b'l) aus der erhaltenen transposonhaltigen
DNS mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen den nicht-symmetrischen Bereich
des Transpos ons vollständig herausschneidet und zusätzlich (b'1I) ein DNS-Fragment
mit einem der beiden Transposonenden herausachneidet, wobei das andere Transposonende
an der um das DNS-Fragment gekürzten Plasmid- oder Bakteriophagen-DNS verbleibt,
oder zusätzlich (b'1I')zwei DNS-Fragmente mit Jeweils einem der beiden Transposenenden
heraus schneidet und (b'2) das oder die erhaltenen DNS-Fragmente mit Transposonende
mit einer Plasmid- oder Bakteriophagen-DNS mit Transposonende mit Hilfe einer oder
mehrerer Ligasen verbindet und DNS mit einem Spiegelsymmetriebereich herstellt,
wobei man die Plasmid-oder Bakteriophagen-DNS mit Transposonende aus einer zweiten
transposonhaltigen Plasmid- oder Bakteriophagen-DNS gemäß den Stufen (a), cm'1)
und (b'1I) gewonnen haben kann, und (c) die erhaltene DNS in Escherichia coli transformiert
oder transduziert und Escherichis coli-Hybride bildet und (d) die infolge der in
den Escherichia coli-EIybriden instabilen DNS-Spiegelsymmetrie gebildeten Escherichia
coli-Mutanten kultiviert und selektiv testet und gegebenenfalls einzelne Mutanten
isoliert.
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Das erfindungsgemäße Verfahren geht also von Plasmid- oder Bakteriophagen-DNS
aus. Hinsichtlich des Begriffs "Plasmid" und der Gewinnung von Plasmiden kann auf
die DE-OS 28 14 039.8 und die darin angeführte Literatur verwiesen werden. Beispiele
für Bakteriophagen sind der Phagen lambda oder lambdoide Phagen, wie Phi80; hinsichtlich
des Phagen lambda vgl. man z.B. Hershey, The Bacteriophage Lambda, Publ. Cold Spring
Harbor Lab. (1971) 773-779; der Begriff t'lambdoide Phagen findet sich z.B. bei
Hohn & Murray, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 3259-3263.
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Zum Begriff 'Transposon" und zur Einführung eines Transposons in Plasmid
oder Bakteriophagen-DNS kann auf folgende Literatur verwiesen werden: Campbell et
al., in Bukhari et al., Nomenclature of transposable elements in Prokaryotes, in
DNA, Insertion Elements, Plasmids, and Episomes, Cold Spring Habor Lab. 1977; Berg,
in Bukhari et al., Insertion andexcision of the transposable kanamycin resistance
determinant Tn5, in DNA insertion elements, plasmids, and episomes, Cold Spring
Harbor 1977, Seite 205, insbesondere 211. Ein Beispiel für ein Transposon (Tn),
bei dem zwei sich spiegelsymmetrisch zueinander verhaltende Bereiche (invertierte
Duplikation).durch einen nicht-symmetrischen Bereich getrennt sind, ist das Transposon
Tun5.
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Zum Stand der Technik von Restriktionsendonukleasen bzw.
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Restriktionsenzymen und von Ligasen wird auf die DE-OS 28 14 039.8
und die darin angeführte Literatur hingewiesen.
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Alternative b (Stufen bl und b2) Bei dieser Variante braucht man lediglich
eine einzige Restriktionsendonuklease zu verwenden. Wenn man nun aus einer transposonhaltigen
DNS mit einer Restriktionsendonuklease den nicht-symmetrischen Bereich des Transposons
vollständig herausschneidet, erhält man zwei Spaltstücke.
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Bei der Ligation kann man den Wiedereinbau des nicht-symmetrischen
Transposonbereichs z.B. dadurch ausschließen, daß man vor der Ligation die DNS verdünnt
oder durch selektives Testen (Screening) lediglich Produkte auswählt, die keine
für den nicht-symmetrischen Transposonbereich charakteristische Eigenschaft besitzen.
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Die vollständige Entfernung des nicht-symmetrischen Transposonbereichs
ergibt sich also daraus, daß dem Ligationsprodukt eine für den nicht-symmetrischen
Bereich charakteristische Eigenschaft (Markierung) fehlt.
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Alternative b' (Stufen b'1 und b'2) Bei dieser Variante wird nicht
nur der nicht-symmetrische Bereich des Transposons herausgeschnitten, sondern zusätzlich
ein oder mehrere DNS-Fragmente, unter denen sich ein Fragment mit Transposonende
oder zwei Fragmente mit jeweils einem der beiden Transposonenden befinden. Diese
DNS-Fragmente mit Transposonenden werden danach mit Hilfe einer Ligase mit einer
Plasmid- oder Bakteriophagen-DNS, die ein Transposonende aufweist, verbunden. Eine
derartige Plasmid-oder Bakteriophagen-DNS dient als Vektor und kann aus einer zweiten
transposonhaltigen Plasmid- oder Bakteriophagen-DNS gemäß den Stufen a, b'1 und
b'lI gewonnen worden sein. Ein derartiger Vektor läßt sich auch auf andere Weise
herstellen und charakterisieren, z.B. durch DNS-Sequenzierung.
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Bei einer speziellen Ausführungsform kann man einen Vektor (Plasmid-
oder Bakteriophagen-DNS) vorsehen, der einen Teil der invertierten Duplikation des
Transposons bzw. das Transposonende in der Nähe eines Signalelements aufweist. Als
Signalelement kommen beispielsweise ein Promotor, ein Gen, ein Teil eines Gens oder
eine Shine-Delgano-Sequenz in Betracht. Die Begriffe "Promotor" und "Shine-Delgano-Sequenz"
(= ribosome bindung site) vgl. man z.B. bei Miller & Reznikoff, lhe Operon,
Cold Spring Harbor1978, S. 231 bzw. 286.
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Durch die Verbindung eines ein Transposonende aufweisenden DNS-Fragments
mit einem derartigen Vektor, d.h. durch die Kopplung eines Gens oder eines Teils
eines Gens z.B. eines Plasmids mit dem Signalelement des Vektors soll erreicht werden,
daß man ein bekanntes Genprodukt mit erhöhter Ausbeute oder ein neues Genprodukt
erhält.
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Die bei den beiden Varianten erhaltene DNS mit spiegelsymmetrischem
Transposonbereich wird in Escherichia coli transformiert oder transduziert, so daß
man Escherichia coli-Hybride erhält. Zur Transformation und Transduktion
wird
auf die DE-OS 28 14 039.8 und die darin angeführte Literatur hingewiesen. Da die
DNS-Spiegelsymmetrie in den Escherichia coli-Hybriden instabil ist, erhält man Escherichia
coli-Mutanten, die kultiviert, selektiv getestet und gegebenenfalls einer Isolation
unterworfen werden. Zum Kultivieren, selektiven Testen und Isolieren kann man sich
beispielsweise der Methoden bedienen, die von Wu in Methods in Enzymology, Bd. 68,
Recombinant DNA, Academic Press, N.Y. 1979, angegeben werden.
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Berg (loc.cit.) nennt ein Verhältnis von mutierter DNS: intakter DNS
= 10-6 bis 10 4. Demgegenüber ergibt sich beim erfindungsgemäßen Verfahren ein Verhältnis
von mutierter DNS : intakter DNS = 0,7 bis 1, so daß man gegeniiberdem Stand der
Technik nach dem erfindungsgemäßen Verfahren Escherichia coli-Mutanten mit dem beachtlichen
faktor von-105 erhalten kann.
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Wenn man ein ransposon in Plasmid- oder Bakteriophagen-DNS einbaut,
wird das Transposon statistisch an unterschiedlichen Stellen der DNS eingebaut.
Demgemäß kann man das irfindungsgemnße Verfahren so durchführen, daß man eine Reihe
von Transposon-haltigen Plssmid- oder Bakteriophagen-DNS herstellt und die einzelnen
gebildeten DNSen ohne Trennung n weiteren erfindungsgemäßen Verfahrensstufen unterwirft.
Dementsprechend werden bei den erfindungsgemäßen Stufen b 2 und b'2 die Spiegelsymmetriebereiche
an verschiedenen Stellen in Abhängigkeit von der Transposon Einbaustelle gebildet.
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Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläutert.
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Beispiele 1 bis 3 Zum Testen der Stabilität spiegelsymmetrischer bzw.
palindromischer DNS in Escherichia coli wurden pBR322::Tn5-bzw. pBR325::Tn5-Derivate
mit Restriktionsenzymen ge-
spalteo, die nur die invertierten Duplikat
ion en des Transposons schneiden.
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Die Konzentration der DNS-Lösung betrug 100 fig DNS/ml, wobei mit
einem Puffer mit 150 mMol Natriumchlorid, 6 mMol ris-HCl (pH 7,6) und 6 mMol Magnesiumchlorid
gearbeitet wurde; Tris=Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. Man arbeitete mit 100 pol
(10 µg) und 15 Einheiten Restriktionsenzym, wobei man das System 1 h lang bei 37
0C stehen ließ.
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Da eine niedrige DNS-Konzentration den Ringschluß begün* stigt, wurde
vor der Ligation eine Verdünnung der DNS vorgenommel, so daß die Bildung palindromischer
Strukturen begUnstigt wurde, bei denen die Spaltstelle mit der Symmetrieachse zusammenfiel.
Derartige Strukturen wurden z.3. durch Entfernung der kleinen XhoI-bzw. BglII-Fragmente
der pBr322::Un5-Derivate erhalten (vgl. die schraffierten Bereiche in Fig. 1).
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Nach dem Verdünnen betrug die DNS-Konzentration 1 pg DNS/ml.
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Das Ligationsmedium versetzte man mit 100 pg/ml Rinderserumalbumin,
20 mMol Tris (pH 7,4) 10 mMol Dithiothreitol (= 1,4-Dimercapto-2,3-butandiol) und
10 mMol Magnesiumchlorid. Man stellte auf Eis, gab 5 x 102 Einheiten DNS-Ligase
zu (aus 24-infizierten Escherichia coli-Zellen) und ließ 5 Stunden bei 8°C stehen.
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Die unerwünschte Wiedereinsetzung herausgeschnittener kleiner Fragmente
ermittelte man durch Testen der Kanamycin-Resistenz (Kmr), die im zentralen Bereich
des Un5 getragen wird, und durch eine Restriktionskartierung. Derartige Moleküle
machten nur einen kleinen Prozentsatz gebildeter tetracyolinresistenter (Tor) Populationen
aus und wurden nicht weiter untersucht.
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Danach wurde transformiert, wobei die von Cohen et al.
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(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70 (1973) 3240 - 3244) angegebenen Arbeitsbedingungen
streng eingehalten wurden. Die Ergebnisse der Transformation sind Tabelle 1 zu entnehmen.
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Tabelle 1 Plasmid Restrik- Eransformanten verzug tions- verknüpft
unverknüpft endonuklease TcrrApS+ Tc r TCrApr cr TcrAPr pBR322::Tn5(Aps42) Xho-I
170 60 3 2 pBR322::Tn5(Aps42) Bgl-II 480 170 9 0 pBR325::Tn5(Ap5115) Xho-I 270 33
2 1 Die Zahlenwerte für die verknüpften Transformanten zeigen, daß für etwa 1/3
der Transformanten die Ampicillin-Resistenz (Apr) zurückgewonnen wurde, was die
Entfernung des spiegelsymmetrischen DNS-Bereichs anzeigt.
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Ferner wurden willkürlich Tcr Aps -Transformanten ausgewählt und ihre
DNS genau mit Restriktionsenzymen kartiert, wobei die in Fig. 2 gezeigten Ergebnisse
erhalten wurden. Da die einzelnen Transformanten alle voneinander verschieden waren,
ergibt sich eine Mutationsrate von 100 % bzw. ein Verhältnis von mutierter DNS :
intakter DNS ; 1.
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