DE3025097A1 - Peptidzubereitung mit immunosuppressiven eigenschaften - Google Patents

Description

Beschreibung

■ Die Erfindung betrifft eine hochgereinigte Zubereitung, die nicht-artspezifische immunosuppressive Wirkungen entfaltet.

Die erfindungsgemäße Zubereitung besitzt die^ folgenden charakteristischen Eigenschaften:

a) ausgehend von einer Lösung dieser Zuberen tung in Was-^ ser kann die Zubereitung durch Verdampfen des Wassers an einem in einem Äthylacetat-Medium gepreßten AIuminiumoxidpulver fixiert und von diesem wieder mit einer Mischung, die 9 Vol.-Teile Äthylace-.tat, o,5 Vol.-TeLIe Methanol und o,25 Vol.-Teile Wasser enthält, eluiert werden?

b) wenn man eine Lösung dieser Zubereitung :.n 1 ml einer Mischung, die 62 Vol.-Teile Äthanol und 38 Vol.-Teile Wasser'enthält, in diesem Lösungsmittel über einer mit dreidimensionalem Polydextran, das über JLtherbindungen gebundene Hydroxypropylgruppen aufweist, wie es im Handel unter der Bezeichnung "Sephadex LH-2o" erhältlieh ist (Pharmacia), und das zu Kügelchon mit einem Durchmesser von 25 bis 1oo /um geformt is:, gefüllten Säule chromatographiert, ergibt sie ein .aktives Eluat, das in einem Volumen V enthalten ist, das zwischen 1,9 Vo und etwa 2,1 Vo (wobei Vo für das Totvolumen der Säule steht) eluiert wird; und

c) sie enthält ein Produkt, das nachfolgend als "hochgereinigtes Produkt" bezeichnet wird und das die folgenden Eigenschaften aufweist:

- es ist im wesentlichen frei von Bestandteilen, die zugleich bei den nachstehend definiertan Tests biologä sch inaktiv sind und durch Elektro ahorese über einer dünnen Celluloseschicht aus einer Lösung die-

130048/0506

ses Produkts in einer Pyridin/Essigsäure/Aceton/Wasser-Mischung mit einem Volumenverhältnis von 1/2/8/ 4o und einem pH-Wert von 4,4 bei einer Spannung von 5oo V von biologisch aktiven Bestandteilen abgetrennt werden können;

- es tesitzt ein Molekulargewicht von weniger als 5ooo;

- es tesitzt eine (vollständige oder teiLweise) peptidische Natur;

- es ]<ann weder mit dem Reagens Ninhydrin-Collidin

nocl: mit Fluoreszamin in einer Dosis von 5 nMol pro 2o cm-Dünnschicht nachgewiesen werden;

- es enthält eine N-terminal mit einer Pyroglutamylgruppe blockierte Aminosäure;

- es enthält eine durch Lysin oder Arginin gebildete C-t^rminale Säure;

- es vird unter der Einwirkung der folgenden Enzyme inaktiviert: Pronase, Trypsin, Pyroglutamat-amino-

. peptidase und Carboxypeptidasen A und B;

- es vird weder durch Leucin-aminopeptidase noch durch Chymotrypsin inaktiviert;

- es wird durch eine Behandlung mit DN-asen und RN-asen nicht inaktiviert;

- es besitzt eine spezifische reversible Affinität für die Immunoglobuline G (IgG) (Fixierung an immobilisierten IgG bei neutralem pH-Wert und Elution bei saurem pH-Wert);

- es besitzt keine selektive Affinität für die Immunoglobuline M (IgM) (keine Fixierung an immobilisierten IgM bei neutralem pH-Wert);

- es Lnhibiert in vitro und in vivo die Bildung von ZeILen, die Immunoglobuline IgM (19S) und IgG (7S) enthalten, die gegen Antigene gerichtet sind, wie rota Blutkörperchen von Schafen in primärer und sekundärer Reaktion (reponses primaire et secondaire); - es Lst im Hinblick auf Lymphocytenkulturen nicht cyt^toxisch;

130048/0506

- 1ο -

- es entfaltet inhibierende Wirkungen auf die Transplantationsreaktion allogenen Ursprungs insbesondere von Zellen der allogenen Ratte geger. den Wirt b zw. Empfanger;
- es beeinflußt nicht merklich die Fähigkeit von Milzzellen der Maus, die zuvor in seiner Gegenwart inkubiert und an Mäuse verabreicht worden sind, die ihrerseits zuvor einer letalen Bestrah]ung unterworfen worden sind, Milzkolonien in den Milzeai dieser Mäuse zu bilden;

- es ist im wesentlichen frei von einer inhibierenden Wirkung auf "unabhängige Antigene T", vie die Trinitrophenyl-lipopolysaccharide; und

- es inhibiert nicht die in vitro-Inkorporation von °H-Thymidin in Milzlymphocytenkulturen, die durch Mitogene, wie Phytohämagglutinin (PHA) und die Lipopolysaccharide (LPS), stimuliert worden sind.

Die Erfindung betrifft insbesondere von diesen Zuberei-

3 tungen jene, die die Inkorporation von H-Thymidin in Milzlymphocytenkulturen, die durch Mitogene, wie PHA und LPS, stimuliert worden sind, nicht merklich inhibieren.

Insbesondere betrifft die Erfindung weiterhin eine Zubereitung, die die folgenden Reinheitseigenschaften aufweist:

- sie wird von einem in Äthylacetat gepreßten Aluminiumoxidpulver absorbiert und kann von diesem unter den oben angegebenen Bedingungen wieder eluiert werden;

- ausgehend von einer Lösung dieser Zubereitung in Wasser kann man die Zubereitung auf eine Cellulose-Dünr.schichtchromatographieplatte auftragen und mit einer Mischung aus 4o Vol.-Teilen Butylalkohol, 15 Vol.-Teilen Essigsäure und 25 Vol.-Teilen Wasser

130048/0506

3025087

unter Bildung eines Fleckens mit einem R -Wert zwischen o,43 und o,21 eluieren; - sie besitzt ein Ultraviolett-Absorptioasmaximum bei 22o nm und
- sie enthält das "hochgereinigte Produkt".

Sie betra fft weiterhin eine noch stärker gereinigte Fraktion, die man aus einer Lösung der oben genannten Fraktion in einer Mischung aus 75 Vol.-Teilen Methanol und 25 Vol.-Teilen Wasser, die man einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie in einer Säule mit einem Innendurchmesser von 4 mm und einer Länge von 3o cm, die Siliciumcioxidteilchen mit einer Teilchengröße von etwa 1o,um, die mit aliphatischen C18-Ketten gepfropft sind, enthält, wie sie im Handel unter der Bezeichnung " ,uBondapack-C18' bekannt ist, unter einem Durchsatz von 1 ml/ Minute unterwirft, erhalten kann, wobei diese noch weiter gereinigte Fraktion in dem Elutionsvolumen enthalten ist, das zwischen 14 Minuten und 3ο Sekunden und 18 Minuten eluiert wird.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin das oben definierte "hochgereinigte Produkt" als solches.

Die erste der oben definierten Zubereitungen erhält man ausgehend von einer Fraktion FA, wie sie in der veröffentlichten französischen Patentanmeldung Nr. 76 23473 vom 3o. Juli 1976 (Veröffentlichungs-Nr. 2 359 612) definiert ist. Es handelt sich insbesondere um die Fraktion, die als eine aktive Fraktion definiert ist, die die folgenden biologischen und physiko-chemischen Eigenschaften aufweist:

a) sie inhibiert in vitro und in vivo die Inkorporation von 3-Thymidin in die ADN von Lymphocytenzellen; b) sie entfaltet immunosuppressive Wirkungen, die sich

130048/0506

" ¹² ~ 3025037

durch einen antagonistischen Effekt im Hinblick auf die Stimulation von Lymphocyten durch Mitogene; durch die Fähigkeit, eine Verminderung der verzögerten Hypersensibilität gegenüber roten Blutkörperchen von Schafen einerseits und von Dinitrochlorbenzol andererseits zu induzieren; und durch eine Verminderung der Anzahl von gebildeten Plättchen oder Plaquen, die die Lymphocyten von Tieren induzieren/ die zuvor mit der genannten aktiven Fraktion behandelt worden sind, bei dem Test nach Jerne und Nordlin; manifestieren;

c) sie besteht aus Bestandteilen mit Molekulargewichten von weniger als I0000 und ergibt, wenn eine wäßrige Lösung dieser Fraktion einer Filtration tber einer Säule unterworfen wird, die ein Molekularsieb enthält, das durch ein vernetztes Polydextrangel cebildet wird, wie es im Handel unter der Bezeichnung "Sephadex G75" bekannt ist,und das zu Kügelchen mit einem Durchmesser von 4o bis 12o/um geformt ist, und die eine Fraktionierung der Mischung in Bestandteile, deren Molekulargewichte zwischen etwa 5ooo und 5oooo liegen, ermöglicht, ein aktives Eluat, das in einem Volumen V enthalten ist, das zwischen etwa.4 Vo und etwa 5 Vo (wobei Vo für das Totvolumen der Kolonne steht) eluiert wird; und

d) wenn eine Lösung dieser Fraktion einer Filtration über einem Polyacrylamidgel für chromatograph.Lsche Zwecke, wie es im Handel unter der Bezeichnung "3iogel P2" erhältlich ist und in Form von Kügelchen mit Durchmessern zwischen etwa 37 und 74 ,um vorliegt, welches Gel eine Ausschlußgrenze von I800 Dalton aufweist und für das Fraktionieren von Mischungen von Bestandteilen geeignet ist, deren Molekulargewichte in dem Entervall von I00 bis 1800 Dalton liegen, unterworfen wird, bei der Elution ihrer Bestandteile die wesentliche Aktivität in einem Elutionsvolumen V enthält, das zwischen etwa 2,5 Vo und etwa 4,1 Vo (wobei Vo für das Totvolumen

130048/0506

der Kolonne steht) eluiert wird.

Die noch weiter gereinigten erfindungsgemäß3n Produkte sind dadurch gekennzeichnet, daß ihre sämtlLehen Bestandteile in dem oben definierten Elektrophorese-System nicht wandern cder zur Anode wandern.

Die Erfindung betrifft weiterhin insbesondere die Produkte, die sämtliche oben angegebenen Eigenschaften besitzen und die insbesondere bestehen aus

- einer biologisch aktiven Substanz, die im Hinblick auf die genannte Elektrophorese-Technik im wesentlicher homogen ist, wenn diese mindestens ein weiteres Mal wiederholt wird, entweder bei einem pH-Wert von 4,4 oder bei einem pH-Wert von 6,5, wobei die genannte Substanz zur Anode wandert und bei einem pH-Wert von 6,5 durch eine Mobilität (Beweglichkeit) von -o,5 bis -o,8, insbesondere von -o,54 bis -o,79 im Vergleich zu der mit -1 definierten Mobilität (Beweglichkeit) von unter den gleichen Bedingungen einer Elektrophorese unterworfenen Asparaginsäure gekennzeichnet ist;

- einer biologisch aktive Substanz, die im Hinblick auf die genannte Elektrophorese-Technik im wesentliehen homogen ist, wenn diese mindestens ein zusätzliches Mal wiederholt wird, entweder bei einem pH-Uert von 4,4 oder bei einem pH-Wert von 6,5, wobei die Substanz zur Kathode wandert und gekennzeichnet ist durch eine Mobilität bei einem pH-Wert von 6,5 im Bereich von +0,8 bis +1,1, insbesondere von +o,83 bis +1,o7 im Vergleich zu der mit -1 definierten Mobilität der unter den gleichen Bedingungen einer Elektrophorese unterworfenen Asparaginsäure.;
- einer biologisch aktiven Substanz, die im Hinblick

130048/0506

auf die genannte Elektrophorese-Technik im wesentlichen homogen ist, wenn diese mindestens ein weiteres Mal wiederholt wird, entweder bei einem pH-Wert von 4,4 oder bei einem pH-Wert von 6,5, wobei die Substanz unter den genannten Bedingungen der Elektrophorese nicht merklich wandert; - einer biologisch aktiven Substanz, die bei der genannten Elektrophorese-Technik im wesertliehen homogen ist, wenn diese mindestens ein weiteres Mal wiederholt wird, entweder bei einem pH-Wert von 4,4 oder bei einem pH-Wert von 6,5, wotei die Substanz durch eine Wanderungsmobilität zvr Kathode von ο oder nicht wesentlich mehr als o,1 im Vergleich zu den Mobilitäten von Harnstoff bzw. Asparaginsäure, die ο bzw. -1 in Systemen tetragen, die darin bestehen. Lösungen des genannten Produkts in den folgenden Mischungen (Volumenverhältnisse): . ' Ameisensäure/Essigsäure/Wasser (1/4/45), pH-Wert

= 1,9;

Pyridin/Essigsäure/Aceton/Wasser (1/2/8/4o),

pH-Wert =4,4;

Pyridin/Essigsäure/Wasser (2o/1/18o), pH-Wert = 6,5,

einer Elektrophorese über einer dünnen Celluloseschicht zu unterwerfen, gekennzeichnet ist.

Weitere Eigenschaften der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen zur Bildung des erfindungsgemäßen Produkts und von Bedingungen, bei denen die Strukturanalysen durchgeführt wurden und von biologischen Untersuchungen, deren Ergebnisse eine Kennzeichnung des erfindungsgemäßen Produkts ermöglichen .

Ganz allgemein wurden zur Kennzeichnung oder zur Markie-

130048/0506

rung der Zubereitungen, Fraktionen oder aktiven Produkte, die nachfolgend beschrieben sind, Versuche herangezogen, die darir. bestehen, die Anzahl (Mittelwert) von Hämolyseplättcher oder Plaquen pro 1o Zellen bei den Tests nach Jerne (Jerne und Nordlin, Science 14o (1963) 4o5) oder Cunningham (Cunningham und Szenberg, Immunology 14 (1968) 599) aus2uzählen, die an Mäusen mit einem Alter von 8 bis 12 Wocher des Stammes DBA/2 χ C57B1/6 oder des Stammes BaIb C durchgeführt werden.

In jedem Fall wurden die Mäuse mit o,5 ml einer Suspension von roten Blutkörperchen von Schafen (GRM) (4 χ Io Zellen) sensibilisiert und es wurden die Antikörper produzierenden Zellen vier Tage später ausgezählt. Je nachdem erhielten die Tiere eine oder zwei Injektionen von o,2 bis ο,5 ml einer physiologischen Natriumchloridlösung, die die ^r/.u untersuchende Substanz enthielt (oder die nur die_phys:.ologische Salzlösung enthielt in dem Fall der Kontrolltiere) 24 oder 24 + 1 Stunde vor dem Zeitpunkt, da sie getötet wurden.

In einer Vielzahl von Fällen wurde der Einfluß von verschiedenem untersuchten chemischen oder biologischen Mitteln auf die biologische Wirksamkeit mit Hilfe dieser Testergebnisse bestimmt.

1. Herstellung der Zubereitung "FA 33"

Als Ausgangsmaterial verwendet man eine Fraktion FA, wie sie oben definiert wurde (oder wie sie in der Veröffentlichung von Lenfant und KoIl. "Purification of immunosuppressLve factors extracted from bovine spleen (lymphoid chalone)', veröffentlicht in "Cell Tissue Kinet." 11 (1978) 455-463 geschrieben ist).

130048/0506

3025Q97

Man löst 3oo mg dieser Fraktion in 3 ml Wasser und zentrifugiert die erhaltene Lösung während 15 Minucen bei 9ooo g. Dann verwirft man den Zentrifugenrückstand und versetzt die überstehende Flüssigkeit, die 6000 Einheiten U26o enthält (wobei eine Einheit U26o oder 1 U26o dec Menge der Substanz entspricht, die, wenn sie in 1 ml Wasser gelöst ist, eine Ab'sorption im Ultravioletten bei 260 nm ergibt, die einer optischen Dichte von 1 bei einer optischen Weglänge von 1 cm entspricht), mit 1 g Aluminiumoxid. Dann verdampft man die flüssige Phase und trocknet das Pulver im Vakuum. Das die absorbierte biologische Aktivität enthaltende Pulver wird dann in eine Säule mit einer Höhe von 4o cm und einem Innendurchmesser von 1,5 cm eingebracht, die mit neutralem Aluminiumoxid gefüllt ist, das zuvor in Äthylacetat gepreßt worden ist. Man eluiert eine Fraktion FA3, die die biologische Aktivität enthält, mit einer Lösungsmittelmischung, die 9 Vol.-Teile Äthylacetat, o,5-Vol.-Teile Methanol und o,25 Vol.-Teile Wasser enthält.

Das erhaltene Eluat (75o U26o) wird im Vakuum eingeengt und gefriergetrocknet. Dann löst man das gefriergetrocknete Produkt erneut in 1 ml einer Mischung aus 62 Vol.-Teilen Äthanol und 38 Vol.-Teilen Wasser. Die erhaltene Lösung wird über einer Sephadex LH-2o-Säule (mit eirer Höhe von 45 cm und einem Innendurchmesser von 1,5 cm) chromatographiert. Man gewinnt die aktive Fraktion FA3o in dem Volumen, das zwischen 1,9 Vo und 2,1 Vo eluiert wird.

In der Fig. 1 der beigefügten Zeichnung ist das Elutionsdiagramm der Fraktion FA33 dargestellt. Es :.st repräsentativ für die Änderungen der optischen Dichte (DO), die man in Abhängigkeit von dem Verhältnis Ve/Vo des eluierten Volumens Ve zu dem Totvolumen Vo beobachtet. Die optischen Dichten wurden bei 22o bzw. 26o nm cjemessen. Es wurden mehrere Fraktionen FA31, FA32, FA33, FA34 und FA35

130048/0506

(die in der Fig. 1 dargestellt sind) mit Hi Lfe des Jerne-Tests auf ihre biologische Aktivität untersucht. Die überwiegende Aktivität findet sich in der Fraktion FA33. Diese Fraktion wird gefriergetrocknet. Die Fraktion FA33 macht etwa 2 % der Fraktion FA3 aus (entsprechend der optischen Dichte).

2. Herstellung der Fraktion "FAC"

Man löst die Fraktion FA33 in einer Lösungsmittelmischung, die 6o VcI.-Teile Butylalkohol, 15 Vol.-Teile Essigsäure und 25 VcI.-Teile Wasser enthält. Dann bewirkt man eine Verteilur.gschromatographie in dünner Schicht auf einer Cellulostplatte (Schleicher-Schüll, Nr. F144o) unter Verwendung c.es gleichen Lösungsmittelsystems. Nach der EIution zeict die Untersuchung der Platte mit ultraviolettem Licht verschiedene Flecken. Man gewinnt die verschiedenen absorbierenden Zonen durch Abkratzen. Dann eluiert man die absorbierten Produkte mit einer Wasser/Äthanol-Mischung. Die wesentliche Aktivität findet sich in der Fraktion.· die nachfolgend als Fraktion "FAC" bezeichnet wird und die durch einen R_f-Wert in dem fraglichen Lösungsmittelmedium zwischen o,43 und o,21 gekennzeichnet ist.

Bei vergleichenden Untersuchungen der Fraktionen FA und FAC beobachtet man, daß die maximale Absorptionsbande, die in diim Ultraviolettspektrum der Fraktion FA bei 264 nm liegt, im Fall des Spektrums der Fraktion FAC nach 22o nm verschoben ist.

Die spek-rometrische Analyse der Fraktion FAC zeigt die Abwesenheit der Nucleoside Thymidin, Desoxyinosin und Desoxy cy tzidin.

130048/0506

Die Fraktion FAC ist frei von jeglicher Toxizität, insbesondere bei dem Trypanblau-Test. Ihre mit dem Jerne-Test gemessene biologische Aktivität ist um den Faktor 1o größer als die der Ausgangsfraktion FA. Sie ist praktisch frei von einer inhibierenden Wirkung im Hinblick auf die in vitro-Inkorporation von H-Thymidin in die ADN von Milzlymphocytenzellen.

3. Herstellung einer Fraktion FACL

Man unterwirft die in der obigen Stufe erhaltene Fraktion FAC, die gefriergetrocknet und erneut in eir.er Mischung aus 75 Vol.-Teilen Methanol und 25 Vol.-Teilen Wasser (in einem Gesamtvolumen von 1,5 ml) gelöst worden ist, einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie in einer Chromatographie-Vorrichtung (Waters) , die eine Säule; aus rostfreiem Stahl mit einem Innendurchmesser von 4 mm und einer" Länge von 3o cm enthält, die mit Siliciumdioxidteilchen,"die mit einer aliphatischen C18-Kette gepfropft sind, garniert ist, und die eine Teilchengröße im Bereich von 1o ,um aufweisen. Die Vorrichtung ist mit einem Detektor, der auf die optische Dichte bei 215 nm anspricht, versehen. Man verwendet als E lut:_ ons lösungsmittel eine Mischung, die 75 Vol.-Teile Methylalkohol und 25 Vol.-Teile Wasser enthält, unter Anwandung eines Durchsatzes von 1 ml/Minute.

In der Fig. 2 ist das Elutionsdiagramm der Fraktion FAC dargestellt (wobei dieses Diagramm die Änderrungen der optischen Dichte bei 215 nm in Abhängigkeit von der EIutionsdauer wiedergibt). Der größte Teil der Bestandteile der Fraktion FAC wird in den ersten Minuten eluiert. Es werden mehrere Peaks isoliert. Die Fraktion, die zwischen 14 Minuten und 3o Sekunden und 18 Mimten eluiert wird (Fraktion FACL) enthält den Hauptteil ler immuno-

130048/0506

suppressi/en Aktivität, wie es die Ergebnisse verdeutlichen, die mit den aufeinander folgenden Fraktionen, darunter den an, die als Fraktion FACL bezeichnet werden, erhalten wurden (wobei diese Untersuchungen darin bestehen, die Fraktionen im Vakuum einzuengen und gefrierzutrocknen, den Rückstand in einer physiologischen Salzlösung aufzunehmen und die Lösung 24 Stunden und 1 Stunde vor ihrem Tode an Mäuse zu injizieren, die für rote Blutkörperchen von Schafen sensibilisiert worden sind). Es zeigt sich, daß die Fraktion FACL 8o % der Aktivität der anfänglich eingesetzten Fraktion FAC enthält.

4. Herstellung einer hochgereinigten Zubereitung, ausgehend von der Fraktion FA durch Hochdruckflüssig-5 keitschromatographie

Man löst 1 g der Fraktion FA in 25 ml Wasser und trägt die _Lösur.g auf eine Hochdruckflüssigkeitschromatographie-Säule (Weters) auf, die mit gepfropften Siliciumdioxid beschickt ist (Bondapack-C18) und eine Korngröße von 7o/Um aufweist, wobei die Säule eine Länge von 3o cm und einen Durchmesser von 5,7 cm besitzt.

Man bewirkt die Elution mit einer Mischung, die 80 Vol.-Teile Methanol und 2o Vol.-Teile Wasser enthält unter einem Durchsat;: von 2oo ml/Minute bei einem Druck von 8 bis 9 bar. D:.e Hauptmenge der in der Fraktion FA enthaltenen Bestandteile geht in dem ersten Liter über, wobei die biologische Aktivität in einem Elutionsmedium eluiert wird, das zwischen dem 4. und dem 8. Liter des Eluats liegt.

Das entsprechende Eluatvolumen wird im Vakuum eingedampft, worauf d'3r Rückstand gefriergetrocknet und dann in 1 ml Wasser galöst wird.

13 0048/0 506

- 2ο -

Die erhaltene wäßrige Lösung wird auf eine Säule (Bondapack-C18) aufgetragen und mit einer Mischung aus 38 Vol.-Teilen Methanol und 62 Vol.-Teilen einer o,1 %-igen Lösung von Trifluoressigsäure in Wasser unter Anwendung eines Durchsatzes von 1 ml/Minute eluiert. Die aktive Fraktion wird in dem Volumen aufgefangen, das zwischen der 38. und der 42. Minute nach Beginn der Elution eluiert wird.

5. Herstellung des "hochgereinigten Produkts" ("SDIP")

Man unterwirft eine Fraktion FAC einer Dünnschichtchromatographie über Cellulose (MN 3oo) in dem Eutanol/Essigsäure/Wasser-System (6o/15/25). Man lokalisiert die aktiven Fraktionen bei R_f-Werten zwischen o,2 und o,32,

o,45 und o,53 bzw. o,73 und ο,83. Man gewinr.t diese Fraktionen und unterwirft sie ihrerseits einer Dünnschichtelektrophorese über Cellulose (MN Cell-3oo uv 254) in einem Pyridin/Essigsäure/Aceton/Wasser-Puffer (1/2/8/ 4o) mit einem pH-Wert von 4,4 bei einer Spannung von 5oo V.

Die aktiven Fraktionen teilen sich in mehrere Unterfraktionen, von denen zwei aktive Substanzen zur Anode wattdern, während eine nicht wandert. Die beiden aktiven Substanzen, die das ultraviolette Licht schwach zu ab-, sorbieren scheinen, können weder mit dem Reagens Ninhydrin-Collidin noch mit Fluoreszamin wegen ihrer geringen Menge nachgewiesen werden. Die in den beiden Fraktionen enthaltenen Substanzen, die zur Anode gewandert sind, werden vereinigt. Sie bilden das erfindungsgemäße hochgereinigte Produkt, das im folgenden als "SDIP" bezeichnet wird (die Abkürzung für den englischen Ausdruck "Spleen Derived Immunosuppressive Peptide").

130048/0506

Es hat sich gezeigt, daß das Produkt SDIP durch Pronase und Trypsin inaktiviert wird, jedoch durch Leucin-aminopeptidasen, DN-asen und RN-asen nicht aktiviert wird und insbesondere:

die Behandlung mit Pyroglutamat-aminopeptidase (o,o5 in PhoEphatpuffer, o,o1 m Mercaptoäthanol, 0,001 m ÄthylendicJtiin-tetraessigsäure, 2 Stunden, 37°C) führt zu einem vollständigen Verlust der biologischen Aktivität; somit wird die terminale NiU-Gruppe durch einen Pyroglutamylring blockiert. Dieses Ergebnis wird durch die Anwesenheit eines starken Fragmentierungspeaks mit einem m/e-Wert von 84 in dem Massenspektrum, der für diese Gruppierung charakteristisch ist, bestätigt; und

die Behandlungen mit den Carboxypeptidasen A und B io-, 2 η N-Äthylmorpholin-acetat-Puffer, pH-Wert = 8,5, 2 Stunden, 37°C) führen ebenfalls zu einem Verlust der Aktivität. Dies weist darauf hin, daß das Molekül eine ::reie terminale COOK-Gruppe trägt und daß die terminale Aminosäure entweder Lysin oder Arginin ist.

Biologische Eigenschaften

1. Untersuchung der Affinität des Produkts SDIP gegenüber immob i-lisierten Immunoglobulinen G und M (IgG und IgM)

a) Fixierung von Kaninchen IgG und IgM am Träger ("Sepharose 4B")

Man bereitet die "aktivierte" Sepharose ausgehend von 3o ml des Trägermaterials durch Behandeln bei 4°C in 12o ml Wasser (mit einem pH-Wert von 1o,2) mit 60 mg BrCN. Anschließend wäscht man das Trägermaterial mit

130048/0506

2 1 Boratpuffer (ο,2 m, pH-Wert =8,4) urd bewirkt die Kupplung in diesem Puffer bei 4 C während 24 Stunden mit 23 mg IgG. Nach dem Filtrieren urd Waschen mit 5oo ml des PBS-Püffers (o,1 m Phosphatpuffer, 8,5 g NaCl, pH-Wert = 7) wird das Trägermaterial bei 4°C unter Stickstoff aufbewahrt.

Die Immunoglobulin-Fraktion wird in einer Menge von o,3 mg/ml des Gels fixiert.
1o

Unter den gleichen Bedingungen bewirkt mein eine Fixierung des Kaninchen-IgM an dem gleichen Trägermaterial.

b) Chromatographie der aktiven Fraktion über einer "IgG-Sepharose"-Säule

Man äquilibriert das Gel (1o ml) mit einem Pyridiniumacetat-Puffer (o,o2 m, pH-Wert = 7). Dann trägt man 2o Dosierungen (d. h. das 2o-fache der Dosis, die eine Verminderung der Anzahl der Hämolyseplätzchen bei dem Jerne-Test von 5o % bewirkt) der aktiven Fraktion in diesem Puffer auf die Säule auf. Man elu:_ert die Säule dann nacheinander mit 2o ml des Pyrid:-niumacetat-Puffers (Fraktion 1) und dann mit 2o ml Essigsäure - (o,2o m, pH-Wert = 2,8)(Fraktion 2).

Die beiden Fraktionen werden gefriergetrocknet, erneut in einer physiologischen Lösung gelöst und durch Verabreichen an Mäuse mit Hilfe des Jerne-Tests untersucht. Die Fraktion 1 (das Produkt, das nit Pyridiniumacetat eluiert worden ist) führt zu keineir Verminderung der Zahl der Hämolyseplättchen bei dem Jerne-Test im Vergleich zu den Kontrollkulturen. Im Geqensatz dazu bewirkt die Fraktion 2 (die mit Essigsäure, pH-Wert = 2,8) eluiert worden ist) eine starke Verminderung der

130048/0506

Anzahl der Hamolyseplattchen von 1o Zellen, eine Verminderung, die die Reversibilität der Fixierung der aktiven Fraktionen an den immobilisierten IgG erkennen läßt. Im Gegensatz dazu beobachtet man keinerlei Fixierung der erfindungsgemäßen aktiven Fraktionen an immobilisierten IgM bei neutralem pH-Wert unter den oben angegebenen Bedingungen, im Gegensatz zu dem Verhalter gegenüber IgG.

2. Aktivität des Produkts SDIP auf die Bildung von Zellen, die IcM produzieren

a) In vii ro-Aktivität

Das Produkt SDIP wurde bei einer Variante des in vitro-Tests nach Mishell und Dutton (Science 153 (1966) 1oo4 bis 1oo5) untersucht. Dieser Test besteht darin, die Bildung von IgM-tragenden Zellen in einer Kultur von Milzlyinphocyten von Mäusen (6 χ 1o Zellen/ml) zu induzie::en. . Die Kultur wird während 5 Tagen bei 37 C in einer 5 % CO„ enthaltenden Luftatmosphäre durchgeführt. Das Kulturmedium besteht aus RPMI 164o, das mit 1 % Antibiotika, 1o % Kalbsfetenserum, 1 % Pferdeserum, 1 % Glutamin und 10 m Mercaptoäthanol ergänzt worden ist. Dann bestimmt man die Anzahl der IgM-tragenden Zellen durch Auszählen der Hamolyseplattchen oder PFC (Abkürzung des entsprechenden englischen Ausdrucks "Plaque forming cells") bei dem Cunningham-Test in getrennten Kulturen nach unterschiedlichen Dauern, die in Tagen angegsben sind.

Die erhaltenen Ergebnisse sind die folgenden:

a) Das Produkt SDIP ist am Ende der Differenzierungsperiode der Lymphocyten (4. Tag der Kultur) aktiv;

130048/0506

b) die Wirkungs/Dosis-Relation zeigt eine maximale inhibierende Wirkung (9o %) bei Dosierungen von 5 bis o,5 pg/ml. Man beobachtet eine Inhibie^rung der Wir-

-4 kung um 5o % bei Dosierungen im Bereich von 1o pg (wobei die Dosierungen mit dem Aminose.ure-Analysator ermittelt wurden).

b) In vivo-Aktivität

Man verabreicht das Produkt SDIP in Dosierungen von o,2 ng auf intraperitonealem Wege an Mäuse des Stammes BaIb C, die zuvor durch eine Injektion von GRM sensibilisiert worden sind, zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach dieser Sensibilisierung. 4 Tage später tötet man die Tiere und zählt die Anzahl der HJonolyseplaquen pro 1o Ze
Tests aus.

pro 1o Zellen unter den Bedingungen des Cunningham-

Die erhaltenen Ergebnisse lassen erkennen, daß das Produkt SDIP nicht aktiv ist, wenn es vor oder gleichzeitig mit den GRM verabreicht wird (oder während der entsprechenden Periode) . Im Gegensatz da::u beobachtet man eine Inhibierung um 9o %, wenn man das Produkt SDIP 3 Tage nach der Sensibilisierung gibt, d h. in der Endphase der Differenzierung der Lympocyten.

3. Wirkung des Produkts SDIP auf die Lymphocyten

Das Produkt SDIP ist nicht cytotoxisch im Hinblick auf Lymphocytenkultüren, deren Wachstumsbedingungen es nicht modifiziert.

■ Weiterhin inhibiert es nicht die Inkorporation oder die

3
Aufnahme von H-Thymidin in Milzlymphocytenkulturen, dl· mit den Mitogenen PHA oder LPS stimuliert worden sind.

130048/0506

" ²⁵ " 3Ö25097

Milzzelle ι von Mäusen des Stammes BaIb C wurden während 48 Stunden in Gegenwart eines Mitogens gezüchtet. Dann wurde radioaktives Thymidin während der sechs letzten Stunden der Kulturdauer zugesetzt. Das Produkt SDIP wird entweder zu Beginn der Kulturdauer oder 24 Stunden später zugesetzt. Es konnte keine Aktivität auf die Vermehrung der Milzlymphocyten B.(mit LPS stimuliert) oder die Milzlymphocyten T (mit PHA stimuliert) beobachtet werden.

4. Inhibierung der Reaktion des Transplantats gegen den Wirt unter der Einwirkung des Produkts SDIP

Man untersucht die Wirkung des Produkts SDIP auf die Splenomegalie, die sich bei mit 4oo r bestrahlten Mäusen des Stamires F1 (C57BL/6 χ DBA/2) entwickelt, bei denen eine Reaktion des Transplantats gegen den Wirt durch die Transplantation von Milzzellen des Stammes C57BL/6 induziert" worden ist. Das Produkt SDIP erweist sich als Inhibitor dieser Reaktion entweder in vivo, wenn es den Empfängern gleichzeitig mit dem Transplantat verabreicht wird, oder in vitro, wenn die Zellen mit dieser Fraktion vor der Transplantation inkubiert werden (in Dosierungen im Bereich von pg/ml). Die dieser Behandlung unterworfenen Milzzellen zeigen keinerlei Verminderung ihrer Fähigkeit zur Bildung von Milzkolonien (CFU ) in der Milz von tödlich hiestrahlten Mäusen des Stammes C57BL/6. Das Produkt SDII¹ übt somit keinerlei inhibierende oder cytotoxische Wirkung auf die hämopoetischen Vorläufer aus.

5. Inaktivität des Produkts SDIP gegenüber einem "unabhängicfen Antigen T": dem TNP-LPS

Es konnte* keinerlei Wirkung des Produkts SDIP auf die Bildung von Antikörpern gegen den Trinitrophenylrest in KuI-türen festgestellt werden, die drei oder vier Tage in Ge-

130048/0506

genwart des Antigens gezüchtet worden sind.

Die im wesentlichen homogenen, biologisch aktiven Substanzen, die unter den oben definierten Bedingungen, ausgehend von dem Produkt SDIP, erhalten werden könner, besitzen die gleichen biologischen Eigenschaften bei den verschiedenen Untersuchungen, die oben angegeben worden sand. Die erfindungsgemäßen Zubereitungen und Produkte ste]len somit biologische Reagenzien dar, die aufgrund ihrer beträchtlichen .Aktivität (in einer Dosis im Picogramm-Bereich im Fall des Produkts SDIP und im Bereich von einigen 1o Picogramm im Fall des Produkts FAC) als Vergleichsstandard zur Bewertung der immunosuppressiven Wirkung von verschiedenen untersuchten Substanzen verwendet werden können.

Weiterhin können sie mit geeigneten pharmazeutischen Trägermaterialien, Bindemitteln und/oder Hilfsstoffen, die für-den gewünschten Verabreichungsweg geeignet sind, zur Bildung von pharmazeutischen Zubereitungen vereinigt wer-

2ο den, insbesondere in Form von injizierbaren Lösungen, die zur Vorbeugung oder zur Behandlung von Erkramkungen verwendet werden können, bei denen eine nicht kontrollierte Bildung von Antikörpern erfolgt, wie Autoimnunkrankheiten, gewisse Formen des Rheumatismus und dergleichen. Aufgrund ihrer vollständigen Abwesenheit einer cytotoxischen Wirkung auch im Hinblick auf die. hämopoetischen Vorläufer, ist ihre Anwendung in den Fällen der Vorbeugung einer sekundären Transplantationsreaktion gegen den Empfänger indiziert, wie bei der Durchführung von Transplantationen, insbesondere bei der Transplantation von Knochenmark.

Gegenstand der Erfindung sind daher auch pharmazeutische Zubereitungen, die eine wirksame Dosis der orfindungsgemäßen Produkte enthalten und die insbesondere, jedoch nicht ausschließlich, in Form von sterilen i.njizierbaren Lösungen vorliegen.

130048/0506

Claims (1)

1. Patentanwälte Dipl.-Ing. H. We"l£x.ma"n-n, Dipr.rPhxs". Dr. K, Fincke

   Dipl.-Ing. R A.Weickmann, Dipl.-Chem. B. Huber Dr. Ing. H. LisKA

   8000 MÜNCHEN 86, DEN ~ 2. JUÜ 1980

   POSTFACH 860 820

   MÖHLSTRASSE 22, RUFNUMMER 98 39 21/22

   HtM/cb
   o294 8o o5

   AGENCE NATIONALE DE VALORISATION DE LA RECHERCHE (ANVAR)

   13, rue Madeleine Michelis 92522 Neuilly sur Seine/Frankreich

   Peptidzutereitung mit immunosuppressiven Eigenschaften

   Patentansprüche

   1. Zubereitung mit nicht-artspezifischer immunosuppressiver Wirkung und den folgenden Eigenschaften:

   a) ausgehend von einer Lösung dieser Zubereitung in Wasser kann man die Zubereitung durch Verdampfen des Wassers auf ei nem in einem Äthylacetat-Medium gepreßten Aluminiumoxidpulver fixieren und von diesem mit einer Mischung, die 9 Vol.-Teile Äthylacetat, ο,5 Vol.-Teile Metharol und o,25 Vol.-Teile Wasser enthält, eluieren;

   b) wenn man eine Lösung dieser Zubereitung in 1 ml einer Mischung, die 62 Vol.-Teile Äthanol und 38 Vol.-Teile Wasser enthält, in diesem Lösungsmittel über einer mit dreidimensionalem Polydextran, das über Ätherbindungen

   130048/0506

   an Glucosereste des Dextrans gebundene Hydroxypropylgruppen aufweist, wie es im Handel unter der-Bezeichnung "Sephadex LH-2o" erhältlich ist (Pharmacia), und das zu Kügelchen mit einem Durchmesser von 25 bis . locyum geformt ist,gefüllten Säule chromatographiert, ergibt sich ein aktives Eluat, das in einem Volumen V enthalten ist, das zwischen 1,9 Vo und e:wa 2,1 Vo (Vo = Totvolumen der Säule) eluiert wird· und c) sie enthält ein Produkt, das nachfolgend als "hochgereinigtes Produkt" bezeichnet wird und das die folgenden Eigenschaften aufweist:

   - es ist im wesentlichen frei von Bestandteilen, die zugleich bei den nachstehend definierten Tests biologisch inaktiv sind und durch Elektrophorese über einer dünnen Celluloseschicht aus einer Lösung dieses Produkts in einer Pyridin/Essigsäure/Aceton/Wasser-Mischung mit einem Volumenverhältnr.s von 1/2/8/ " 4o und einem pH-Wert von 4,4 bei einer Spannung von 5oo V von biologisch aktiven Bestandter.le abgetrennt

   2ο werden können;

   - es besitzt ein Molekulargewicht von weniger als 5ooo;

   - es besitzt eine (vollständige oder teilweise) Peptidnatur;

   - es kann weder mit dem Reagens Ninhydriii-Collidin noch mit Fluoreszamin in einer Dosis von 5 iiMol pro 2o cm-Dünnschicht nachgewiesen werden;

   - es enthält eine N-terminal mit einer Pyroglutamylgruppe blockierte Aminosäure;

   - es enthält eine durch Lysin oder Arginin gebildete C-terminale Säure;

   - es wird unter der Einwirkung der folgerden Enzyme inaktiviert: Pronase, Trypsin, Pyroglutamat-aminopeptidase und Carboxypeptidasen A und I;

   - es wird weder durch Leucin-aminopeptidcse noch durch Chymotrypsin inaktiviert;

   130048/0506

   3925017

   - es Vvird durch eine Behandlung mit DN-asen und RNasen nicht inaktiviert;

   - es 1esitzt eine spezifische reversible Affinität für die Immunoglobuline G (IgG) (Fixierung an immobilisierten IgG bei neutralem pH-Wert; Elution bei saurem pH-t'ert) ;

   - es tesitzt keine selektive Affinität für die Immunoglohuline M (IgM) (keine Fixierung an immobilisierten IgM bei neutralem pH-Wert); - es jnhibiert in vitro und in vivo die Bildung von Zellen, die Immunoglobuline IgM (19S) und IgG (7S) trac en, die gegen die Antigene gerichtet sind, wie rote Blutkörperchen von Schafen in primärer und sekunc.ärer Reaktion;

   - es :st im Hinblick auf Lymphocytenkulturen nicht

   cytotoxisch;
   -* es emtfaltet inhibierende Wirkungen auf die Trans-

   - plantationsreaktion allogenen Ursprungs, insbesondere "¹On Zellen der allogenen Ratte gegen den Wirt; - es beeinflußt nicht merklich die Fähigkeit von MiIzzei;.en der Maus, die zuvor in Gegenwart des Produkts inkubiert und an Mäuse verabreicht wurden, bevor diese einer letalen Bestrahlung unterworfen wurden, Mil:;kolonien in der Milz dieser Mäuse zu bilden; - es .st im wesentlichen frei von einer inhibierenden Wirkung auf "unabhängige Antigene T", wie die Trinitrophenyl-Lipopolysaccharide; und

   - es Lnhibiert nicht die in vitro-Inkorporation von

   H-Thymidin in Milzlymphocytenkulturen, die durch Mitogene, wie Phytohämagglutinin (PHA) und die Lipopolysaccharide (LPS), stimuliert worden sind.

   2. ZuDereitung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß sie die Inkorporation von H-Thymiiin in Milzlymphocytenkulturen, die durch Mito-

   130048/0506

   3Q25Q97

   gene, wie Phytohämagglutinin (PHA) und Lipopolysaccharide (LPS)₁ stimuliert worden sind_r nicht merklich inhibiert.

   3. Zubereitung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie von einem in Äthylacetat gepreßten Aluminiumoxidpulver absorbiert und unter den in Anspruch 1 angegebenen Bedingungen eluiert werden kann;

   ausgehend von einer Lösung dieser Zubereiturg in Wasser kann man die Zubereitung auf eine Cellulose-Dünnschichtchromatographieplatte auftragen und' mit eine r Mischung aus 4o Vol.-Teilen Butylalkohol, 15 Vol.-TeJlen Essigsäure und 25 Vol.-Teilen Wasser unter Bildung eines Fleckens mit einem R_f-Wert zwischen o,43 und o,21 elv.ieren; sie besitzt ein Ultraviolett-Absorptionsmaxi mum bei 22o nm und
   sie enthält das "hochgereinigte Produkt".

   4. Noch stärker gereinigte Fraktion, abgeleitet von der Zubereitung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dar durch gekennzeichnet, daß sie, wenn man sie in einer Mischung aus 75 Vol.-Teilen Methanol . und 25 Vol.-Teilen Wasser löst und einer Hoohdruckflüssigkeitschromatographie in einer Säule mit einem Innendurchmesser von 4 mm und einer Länge von 3o cm, die mit Siliciumdioxidteilchen, die mit aliphatischen C18-Ketten gepfropft sind, mit einer Teilchengröße von etwa 18/Um gefüllt ist, mit einem Durchsatz von 1 ml/Munute unterwirft, sie in dem Elutionsvolumen enthalten ist, das zwi- sehen 14 Minuten und 3o Sekunden und 18 Minuten eluiert wird.

   5. "Kochgereinigtes Produkt", wie es in Anspruch 1 definiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß seine sämtlichen Bestandteile in dem genannten Elektro-

   130048/0506

   phorese-System nicht wandern oder zur Anode wandern.

   6. Produkt nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet , daß es im wesentlichen aus einer biologisch aktiven Substanz besteht, die im wesentlichen im Hinblick auf die genannte Elektrophorese-Technik homogen ist, wenn diese mindestens ein weiteres Mal wiederholt wird, entweder bei einem pH-Wert von 4,4 oder bei einem pH-Wert von 6,5, wobei die Substanz zur Anode wandert

   5ο und bei eLnem pH-Wert von 6,5 durch eine Mobilität bei einem pH-/Jert von 6,5 von etwa -o,5 bis -o,8, insbesondere -o,54 ois -o,79 gegenüber der mit -1 definierten Mobilität von Asparaginsäure, die unter den gleichen Bedingungen einer Elektrophorese unterworfen wird, gekennzeichnet ist.

   7. Produkt nach Anspruch 4, dadurch g e kejn-nzeichnet , daß es im wesentlichen aus einer biologisch aktiven Substanz besteht, die im Hinblick auf die genannte Elektrophorese-Technik im wesentlichen homogen ist, wenn diese mindestens ein weiteres Mal wiederholt vvird, entweder bei einem pH-Wert von 4,4 oder bei einen pH-Wert von 6,5, wobei die Substanz zur Kathode wandert und gekennzeichnet ist durch eine Mobilität bei einerr pH-Wert von 6,5 im Bereich von +0,8 bis +1,1 und insbesondere von +o,83 bis +1,o7 gegenüber der mit -1 definierten Mobilität der Asparaginsäure, die unter den gleichen Bedingungen der Elektrophorese unterworfen wird.

   8. Produkt nach Anspruch 4, dadurch g e kennzeichnet, daß es im wesentlichen aus einer biologisch aktiven Substanz besteht, die im Hinblick auf die ςenannte Elektrophorese-Technik im wesentlichen homogen ist, wenn diese mindestens ein weiteres Mal wie-

   130048/0506

   derholt wird, entweder bei einem pK-Wert von 4,4 oder bei einem pH-Wert von 6,5, wobei die Substanz unter den definierten Elektrophorese-Bedingungen nicht merklich wandert.

   9. Produkt nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch eine Wanderung smobi Ii tä-f: zur Kathode von O oder nicht wesentlich mehr als 0,1 gegenüber den Mobilitäten von Harnstoff bzw. Asparaginsäure, die definitionsgemäß O bzw.-1 bei Systemen betragen- die darin bestehen, Lösungen des genannten Produkts in den folgenden Mischungen (Volumenverhältnisse): Ameisensäure/Essigsäure/Wasser (1/4/45), pH-Wert =1,9; Pyridin/Essigsäure/Aceton/Wasser (1/2/8/4o), pH-Wert= 4,4; und

   Pyridin/Essigsäure/Wasser (2o/1/18o), pH-Wert = 6,5, einer Elektrophorese über einer dünnen Celluloseschicht zu unterwerfen.

   1 ο. Fraktion nach Anspruch 1, dadurch g e kennzeichnet, daß dann, wenn si a in einer Mischung aus 38 Vol.-Teilen Methanol und 62 Vol.-Teilen einer o,1 %-igen Lösung von TrifluoressLgsäure in VJasser gelöst wird und einer HochdruckflüssLgkeitschromatographie in einer Säule mit einer Höhe von 3o cm und einem Durchmesser von 5,7 cm, die mit SilicLumdioxidteilchen, die mit einer aliphatischen C18-K2tte gepfropft sind und eine Teilchengröße im Bereich von 1o/Um aufweisen, gefüllt ist, unterwirft, sie in dem Volumen eluiert wird, das' zwischen der 38. und der 42. Minute naci Beginn der Elution eluiert wird.

   11. Biologisches Reagens, enthaltend das Produkt nach einem der Ansprüche 4 bis 1o.

   12. Zubereitung, enthaltend das Produkt aach einem der

   130048/0506

   Ansprüche 4 bis 1o in Kombination mit einem pharmazeuti schen Trägermaterial, Bindemittel und/oder Hilfsstoff.

   13. Zubereitung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß sie in einer injizier baren Form vorliegt.

   130048/0506