DE3006289A1 - Absorbens fuer den passiven agglutinationstest - Google Patents
Absorbens fuer den passiven agglutinationstestInfo
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Description
Absorbens für den passiven Agglutinationstest.
! Die passiven oder indirekten sowie die umgekehrt (reverse) pas- ;
;siven Agglutinationsteste stellen bekannte serologische Verfah-Iren
dar.
j In diesen Verfahren werden gewöhnlich als Träger tierische . Eryithrocyten,
z.B. von Vögeln oder Säugetieren, oder Zellen von iMikroorganismen verwendet· Diese Träger können Antigene oder Ani
tikörper adsorptiv gebunden halten. Dann werden sie als sensibi-'lisierte
Zellen bezeichnet. Diese sensibilisierten Zellen sind ;befähigt, mit komplementären, Antikörper oder Antigene enthal- ;
'tenden Reagentien Agglutinationsreaktionen zu geben, wobei die dabei erhaltenen Agglutinate es ermöglichen, optisch die Anwesenheit
von Antigenen oder Antikörpern festzustellen. Dieses Ver— ;fahren ist als Agglutinationstest bekannt. Das agglutinierte Pro-.
dukt flockt gegebenenfalls aus und fällt als Niederschlag auf den;
Boden des Testgefässes.
Die Agglutinationsteste werden in großem Umfang benutzt. Ihre
Durchführung bereitet jedoch wegen einer unerwünscht hohen Anzahl von falschen positiven Reaktionen, die auf die Anwesenheit
von falsch reagierenden (cross-reacting) Substanzen zurückzuführen sind, Schwierigkeiten. Es gibt eine Anzahl von Faktoren, die
diese unspezifischen Reaktionen verursachen und dadurch falsche positive Reaktionen hervorrufen. Ein Beispiel hierfür können Antikörper
sein, die mit den Träger-Erythrocyten oder -Zellen reagieren.
Alle diese Faktoren werden nachfolgend als "Anti-Träger" ,bezeichnet. Um die Anzähl der falschen positiven Reaktionen einzuschränken,
ist versucht worden, die Anti-Träger in einem Routineverfahren vor Durchführung des passiven Agglutinationstestes
durch Absorption zu entfernen.
j Die absorptive Entfernung von Anti-Trägern stellt eine bekannte I Technik dar. Gewöhnlich werden als Absorbentien die gleichen
ι Erythrocyten oder Zellen wie für die Träger benutzt, z.B. Ery-
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- V-.V tW- BAD ORIGINAL
throcyten von Vögeln oder Säugetieren, obgleich auch die Erythrocyten
von Reptilien oder Krüstentieren verwendet werden können. Alle diese Erythrocyten werden nachfolgend als tierische Erythrocyten
bezeichnet. Am häufigsten werden die von Hühnern, Truthähnen, Schafen, Hammel, Rindvieh (cattle), Schweinen, Kaninchen
oder Menschen "benutzt. Erythrocyten von Hühnern, und von Rindern werden gewöhnlich bevorzugt, weil sie besonders
:leicht verfügbar sind.
Als Zellen enthaltende~~MikrGorganismen wird z.B. Saccharomyces
cerevisiae oder Serratia marcescens der Vorzug gegeben.
Die Absorbentien sind Aldehyd-fixiert, z.B. durch Eintauchen in
0,1 bis 30 %ige wässrige lOrmaldehydlösungen bei einer Temperatur
von 4- bis 400C für 1 bis 200 Stunden. Aequivalente Aldehyd-Eixierungsverfahren,
bei denen z.B. Acetaldehyd, Glutaraldehyd oder Methylglyoxal verwendet werden, sind ebenfalls bekannt und können
in dem Verfahren der Erfindung angewendet werden.
Die Erfahrung hat gelehrt, daß die konventionellen Absorbentien zwei prinzipielle Nachteile aufweisen:
1) sie entfernen nicht alle störenden Beaktanten und
2) die bei der Reaktioif gebildeten Produkte lassen sich selbst
mit der Ultrazentrifuge nur schwer entfernen.
Aus diesen Gründen haben sich die konventionellen Absorptionsverfahren nicht als voll zufriedenstellend erwiesen.
Ziel der Erfindung war daher, neue Absorbentien zu entwickeln, mit denen praktisch alle Anti-Träger und andere Faktoren entfernt
werden, die die Spezifität und Zuverlässigkeit des passiven Agglutinationstestes stören.
Dieses Ziel ist gemäß Erfindung mit Absorbentien erreicht worden, die außer Aldehyd-fixierten Erythrocyten und Mikroorganismenzellen
Aluminiumhydroxid und Calciumphosphat enthalten. Mehr ins einzelne gehend: die Absorbentien der Erfindung sind Träger, die
tierische Erythrocyten oder Mikroorganismeneilen und - auf
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_ if. _
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Trockengewichtbasis - pro 100 Gwt. Träger 100 bis 400 Gwt. Aluminiumhydroxid
und 50 "bis 200 Gwt. Calciumphosphat enthalten.
Die-bevorzugte Form des Calciumphospiiats ist das see. Calcium- :
■ phospat CaHPO^ (oder CaHPO^. 2H2O'), es kann aber auch das tert-
; Calciumphosphat Ca,(I3O.)ρ verwendet werden»
Die Absorbentien können allein oder zusammen mit inerten Binde-'
mitteln, wie Stärke,. Ton, Talcum und dergleichen in Pulver- oder Teilchenform verwendet werden. Es hat sich jedoch als zweckmäßig
• erwiesen, die Absorbentien zusammen mit dem inerten Träger zu Tabletten oder anderen Formen für Testeinheiten zu verpresseh,
die genügend aktives Material für eine ausgewählte Anzahl von Testen liefern.
Das für die Erfindung geeignete Aluminiumhydroxid wird in Üblicher
Weise hergestellt. Eine Herstellungsmöglichkeit besteht darin, aus einer wässrigen Lösung eines Aluminiumsalzes» wie Aluminiumsulfat oder Alaun, durch Zusatz einer wässrigen Natrium- oder
Ammoniumhydroxidlösung Aluminiumhydroxidgel auszufällen und abzufiltrieren.
Das Gel (200 bis 800 g) kann mit 15 his 60 g pulverförmigem CaI-ciumphosphat
in eine Mischung übergeführt werden, die dann in 100 g einer Paste von Aldehyd-fixierten Erythrocyten oder Mikroorganismen
eil en eingerührt wird.
Die Mischung liefert nach dem Lyophilisieren im Vakuum und dem Pulverisieren die Produkte der Erfindung in Pulverform. Zur Herstellung
der Absorbentien in Tablettenform kann die weiter oben erhaltene Mischung mit 300 bis 500 g eines inerten Bindemittels,
wie Stärke, versetzt und dann zu Tabletten verpresst werden.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird wie folgt vorgegangen:
1) Zur Herstellung von Aldehyd-fixierten Erythrocyten oder Mikroorganismenzellen
werden zunächst die Erythrocyten in konventioneller Weise aus Tierblut durch Sedimentation - nach
Zusatz von einem Anticoagulans - und Abzentrifugieren des
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! Plasmas gewonnen. Die Zellen werden ebenfalls in konventioneli
ler Weise durch Isolierung der Mikroorganismen nach der Kulti-;
j vierung aus dem Kulturmedium gewonnen. Hierfür kann im Handel '
I erhältliche Trockenhefe "benutzt werden. '
I Die so erhaltenen Erythrocyten cder Mikroorganismenzellen '
' werden mit einer physiologischen Salzlösung oder einer Phos- ] phatpufferlösung gewaschen. 10Og der so erhaltenen Paste von
I Erythrocyten oder Mikroorganismenzellen werden mit 100 bis ; 1.000 ml einer 0,1 bis 30 %igen wässrigen Formaldehydlösung
' versetzt, die erhaltene Mischung bei einer Temperatur von etwa 4 bis 400G 1 bis 200 Stunden stehen gelassen, um die Erythrocyten
oder Mikroorganismenzellen zu fixieren. Die so fixierten Erythrocyten oder Mikroorganismenzellen werden dann
! mit physiologischer Salzlösung oder einer Phosphatpufferlösung
gewaschen und abfiltriert, wobei eine Paste mit einem Wassergehalt von etwa 40 % erhalten wird. :
ι 2) Zur Herstellung des Aluminiumhydroxidgels werden 860 g Alaun ,
in 10 1 Wasser gelöst und der erhaltenen Lösung 1 η wässrige NaOH-Iiösung zugetropft, um den pH-Wert der Lösung auf 5»2 einzustellen.
Der dabei erhaltene Al(OH),-Niederschlag wird abfiltriert
und mit einer Phosphatpufferlösung gewaschen, wobei eine Paste von Aluminiumhydroxid gel mit einem Wassergehalt von
etwa 40 % erhalten wird.
[ 3) Zur Herstellung des Absorbens in Tablettenform werden in 100 g
der in der oben angegebenen Weise erhaltenen Paste von fixierten Erythrocyten (oder Zellen) 500 g der Paste von Aluminiumhydroxidgel,
20 g Calciumphosphat (CaBPO^.2H2O) und 100 g Kar-
\ toffelstärke eingemischt. Die erhaltene Mischung wird 30 Stun-I
den im Vakuum lyophilisiert und pulverisiert, wobei das aktive. Absorbens in Form eines braunen Pulvers erhalten wird. 100 g
dieses Pulvers werden gründlich mit 2 g Talcum vermischt und zu Tabletten von 43 mg verpresst.
Zur Bewertung der in der oben angegebenen Weise erhaltenen Absorbentien
wurde deren Absorptionswirkung bei Hühnererythrocyten
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: entlialtenden Absorbentien in der folgenden Weise gemessen.
Eine Tablette (4-3 mg) des in der oben angegebenen Weise erhaltenen
Absorbens wurde zu 0,5 ml eines Verdünnungsmittels (eine Mii
schung die Kaninchen serum in einer Menge von 1 % in 0,15 M
Phosphat-gepufferter Salzlösung enthielt) gegeben, die erhaltene Dispersion mit 0,05 ml Anti-Hühnerserum (d.h. Anti-Hühnererythro-
■ cyten-Immunserum, da-durch erhalten, daß es Kaninchen gegenüber
mit Hühnererythrocyten immun gemacht worden ist) versetzt, gerührt, um die Adsorption zu unterstützen,und zentrifugiert, wobei
eine überstehende Flüssigkeit erhalten wurde. Diese überste-•
hende Flüssigkeit stellt das Anti-Hühnerserum dar, aus dem der
Anti-Träger und andere Faktoren entfernt worden sind. Das Anti-Hühnerserum
ist auf das 10-fache mit dem Verdünnungsmittel (mit · Phosphat gepufferte Salzlösung) verdünnt worden. 50 μΐ des AntiHühner
serums wurden mit dem Verdünnungsmittel von 1 : 20 bis 1 : 1.280 verdünnt. Die Agglutinationsteste der verdünnten Anti-Hühnerseren
wurden mit fixierten Hühnererythrocyten durchgeführt.
Bei den für die Vergleichszwecke durchgeführten Agglutinationstesten wurde das oben angegebene Verfahren wiederholt, jedoch
mit folgenden Abweichungen:
1) es wurden Aldehyd-fixierte Hühnererythrocyten (5 mg, die Menge der in einer Tablette Adsorptionsmittel enthaltenen Erythrocyten)
anstelle des Adsorptionsmittels der Erfindung als Adsorptionsmittel benutzt;
2) es wurde kein Adsorptionsmittel benutzt.
Die bei den Testen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt.
0 3 0035/0838
Absorbens Dilution 1:20 1:40 1:80 1:160 1:520 1:640 1:1280
Absorbens
der Erf in- + - · - - - - - -
dung .
Anti- fixierte
Hühner-Hühnerery- ++ + - —" - - —
serum throcyten
kein ++ + + „
Absorbens + + ++ + -
- » nicht agglutiniert
+ = rfenig agglutiniert
++ = agglutiniert :
+ = rfenig agglutiniert
++ = agglutiniert :
Bei weiteren Agglutinationstesten, die nach dem weiter oben an- i
gegebenen Verfahren durchgeführt wurden, wobei jedoch !
1) das Serum eines Patienten, dessen Blut einer externen Dialyes ;
unterworfen worden war,
2) mit Citrat behandeltes normales Humanplasma oder I
J>) mit Heparin behandeltes Humanplasma · :
anstelle von Anti-Hühnerserum verwendet worden war, wurden die in Tabelle II zusammengestellten Ergebnisse erhalten.
0 30035/0838
BAD ORIGINAL
Serum Absorbens oder
Plasma
1:20 1:40 1:80
3008289
Dilution 1:160 1:320
1:640 1:1280
Absorbens der Erfin-I dung
j Serum fixierte ;des Hühnerery-'
Pati- throcyten ;enten kein
Absorbens
Absorbens der Erfindung
mit fixierte Gitrat Hlihnererybehanthrocyten
deltes
Plasma
kein Absorbens
jmit
i Hepa-
: rin
verj setztes
• Plasma
i Hepa-
: rin
verj setztes
• Plasma
Absorbens der Erfindung
fixierte
Hühnerery
throcyten
kein Absorbens
Zur Bewertung der Absorbentien· der Erfindung wurde auch AntiSchaf-Serum (Anti-Hammel-Serum) (d.h. ein Anti- Schaf - (Hammel )-erythrocyten-Immunserum,
das durch Schaf-(Hammel)-erythrocyten Kaninchen gegenüber immun gemacht worden ist) benutzt.
Bei Agglutinationstesten, die nach dem weiter oben angegebenen Verfahren, jedoch mit der Abweichung-durchgeführt wurden, daß
Anti-Schaf-(Hammel)-Serum und
fixierte Schaf-(Hammel)-erythrocyten
fixierte Schaf-(Hammel)-erythrocyten
anstelle von Anti-Hühnerserum und fixierten Hühnererythrocyten benutzt wurde, wurden die in Tabelle III zusammengestellten Ergebnisse
erhalten.
03003^5/083^
ΒΛΟ ORIGINAL
3Γ06289
Absorbens Dilution
1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280
Absorbens
Schaf-· fixierte
(Harn- Schafery- +{■ ++ ++
Eiel)- throcyten
serum kein
Absorbens h( ++ ++
Diese Ergebnisse zeilen, daß die Absorbentien der Erfindung, die
fixierte Erythrocytes, Aluminiuiühydroxidgel und Calciuffl^EEospnatl,
den konventionellen Srythrocyten-absorbentien in der Absorption
von Faktoren, die beim passiven (indirekten) Agglutinationstest unspezifische .Reaktionen verursachen, überlegen sind.
Lie Absorbentien der Erfindung lassen sich nach der Reaktion von :
Cerum durch Zentrifugieren abtrennen. :
-3 wurde durch Vergleichaversuche auch festgestellt, daß Absorbentien,
die in analoger Weise aus Sac char omyces cerevisiae oder
^erratia marcetxeas - vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae 4195
TjJ1I oder Serratia marsescens 16 ATU - Aluminiumhydroxid und CaI-eiuinphosphat
hergestellt worden sind, den konventionellen, fixierte Mikroorganismen?,eil er;, enthaltenden Absorbentien überlegen
t.:.ind.
0 30035/0838 ~:M BAD OFHGfNAL
Claims (5)
1), Absorbens für den passiven Agglutinationstest, gekennzeichnet durch einen Träger, der durch Behandlung mit einem Aldehyd
fixierte Erythrocyten oder Mikroorganismenzellen und - auf Trockengewichtsbasis - pro 100 Gwt. Träger 100 bis 400 Gwt..
Aluminiumhydroxid und 50 bis 200 Gwt. Calciumphosphat enthält.
2) Absorbens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der
Träger als feste Dispersion in einem inerten Bindemittel vorliegt.
3) Absorbens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger als Aldehyd-fixierte Erythrocyten solche von
Hühnern, Truthähnen, Schafen, Hammel, Rindvieh, Schweinen, Kaninchen oder Menschen enthält.
4) Absorbens nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger als Aldehyd-fixierte Mikroorganismenzellen
solche von Saccharomyces ceruvisiae oder Serratia marcescens enthält.
5) Absorbens nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet,
daß der Träger als Calciumphosphat tertiäres und/oder sekundäres Calciumphosphat enthält.
030035/0838
BAD ORIGINAL
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| JP54019092A JPS5917388B2 (ja) | 1979-02-22 | 1979-02-22 | 間接凝集反応用吸収剤 |
Publications (2)
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|---|---|
| DE3006289A1 true DE3006289A1 (de) | 1980-08-28 |
| DE3006289C2 DE3006289C2 (de) | 1983-05-11 |
Family
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|
| DE3006289A Expired DE3006289C2 (de) | 1979-02-22 | 1980-02-20 | Adsorbens für den passiven Agglutinationstest |
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-
1979
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-
1980
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- 1980-02-22 FR FR8003945A patent/FR2449893A1/fr active Granted
- 1980-09-19 US US06/188,894 patent/US4335096A/en not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
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Also Published As
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| GB2044452A (en) | 1980-10-15 |
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