Procédé d'obtention d'une préparation stable, sensibilisée, d'érythrocytes La présente invention concerne un procédé d'ob tention d'une préparation stable, sensibilisée, d'éry- bhrocytes, propre à l'emploi pour les essais d'hémag- glutination indirecte ou passive, et la préparation d'érythrocytes stable sensibilisée, obtenue par ce procédé.
Les érythrocytes natifs et ceux traités par les procédés de l'art antérieur utilisables pour les essais d'hémagglutination directe tels que la détermination de groupes sanguins présentent l'inconvénient qu'ils se détériorent rapidement au stockage, de sorte que pour de nombreuses applications, ils deviennent inutilisables après environ 21 jours. En outre, les cellules natives ne sont pas aptes nu stockage par congélation sortant des milieux spéciaux et ne sont pas non plus satisfai sants après lyophilisation et reconstitution.
Les éry throcytes natifs sont aussi sensibles à la composition ionique, au pH et à la pression osmotique des milieux de suspension, de sorte qu'il existe des limitations indésirables au domaine d'essais auxquels on peut les utiliser.
Les érythrocytes qui sont enduits avec des anti gènes connus constituent une préparation connue pour l'utilisation de moyens d'essais pour des anticorps spécifiques à ces antigènes. Lorsque l'on met en contact avec les érythrocytes enduits un antisérum ou un sérum contenant l'anticorps soupçonné, il se pro duit une agglutination qui indique que l'anticorps sup posé est bien présent dans le sérum. L'homme de l'art sait que cette agglutination fournit des renseignements semi-quantitatifs sur la présence d'anticorps spécifiques et également des renseignements utiles sur les condi tions qui donnent lieu à la présence de ces anticorps.
On a rencontré de nombreux problèmes dans la préparation, le stockage et l'utilisation de ces érythro cytes enduits. Par exemple, pour résoudre les pro blèmes d'enduction pendant la préparation, on a utilisé des agents de couplage pour appliquer les antigènes aux érythrocytes.
Les problèmes peuvent aussi concerner d'une manière générale la stabilité des éry- throeytes dans les conditions de stockage ou leur sensi bilité dans des essais choisis d'hémagglutination pas sive et la reproductibilité de ces essais d'hémagglutina- tion. En outre, les cellules individuelles d'érythrocyte peuvent s'agglutiner ou présenter une hémagglutination non spécifique,
cette activité interférant avec les essais d'hémagglutination pour un facteur spécifique. On conserve ordinairement les érythrocytes enduits à l'état congelé, mais lorsque l'on dégèle les préparations congelées, il peut se produire une agglutination ou bien les cellules peuvent être détruites par hémolyse.
Il est souhaitable de pouvoir traiter les érybhrocytes de telle manière que l'on puisse y appliquer divers antigènes et que ces érythrocytes enduits puissent être utilisés comme réactifs sensibles pour l'hémagglutina- tion passive, dont l'essai soit fidèle et reproductible. Il est également souhaitable d'obtenir l'adsorption d'anti gène sans que soit nécessaire la présence d'agents de couplage ou d'autres étapes.
L'invention a donc pour objet un procédé d'obten tion d'une préparation stable, sensibilisé, d'érythro cytes, caractérisé en ce que l'on adsorbe sur lesdits érythrocytes, mis en jeu sous forme d'une préparation stabilisée, un ou plusieurs antigènes et/ou anticorps.
Selon le procédé, on obtient une préparation d'éry throcytes enduits avec divers antigènes ou anticorps, qui peut être efficacement emballée et stockée pendant des périodes prolongées, jusqu'à ce qu'on la soumette aux essais particuliers d'hémagglutination passive.
L'invention concerne aussi les préparations stables d'érythrocytes sensibilisées, c'est-à-dire améliorées, par une méthode de potentialisation. Le terme potentialisa tion indique le conditionnement des cellules de manière à augmenter le titre d'hémagglutination de la prépara tion.
L'invention est illustrée par la description qui suit. On exposera d'abord le mode selon lequel on peut obtenir la préparation d'érythrocytes stabilisée; à cet égard, il .importe de noter que la préparation d'érythro cytes stabilisée peut, en outre, faire l'objet de différents traitements d'activation, avant d'être mise en jeu dans le procédé selon l'invention.
On recueille des érythrocytes natifs dans les sang complet de divers animaux tels que lapins, rats., pigeons, moutons, poulets et aussi de l'homme. On traite l'échantillon de sang par des solutions isotoni- ques classiques d'anticoagulants, on passe ensuite les érythrocytes, par exemple par centrifugation, et on les lave avec des solutions-tampons compatibles ayant un pH sensiblement neutre pour éviter l'hémolyse des éry throcytes et pour éliminer du sérum des. substances indésirables qui peuvent être présentes sur les érythro cytes.
On prépare une suspension des érythrocytes lavés dans la solution-tampon neutre à une concentration faible de préférence inférieure à environ 10 % en volume. On traite les érythrocytes avec une faible quantité d'aldéhyde pyruvique, par rapport au volume des érythrocytes, pendant un temps suffisant pour donner aux érythrocytes la stabilité souhaitable, par exemple pendant une nuit, en agitant.
Après ce stade de traitement à l'aldéhyde pyruvique, on lave plusieurs fois les érybhrocytes pour éliminer l'excès d'aldéhyde pyruvique et les autres substances qui peuvent s'être formées à partir du sérum. On soumet ensuite les éry throcytes traités à l'aldéhyde pyruvique à l'action d'une faible quantité de formaldéhyde par rapport au volume d'érythrocyte et on élimine l'excès de formal- déhyde par plusieurs lavages au moyen d'une solution tamponnée.
Les traitements précédents par l'aldéhyde pyru vique et par le formaldéhyde peuvent être désignés ensemble par l'expression double traitement aux aldé hydes pour obtenir une préparation stabilisée d'éry- throcytes .
De préférence, le traitement à l'aldéhyde pyruvique doit précéder le traitement au formaldéhyde car on a trouvé qu'avec beaucoup d'érythrocytes, un traitement initial au formaldéhyde tend à endommager ces cel lules;
l'ordre préféré est donc recommandé comme pra tique habituelle. Toutefois, il est bien entendu qu'avec certains érythrocytes, un traitement initial au formaldé- hyde peut ne pas être particulièrement contre-indiqué et par conséquent, dans certains cas, un traitement ini tial au formaldéhyde peut encore conduire à des résul tats avantageux, aussi cet ordre des traitements est préféré.
Les préparations stabilisées d'érythrocytes peuvent être conservées pendant des périodes de temps nota bles sans qu'il se produise de phénomènes indésirables d'hémolyse, d'agglutination ou qu'il se présente d'au tres caractéristiques indésirables.
La préparation d'érythrocytes stabilisée ci-dessus peut être transformée en une préparation stable d'éry throcytes enduits, par mise en contact d'un échantillon d'érythrocyte traité aux aldéhydes avec un antigène, puis une ou plusieurs étapes de lavage pour éliminer l'excès d'antigène. En général, les érythrocytes stabi lisés sont enduits avec des antigènes dans une solution stabilisée à un pH inférieur à 7 et de préférence tam ponnée à un pH d'environ 3,6 à environ 6. Pour les antigènes du type polysaccharide tels que l'endotoxine de E. coli, l'enduction peut être effectuée à pH 7.
On obtient une sensibilité supérieure lorsque les érythro cytes traités sont conditionnés par agitation dans la solution tamponnée pendant d'enduction est habituelle ment terminée en environ 1 heure mais peut parfois nécessiter jusqu'à 24 heures. On préfère une tempéra ture d'enduction de 24 C; des températures de 50 C et supérieures produisent des préparations d'érythro cytes ayant une sensibilité réduite.
Les conditions précédentes peuvent varier un peu pour les différents antigènes mais l'homme de l'art peut facilement déterminer les conditions préférées d'enduction en se référant à l'agglutination avec des dilutions en série d'un antisérum choisi. Par exemple, on peut injecter à un lapin diverses quantités d'anti gène identique à l'antigène adsorbé sur la préparation d'érythrocytes.
On recueille un échantillon de sérum dans lequel les anticorps seraient présents et on peut placer une série de dilutions de ce sérum dans, des pla teaux en matière plastique à fond en V auquel on ajoute un égal volume de la préparation stable d'éry throcytes traitée aux aldéhydes. On utilise un mélange de réaction contenant des cellules et le diluant comme témoin dans lequel les cellules forment un bouton dans le fond si la réaction est négative. L'aspect d'une surface mate indique une réaction positive d'aggluti nation qui indique une enduction satisfaisante. On doit soigneusement distinguer l'agglutination non spécifique.
Dans la présente description, l'expression enduc- tion par un antigène doit être comprise comme dési gnant une substance qui peut être un anticorps ou un antigène, sauf référence particulière à des antigènes ou des anticorps particuliers.
Les antigènes que l'on peut utiliser avec succès pour enduire les préparations d'érythrocytes stabilisées comprennent les antigènes du type protéine tels que l'albumine de sérum de boeuf ou BSA, le BSA insolu bilisé, l'albumine de sérum humain, la y-globuline de lapin, la y-globuline humaine, protéine M de strepto coque, antigène E de mauvaises herbes, antigènes du type polysaccharide tels que l'endotoxine de E.
coli (TE), ET acétylé, ET succinilé, ET désestérifié, ET désestérifié et bormacétylé, polyglucose synthétique, antigènes divers tels que RNA-bactériophage (acide ribonucléique), Qp, antigène d'entamoeba histolytica et d'autres encores. Un avantage particulier de l'inven tion est que la préparation stabilisée d'érythrocytes convient pour l'enduction par ces diverses substances de compositions chimique variées.
Selon un mode d'activation éventuel, on peut aug menter le titre d'hémagglutination de la préparation d'érythrocytes stabilisée et enduite en réduisant sa tem pérature jusqu'à environ -190 C et en la maintenant ensuite à une température de plusieurs degrés en des sous du point de congélation, de préférence à une tem pérature maintenue de manière uniforme et à environ -20 C, pendant une période d'environ 16 semaines.
On peut aussi obtenir des résultats également effi caces en environ 6 semaines en élevant périodiquement la température des érythrocytes stabilisés et enduits à 24 C pendant plusieurs heures et sans agitation, de préférence à des intervalles d'environ 6 ou 7 jours. Des cycles de plusieurs heures à quelques jours sont inefficaces.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'étape éventuelle d'activation, on traite les érythrocytes par une solution diluée d'un agent oxydant, le periodate de sodium étant un réactif approprié.
On peut conserver la préparation d'érythrocytes enduits, éventuellement activée, à l'état lyophilisé ou à une température d'environ -190 C jusqu'au moment nécessaire pour les essais d'hémagglutination. Le mode opératoire pour ces essais est bien connu de l'homme de l'art.
En général, on combine un échantillon de sérum animal que l'on suppose contenir l'anticorps avec les érythrocytes enduits dans un véhicule liquide pour déterminer sic l'agglutination se produit.
De manière analogue, on peut enduire les prépara tions d'érytrhocytes stabilisées avec un anticorps spéci fique, de sorte que dans l'essai ultérieur d'hémaggluti- nation, les érythrocytes s'agglutinent en présence d'un antigène spécifique libre. L'homme de l'art peut avan tageusement mettre en oeuvre d'autres variantes de l'essai d'hémagglutimation avec les préparations d'éry throcytes stables enduits, obtenues selon l'invention.
On peut utiliser l'essai d'hémagglutination passive pour déceler la présence de y-globuline sur les cellules, par exemple en présence d'antigène d'endotoxine, pour déceler l'infection virale, pour déterminer un type d'histocompatibilité, pour déceler des maladies par autoimmunisabion et pour d'autres phénomènes de ce type. On peut aussi utiliser les préparations d'érythro cytes enduits et stabilisés comme réactifs d'essais dans les analyses chimique quantitatives ou semi-quantita- tives, pour déceler la présence d'antigène.
<I>Obtention du matériel -de départ</I> a) Préparation stable d'érythrocytes traités aux aldéhydes On prélève par ponction cardiaque un échantillon de 20 ml de sang complet chez un lapin de 2-3 kg et on recueille cet échantillon dans une seringue conte nant un égal volume de solution stérile d'Alsever. Cette solution est en général isotonique et contient un anticoagulant à base de citrate de sodium, du chlorure de sodium, du dextrose et de l'eau distillée. On laisse reposer l'échantillon prélevé pendant une nuit à environ à 4 C et ensuite on le centrifuge à 1500 tr/mn pendant 10 minutes pour obtenir 10 ml d'érythrocytes de lapin tassés.
On combine ensuite les érythrocytes tassés avec 10 volumes d'une solution de tampon au phosphate 0,11 M à pH 7,2. On prépare cette solution tamponnée à partir de phosphate monopotassique et de phosphate dissodique par agitation tourbillonnaire. On centrifuge le mélange d'érythrocytes et de solutions- tampons et ensuite on le soumet à 5 lavages séparés par 10 volumes de la solution tamponnée ci-dessus pour éliminer les protéines et autres substances prove nant du sérum. On remet ensuite en suspension les éry throcytes lavés dans la solution tamponnée précédente pour obtenir une suspension d'érythrocytes de lapin à 8 % en volume.
Dans une fiole Erlenmeyer de 507 ml, on ajoute 125 ml de la solution tamponnée au phosphate conte nant 3 % en volume d'aldéhyde pyruvique et 125 ml de la suspension précédente à 8 % d'érythrocytes et on agite le mélange pendant environ 18 heures à la tem pérature ambiante. On filtre ensuite le mélange à tra vers un tampon de gaze pour séparer les plus gros débris cellulaires et ensuite on lave les érythrocytes 5 fois séparément avec 10 fois leur volume de la solution tamponnée de phosphate. On remet ensuite en suspen sion la préparation d'érythrocytes traités à l'aldéhyde pyruvique dans la solution tamponnée précédente avec une concentration à 10 % en volume.
On dilue à 8 % 125 ml de la suspension précédente traitée à l'aldéhyde pyruvique et on mélange avec 125 ml de la solution tamponnée de phosphate conte nant 3 % en volume de formaldéhyde. On agite le mélange pendant une nuit avec un agitateur magné tique à la température ambiante et ensuite on filtre le mélange à travers un tampon de gaze pour éliminer les débris cellulaires éventuels. On lave ensuite les éry throcytes traités à l'aldéhyde pyruvique et au formaldé- hyde 5 fois séparément par 10 fois leur volume de la solution tamponné précédente.
On remet ensuite en suspension la préparation d'érythrocytes traités aux aldéhydes à une concentration de 10 % dans la solu tion tamponnée précédente et on verse la suspension obtenue dans des récipients en verre que l'on bouche pour leur conservation. La préparation d'érythrocytes précédente traitée aux aldéhydes est stable pendant au moins 2 mois aux basses températures de l'ordre de 4 C ou indéfiniment, congelée dans l'azote liquide.
On peut activer la préparation d'érythrocytes bilisée mais, de préférence, on effectue l'étape d'acti vation seulement lorsque les érythrocytes ont été enduits.
La préparation d'érythrocytes ainsi stabilisée pos sède la plupart sinon tous les centres actifs de combi naison présents sur les érythrocytes natifs, ces centres actifs désignant en particulier des centres qui peuvent réagir avec un anticorps ou un virus.
b) Préparation d'érythrocytes stabilisés activés Le présent alinéa illustre l'augmentation du titre d'hémagglutination réalisé par fixation de fibrinogène aux cellules de la préparation d'érythrocytes stabilisée. On chauffe à 60 C pendant 1 heure du fibrinogène de boeuf à une concentration de 1 ;,/ml dans une solution tamponnée d'acétate 0,1 M à pH 4,0 et on refroidit à la température ambiante. On ajoute à la solution de fibrinogène une suspension à 10 % des érythrocytes traités aux aldéhydes obtenue par le procédé de l'exemple 1 et on agite pendant 1 heure à la tempéra ture ambiante.
On lave les érythrocytes stabilisés activés avec une solution tampon de phosphate à pH 7,2 et on ajuste la concentration d'érythrocytes à 10 % en volume. On utilise ultérieurement ces cellules avec des résultats supérieurs pour les déterminations de groupes sanguins.
c) Préparation d'érythrocytes stabilisés activés On traite des érythrocytes humains par les aldé hydes déjà mentionnés pour obtenir des érythrocytes humains stabilisés en suspension dans une solution tamponnée de phosphate à pH 7,2. On traite ensuite les érythrocytes stabilisés à 24 C pendant 15 minutes par une solution de periodate de sodium 0,00035 M et ensuite on lave jusqu'à élimination de ce réactif avec la solution tamponnée de phosphate pH 7,2.
Lorsqu'on les soumet à la réaction d'hémagglutination directe par l'antisérum de rat, les cellules stabilisées donnent une réaction à une dilution de 1:100 tandis que les cellules stabilisées, activées par la réaction d'oxydation, pré sentent l'hémagglutination à une dilution de 1:2000.
<I>Exemple 1</I> Préparation d'érythrocytes stabilisés activés enduits On lave 1 ml de la suspension à 10 % d'érythro cytes stabilisée activée, obtenue par la méthode décrite sous b), avec une solution tampon d'acétate 0,1 M à pH 4,0 et on remet en suspension dans 9 ml de la solution tampon d'acétate contenant 1 mg de BSA. On agite le mélange à la température ambiante pendant 2 heures et ensuite on lave 5 fois avec un excès de solu tion tamponnée au phosphate à pH 7,2. On utilise ensuite ces cellules pour des réactions d'hémagglutina- tion passive.
<I>Exemple 2</I> Préparation d'érythrocytes stabilisés enduits d'antigène Dans un tube à centrifugation conique de 12 ml à 24 C, on ajoute 1 ml de la suspension à 10 % de la préparation d'érythrocytes traitée aux aldéhydes selon a).
On lave ensuite cet échantillon avec une solution tampon d'acétate 0,1 M à pH 4,0. Les érythrocytes stabilisés ne sont pas hémolysés ni agglutinés à cette faible valeur de pH. On remet en suspension les cel lules de la préparation d'érythrocytes dans 9 ml de la solution tamponnée d'acétate à 24 C, à pH 4,0, .et on agite à ce pH et à cette température pendant 1 heure;
ensuite, on ajoute 1 ml de la solution tampon d'acétate contenant 1 mg de BSA. On centrifuge pendant 2 heures à la température ambiante le mélange d'anti gènes et d'érythrocytes traités aux aldéhydes et stabi lisés et ensuite on effectue 5 lavages séparés avec un excès d'une solution tamponnée de phosphat à pH 7,2. On remet en suspension les érythrocytes stables enduits de BSA dans la solution volume et on place des por tions aliquotes de 10 ml de cette suspension dans des bouteilles en verre de 20 ml que l'on bouche.
On congèle ensuite rapidement la quantité prédéterminée emballée de préparation d'érythrocytes traités aux aldéhydes stabilisés enduits, dans un réfrigérateur à azote liquide et on conserve à 20 C. <I>Exemple 3</I> Activation d'une préparation stable d'érythrocytes enduits On dégèle à une température ambiante de 24 C sans agitation des érythrocytes traités aux aldéhydes et enduits comme dans l'exemple 2, mais à un pH de 3,6, qui ont éé congelés à -196 C et conservés à 20 C pendant 6 jours, on les maintient à 24 C pendant 2 heures et après les avoir à nouveau congelés à -196 C,
on les porte à -20 C. On répète ce procédé une fois par semaine pendant 6 semaines.
On .congèle ensuite les érythrocytes enduits activés à -196 C et on les conserve à cette température jus qu'à ce qu'on en ait besoin pour l'essai d'hémaggluti- nation. On peut aussi lyophiliser la suspension de cel lules enduites activée et la reconstituer par addition d'eau avant l'utilisation.
Ce procédé augmente 30 fois le titre tandis qu'il ne fait que doubler le titre d'hémagglutination non spéci fique, augmentation qui est pratiquement insignifiante Si l'on répète à nouveau les cycles de congélation et dégel, on aboutit à une nouvelle augmentation du titre d'hémagglutination mais également une augmentation concurrente notable du titre d'hémagglutination non spécifique, de sorte qu'.l n'y a que peu d'avantage à prolonger ce traitement.
Le nombre optimum de cycles de congélation et dégel est lié à une préparation de cellules enduites par ticulière mais l'homme de l'art notera facilement que l'optimum est obtenu avec le cycle au-delà duquel l'augmentation du titre d'hémagglutination est accom- pagné par une augmentation notable du titre d'hémag- glutination non spécifique. Une préparation de cellules enduites optimale pour le sérum standard se révèle aussi optimale pour d'autres antisérums. Ainsi,
on peut éta lonner des sérums standards successifs par rapport à l'antisérum initial choisi.
<I>Exemple 4</I> Sensibilité de la préparation d'érythrocytes enduits par l'albumine de sérum de boeuf En suivant les procédés des exemples 1 et 2, on obtient une préparation d'érythrocytes dans laquelle des érythrocytes de lapin sont enduits d'albumine de sérum de boeuf (BSA). On suit un procéé semblable pour enduire une autre préparation d'érythrocytes par du BSA, mais les érythrocytes de cet échantillon sont stabilisés seulement par l'aldéhyde pyruvique et sans la séquence de traitement aux aldéhydes.
Les titres d'hémagglutination des deux préparations sont com parés dans le tableau 1 ci après pour illustrer la sensi bilité plus grande de la préparation d'érythrocytes enduits de BSA qui ont été stabilisés par le double traitement aux aldéhydes. Ce tableau illustre aussi les résultats de l'étape d'activation.
<I>Exemple 5</I> Préparation d'érythrocytes stabilisés activés enduits On traite comme décrit sous c), par le periodate de sodium 0,00035 M pendant 15 minutes à 24 C, une préparation d'érythrocytes stabilisée enduits d'antigène obtenue par le procédé de l'exemple 2. On lave les érythrocytes stabilisés activés avec une solution tam ponnée de phosphate pH 7,2 et on trouve qu'ils ont un titre d'hémagglutination de 1:2 400 000.
EMI0004.0063
<I>Tableau <SEP> 1</I>
<tb> <I>Comparaison <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction <SEP> d'hémagglutination <SEP> de</I>
<tb> <I>préparations <SEP> d'érythrocytes</I>
<tb> Cellules <SEP> enduites <SEP> pH <SEP> à <SEP> Durée <SEP> Titre <SEP> d'hémag l'enduc- <SEP> (heures) <SEP> glutination
<tb> tion
<tb> érythrocytes <SEP> traités*
<tb> à <SEP> l'aldéhyde <SEP> pyruvique <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/2.0'48
<tb> enduits <SEP> de <SEP> BSA
<tb> érythrocytes <SEP> stabilisés
<tb> traités <SEP> à <SEP> l'aldéhyde
<tb> pyruvique <SEP> et <SEP> au <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/40.000
<tb> formaldhyde, <SEP> enduits
<tb> de <SEP> BSA
<tb> érythrocytes <SEP> traités <SEP> à
<tb> l'aldéhyde <SEP> pyruvique <SEP> et
<tb> au <SEP> formaldéhyde,
<tb> enduits <SEP> de <SEP> BSA, <SEP> 3,
6 <SEP> 1 <SEP> 1/1.280.000
<tb> activés <SEP> par <SEP> 6 <SEP> cycles
<tb> d'activation <SEP> par <SEP> con gélation-dégel <SEP> (Ex. <SEP> 3)
<tb> érythrocytes <SEP> stabilisés
<tb> enduits <SEP> de <SEP> BSA <SEP> activés <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/2.400.000
<tb> par <SEP> oxydation
<tb> (exemple <SEP> 5)
EMI0005.0001
<I>Tableau <SEP> 1 <SEP> (suite)</I>
<tb> Cellules <SEP> enduites <SEP> pH <SEP> à <SEP> Durée <SEP> Titre <SEP> d7hémag l'enduc- <SEP> (heures) <SEP> glutination
<tb> tion
<tb> érythrocytes <SEP> stabilisés
<tb> activés <SEP> par <SEP> le <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/2.400.000
<tb> fibrinogène <SEP> de <SEP> BS<B>A</B>
<tb> (exemple <SEP> 1)
<tb> comparatif <I>Exemple 6</I> Variations représentatives des conditions d'enducation de préparations -d'érythrocytes traitées aux aldéhydes par divers antigènes On choisit un certain nombre d'antigènes pour en duire une préparation d'érythrocytes préparée comme décrit
sous a). On suit d'une manière générale le procédé d'enduction de l'exemple 2.
Le tableau II ci-après illustre les observations en- registrées que l'homme de l'art peut facilement déter miner en notant l'agglutination positive par des dilutions en série de sérum de lapin comme décrit précédemment.
EMI0005.0034
<I>Tableau <SEP> II</I>
<tb> Antigènes <SEP> Quantité <SEP> pH <SEP> Durée,
<tb> (mg/10 <SEP> ml) <SEP> heures
<tb> (à <SEP> 240 <SEP> C)
<tb> Albumine <SEP> de <SEP> sérum
<tb> de <SEP> boeuf <SEP> (BSA) <SEP> 1,0 <SEP> 4 <SEP> 2
<tb> BSA <SEP> insolubilisé <SEP> 0,1 <SEP> 4 <SEP> 2
<tb> Globuline <SEP> de <SEP> lapin <SEP> 0,01 <SEP> 5 <SEP> 1/6
<tb> Endotoxine <SEP> et <SEP> dérivés <SEP> 0,01 <SEP> 7 <SEP> 1/2
<tb> Polyglucose <SEP> 1,0 <SEP> 4 <SEP> 1/2
<tb> Bactériophage, <SEP> Q/3 <SEP> 0,3 <SEP> 5 <SEP> 4
<tb> Hormone <SEP> de <SEP> lutéine
<tb> <B>d</B>e <SEP> brebis <SEP> 0,004 <SEP> 4
<tb> Albumine <SEP> de <SEP> sérum
<tb> de <SEP> boeuf <SEP> (BSA) <SEP> 1,0 <SEP> 4 <SEP> 1
<tb> Albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> 1,0 <SEP> 3,6 <SEP> 1 <SEP> **
<tb> de <SEP> boeuf <SEP> (BSA)
<tb> * <SEP> -f- <SEP> 1 <SEP> heure <SEP> d'agitation <SEP> à <SEP> pH <SEP> 4 <SEP> avant <SEP> l'addition <SEP> d'antigène.
<tb> ** <SEP> -f- <SEP> 1 <SEP> heure <SEP> d'agitation <SEP> à <SEP> pH <SEP> 3,6 <SEP> avant <SEP> l'addition <SEP> d'antigène.