Procédé d'obtention d'une préparation stable, sensibilisée, d'érythrocytes La présente invention concerne un procédé d'ob tention d'une préparation stable, sensibilisée, d'éry- bhrocytes, propre à l'emploi pour les essais d'hémag- glutination indirecte ou passive, et la préparation d'érythrocytes stable sensibilisée, obtenue par ce procédé.
Les érythrocytes natifs et ceux traités par les procédés de l'art antérieur utilisables pour les essais d'hémagglutination directe tels que la détermination de groupes sanguins présentent l'inconvénient qu'ils se détériorent rapidement au stockage, de sorte que pour de nombreuses applications, ils deviennent inutilisables après environ 21 jours. En outre, les cellules natives ne sont pas aptes nu stockage par congélation sortant des milieux spéciaux et ne sont pas non plus satisfai sants après lyophilisation et reconstitution.
Les éry throcytes natifs sont aussi sensibles à la composition ionique, au pH et à la pression osmotique des milieux de suspension, de sorte qu'il existe des limitations indésirables au domaine d'essais auxquels on peut les utiliser.
Les érythrocytes qui sont enduits avec des anti gènes connus constituent une préparation connue pour l'utilisation de moyens d'essais pour des anticorps spécifiques à ces antigènes. Lorsque l'on met en contact avec les érythrocytes enduits un antisérum ou un sérum contenant l'anticorps soupçonné, il se pro duit une agglutination qui indique que l'anticorps sup posé est bien présent dans le sérum. L'homme de l'art sait que cette agglutination fournit des renseignements semi-quantitatifs sur la présence d'anticorps spécifiques et également des renseignements utiles sur les condi tions qui donnent lieu à la présence de ces anticorps.
On a rencontré de nombreux problèmes dans la préparation, le stockage et l'utilisation de ces érythro cytes enduits. Par exemple, pour résoudre les pro blèmes d'enduction pendant la préparation, on a utilisé des agents de couplage pour appliquer les antigènes aux érythrocytes.
Les problèmes peuvent aussi concerner d'une manière générale la stabilité des éry- throeytes dans les conditions de stockage ou leur sensi bilité dans des essais choisis d'hémagglutination pas sive et la reproductibilité de ces essais d'hémagglutina- tion. En outre, les cellules individuelles d'érythrocyte peuvent s'agglutiner ou présenter une hémagglutination non spécifique,
cette activité interférant avec les essais d'hémagglutination pour un facteur spécifique. On conserve ordinairement les érythrocytes enduits à l'état congelé, mais lorsque l'on dégèle les préparations congelées, il peut se produire une agglutination ou bien les cellules peuvent être détruites par hémolyse.
Il est souhaitable de pouvoir traiter les érybhrocytes de telle manière que l'on puisse y appliquer divers antigènes et que ces érythrocytes enduits puissent être utilisés comme réactifs sensibles pour l'hémagglutina- tion passive, dont l'essai soit fidèle et reproductible. Il est également souhaitable d'obtenir l'adsorption d'anti gène sans que soit nécessaire la présence d'agents de couplage ou d'autres étapes.
L'invention a donc pour objet un procédé d'obten tion d'une préparation stable, sensibilisé, d'érythro cytes, caractérisé en ce que l'on adsorbe sur lesdits érythrocytes, mis en jeu sous forme d'une préparation stabilisée, un ou plusieurs antigènes et/ou anticorps.
Selon le procédé, on obtient une préparation d'éry throcytes enduits avec divers antigènes ou anticorps, qui peut être efficacement emballée et stockée pendant des périodes prolongées, jusqu'à ce qu'on la soumette aux essais particuliers d'hémagglutination passive.
L'invention concerne aussi les préparations stables d'érythrocytes sensibilisées, c'est-à-dire améliorées, par une méthode de potentialisation. Le terme potentialisa tion indique le conditionnement des cellules de manière à augmenter le titre d'hémagglutination de la prépara tion.
L'invention est illustrée par la description qui suit. On exposera d'abord le mode selon lequel on peut obtenir la préparation d'érythrocytes stabilisée; à cet égard, il .importe de noter que la préparation d'érythro cytes stabilisée peut, en outre, faire l'objet de différents traitements d'activation, avant d'être mise en jeu dans le procédé selon l'invention.
On recueille des érythrocytes natifs dans les sang complet de divers animaux tels que lapins, rats., pigeons, moutons, poulets et aussi de l'homme. On traite l'échantillon de sang par des solutions isotoni- ques classiques d'anticoagulants, on passe ensuite les érythrocytes, par exemple par centrifugation, et on les lave avec des solutions-tampons compatibles ayant un pH sensiblement neutre pour éviter l'hémolyse des éry throcytes et pour éliminer du sérum des. substances indésirables qui peuvent être présentes sur les érythro cytes.
On prépare une suspension des érythrocytes lavés dans la solution-tampon neutre à une concentration faible de préférence inférieure à environ 10 % en volume. On traite les érythrocytes avec une faible quantité d'aldéhyde pyruvique, par rapport au volume des érythrocytes, pendant un temps suffisant pour donner aux érythrocytes la stabilité souhaitable, par exemple pendant une nuit, en agitant.
Après ce stade de traitement à l'aldéhyde pyruvique, on lave plusieurs fois les érybhrocytes pour éliminer l'excès d'aldéhyde pyruvique et les autres substances qui peuvent s'être formées à partir du sérum. On soumet ensuite les éry throcytes traités à l'aldéhyde pyruvique à l'action d'une faible quantité de formaldéhyde par rapport au volume d'érythrocyte et on élimine l'excès de formal- déhyde par plusieurs lavages au moyen d'une solution tamponnée.
Les traitements précédents par l'aldéhyde pyru vique et par le formaldéhyde peuvent être désignés ensemble par l'expression double traitement aux aldé hydes pour obtenir une préparation stabilisée d'éry- throcytes .
De préférence, le traitement à l'aldéhyde pyruvique doit précéder le traitement au formaldéhyde car on a trouvé qu'avec beaucoup d'érythrocytes, un traitement initial au formaldéhyde tend à endommager ces cel lules;
l'ordre préféré est donc recommandé comme pra tique habituelle. Toutefois, il est bien entendu qu'avec certains érythrocytes, un traitement initial au formaldé- hyde peut ne pas être particulièrement contre-indiqué et par conséquent, dans certains cas, un traitement ini tial au formaldéhyde peut encore conduire à des résul tats avantageux, aussi cet ordre des traitements est préféré.
Les préparations stabilisées d'érythrocytes peuvent être conservées pendant des périodes de temps nota bles sans qu'il se produise de phénomènes indésirables d'hémolyse, d'agglutination ou qu'il se présente d'au tres caractéristiques indésirables.
La préparation d'érythrocytes stabilisée ci-dessus peut être transformée en une préparation stable d'éry throcytes enduits, par mise en contact d'un échantillon d'érythrocyte traité aux aldéhydes avec un antigène, puis une ou plusieurs étapes de lavage pour éliminer l'excès d'antigène. En général, les érythrocytes stabi lisés sont enduits avec des antigènes dans une solution stabilisée à un pH inférieur à 7 et de préférence tam ponnée à un pH d'environ 3,6 à environ 6. Pour les antigènes du type polysaccharide tels que l'endotoxine de E. coli, l'enduction peut être effectuée à pH 7.
On obtient une sensibilité supérieure lorsque les érythro cytes traités sont conditionnés par agitation dans la solution tamponnée pendant d'enduction est habituelle ment terminée en environ 1 heure mais peut parfois nécessiter jusqu'à 24 heures. On préfère une tempéra ture d'enduction de 24 C; des températures de 50 C et supérieures produisent des préparations d'érythro cytes ayant une sensibilité réduite.
Les conditions précédentes peuvent varier un peu pour les différents antigènes mais l'homme de l'art peut facilement déterminer les conditions préférées d'enduction en se référant à l'agglutination avec des dilutions en série d'un antisérum choisi. Par exemple, on peut injecter à un lapin diverses quantités d'anti gène identique à l'antigène adsorbé sur la préparation d'érythrocytes.
On recueille un échantillon de sérum dans lequel les anticorps seraient présents et on peut placer une série de dilutions de ce sérum dans, des pla teaux en matière plastique à fond en V auquel on ajoute un égal volume de la préparation stable d'éry throcytes traitée aux aldéhydes. On utilise un mélange de réaction contenant des cellules et le diluant comme témoin dans lequel les cellules forment un bouton dans le fond si la réaction est négative. L'aspect d'une surface mate indique une réaction positive d'aggluti nation qui indique une enduction satisfaisante. On doit soigneusement distinguer l'agglutination non spécifique.
Dans la présente description, l'expression enduc- tion par un antigène doit être comprise comme dési gnant une substance qui peut être un anticorps ou un antigène, sauf référence particulière à des antigènes ou des anticorps particuliers.
Les antigènes que l'on peut utiliser avec succès pour enduire les préparations d'érythrocytes stabilisées comprennent les antigènes du type protéine tels que l'albumine de sérum de boeuf ou BSA, le BSA insolu bilisé, l'albumine de sérum humain, la y-globuline de lapin, la y-globuline humaine, protéine M de strepto coque, antigène E de mauvaises herbes, antigènes du type polysaccharide tels que l'endotoxine de E.
coli (TE), ET acétylé, ET succinilé, ET désestérifié, ET désestérifié et bormacétylé, polyglucose synthétique, antigènes divers tels que RNA-bactériophage (acide ribonucléique), Qp, antigène d'entamoeba histolytica et d'autres encores. Un avantage particulier de l'inven tion est que la préparation stabilisée d'érythrocytes convient pour l'enduction par ces diverses substances de compositions chimique variées.
Selon un mode d'activation éventuel, on peut aug menter le titre d'hémagglutination de la préparation d'érythrocytes stabilisée et enduite en réduisant sa tem pérature jusqu'à environ -190 C et en la maintenant ensuite à une température de plusieurs degrés en des sous du point de congélation, de préférence à une tem pérature maintenue de manière uniforme et à environ -20 C, pendant une période d'environ 16 semaines.
On peut aussi obtenir des résultats également effi caces en environ 6 semaines en élevant périodiquement la température des érythrocytes stabilisés et enduits à 24 C pendant plusieurs heures et sans agitation, de préférence à des intervalles d'environ 6 ou 7 jours. Des cycles de plusieurs heures à quelques jours sont inefficaces.
Selon un autre mode de mise en oeuvre de l'étape éventuelle d'activation, on traite les érythrocytes par une solution diluée d'un agent oxydant, le periodate de sodium étant un réactif approprié.
On peut conserver la préparation d'érythrocytes enduits, éventuellement activée, à l'état lyophilisé ou à une température d'environ -190 C jusqu'au moment nécessaire pour les essais d'hémagglutination. Le mode opératoire pour ces essais est bien connu de l'homme de l'art.
En général, on combine un échantillon de sérum animal que l'on suppose contenir l'anticorps avec les érythrocytes enduits dans un véhicule liquide pour déterminer sic l'agglutination se produit.
De manière analogue, on peut enduire les prépara tions d'érytrhocytes stabilisées avec un anticorps spéci fique, de sorte que dans l'essai ultérieur d'hémaggluti- nation, les érythrocytes s'agglutinent en présence d'un antigène spécifique libre. L'homme de l'art peut avan tageusement mettre en oeuvre d'autres variantes de l'essai d'hémagglutimation avec les préparations d'éry throcytes stables enduits, obtenues selon l'invention.
On peut utiliser l'essai d'hémagglutination passive pour déceler la présence de y-globuline sur les cellules, par exemple en présence d'antigène d'endotoxine, pour déceler l'infection virale, pour déterminer un type d'histocompatibilité, pour déceler des maladies par autoimmunisabion et pour d'autres phénomènes de ce type. On peut aussi utiliser les préparations d'érythro cytes enduits et stabilisés comme réactifs d'essais dans les analyses chimique quantitatives ou semi-quantita- tives, pour déceler la présence d'antigène.
<I>Obtention du matériel -de départ</I> a) Préparation stable d'érythrocytes traités aux aldéhydes On prélève par ponction cardiaque un échantillon de 20 ml de sang complet chez un lapin de 2-3 kg et on recueille cet échantillon dans une seringue conte nant un égal volume de solution stérile d'Alsever. Cette solution est en général isotonique et contient un anticoagulant à base de citrate de sodium, du chlorure de sodium, du dextrose et de l'eau distillée. On laisse reposer l'échantillon prélevé pendant une nuit à environ à 4 C et ensuite on le centrifuge à 1500 tr/mn pendant 10 minutes pour obtenir 10 ml d'érythrocytes de lapin tassés.
On combine ensuite les érythrocytes tassés avec 10 volumes d'une solution de tampon au phosphate 0,11 M à pH 7,2. On prépare cette solution tamponnée à partir de phosphate monopotassique et de phosphate dissodique par agitation tourbillonnaire. On centrifuge le mélange d'érythrocytes et de solutions- tampons et ensuite on le soumet à 5 lavages séparés par 10 volumes de la solution tamponnée ci-dessus pour éliminer les protéines et autres substances prove nant du sérum. On remet ensuite en suspension les éry throcytes lavés dans la solution tamponnée précédente pour obtenir une suspension d'érythrocytes de lapin à 8 % en volume.
Dans une fiole Erlenmeyer de 507 ml, on ajoute 125 ml de la solution tamponnée au phosphate conte nant 3 % en volume d'aldéhyde pyruvique et 125 ml de la suspension précédente à 8 % d'érythrocytes et on agite le mélange pendant environ 18 heures à la tem pérature ambiante. On filtre ensuite le mélange à tra vers un tampon de gaze pour séparer les plus gros débris cellulaires et ensuite on lave les érythrocytes 5 fois séparément avec 10 fois leur volume de la solution tamponnée de phosphate. On remet ensuite en suspen sion la préparation d'érythrocytes traités à l'aldéhyde pyruvique dans la solution tamponnée précédente avec une concentration à 10 % en volume.
On dilue à 8 % 125 ml de la suspension précédente traitée à l'aldéhyde pyruvique et on mélange avec 125 ml de la solution tamponnée de phosphate conte nant 3 % en volume de formaldéhyde. On agite le mélange pendant une nuit avec un agitateur magné tique à la température ambiante et ensuite on filtre le mélange à travers un tampon de gaze pour éliminer les débris cellulaires éventuels. On lave ensuite les éry throcytes traités à l'aldéhyde pyruvique et au formaldé- hyde 5 fois séparément par 10 fois leur volume de la solution tamponné précédente.
On remet ensuite en suspension la préparation d'érythrocytes traités aux aldéhydes à une concentration de 10 % dans la solu tion tamponnée précédente et on verse la suspension obtenue dans des récipients en verre que l'on bouche pour leur conservation. La préparation d'érythrocytes précédente traitée aux aldéhydes est stable pendant au moins 2 mois aux basses températures de l'ordre de 4 C ou indéfiniment, congelée dans l'azote liquide.
On peut activer la préparation d'érythrocytes bilisée mais, de préférence, on effectue l'étape d'acti vation seulement lorsque les érythrocytes ont été enduits.
La préparation d'érythrocytes ainsi stabilisée pos sède la plupart sinon tous les centres actifs de combi naison présents sur les érythrocytes natifs, ces centres actifs désignant en particulier des centres qui peuvent réagir avec un anticorps ou un virus.
b) Préparation d'érythrocytes stabilisés activés Le présent alinéa illustre l'augmentation du titre d'hémagglutination réalisé par fixation de fibrinogène aux cellules de la préparation d'érythrocytes stabilisée. On chauffe à 60 C pendant 1 heure du fibrinogène de boeuf à une concentration de 1 ;,/ml dans une solution tamponnée d'acétate 0,1 M à pH 4,0 et on refroidit à la température ambiante. On ajoute à la solution de fibrinogène une suspension à 10 % des érythrocytes traités aux aldéhydes obtenue par le procédé de l'exemple 1 et on agite pendant 1 heure à la tempéra ture ambiante.
On lave les érythrocytes stabilisés activés avec une solution tampon de phosphate à pH 7,2 et on ajuste la concentration d'érythrocytes à 10 % en volume. On utilise ultérieurement ces cellules avec des résultats supérieurs pour les déterminations de groupes sanguins.
c) Préparation d'érythrocytes stabilisés activés On traite des érythrocytes humains par les aldé hydes déjà mentionnés pour obtenir des érythrocytes humains stabilisés en suspension dans une solution tamponnée de phosphate à pH 7,2. On traite ensuite les érythrocytes stabilisés à 24 C pendant 15 minutes par une solution de periodate de sodium 0,00035 M et ensuite on lave jusqu'à élimination de ce réactif avec la solution tamponnée de phosphate pH 7,2.
Lorsqu'on les soumet à la réaction d'hémagglutination directe par l'antisérum de rat, les cellules stabilisées donnent une réaction à une dilution de 1:100 tandis que les cellules stabilisées, activées par la réaction d'oxydation, pré sentent l'hémagglutination à une dilution de 1:2000.
<I>Exemple 1</I> Préparation d'érythrocytes stabilisés activés enduits On lave 1 ml de la suspension à 10 % d'érythro cytes stabilisée activée, obtenue par la méthode décrite sous b), avec une solution tampon d'acétate 0,1 M à pH 4,0 et on remet en suspension dans 9 ml de la solution tampon d'acétate contenant 1 mg de BSA. On agite le mélange à la température ambiante pendant 2 heures et ensuite on lave 5 fois avec un excès de solu tion tamponnée au phosphate à pH 7,2. On utilise ensuite ces cellules pour des réactions d'hémagglutina- tion passive.
<I>Exemple 2</I> Préparation d'érythrocytes stabilisés enduits d'antigène Dans un tube à centrifugation conique de 12 ml à 24 C, on ajoute 1 ml de la suspension à 10 % de la préparation d'érythrocytes traitée aux aldéhydes selon a).
On lave ensuite cet échantillon avec une solution tampon d'acétate 0,1 M à pH 4,0. Les érythrocytes stabilisés ne sont pas hémolysés ni agglutinés à cette faible valeur de pH. On remet en suspension les cel lules de la préparation d'érythrocytes dans 9 ml de la solution tamponnée d'acétate à 24 C, à pH 4,0, .et on agite à ce pH et à cette température pendant 1 heure;
ensuite, on ajoute 1 ml de la solution tampon d'acétate contenant 1 mg de BSA. On centrifuge pendant 2 heures à la température ambiante le mélange d'anti gènes et d'érythrocytes traités aux aldéhydes et stabi lisés et ensuite on effectue 5 lavages séparés avec un excès d'une solution tamponnée de phosphat à pH 7,2. On remet en suspension les érythrocytes stables enduits de BSA dans la solution volume et on place des por tions aliquotes de 10 ml de cette suspension dans des bouteilles en verre de 20 ml que l'on bouche.
On congèle ensuite rapidement la quantité prédéterminée emballée de préparation d'érythrocytes traités aux aldéhydes stabilisés enduits, dans un réfrigérateur à azote liquide et on conserve à 20 C. <I>Exemple 3</I> Activation d'une préparation stable d'érythrocytes enduits On dégèle à une température ambiante de 24 C sans agitation des érythrocytes traités aux aldéhydes et enduits comme dans l'exemple 2, mais à un pH de 3,6, qui ont éé congelés à -196 C et conservés à 20 C pendant 6 jours, on les maintient à 24 C pendant 2 heures et après les avoir à nouveau congelés à -196 C,
on les porte à -20 C. On répète ce procédé une fois par semaine pendant 6 semaines.
On .congèle ensuite les érythrocytes enduits activés à -196 C et on les conserve à cette température jus qu'à ce qu'on en ait besoin pour l'essai d'hémaggluti- nation. On peut aussi lyophiliser la suspension de cel lules enduites activée et la reconstituer par addition d'eau avant l'utilisation.
Ce procédé augmente 30 fois le titre tandis qu'il ne fait que doubler le titre d'hémagglutination non spéci fique, augmentation qui est pratiquement insignifiante Si l'on répète à nouveau les cycles de congélation et dégel, on aboutit à une nouvelle augmentation du titre d'hémagglutination mais également une augmentation concurrente notable du titre d'hémagglutination non spécifique, de sorte qu'.l n'y a que peu d'avantage à prolonger ce traitement.
Le nombre optimum de cycles de congélation et dégel est lié à une préparation de cellules enduites par ticulière mais l'homme de l'art notera facilement que l'optimum est obtenu avec le cycle au-delà duquel l'augmentation du titre d'hémagglutination est accom- pagné par une augmentation notable du titre d'hémag- glutination non spécifique. Une préparation de cellules enduites optimale pour le sérum standard se révèle aussi optimale pour d'autres antisérums. Ainsi,
on peut éta lonner des sérums standards successifs par rapport à l'antisérum initial choisi.
<I>Exemple 4</I> Sensibilité de la préparation d'érythrocytes enduits par l'albumine de sérum de boeuf En suivant les procédés des exemples 1 et 2, on obtient une préparation d'érythrocytes dans laquelle des érythrocytes de lapin sont enduits d'albumine de sérum de boeuf (BSA). On suit un procéé semblable pour enduire une autre préparation d'érythrocytes par du BSA, mais les érythrocytes de cet échantillon sont stabilisés seulement par l'aldéhyde pyruvique et sans la séquence de traitement aux aldéhydes.
Les titres d'hémagglutination des deux préparations sont com parés dans le tableau 1 ci après pour illustrer la sensi bilité plus grande de la préparation d'érythrocytes enduits de BSA qui ont été stabilisés par le double traitement aux aldéhydes. Ce tableau illustre aussi les résultats de l'étape d'activation.
<I>Exemple 5</I> Préparation d'érythrocytes stabilisés activés enduits On traite comme décrit sous c), par le periodate de sodium 0,00035 M pendant 15 minutes à 24 C, une préparation d'érythrocytes stabilisée enduits d'antigène obtenue par le procédé de l'exemple 2. On lave les érythrocytes stabilisés activés avec une solution tam ponnée de phosphate pH 7,2 et on trouve qu'ils ont un titre d'hémagglutination de 1:2 400 000.
EMI0004.0063
<I>Tableau <SEP> 1</I>
<tb> <I>Comparaison <SEP> de <SEP> la <SEP> réaction <SEP> d'hémagglutination <SEP> de</I>
<tb> <I>préparations <SEP> d'érythrocytes</I>
<tb> Cellules <SEP> enduites <SEP> pH <SEP> à <SEP> Durée <SEP> Titre <SEP> d'hémag l'enduc- <SEP> (heures) <SEP> glutination
<tb> tion
<tb> érythrocytes <SEP> traités*
<tb> à <SEP> l'aldéhyde <SEP> pyruvique <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/2.0'48
<tb> enduits <SEP> de <SEP> BSA
<tb> érythrocytes <SEP> stabilisés
<tb> traités <SEP> à <SEP> l'aldéhyde
<tb> pyruvique <SEP> et <SEP> au <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/40.000
<tb> formaldhyde, <SEP> enduits
<tb> de <SEP> BSA
<tb> érythrocytes <SEP> traités <SEP> à
<tb> l'aldéhyde <SEP> pyruvique <SEP> et
<tb> au <SEP> formaldéhyde,
<tb> enduits <SEP> de <SEP> BSA, <SEP> 3,
6 <SEP> 1 <SEP> 1/1.280.000
<tb> activés <SEP> par <SEP> 6 <SEP> cycles
<tb> d'activation <SEP> par <SEP> con gélation-dégel <SEP> (Ex. <SEP> 3)
<tb> érythrocytes <SEP> stabilisés
<tb> enduits <SEP> de <SEP> BSA <SEP> activés <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/2.400.000
<tb> par <SEP> oxydation
<tb> (exemple <SEP> 5)
EMI0005.0001
<I>Tableau <SEP> 1 <SEP> (suite)</I>
<tb> Cellules <SEP> enduites <SEP> pH <SEP> à <SEP> Durée <SEP> Titre <SEP> d7hémag l'enduc- <SEP> (heures) <SEP> glutination
<tb> tion
<tb> érythrocytes <SEP> stabilisés
<tb> activés <SEP> par <SEP> le <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1/2.400.000
<tb> fibrinogène <SEP> de <SEP> BS<B>A</B>
<tb> (exemple <SEP> 1)
<tb> comparatif <I>Exemple 6</I> Variations représentatives des conditions d'enducation de préparations -d'érythrocytes traitées aux aldéhydes par divers antigènes On choisit un certain nombre d'antigènes pour en duire une préparation d'érythrocytes préparée comme décrit
sous a). On suit d'une manière générale le procédé d'enduction de l'exemple 2.
Le tableau II ci-après illustre les observations en- registrées que l'homme de l'art peut facilement déter miner en notant l'agglutination positive par des dilutions en série de sérum de lapin comme décrit précédemment.
EMI0005.0034
<I>Tableau <SEP> II</I>
<tb> Antigènes <SEP> Quantité <SEP> pH <SEP> Durée,
<tb> (mg/10 <SEP> ml) <SEP> heures
<tb> (à <SEP> 240 <SEP> C)
<tb> Albumine <SEP> de <SEP> sérum
<tb> de <SEP> boeuf <SEP> (BSA) <SEP> 1,0 <SEP> 4 <SEP> 2
<tb> BSA <SEP> insolubilisé <SEP> 0,1 <SEP> 4 <SEP> 2
<tb> Globuline <SEP> de <SEP> lapin <SEP> 0,01 <SEP> 5 <SEP> 1/6
<tb> Endotoxine <SEP> et <SEP> dérivés <SEP> 0,01 <SEP> 7 <SEP> 1/2
<tb> Polyglucose <SEP> 1,0 <SEP> 4 <SEP> 1/2
<tb> Bactériophage, <SEP> Q/3 <SEP> 0,3 <SEP> 5 <SEP> 4
<tb> Hormone <SEP> de <SEP> lutéine
<tb> <B>d</B>e <SEP> brebis <SEP> 0,004 <SEP> 4
<tb> Albumine <SEP> de <SEP> sérum
<tb> de <SEP> boeuf <SEP> (BSA) <SEP> 1,0 <SEP> 4 <SEP> 1
<tb> Albumine <SEP> de <SEP> sérum <SEP> 1,0 <SEP> 3,6 <SEP> 1 <SEP> **
<tb> de <SEP> boeuf <SEP> (BSA)
<tb> * <SEP> -f- <SEP> 1 <SEP> heure <SEP> d'agitation <SEP> à <SEP> pH <SEP> 4 <SEP> avant <SEP> l'addition <SEP> d'antigène.
<tb> ** <SEP> -f- <SEP> 1 <SEP> heure <SEP> d'agitation <SEP> à <SEP> pH <SEP> 3,6 <SEP> avant <SEP> l'addition <SEP> d'antigène.
Process for obtaining a stable, sensitized preparation of erythrocytes The present invention relates to a process for obtaining a stable, sensitized preparation of erybhrocytes, suitable for use for haemagination tests. - indirect or passive glutination, and the preparation of stable, sensitized erythrocytes, obtained by this process.
Native erythrocytes and those treated by the methods of the prior art which can be used for direct hemagglutination tests such as the determination of blood groups have the drawback that they deteriorate rapidly on storage, so that for many applications, they become unusable after about 21 days. In addition, native cells are not suitable for freezing storage from special media, nor are they satisfactory after lyophilization and reconstitution.
Native erythrocytes are also sensitive to the ionic composition, pH and osmotic pressure of suspension media, so there are undesirable limitations to the range of assays in which they can be used.
Erythrocytes which are coated with known antigens constitute a known preparation for the use of assay means for antibodies specific to these antigens. When an antiserum or serum containing the suspected antibody is brought into contact with the coated erythrocytes, agglutination occurs which indicates that the sup posed antibody is indeed present in the serum. Those skilled in the art know that this agglutination provides semi-quantitative information on the presence of specific antibodies and also useful information on the conditions which give rise to the presence of these antibodies.
Many problems have been encountered in the preparation, storage and use of these coated erythrocytes. For example, to solve coating problems during preparation, coupling agents were used to apply the antigens to erythrocytes.
Problems may also relate generally to the stability of erythroeytes under storage conditions or their sensitivity in selected non-passive hemagglutination assays and the reproducibility of such hemagglutination assays. In addition, individual erythrocyte cells may clump together or exhibit non-specific hemagglutination,
this activity interfering with hemagglutination tests for a specific factor. The coated erythrocytes are usually stored frozen, but when thawing the frozen preparations, clumping may occur or the cells may be destroyed by hemolysis.
It is desirable to be able to process erythrocytes in such a way that a variety of antigens can be applied thereto and that these coated erythrocytes can be used as sensitive reagents for passive hemagglutination, the assay of which is reliable and reproducible. It is also desirable to achieve adsorption of antigen without the need for the presence of coupling agents or other steps.
The subject of the invention is therefore a process for obtaining a stable, sensitized preparation of erythrocytes, characterized in that the said erythrocytes, used in the form of a stabilized preparation, are adsorbed on them. or more antigens and / or antibodies.
According to the method, a preparation of erythrocytes coated with various antigens or antibodies is obtained which can be efficiently packaged and stored for prolonged periods of time, until subjected to the particular tests for passive hemagglutination.
The invention also relates to stable preparations of erythrocytes sensitized, that is to say improved, by a potentiation method. The term potentiation indicates the conditioning of the cells so as to increase the hemagglutination titer of the preparation.
The invention is illustrated by the following description. The method according to which the stabilized erythrocyte preparation can be obtained will first be explained; in this regard, it is important to note that the stabilized erythrocytic preparation can, moreover, be the subject of various activation treatments, before being used in the process according to the invention.
Native erythrocytes are collected from the whole blood of various animals such as rabbits, rats, pigeons, sheep, chickens and also from man. The blood sample is treated with standard isotonic anticoagulant solutions, then the erythrocytes are passed, for example by centrifugation, and washed with compatible buffer solutions having a substantially neutral pH to avoid hemolysis of the blood. erythrocytes and to remove serum from. unwanted substances which may be present on the erythrocytes.
A suspension of the washed erythrocytes is prepared in the neutral buffer solution at a low concentration, preferably less than about 10% by volume. The erythrocytes are treated with a small amount of pyruvic aldehyde, relative to the volume of the erythrocytes, for a time sufficient to give the erythrocytes the desirable stability, for example overnight, with shaking.
After this stage of pyruvic aldehyde treatment, the erybhrocytes are washed several times to remove excess pyruvic aldehyde and other substances which may have formed from the serum. The erythrocytes treated with pyruvic aldehyde are then subjected to the action of a small quantity of formaldehyde relative to the volume of erythrocyte and the excess formaldehyde is removed by several washes using a buffered solution. .
The above treatments with pyruvic aldehyde and with formaldehyde can be referred to together by the expression double treatment with aldehyde to obtain a stabilized preparation of erythrocytes.
Preferably, the pyruvic aldehyde treatment should precede the formaldehyde treatment because it has been found that with many erythrocytes, an initial formaldehyde treatment tends to damage these cells;
the preferred order is therefore recommended as usual practice. However, it is understood that with certain erythrocytes, an initial treatment with formaldehyde may not be particularly contraindicated and therefore, in certain cases, an initial treatment with formaldehyde may still lead to advantageous results, also this order of treatments is preferred.
Stabilized erythrocyte preparations can be stored for substantial periods of time without undesirable phenomena of hemolysis, agglutination or other undesirable characteristics occurring.
The above stabilized erythrocyte preparation can be made into a stable preparation of coated erythrocytes, by contacting an aldehyde treated erythrocyte sample with an antigen, followed by one or more washing steps to remove the erythrocyte. excess antigen. In general, stabilized erythrocytes are coated with antigens in a solution stabilized at a pH below 7 and preferably buffered at a pH of about 3.6 to about 6. For polysaccharide antigens such as E. coli endotoxin, coating can be done at pH 7.
Superior sensitivity is obtained when the treated erythrocytes are conditioned by shaking in the buffered solution while coating is usually completed in about 1 hour but can sometimes take up to 24 hours. A coating temperature of 24 ° C is preferred; temperatures of 50 ° C and above produce erythrocyte preparations with reduced sensitivity.
The foregoing conditions may vary somewhat for the different antigens but one skilled in the art can readily determine the preferred coating conditions by referring to agglutination with serial dilutions of a chosen antiserum. For example, a rabbit can be injected with various amounts of antigen identical to the antigen adsorbed on the erythrocyte preparation.
A sample of serum in which the antibodies would be present is collected and a series of dilutions of this serum can be placed in V-bottom plastic trays to which an equal volume of the stable preparation of treated erythrocytes is added. with aldehydes. A reaction mixture containing cells and the diluent is used as a control in which the cells form a button in the background if the reaction is negative. The appearance of a matt surface indicates a positive agglutination reaction which indicates a satisfactory coating. One must carefully distinguish nonspecific agglutination.
In the present specification, the term antigen coating should be understood as meaning a substance which may be an antibody or an antigen, unless specific reference is made to particular antigens or antibodies.
Antigens that can be used successfully to coat stabilized erythrocyte preparations include protein-like antigens such as bovine serum albumin or BSA, insoluble BSA, human serum albumin, y. - rabbit globulin, human γ-globulin, streptococcus M protein, weed E antigen, polysaccharide antigens such as endotoxin from E.
coli (TE), acetylated ET, succinilated ET, deesterified ET, deesterified and bormacetylated ET, synthetic polyglucose, various antigens such as RNA-bacteriophage (ribonucleic acid), Qp, entamoeba histolytica antigen and others. A particular advantage of the invention is that the stabilized preparation of erythrocytes is suitable for coating with these various substances of various chemical compositions.
According to a possible mode of activation, the haemagglutination titer of the stabilized and coated erythrocyte preparation can be increased by reducing its temperature to about -190 ° C. and then maintaining it at a temperature of several degrees by below freezing, preferably at a temperature maintained uniformly and at about -20 ° C, for a period of about 16 weeks.
Equally effective results can also be obtained in about 6 weeks by periodically raising the temperature of the stabilized and coated erythrocytes to 24 ° C for several hours and without agitation, preferably at intervals of about 6 or 7 days. Cycles of several hours to a few days are ineffective.
According to another embodiment of the optional activation step, the erythrocytes are treated with a dilute solution of an oxidizing agent, sodium periodate being an appropriate reagent.
The coated erythrocyte preparation, optionally activated, can be stored in a lyophilized state or at a temperature of about -190 ° C. until the time required for the hemagglutination tests. The procedure for these tests is well known to those skilled in the art.
In general, an animal serum sample believed to contain the antibody is combined with the erythrocytes coated in a liquid vehicle to determine whether agglutination occurs.
Analogously, the stabilized erythrocyte preparations can be coated with a specific antibody, so that in the subsequent haemagglutination test the erythrocytes agglutinate in the presence of a free specific antigen. Those skilled in the art can advantageously implement other variants of the haemagglutimation test with the preparations of stable coated erythrocytes obtained according to the invention.
The passive hemagglutination test can be used to detect the presence of γ-globulin on cells, for example in the presence of endotoxin antigen, to detect viral infection, to determine a type of histocompatibility, to detect autoimmunisabion diseases and other phenomena of this type. The coated and stabilized erythrocyte preparations can also be used as test reagents in quantitative or semi-quantitative chemical analyzes to detect the presence of antigen.
<I> Obtaining the starting material </I> a) Stable preparation of erythrocytes treated with aldehydes A 20 ml sample of whole blood is taken by cardiac puncture from a 2-3 kg rabbit and this sample is collected in a syringe containing an equal volume of sterile Alsever's solution. This solution is generally isotonic and contains an anticoagulant based on sodium citrate, sodium chloride, dextrose and distilled water. The collected sample is allowed to stand overnight at about 4 ° C. and then centrifuged at 1500 rpm for 10 minutes to obtain 10 ml of packed rabbit erythrocytes.
The packed erythrocytes are then combined with 10 volumes of 0.11 M phosphate buffer solution, pH 7.2. This buffered solution is prepared from monopotassium phosphate and dissodium phosphate by vortexing. The mixture of erythrocytes and buffer solutions was centrifuged and then subjected to 5 washes separated by 10 volumes of the above buffered solution to remove proteins and other substances from the serum. The washed erythrocytes are then resuspended in the previous buffered solution to obtain an 8% by volume suspension of rabbit erythrocytes.
In a 507 ml Erlenmeyer flask, 125 ml of the phosphate buffered solution containing 3% by volume of pyruvic aldehyde and 125 ml of the previous 8% erythrocyte suspension are added and the mixture is stirred for about 18 hours. at room temperature. The mixture is then filtered through a gauze pad to separate out larger cell debris and then the erythrocytes are washed 5 times separately with 10 times their volume of the phosphate buffered solution. The preparation of erythrocytes treated with pyruvic aldehyde is then resuspended in the previous buffered solution with a concentration of 10% by volume.
125 ml of the preceding suspension treated with pyruvic aldehyde is diluted to 8% and mixed with 125 ml of the buffered phosphate solution containing 3% by volume of formaldehyde. The mixture is stirred overnight with a magnetic stirrer at room temperature and then the mixture is filtered through a gauze pad to remove any cell debris. The erythrocytes treated with pyruvic aldehyde and formaldehyde are then washed 5 times separately by 10 times their volume of the previous buffered solution.
The preparation of erythrocytes treated with aldehydes at a concentration of 10% in the previous buffered solution is then resuspended and the suspension obtained is poured into glass containers which are sealed for storage. The previous preparation of erythrocytes treated with aldehydes is stable for at least 2 months at low temperatures of the order of 4 ° C. or indefinitely, frozen in liquid nitrogen.
The bilised erythrocyte preparation can be activated, but preferably the activating step is performed only when the erythrocytes have been coated.
The erythrocyte preparation thus stabilized possesses most if not all of the active combining centers present on the native erythrocytes, these active centers designating in particular centers which can react with an antibody or a virus.
b) Preparation of Stabilized Activated Erythrocytes This paragraph illustrates the increase in the hemagglutination titer achieved by binding of fibrinogen to the cells of the stabilized erythrocyte preparation. Beef fibrinogen at a concentration of 1% / ml in 0.1 M acetate buffered solution at pH 4.0 is heated at 60 ° C. for 1 hour and cooled to room temperature. A 10% suspension of aldehyde-treated erythrocytes obtained by the process of Example 1 is added to the fibrinogen solution and stirred for 1 hour at room temperature.
The activated stabilized erythrocytes were washed with a pH 7.2 phosphate buffer solution and the erythrocyte concentration adjusted to 10% by volume. These cells are subsequently used with superior results for blood group determinations.
c) Preparation of Activated Stabilized Erythrocytes Human erythrocytes are treated with the aldehydes already mentioned to obtain stabilized human erythrocytes in suspension in a buffered phosphate solution at pH 7.2. The erythrocytes stabilized at 24 ° C. for 15 minutes are then treated with a 0.00035 M sodium periodate solution and then washed until elimination of this reagent with the buffered phosphate solution of pH 7.2.
When subjected to the direct haemagglutination reaction by rat antiserum, stabilized cells give a reaction at a 1: 100 dilution while stabilized cells, activated by the oxidation reaction, show the reaction. hemagglutination at a dilution of 1: 2000.
<I> Example 1 </I> Preparation of coated activated stabilized erythrocytes 1 ml of the 10% suspension of stabilized activated erythrocytes obtained by the method described under b) is washed with an acetate buffer solution 0 , 1 M at pH 4.0 and resuspended in 9 ml of the acetate buffer solution containing 1 mg of BSA. The mixture was stirred at room temperature for 2 hours and then washed 5 times with excess phosphate buffered solution pH 7.2. These cells are then used for passive hemagglutination reactions.
<I> Example 2 </I> Preparation of stabilized erythrocytes coated with antigen In a conical centrifuge tube of 12 ml at 24 C, 1 ml of the 10% suspension of the preparation of erythrocytes treated with aldehydes is added according to a).
This sample is then washed with 0.1 M acetate buffer solution at pH 4.0. Stabilized erythrocytes are not hemolyzed or agglutinated at this low pH value. The cells of the erythrocyte preparation are resuspended in 9 ml of the acetate buffered solution at 24 ° C., pH 4.0, and stirred at this pH and temperature for 1 hour;
then 1 ml of the acetate buffer solution containing 1 mg of BSA is added. The mixture of anti-genes and stabilized aldehyde-treated erythrocytes was centrifuged for 2 hours at room temperature and then carried out 5 separate washes with an excess of a buffered phosphate solution at pH 7.2. The stable BSA coated erythrocytes were resuspended in the bulk solution and 10 ml aliquots of this suspension were placed in 20 ml glass bottles which were capped.
The predetermined, packaged amount of coated stabilized aldehyde treated erythrocyte preparation is then rapidly frozen in a liquid nitrogen refrigerator and stored at 20 ° C. <I> Example 3 </I> Activation of a stable erythrocyte preparation. Coated erythrocytes treated with aldehydes and coated as in Example 2, but at a pH of 3.6, which were frozen at -196 C and stored at 20 C for 6 ° C., were thawed at an ambient temperature of 24 ° C. without stirring. days, they are kept at 24 C for 2 hours and after having frozen them again at -196 C,
they are brought to -20 ° C. This process is repeated once a week for 6 weeks.
The activated coated erythrocytes are then frozen at -196 ° C and stored at that temperature until needed for the hemagglutination test. The activated coated cell suspension can also be freeze-dried and reconstituted by adding water before use.
This process increases the titer 30 times while it only doubles the titer of nonspecific haemagglutination, which increase is practically insignificant. If the freeze and thaw cycles are repeated again, a further increase in blood is obtained. haemagglutination titer but also a significant concurrent increase in nonspecific haemagglutination titer, so that there is little benefit in prolonging this treatment.
The optimum number of freezing and thawing cycles is linked to a particular preparation of coated cells, but those skilled in the art will easily note that the optimum is obtained with the cycle beyond which the increase in the haemagglutination titer. is accompanied by a noticeable increase in the nonspecific hemagglutination titer. Optimal coated cell preparation for standard serum is also found to be optimal for other antisera. So,
successive standard sera can be calibrated against the selected initial antiserum.
<I> Example 4 </I> Sensitivity of the Preparation of Erythrocytes Coated with Bovine Serum Albumin By following the methods of Examples 1 and 2, an erythrocyte preparation is obtained in which rabbit erythrocytes are coated of bovine serum albumin (BSA). A similar procedure was followed for coating another erythrocyte preparation with BSA, but the erythrocytes in this sample were stabilized only by pyruvic aldehyde and without the aldehyde treatment sequence.
The hemagglutination titers of the two preparations are compared in Table 1 below to illustrate the greater sensitivity of the preparation of BSA coated erythrocytes which have been stabilized by the double aldehyde treatment. This table also illustrates the results of the activation step.
<I> Example 5 </I> Preparation of coated activated stabilized erythrocytes A preparation of stabilized erythrocytes coated with antigen is treated as described under c) with 0.00035 M sodium periodate for 15 minutes at 24 ° C. obtained by the method of Example 2. The activated stabilized erythrocytes were washed with a buffered solution of phosphate pH 7.2 and found to have a hemagglutination titer of 1: 2,400,000.
EMI0004.0063
<I> Table <SEP> 1 </I>
<tb> <I> Comparison <SEP> of <SEP> the <SEP> hemagglutination <SEP> reaction <SEP> of </I>
<tb> <I> erythrocyte <SEP> preparations </I>
<tb> Cells <SEP> coated <SEP> pH <SEP> to <SEP> Duration <SEP> Title <SEP> of hemag the coating- <SEP> (hours) <SEP> glutination
<tb> tion
<tb> erythrocytes <SEP> treated *
<tb> to <SEP> pyruvic aldehyde <SEP> <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1 / 2.0'48
<tb> <SEP> coated with <SEP> BSA
<tb> erythrocytes <SEP> stabilized
<tb> treated <SEP> to <SEP> aldehyde
<tb> pyruvic <SEP> and <SEP> to <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1 / 40,000
<tb> formaldhyde, <SEP> coated
<tb> from <SEP> BSA
<tb> erythrocytes <SEP> treated <SEP> at
<tb> pyruvic aldehyde <SEP> <SEP> and
<tb> to <SEP> formaldehyde,
<tb> coated <SEP> with <SEP> BSA, <SEP> 3,
6 <SEP> 1 <SEP> 1 / 1,280,000
<tb> activated <SEP> by <SEP> 6 <SEP> cycles
<tb> <SEP> activation by <SEP> freezing-thawing <SEP> (Ex. <SEP> 3)
<tb> erythrocytes <SEP> stabilized
<tb> coated <SEP> with <SEP> BSA <SEP> activated <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1 / 2.400.000
<tb> by <SEP> oxidation
<tb> (example <SEP> 5)
EMI0005.0001
<I> Table <SEP> 1 <SEP> (continued) </I>
<tb> Cells <SEP> coated <SEP> pH <SEP> to <SEP> Duration <SEP> Title <SEP> hemag the coating- <SEP> (hours) <SEP> glutination
<tb> tion
<tb> erythrocytes <SEP> stabilized
<tb> activated <SEP> by <SEP> on <SEP> 4 <SEP> 2 <SEP> 1 / 2.400.000
<tb> fibrinogen <SEP> from <SEP> BS <B> A </B>
<tb> (example <SEP> 1)
<tb> Comparative <I> Example 6 </I> Representative Variations of Enducation Conditions of Erythrocyte Preparations Treated with Aldehydes with Various Antigens A number of antigens are chosen to result in an erythrocyte preparation prepared as described
under a). The coating process of Example 2 is generally followed.
Table II below illustrates the recorded observations which one skilled in the art can readily determine by noting positive agglutination by serial dilutions of rabbit serum as previously described.
EMI0005.0034
<I> Table <SEP> II </I>
<tb> Antigens <SEP> Quantity <SEP> pH <SEP> Duration,
<tb> (mg / 10 <SEP> ml) <SEP> hours
<tb> (at <SEP> 240 <SEP> C)
<tb> Serum <SEP> albumin <SEP>
<tb> of <SEP> beef <SEP> (BSA) <SEP> 1.0 <SEP> 4 <SEP> 2
<tb> BSA <SEP> insolubilized <SEP> 0.1 <SEP> 4 <SEP> 2
<tb> Globulin <SEP> from <SEP> rabbit <SEP> 0.01 <SEP> 5 <SEP> 1/6
<tb> Endotoxin <SEP> and <SEP> derivatives <SEP> 0.01 <SEP> 7 <SEP> 1/2
<tb> Polyglucose <SEP> 1.0 <SEP> 4 <SEP> 1/2
<tb> Bacteriophage, <SEP> Q / 3 <SEP> 0.3 <SEP> 5 <SEP> 4
<tb> Lutein <SEP> hormone <SEP>
<tb> <B> d </B> e <SEP> sheep <SEP> 0.004 <SEP> 4
<tb> Serum <SEP> albumin <SEP>
<tb> of <SEP> beef <SEP> (BSA) <SEP> 1.0 <SEP> 4 <SEP> 1
<tb> Serum <SEP> albumin <SEP> <SEP> 1.0 <SEP> 3.6 <SEP> 1 <SEP> **
<tb> of <SEP> beef <SEP> (BSA)
<tb> * <SEP> -f- <SEP> 1 <SEP> hour <SEP> of agitation <SEP> to <SEP> pH <SEP> 4 <SEP> before <SEP> the addition <SEP> d 'antigen.
<tb> ** <SEP> -f- <SEP> 1 <SEP> hour <SEP> of agitation <SEP> to <SEP> pH <SEP> 3.6 <SEP> before <SEP> addition < MS> antigen.