DE3004018A1 - Substanz mit interferon induzierender aktivitaet sowie verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

Andrejewski, Honke & Partner ß Patente nWoT"

Diplom-Physiker Dr. Walter Andrejewski Diplom-Ingenieur Dr.-Ing. Manfred Honke Diplom-Physiker Dr. Karl Gerhard Masch Anwaltsakte: ^{4300 Essen ]}' Theaterplatz 3, Postf. 10 02

1)4 9b'l/R-ftix 4. Februar lybü

Patentanneldung
KITAJATO iuiK/LYUoiIo
(Tne Kitasato Institute)
Q-I, ShlroKane 5-ohcr:;e,
:-:ir.ato-^-u, ToLjG-to, Japan

ouLstanz n.it Interferon induzierender Ai. ti vl tat sov/'ie Verfahren zu ihrer Herstellung.

Eei Interferon, welches nachstehend auch als If oaer als virushemmender Faktor bezeichnet wird, handelt es s:^;cn u.n eine 3uV-s tanz, weiche auf tierische Zellen eiriv;Lrl-er. --.α^η, umi aas Wachstun; eines Virus zu hemmen, wooei es sich um eine von der /,eile entsprechend der Virusinfe/:tion freigegebene Proteinart handelt. Gie virozide Aktivität von IF ist in Be<iug auf eine i'iersüezies sperifisch, jedoch unopuzifiscü iu ^ezug auf exiiO Virusspezies uuci ,,arm unter für ihre induzierung unterseil Ledlicrier· --.edlngunget:

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GCiiwa.ni.en. Εε ist aucii bekannt, daß das Wachstum bestimmter tieriscner tu.-.orarciger Viren durch IP unter bestimmten Bedingungen st^K _ofcuei:_:int werden .i

iiirie Substanz, welche zur Induzierung von IP auf tierische Zellen einwirken kann, wird als Interferon induzierende Substanz bezeichnet. Sine derartige Substanz ist daher von Interesse fur Vorbeufvun^sii.aiinalüfien und die K-ehandiung verschiedener menschlicher utid tierischer Erkrankungen durch Virusinfe^tion. Allerdings wurden in der Praxis bisher verschiedene bei.annte derartige Substanzen niemals für einen derartigen Zweci; verwendet, da gewinne sohw&rwiegende Schäden auftragen. So ist beispielsweise in der US-Patentschrift _) jb'ji t-93 (1971) eine doppelsträngige Ribonucleinsäure als xnterferon induzierende Substanz offenbart, Vielehe unter Verwendung eines Mikroorganismus iiergestellt wird, da υ viele Substanzer, wie uai.terien, Viren, Polysaccharide, rriitogene »virt-stoffe, Indotoxine und dgl. die Interferonbildung stimulieren, daiS jedoch ^eine für den Routinegebrauch von Interesse ist, und zwar unter ariderem wegen der Giftigkeit, der Antigenwin-ung und wegen der Infe; tiöcit-lit. V/eitere bekannte Interferon induzierende ouustanzen sind beispielsweise in den US-Patentschriften j '['(■) 924 und J ^A bh^lj sowie der ja^janischen Offenlegungsschrift ho^al Koho 12IyIS/?^ beschrieben. Diese Interferon indu>..iere:iüen Substanzen sind jedoch nicht aus Pflanzen isoliert und iv.an weiis auch, daß aus iYiih.roorganisrhen isolierte Interferon inauzierende Substanzen im allgemeinen wegen ihrer hohen Giftigkeit für therapeutische Zwecue unvorteilhaft sind.

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Beispiele bekannter raitogener Mittel sind Phytohemaglutinin (Wheelock, Science, 14Q:31O (I965), pokeweed Mitogen (Friedman et al, Proc.Soc.Exp.Biol.Med., 12^:901 (1£"67) und Concanavalin A (Willen et al.,Cell.Immunol., (S: 110 (1973), welche jeweils aus Geweben zweier in Amerika als "kidney bean" und als "horse bean" bekannter Bohnenarten und aus einer unter den Hamen Po^eweed bekannten Pflanze isoliert wurden. Infolge ihrer extrem niedrigen Aktivität, Interferon zu induzieren, wurde jedoch kein erfolgreicher Versuch gemacht, diese rnitogenen Kittel zu Präventivzwecken und zum Heilen verschiedener inenscnlicher und tierischer Krankheiten infolge Virusinfektionen zu verwenden.

Man kennt auch andere Interferon induzierende Substanzen, welche aus Geweben höherer Pflanzen isoliert werden. So gibt beispielsweise Kumazawa, Kojima et al (japanische Offenlegungsschrift Kokai Koho 32107/7^) an, daß eine Interferon induzierende Substanz, von welcher angenommen wird, daiB es sich um eine Art von hydropolyrnerem Saccharid handelt, welche als Hauptbestandteile Hexose (4-8$), Protein (5%) und Uronsäure (4ü}£) enthält und ein Molekulargewicht von mehr als 10 OÜü besitzt, aus der Wurzel von Angellica acutiloba Kitagawa (in Japan bekannt als Toici) durch Extraktion mit heißem Wasser isoliert wird, sodaß eine extrahierte Lösung entsteht, welche der Dialyse unterworfen wird. Dem entstandenen Rückstand wird Azeton zugesetzt, um ein Präzipitat zu erhalten, welches dann gefriergetrocknet wird. In diesem Fall kann, falls gewünscht, die extrahierte Lösung durch Konzentration unter vermindertem Druck oder durch Verwendung einer DiafIo-Membrane und anschließende Dialyse auf eine geeignete Menge aufgefüllt werden. Als Nächstes beschreiben Kojima und Tamamura (japanische Offenlegungsschrift Kokai Koho 99313/7&) eine Inter-

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feron induzierende Substanz mit einem Molekulargewicht von mehr als 20 000 (in der Hauptsache mehr als 100 000), welche als Hauptbestandteil eine 1-3 gebundene Glukose (Hexose: mehr als 90$) enthält. Diese Interferon induzierende Substanz wird dadurch hergestellt, daß die Wurzelrinde eines Maulbeerbaumes wie beispielsweise Morus alba Linne (in Japan als Maguwa bekannt) oder Morus bombycls Koizdumi (in Japan bekannt als Yamaguwa) mit heißem Wasser extrahiert wird, der extrahierten Lösung ein organisches Lösungsmittel zugesetzt wird, um ein Präzipitat zu erhalten, und diesem Präzipitat eine geringe Wassermenge zugesetzt wird, die Lösung der Dialyse zur Herstellung eines Rückstandes unterworfen wird und dieser Rückstand dann gefriergetrocknet wird. In diesem Fall kann die Lösung nach der Extraktion und/oder vor der Dialyse erforderlichenfalls durch Konzentration unter vermindertem Druck oder durch Verwendung einer Diaflo-Membrane auf eine geeignete Menge aufgefüllt werden.

Diese beiden Interferon induzierenden Substanzen haben eine geringe Giftigkeit und können leicht hergestellt werden. Der billige und reichlich vorhandene Vorrat der Pflanzengewebe, aus denen die Interferon induzierende Substanz erhalten wird, kann jedoch infolge der fortgesetzten Verwendung dieser Pflanzengewebe über viele Jahre hinweg als Quelle traditioneller Sinojapanischer Drogen zu Ende gehen.

Die Erfindung hat sich die Aufgabe gestellt, eine Interferon induzierende Substanz mit ausgezeichneten Eigenschaften zu schaffen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu verwirklichen. Die Erfindung basiert auf der Feststellung, daß eine Substanz, welche

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aus dem Gewebe verschiedener Pflanzen isoliert wurcje, welche zum Genus Carthamus der Familie Compositae und ihren Varianten gehören, bei geringer Giftigkeit ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität zeigt. Außerdem kann die aktive Substanz aus Pflanzengewebe leicht und preiswert isoliert werden.

Gemäß einem Merkmal der Erfindung ist eine Substanz mit Interferon induzierender ÄKtivität, welche in der Poriu von amorphem weißlichem Pulver stabil ist, dadurch gekennzeichnet, daß sie in praktisch reiner Form nachstenende physikalisch-chemische MerK-male aufweist:

1) Elementaranalyse:

H: 6,^4+0,3^, C: 41,c.+0,3^', N: 2,39+0, 3>ä, P: 0,2t+C,03?i

2) Molekulargewicht:

Ca. 100 000 bis ca. 3 000 000 (hauptsächlich ca. 500 000 bis ca. 1 000 000)

bestimmt durch Ultrazentrifugieren mit einer Spinco Model Ξ Analytical Ultrazentrifuge (HandelsproduKt der BecKman Instrument Inc., USA), Ultrafiltrieren mit einem Amicon Ultrafilter mit Amicon XM 50, XM lOOA und XM 300 Membranen (Handelsprodukte der Amicon Corp., USA) und UK 50, UK 100 und UK 200 Membranen (Handelsproduicte der Toyo Roshi K.K., Tokyo) und Gel-filtrieren mit Sephadex G-200 (Handelsprodukt der Pharmacia Fine Chemical AB. Schweden).

3) Schmelz- oder Zersetzungspunkt:

2 Schmelzpunkt unbestimmt. Verkohlt bei etwa 220 C.

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4) Ultrafiolett-Absorptionsspektrum:

Siehe in Fig.l (bestimmt in Ο,ΙΝ NaOH-Lösung), welches im wesentlichen unverändert ist, wenn in IN NaOH oder Wasser bestimmt.

Absätze bei etwa 250 und 28θ mp.

5) Infrarot-Absportionsspektrum:
Siehe in Fig.2 (durch KBr-Methode).

6) Löslichkeit in verschiedenen Lösungsmitteln:

Löslich in Wasser, leicht löslich in wässrigen Lösungen
vom Natriumhydroxid, Kaiiumhydroxid und Ammoniumhydroxid, im wesentlichen unlöslich in Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, Azeton, Chloroform und Diäthyläther.

7) FarbreaKtion:

Positiv in Ninhydrinreaktion, Phenol/Schwefelsäure-Reaktion, Folin's Reagens und Dittmer-Reaktion. Negativ in Elson-Morgan-Reaktion.

b) Natur:
Sauer.

9) Chemische Hauptbestandteile:
a) Aminosäuren:

Oxyprolin 15,61 % Asparaginsäure 5,51 %

Threonin 10,90 % Serin 9,64 %

Glutaminsäure 3,9β % Prolin 4,27 %

Glycin 9,09 % Alanin 8,24 %

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Valin	4,o4 %	Isoleuzin	5,59 %
Leuζin	2,56 %	Phenylalanin	1,32 %
Lysin	2,18 %	Arginin	1,24 fo
Tyrosin	1,94 %	Histidin	0,93 %
Ammoniak	2,98 %

b) Zucker:

Arabinose	9,38 %	Galaktose	20,98 fo
Glukose	64,9b fo	Mannose	3,26 %
Xylose	1,40 %

Die vorhandenen Aminosäuren wurden durch Hydrolyse iuit 6n HCl bei 110 C in einer Zeitspanne von 48 h in vacuo und durch nachfolgende Analyse mit Technicon Amino Acid Autoanalyzer Type NC-I bestimmt. Die vorhandenen Zucker wurden durch Hydrolyse mit 0,1N Schwefelsäure bei 80⁰C während einer Zeitspanne von 20 min bezw. mit IN Schwefelsäure bei 100⁰C in einer Zeitspanne von 2 h und anschliessende Analyse mit Technicon Sugar Autoanalyzer Type N-I (Handelsprodukte der Technicon Corporation, USA) bestimmt.

10) Optisches Drehverniögen:

26 D

(+66° im Durchschnitt)

(c = 0,49$ in O,1N NaOH)

Biologische Merkmale:

1. Interferon induzierende Aktivität:

Proben der Interferon induzierenden Substanz der Erfindung wurden verwendet, um Interferon in den Zellen und dem Serum von Test-

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tieren zu induzieren. Die Aktivität des entstandenen Interferon vmrde durch die im Versuch 1_ beschriebene Methode bestimmt. Die Resultate dieser Bestimmung geben die Tabellen 1 und 2 wieder, welche zeigen, daß die Interferon induzierende Aktivität positiv ist.

Tabelle 1

Konzentration der Probe

(/Ug/ml) 10 1,0 0,1 0,01

Aktivität

(in vitro) > iOü >100 $6 < 10

Tabelle 2

Aktivität (in vive)	1	Ll G	utentnah 1
r.aninchen	2	Io	oC
Kaninchen	13	90

Blutentnahme in (h) nach Verabreichung

2 4 6

175 30

20C To

Tabelle 2 zeigt die nach der Methode, welche nachstehend im Versuch 1 beschrieben werden soll, bei zwei Kaninchen erhaltenen Resultate, aus denen sich ergibt, daß die IF-Aktivität ihren Maximalwert zwei Stunden nach Verabreichung erreicht. Durch die im Versuch 1 beschriebene Methode wurde auch bestätigt, daß Interferon im Körner des Testtieres durch die Wirkung der erfindungsgeciäßen Interferon induzierenden Substanz induziert wurde.

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2. Stabilität der Interferon induzierenden Aktivität:

Proben von jeweils 1 mg der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz wurden in Wasser (jeweils 1 ml) gelöst und bei 10O⁰C für eine gegebene Zeitspanne oder bei einer gegebenen Temperatur für 1 h erhitzt. Jede Probe wurde dann in gleicher Weise wie im Versuch 1 beschrieben (in vitro-Methode) behandelt und man erhielt die in den Tabellen 3 und K wiedergegebenen Resultate, welche zeigen, daß die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz gegenüber Hitzeeinwirkung sehr stabil ist.

Heiζtemperatür (°C)

Tabelle 3

IF-Aktivität bei einer Konzentration der Probe (/Ug/ml) von

	10	1,0	0,1	0,01
Unbehandelt	> 100	> 100	9ü	< 10
37	> 100	> 100	9:3	< 10
60	> 100	>100	90	< 10
bü	>100	>100	92	< 10
100	> 100	>100	93	<10

Erwärmungszeit: 1 h

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Erwärmungszeit (h)

Tabelle 4

IP-Aktivität bei einer Konzentration der Probe (/Ug/ml) von

0,1

Io

1,0

Unbehandelt

>100	">100	92
>100	>100	95
>100	>100	93
>100	>100	65
>1OO	75	35

Heizternperatur: IuO J5. Aiiute Giftigkeit:

Männliche und weibliche Mäuse (ddy-Stammj 5 Wochen alt; Gewicht 20+1 g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet. Eine physiologische Lösung von Natriumchlorid, welche die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz enthielt, wurde den Mäusen verabreicht (ip. oder oral), um die LD,-Q-Werte von >1,5 g/tfg (ip· ) oder > 10 g/kg (oral) zu ermitteln. Es ergab sich kein bemerkenswerter Unterschied zwischen den männlichen und weiblichen Mäusen.

4. Anti-Tumor Aktivität:

Mäuse (ddy-Stammj 5 Wochen alt; Gewicht 20+1 g; jede Gruppe bestehend aus 10 Mäusen) wurden als Testtiere verwendet. In der Achselhöhle eines jeden Testtieres wurde eine Probe von S-Ιδθ

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Sarcoma solid tumor (2x2x2 mm) oder Ehrlich ascites tumor (2,5 χ 10 Zellen) geimpft. Nach 24 Stunden wurde die Interferon induzierende Substanz der Erfindung (o₅2 mg) in Wasser gelöst jeder Maus oral verabreicht. Die Verabreichung erfolgte einmal täglich und wurde 14 Tage lang durchgeführt. Ein bemerkenswerter Anti-Tumor-Effekt wurde beobachtet»

Aus den vorgenannten Merkmalen wurde festgesteilte daß es sich bei der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz um einen Komplex aus Protein und Zucker handelt* welcher Phosphorsäure enthält und ein Molekulargewicht von etwa 100 000 bis etwa 3 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa 1 000 000) besitzt Diese Substanz entspricht auch der weitgehend anerkannten Definition irgendeiner Interferon induzierenden Substanz., da sie Interferon in tierischen Zellen oder Serum in vivo oder in vitro induziert, welche mit 0,08$ Trypsin bei Jf⁰C für 2 h inaktiviert wird wobei außerdem die Aktivität der induzierenden Substanz in Bezug auf tierische Spezies spezifisch ist^ jedoch in Bezug auf Virus-Spezies unspezifisch ist. Daraus ergibt sichj, daß die erfindungsgemäße Substanz nicht nur eine neuartige Interferon induzierende Substanz ist, sondern daß es sich auch um eine neue Substanz an sich handelt, da keine Substanz mit den gleichen physikalischchemischen und biologischen Merkmalen wie die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz bisher in der einschlägigen Lite ratur beschrieben wurde»

Bei den in der einschlägigen Literatur beschriebenen mitogenen Mitteln mit Interferon induzierender Aktivität (z.B. Phytohämaglutinin, Pokeweed-rnitogen und Concanavalin A) handelt es sich

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beispielsweise um Proteintypen mit Molekulargewichten von über 100 000, welche eine sehr schwache Interferon induzierende Aktivität besitzen, welche bei Erwärmung auf 56 C für 5 h inaktiviert werden. Demgegenüber besitzt die erfindungsgeniäße Interferon induzierende Substanz andersartige chemische Bestandteile, eine hohe Wärmestabilität selbst bei IGO⁰C für mehrere Stunden und ausgezeichnete Interferon induzierende Aktivität. Die aus der ToKiwurzel (Angellica acutiloba Kitagawa) isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz hat auch ein hohes Molekulargewicht (mehr als 100 000) und ihre Interferon induzierende Aktivität wird nicht inaktiviert, wenn sie auf 100⁰C für 1 h erhitzt wird. Ihre chemischen Bestandteile (Hexose: 46$, Uronsäure: Protein: 5$) und das Infrarot-Absorptionsspektrum unterscheiden sich jedoch von den entsprechenden Werten der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz. Die aus der Maulbeerbaum-V/urzelrinde isolierte bekannte Interferon induzierende Substanz enthält als Hauptbestandteile eine 1-3 gebundene Glukose (Hexose: 96%) und hat ein Molekulargewicht von mehr als 2Q000 (hauptsächlich mehr als 60 000) und unterscheidet sich daher auch von der erfindungsgemäßen Sudstanz. Außerdem ist die mitogene Aktivität, welche in den bekannten Interferon induzierenden Substanzen gefunden wird, welche von bakteriellen: Endotoxin und höheren Pflanzen herstammen, in der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz sehr niedrig.

Verschiedene Pflanzen, welche zum Genus Chartamus gehören und als Ausgangsstoff für das Produkt der Erfindung verwendet werden können, enthalten beispielsweise Carthamin, Carthamon, Neocartharnin und dgl., wobei es sich insgesamt um Substanzen mit anders-

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artigen physikalisch-chemischen und biologischen Merkmalen und ohne Interferon induzierende Aktivität handelt.

Die physikalisch-chemischen Merkmale der bekannten Interferon induzierenden Substanzen, welche nicht aus Pflanzen isoliert werden (offenbart in den US-Patentschriften J5 773 924 und 3 b&4 845 sowie der japanischen Offenlegungsschrift Kokai Koho 121919/78), entsprechen nicht den Merkmalen der erfindungsgemäßen Interferon induzierenden Substanz.

Die erfindungsgemäße Interferon induzierende Substanz ist von potentiellem Interesse als Medikament zur Verhinderung und zur Behandlung verschiedener Krankheiten bei Menschen und Tieren, welche durch Viren verursacht werden, wie beispielsweise tierische tumorartige Viren, da ihre Interferon induzierende Aktivität im Vergleich mit bekannten, aus Pflanzen isolierten Interferon induzierenden Substanzen ausgezeichnet ist und da sie gegen tierische Tumor-Viren aktiv ist. Außerdem ist ihre Giftigkeit sehr gering, wenn sie oral ans Menschen und Tiere verabreicht wird.

In verfahrensmäßiger Hinsicht schlägt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Substanz mit Interferon induzierender Aktivität vor, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß diese aktive Substanz aus einer Pflanze des Genus Carthamus der Familie Compositae oder einer Variante derselben, welche diese aktive Substanz enthält, extrahiert wird und die aktive Substanz aus dem dadurch erhaltenen Extrakt gewonnen wird.

Als Pflanzen für die Herstellung der erfindungsgemäßen Substanz eignen sich Pflanzen, welche in verschiedenen Ländern der Welt

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unabhängig und im Überfluß wachsen und welche verschiedene Varianten wie Mutanten und Hybriden auf natürliche oder künstliche Weise bilden können. Beispielsweise wurden Carthamus tinctorius Linne (safflower) und deren Varianten viele Jahre lang wegen ihrer gelben und roten Pigmente gezüchtet und verwendet und werden heutzutage hauptsächlich wegen ihres Öles in verschiedenen Ländern gezüchtet. Auch die Blüten und Kerne wurden lange Zeit in Japan und China als Volksgetränk verwendet, wobei jedoch das Vorhandensein einer Substanz mit IP induzierender Aktivität in ihren Geweben unbekannt war.

Alle zum Genus Carthamus gehörenden Pflanzen können, soweit sie die aktive erfindungsgemäße Substanz enthalten, für die Zwecke der Erfindung verwendet werden. Lediglich als Beispiele seien genannt:

Carthamus tinctorius Linne; Carthamus lanatus Linne; Carthamus arborescens Linne und deren Varianten wie z.B. C. baeticus Nyman.

Die vorgenannten botanischen Namen sind folgenden druckschriftlichen Veröffentlichungen entnommen:

"Yakuyo Shokubutsu Dax Jiten" von Kariyone und Kimura, veröffentlicht von Hirokawa Shoten, Tokyo (197^); "Saishin Yakuyo Shokubutsu" von Kariyone und Kimura, veröffentlicht von Hirokawa Shoten, Tokyo (I976); "Flora Europaea", Vol.4, veröffentlicht von Cambridge University Press, London (1976) und "illustrated Flora of The Pacific States", Vol. IV der Standford University Press, CA.(1965).

Zwecks besserer Konservierung und Extrahierung wird vorzugsweise getrocknetes Material verwendet, wenn es auch möglich ist, frisches

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Material zu verwenden. Zum Trocknen kann jedes gewünschte Verfahren wie beispielsweise NaturtrocKnung, Trocknung mit Heißluft usw. angewendet werden. Erforderlichenfalls kann das Material vor der Verwendung mit V/asser gewaschen werden.

Die Extraktion kann bei irgendeiner passenden Temperatur, beispielsweise zwischen Raumtemperatur bis zum Siedepunkt der Extraktionsmischung, mit Wasser erfolgen. Da die aktive Substanz der Erfindung besonders in Wasser unter alkalischen Bedingungen (z.B. pH 7-10) löslich ist, wird vorzugsweise der pH-Wert des Wassers vor der Verwendung beispielsweise mit einer geeigneten Pufferlösung wie Natriumhydroxid, Kaiiumhydroxid oder Ammoniumhydroxid eingestellt. Die Extraktion kann während einer beliebigen Zeitspanne, gewöhnlich 1-5 Tage bei Raumtemperatur, erfolgen, wobei diese Zeitspanne abgekürzt werden kann, wenn die Temperatur der Extraktion erhöht wird. So Kann beispielsweise die Extraktion während einer Zeitspanne von 30 min bis 6 h bei 40-100°C erfolgen. Erfindungsgemäß kann man den Hauptteil der im Ausgangsmaterial enthaltenen aktiven Substanz extrahieren (in einigen Fällen mehr als 90$). Allerdings sollte die Anwendung von übermäßig hohen Temperaturen vermieden werden, da hierdurch die Menge an unerwünschten Verunreinigungen wie Pigmenten, niederrnoleKUlaren Substanzen usw., die im Extrakt auftreten,, erhöht werden kann. Man kann erforderlichenfalls dem extrahierenden Wasser auch einen geeigneten antiseptischen Wirkstoff zusetzen. Die Extraktion kann kontinuierlich oder intermittierend erfolgen, und es kann jedes zweckmäßig erscheinende Verhältnis zwischen dem extrahierenden Wasser und dem Rohmaterial angewendet werden.

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Alternativ ist es auch möglich, die erfindungsgemäße aktive Substanz aus dem Pflanzengewebe mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Methanoi, Äthanol, Propanol, Butanol, Azeton und dgl. in irgendeiner zweckmäßigen Menge beispielsweise von 20 bis 8o$ zu extrahieren. In diesem Fall kann die Sxtraktionszeit und die Temperatur beispielsweise 4 h bis 3 Tage bei 4o bis bO°C betragen. Wenn auch die Extraktion mit Wasser einfacher, sicherer und preiswerter durchgeführt werden kann, so kann die Extraktion, falls gewünscht, auch durch Verxvendung eines hydrophilen organischen Lösungsmittels trotz der Unlöslichkeit des reinen Produktes der Erfindung in derartigen Lösungsmitteln durchgeführt werden, wenn die extrahierte Lösung eine Mischung oder einen Komplex von Substanzen wie beispielsweise Fettsäuren, Steroiden, Proteinen, Mono- oder Polysacchariden und dgl. enthält . Wenn auch nicht beabsichtigt ist, sich auf theoretische Betrachtungen festzulegen, so darf doch angenommen werden, daß die Extraktion mit derartigen organischen Lösungsmitteln durch die Pufferwirkung ermöglicht wird.

Aus der extrahierten Lösung wird in üblicher Weise der Pflanzenrest entfernt, beispielsweise durch Filterung, Pressen, Zentrifugieren und dgl. Anschließend werden unerwünschte Verunreinigungen wie Pigmente und niedermolekular-gewichtige Substanzen von der entstehenden überstehenden Flüssigkeit (supernatant) entfernt, um die Gewinnung der aktiven Fraktion zu ermöglichen. Für diesen Zweck geeignete bevorzugte Verfahren werden nachstehend angegeben.

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A) Die überstehende Flüssigkeit wird durch Ultrafilterung fraktioniert, beispielsweise mittels einer geeigneten Membrane, um Substanzen zurückzuhalten, welche ein Molekulargewicht von mehr als 100 000 besitzen, da die erfindungsgemäße aktive Substanz, welche in den Fraktionen vorhanden ist, ein Molekulargewicht von etwa 100 000 bis etwa J5 000 000 (hauptsächlich etwa 500 000 bis etwa 1 000 000) besitzt. Die Ultrafilterung kann unter geeignetem Druck von beispielsweise 0,1 bis 5 kg/cm mittels einer Membrane durchgeführt werden, welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 oder 200 000 zurückhalten kann. Die aktiven Fraktionen werden aufgefangen und zusammengefaßt und dann gefriergetrocknet, wobei man braune Pulver enthält.

B) Die überstehende Flüssigkeit wird konzentriert, wenn gewünscht unter vermindertem Druck, und wird mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Propanol, n-butanol, Azeton und dgl. bei einer zweckmäßig erscheinenden Konzentration von beispielsweise 4o-7O/a w/v behandelt, wobei Präzipitate entstehen, welche die aktive Substanz enthalten. Diese Präzipitate werden dann gefriergetrocknet und man erhält ein braunes Pulver.

C) Anstelle des organischen Lösungsmittels kann man der überstehenden Flüssigkeit auch ein Ammoniumsalz wie beispielsweise Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Cetylmethylan;moniumbromid und dgl. oder ein anorganisches Metallsalz wie beispielsweise Zinkchlorid, Kupferchlorid und dgl. bei einer zweckmäßigen Iionzentration von beispielsweise 20 bis 50% w/v zusetzen, wobei Präzipitate entstehen, welche dann z.B. mittels einer Membrane oder

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einem Ultrafilter, welche Substanzen mit einem Molekulargewicht von 5000-10 000 zurückhalten können, entsalzt und gefriergetrocknet werden. Man erhält wiederum ein braunes Pulver.

Es ist möglich, den Hauptteil der im Ausgangsmaterial enthaltenen aktiven Substanz zu gewinnen, und zwar in einigen Fällen über 90$. Dabei ist die Menge an Verunreinigungen, welche im Rohpulver enthalten sind, bei Durchführung der Methode (A) am geringsten, welche auch einfach durchgeführt werden kann. Außerdem hat sich bestätigt, daß jegliche bemerkenswerte Nebenwirkung vermieden werden kann, selbst wenn eine große Menge des nach der Methode (A) erhaltenen Rohpulvers oral an Menschen und Tiere verabreicht wird, sodaß dieses Rohpulver für orale Verabreichung ohne weitere Reinigung verwendet werden kann. Es ist darauf hinzuweisen, daß z.B. Safflower (Chartamus tinctorius L.) lange Jahre in Japan und China als Volksdroge und als Rohstoff für rote öle und Speiseöl verwendet wurde.

Falls gewünscht, kann das auf diese Weise erhaltene Rohpulver noch weiter gerinigt werden, und zwar beispielsweise durch Säulenchromatographie unter Verwendung eines geeigneten Wirkstoffes für die Gel-Filterung oder eines Ionentauschers. Im erstgenannten Fall kann die Elution mit Wasser durchgeführt werden, wenn es auch möglich ist, eine geeignete Pufferlösung zu verwenden. Im letztgenannten Fall kann die Elution mit einer geeigneten Pufferlösung durchgeführt werden. Bevorzugte Wirkstoffe für die Gel-Filterung sind beispielsweise Sephades G-50 bis G-200, Sephadex 2B bis 6B, Sephacryl S-200 oder S-300 (Handelsprodukte der Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden), Bio-Gel P-30 bis P-300, Bio-Gel A (Handelsprodukte der Bio-Rad Laboratories Ltd., USA), Sagavac (Hande3s-

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produkt der Seravac Laboratories Ltd., UK) und dgl.. Bevorzugte Wirkstoffe für die Ionentauscher-Behandlung sind beispielsweise QAE-Sephadex A-25 und A-50 (CL""-Form), CM-Sephadex C-25 und C-50 (Na⁺-Form), DEAE-Sephacel (Cl~-Form), DEAE-Sepharose C1-6B (Cl~- Form), CM-Sepharose CL-6B (Na⁺-Form), (Handelsprodukte eier Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) und dergleichen. Für die Reinigung kann man auch eine geeignete Anionen- oder Kationenaustauschzellulose verwenden. Das auf diese Weise erhaltene Produkt kann bestimmte Verunreinigungen enthalten, obwohl seine Interferon induzierende Aktivität für praktische Zwecke ausreicht. Falls gewünscht, lassen sich die Mengen an Verunreinigungen durch Kombination der vorgenannten Behandlungen weiter herabsetzen.

Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Komposition ist im wesentlichen dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteil eine erfindungsgemäße Substanz der vorbeschriebenen Art zusammen mit einem pharmazeutischen Träger oder Exzipienten enthält. Die Zusammensetzung oder Mischung Kann in geeigneter Form für orale, rektale oder parenterale Verabreichung dargeboten werden. So Kann beispielsweise die Zusammensetzung oder Mischung für orale Verabreichung fest oder flüssig sein und die Form von Körnern, Tabletten, überzogenen Tabletten, Kapseln, Syrup, Emulsionen, Suspensionen oder Tropfen haben und Träger oder Exzipienten aufweisen, wie sie allgemein in der pharmazeutischen Technik verwendet werden. So können beispielsweise geeignete Tablettier-Exzipienten aus Laktose, Kartoffel- und löslichen Stärken und Magnesiumstearat bestehen.

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Für die parenteraie Verabreichung kann der Träger aus einer sterilen parenteral verträglichen Flüssigkeit wie beispielsweise sterilem Wasser oder einem parenteral verträglichen Öl wie beispielsweise Arachis-ül in Ampullen bestehen. Für die Rektal-Verabreichung eignen sich Zäpfchen, wobei der Träger aus einem dafür geeigneten Grundstoff besteht.

Zweckmäßigerweise wird die Zusammensetzung oder Mischung in Einsatzrr.engen formuliert, von denen jede eine feststehende Dosis des aktiven Bestandteils liefern kann. Tabletten, beschichtete Tabletten, Kapseln, Suppositorien und Ampullen sind Eeispiele geeigneter Formen von Einsatzmengen.

Schließlich schafft die Erfindung noch eine Interferon induzierende Substanz der vorstehend beschriebenen Art in ihrer Verwendung als Medikament.

Die beiliegenden Figuren 1 und 2 zeigen das Ultraviolett-AbsorptionsspeKtrurr; bezw. das Infrarot-Absorptionsspektrum der aktiven Substanz der Erfindung.

Die Erfindung wird nachstehend anhand einiger Ausführungsbeispiele des weiteren beschrieben, wobei diese Eeispiele keinerlei Einschränkung der Erfindung bedeuten.

Beispiel 1

Zunächst wurden getrocknete Blüten von Chartamus tinetorius Linne in einer Menge von 2 kg mit Wasser gewaschen und in 40 1 Wasser bei Raumtemperatur 3 Tage lang stehengelassen, um die Extraktion

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3 O C /,018

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durchzuführen. Anschließend wurde das Ganze mit 6OüC U/min 20 min lang zentrifugiert, um den Rückstand zu entfernen, welcher zweimal mit Wasser gewaschen wurde, wobei jeweils 10 i Wasser verwendet wurden. Die Waschflüssigkeit wurde rr-it der überstehenden Flüssigkeit zusammengeschüttet. Der gesamte Feststoffgehalt der kombinierten Lösung betrug 562.037 g (Trockenbasis). Die kombinierte Lösung wurde durch Uitrafilterung mittels eines Uitrafilters (Model UD-6, Handelsprodukt der Bio Engineering K.K., Toyko) mit einer UK-200-Membrane (liandelsprodukt der Toyo Roshi K.K.j Japan) fraktioniert, um Suostanzen mit einem Molekulargewicht von über 200 000 bei einen; Drucx. von 3 Kg/cm festzuhalten, wobei sich ein Rückstand ergab, welcher dann nach Gefriertrocknung ein braunes Pulver, und zwar b9,46 g, ergab. Zu Vergleichs zwecken wurde die gleiche Behandlung mit einer Xm lüü-Membrane (Handelsprodukt der Amicon Corp., USA) durchgeführt, um Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 00C zurückzuhalten, wobei sich 93*50 g an braunem Pulver ergaben.

In der zweiten Stufe, der Reinigung, wurden 2 g des braunen Pulvers in 5 nil Wasser gelöst und in eine Säule (4,5 x 70 cm) übergeleitet, welche mit Sephadex G-200 (einem Wirkstoff für die Gelfilterung) angefüllt war. Die Eiution wurde mit 600 ml Wasser durchgeführt und die ausfließende Flüssigkeit wurde in Fraktionen von jeweils 3 ml aufgeteilt. Die Fraktionen 25-55 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet, wobei ein weißliches Pulver (155,0²J- mg) entstand.

In der dritten Stufe (v/eitere Reinigung) wurde dieses Pulver (100 mg) in einer 0,1M tris-HCl-Fufferlösung (5 ml; pH 7,0; 1=0,01) gelöst und in eine Säule (2,5 χ 70 cm) gefüllt, welche

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ab

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mit DEAE-Gephadex A-50 (Ionentauscher) angefüllt war. Eine O,IM tris-HCi-Pufferlösung (j50ö ml; pH 9,0, welche 0,5M Nacl enthielt) wurde für die Elution verwendet und die ausfließende Flüssigkeit in Fraktionen von jeweils j5 ml aufgeteilt. Die Fraktionen 16 bis 27 wurden aufgefangen und zusammengeschüttet und das Ganze dann gefriergetrocknet, wobei man ein weißliches amorphes Pulver (72,3 mg) erhielt, welches geringere Mengen an Verunreinigungen enthielt und im wesentlichen die gleiche Interferon induzierende Aktivität besaß wie das zuerst erhaltene weißliche Pulver. Das Endprodukt hatte die vorbeschriebenen physikalisch-chemischen Merkmale und sein hoher Reinheitsgrad wurde durch Ultrazentrifugieren und Elektrophorese bestätigt.

Zu Vergleichszwecken wurden die Interferon induzierenden Aktivitäten der in den einzelnen Stufen dieses Beispiels erhaltenen Substanz in gleicher V/eise bestimmt, wie im nachstehend erläuterten Versuch 1 (in vitro-Methode), wobei sich nachstehende Resultate ergaben.

Tabelle 5

Stufe Probe (nach Aktivität bei einer Konzen

tration der Probe von (/Ug/ml)

10 1,0 0,1

1	Extraktion	>100	<10	<io
1	Ultrafilterung	>100	95	<rio
2	Gel-Filterung	>100	"> 100	96
3	lonentauscher-Behandlung	> 100	> 100	>100
	(Endprodukt)

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Andrejewski, Honke & Partner, Patentanwälte in Essen Beispiel 2

Es wurde in gleicher V/eise wie im Beispiel 1 vorgegangen, wobei jedoch Chartamus lanatus Linne dadurch extrahiert wurde, daß man die Blüten bei Raumternperatur 2 h lang in V/asser stehen ließ und dann bei 100 C weitere 2 h lang nochmals extrahierte. Die physikalisch-chemischen Merkmale des Endproduktes (70,3 rng) waren im wesentlichen die gleichen wie bei den. Endprodukt, welches im Beispiel 1 erhalten wurde.

Versuch 1

Bestimmung der IF-Induu/bion mit IF-induzierender Substanz und IF-Bestimmung: (Bezugsquelle: Y. Kojima's Bericht in Kitasato Ar-ch.Exp.Med., 4-3:35 (1970)).

a) IF-Induktion (in vitro):

Ein Kaninchen (Gewicht etwa 1 kg; Neu Seeland Weiß; SPB¹) wurde durch Herzpunktur getötet und Milz, Knochenmark und Lymphknotenzellen entnommen und zu einer Zellsuspension kombiniert, welche die vermischten Zellen (10' Zellen) enthielt. Die Masse wurde dann in Proben von jeweils 1 ml aufgeteilt. Vier Proben wurden unabhängig voneinander mit 10, 1,0, 0,1 oder 0,01 /Ug/ml eines Endproduktes versetzt, welches in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt worden war. Die Proben wurden dann 2Ά h lang bei 25 C gezüchtet und anschließend zentrifugiert. Die entstehenden überstehenden Flüssigkeiten wurden jeweils als Probe verwendet, um die Interferon-Aktivität zu bestimmen.

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ο) IF-induktiori (in vivo}:

Das lindproduut vom Beispiel 1 wurde in einer Menge von 1 mg in 2 ml Wasser gelöst und in die Ohrvene eines Kaninchens (Gewicht etwa 1 ngj Neu deeland Weiß; SPF) injiziert. 1, 2, 4 und 6 h nach der injektion wurde eine blutprobe von jeweils 2 rr.l den, Testtier entnommen und das Seruni einer jeden Probe wurde vom Blut isoliert und als Probe zur Bestimmung der Aktivität des induzierten Interferon verwendet.

c) Bestimmung der IF-Aativitat:

In beiden Methoden (a) und (b) wurde Vesicular-stomatitis-Virus als bedrohlicher Virus eingesetzt, um die Aktivität des induzierten Interferon auf nachstehende Weise zu bestimmen. Eine Einschicht-Kultur der Gelegten Zellen (lined cells) RK-13 von Kaninchen wurde in eine Flachschale gefüllt und derselben eine vorgegebene Menge der Probe der durch die vorgenannten Methoden (a) oder (b) erhaltenen Losung zugesetzt. Die Kultur wurde bei 37 C über Kacht unter Zusatz von Vesicular stomatitis Viren als Krankheitsviren bebrütet. Die Interferon-Aktivität wurde aufgrund des Redu,.tionsverhältnisses von Platten (plaques) bestimmt. Die Einheit der Interferon-Aktivität wird durch eine reziproke Zahl der höchsten Verdünnung der Probe ausgedrüCKt, welche zur Reduzierung der Zahl von Platten auf 5G^ erforderlich ist.

Versuch 2; Definition der Interferon induzierenden Substanz:

Es wurde bestätigt, daß die nach den Methoden (a) und (b) hergestellten Proben das Wachstum von Vesicular stomatitis- und

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Vacoinia-Viren in den RK-1,5 Zellen von Kaninchen der gleichen Tierspezies hemmen, jedoch nicht das Wa oh ε tu.·', Yauoinia-Viren ii; L-Zellen von Mäusen unterscniedlicner Tierspezies. Aui'3erderr, wurde ihre IF-ÄK.tivität nach einer 2-stündigen Behandlung mit 0 ,Ocfo Trypsin bei 37°C inaktiviert. Diese Tatsachen zeigen, daß die aktive Substanz der Erfindung eins= oubstanj init IF inau^ierenaer Aktivität darstellt.

Versuch

Im Beispiel 1 wurde die Elektrophorese uei h C in nei\..örr;rr,iicher V/eise durchgeführt, wobei eine im Handel erhältliche Einrichtung (Model ÄE-2, Handelsprodul.t der Toyo ILagaku San^yc I₁.L., Joi.jo) eine Pol5^raorylanrid-Gel-PIatte (Dice ^ ü,m} und ein u,j5M Lorsäure-Puffer (ph ύ,4) verwendet wurden. Das entstehende Einzelband zeigte, daß die Testprobe einen hohen Reinheit α ^r ad hatte·.

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Claims (1)

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   1. üubstai^ iiiit Interferon induzierender λ,,χ,Ι-i l'ylt, -"eiche als amorphes weibliches Pulver stabil ist, d a ο u r c u g e x, e η η ε e χ e h η s t , ua^ sis nachstehende physical!ach chemischen Mer^n^le aufueist:

   I) Slenentaranaiyse:

   Ca. ΙΟυ ΰ^ϋ bis ca. pÜO üüü (hauptfiUchiic. o:t. JGO LOg bis ca. 1 OuO OGG)

   !..estir/mt ourch Uj.trazeutr-ifu^ier'2:), Ultrafiltrieren und

   ß) ochfflelz- oaer «iersetüun

   oeii/r.eiipun,· t unbestimnit. Verkohlt L-ti etwa 22'.. G.

   4} Ültraviolett-Äbsorptionsüpe^tru:-.::

   oiehe in Pig.l (bestimmt in Ο,ΐί·,· waOii-i.ösurij).

   O } Inf rarot-Absorptionsspe^tru.j:

   üiihe in Pig.2 (durch KBr-Methoae).

   5) Löslichkeit in vez-schiedunen Lösungsmitteln:

   Löslich in Wasserj leicht löslich in wässrigen Lösungen von Natriurrmyciroxid, Kaliurnhydroxid und Ammoniumh^droxid, im wesentlichen unlöslich in Methanoi, /ithanoi, Propanoi, loutanoi, Azeton, Chloroform und Diäthylather.

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   - Vf -

   7) Farbreaktion:

   Positiv in Ninhydrinrea±,.tion, Phenol/Schwefelsäure-Reaktion, Dittnier-ReaAtion und in Foiin's Reagens; negativ in Eison-Morgan-Rea^tion.

   6) Natur: 15,61 $ 9,3b ^ Asparagins äure 5,51 % 8auer. 10,90 % 64,9b fo Serin 9,64 % 3, Sd % 1,40 Si Prolin 4,27 9,09 % Alanin 8,24 % 9) Chemische Hauptbestandteile: 4,04 % soieuzin 5,59 % a) Aminosäuren: 2,56 ;3 Phenylalanin 1,32 P Oxyprolin Arginin 1,24 ¹P Threonin 1,S'4 £ Histidin 0,93 fo Glutamine äure Lc:.-JO ρ \ Glycin b) Zucker: (+0,6 %') Valin Arabinose Galaktose 20,98 % Leuzin GlUKOse Mannose 3,26 Lysin Xylose Tyrosin Ammoniak

   lü) Optisches Drehvermögen:

   '- = + 63⁰ bis +69° (+66° im Durchschnitt) (c = 0,49 fo in O,1N MaOH).

   ~3~ 3 CJ i j 4 01 8

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   2. Substanz nach Anspruch 1, dadurch ge*vennzeicnriet, da« sie in im wesentlichen reiner Form die Merkmale sernäß Ansprucn I aufweist.

   3. Verfahren zur Herstellung einer Substanz '-nit Interferon induzierender Aktivität, dadurch ge^enn^eicunet, daß diese aktive Substanz aus einer Pflanze des Genus Carthamus und deren diese aktive Substanz enthaltenden Varianten extrahiert wird und aus dem erhaltenen Extrakt die Substanz gewonnen wird.

   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze aus Carthamus tinctorius Linne und deren Varianten ausgewählt wird.

   5· Verfahren nach Anspruch ~j>, dadurch gekennzeichnet, daß die Pflanze aus Carthamus lanatus Linne, Carthamus arborescens Linne, Carthamus baeticus Linne und deren Varianten ausgewählt wird.

   6. Verfahren nach Anspruch 3 j dadurch geKennzeichnet, daß die Extraktion mit Wasser durchgeführt xuird.

   7· Verfahren nach Anspruch o, dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion bei einem pH-Wert von 7-10 durchgeführt wird.

   (j. Verfahren nach Anspruch 3j dadurch gekennzeichnet, daß die Extraktion mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel durchgeführt wird, welches im wesentlichen unfähig ist, die a Substanz zu lösen.

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   ^lj. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung eine überstehende Flüssigkeit (supernatant) gebildet wird und diese durch Ultrafilterung in Fraktionen fraktioniert wird, Vielehe die aKtive Substanz enthalten.

   IC. Verfahren nach Anspruch y, dadurch gekennzeichnet, daß die

   Ultrafilterung mittels eines Ultrafilters durchgeführt wird,

   durch welchen Substanzen mit einem Molekulargewicht von mehr als 100 000 abfilterbar sind.

   11. Verfahren nach Anspruch 3j dadurch gekennzeichnet, daß zur Gewinnung eine überstehende Flüssigkeit (supernatant) gebildet wird und dieser ein hydrophiles organisches Lösungsmittel zugesetzt wird, welches im wesentlichen unfähig ist, die aktive Substanz zu lösen, wodurch Fraktionen erzielbar sind, welche die a.-.tive 3uustanz enthalten.

   12. Substanz mit Interferon induzierender Aktivität, dadurch gekennzeichnet, dai> sie nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche ^ - 11 hergestellt ist.

   13?· Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als aktiven Bestandteile eine Interferon induzierende Substanz geniäß einem der Ansprüche 1 - 12 in Verbindung mit einem Träger oder Exzipienten enthält.

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