DE2822527C2 - - Google Patents

Info

Publication number
DE2822527C2
DE2822527C2 DE2822527A DE2822527A DE2822527C2 DE 2822527 C2 DE2822527 C2 DE 2822527C2 DE 2822527 A DE2822527 A DE 2822527A DE 2822527 A DE2822527 A DE 2822527A DE 2822527 C2 DE2822527 C2 DE 2822527C2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
protease
group
reaction
methyl ester
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired
Application number
DE2822527A
Other languages
English (en)
Other versions
DE2822527A1 (de
Inventor
Yuji Nonaka
Kiyotaka Oyama
Heijiro Shin-Nanyo Yamaguchi Jp Satoh
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sagami Chemical Research Institute
Tosoh Corp
Original Assignee
Sagami Chemical Research Institute
Toyo Soda Manufacturing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sagami Chemical Research Institute, Toyo Soda Manufacturing Co Ltd filed Critical Sagami Chemical Research Institute
Publication of DE2822527A1 publication Critical patent/DE2822527A1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE2822527C2 publication Critical patent/DE2822527C2/de
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/814—Enzyme separation or purification
    • Y10S435/816—Enzyme separation or purification by solubility

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Wiedergewinnen von Protease aus einem wäßrigen Medium, in dem in Anwesenheit der Protease eine erste Aminosäure, deren Aminogruppe mit einer Schutzgruppe geschützt ist, mit einer zweiten Aminosäure, deren Carboxylgruppe mit einer Schutzgruppe geschützt ist, unter Durchführung eine Peptidsynthese umgesetzt wird und eine Additionsverbindung aus dem gebildeten Dipeptid und der zweiten C-endständig geschützten Aminosäure ausgefällt wird.
Es ist bekannt, daß Proteasen, wie Papain und Chymotrypsin, zur Bildung von Peptidbindungen als umgekehrte Reaktion der Proteinzersetzung verwendet werden. Beispielsweise wurden Anilide unter Verwendung von Papsin von Bergman hergestellt, und die Peptidsynthesen, bei denen Monoaminocarbonsäuren, wie Leucin, mit N-endständigen Schutz-Benzoylgruppen und Leucin und Glycin mit C-endständigen Schutz-Amid- oder -Anilidgruppen verwendet wurden, wurden mit Papain und Chymotrypsin von Fruton durchgeführt (Advances in Protein Chemistry, Band 5, Seite 33 (1949), Academic Press Inc. New York, N.Y.).
Kürzlich haben einige der Erfinder, Isowa et al., über Peptidsynthesen unter Verwendung von Aminosäuren mit einer N-endständigen Schutz-Benzyloxycarbonylgruppe und Aminosäuren mit einer C-endständigen Estergruppe mit Enzymen, wie Papain, Prolisin, Subtilisin, BPN′ usw., berichtet (Nippon Kagakukai 35th Autumn Meeting Brief Report, Seiten 482 und 486 (1979) Nippon Kagakukai).
Einige der Erfinder und Isowa et al. haben die Umsetzung von Asparaginsäure oder Glutaminsäure mit einer N-endständigen Schutzgruppe mit einer Monoamino-monocarbonsäure mit einer C-endständigen Schutzgruppe, die keine weitere funktionelle Gruppe enthält, in Anwesenheit von Protease vorgeschlagen, wobei eine Additionsverbindung des Monoamino-monocarbonsäureesters mit keiner anderen funktionellen Gruppe und dem Reaktionsprodukt gebildet wird, und gemäß dem die Isolierung des Additionsproduktes durchgeführt wird (japanische Patentanmeldung 7279/1977; US-Patentanmeldung 8 70 108; CA-Patentanmeldung 2 95 711 und DE-Patentanmeldung P 28 01 238.6).
Es wird angenommen, daß die bei diesen Verfahren verwendete Protease ihre Proteaseaktivität nach der Reaktion beibehält. Jedoch besitzt das Filtrat des Reaktionsgemisches, aus dem das Reaktionsprodukt abgetrennt wird (das Reaktionsprodukt wird abgeschieden und ist in dem Reaktionsmedium unlöslich), nur eine schwache Proteaseaktivität.
Die Anmelderin hat festgestellt, daß die Hauptmenge der bei der Reaktion verwendeten Protease zusammen mit dem Reaktionsprodukt aus dem Filtrat abgetrennt wird und ihre Proteaseaktivität beibehält. Es erschien daher wünschenswert, die Protease aus dem Reaktionsgemisch zu isolieren und für die Peptidsynthese wieder zu verwenden.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zum Wiedergewinn von Protease durch Abtrennen der Protease aus dem Reaktionsprodukt einer Peptidsynthese, die in Anwesenheit der Protease durchgeführt wurde, zur Verfügung zu stellen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß die Additionsverbindung in dem wäßrigen Medium durch Zugabe eines polaren, mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels aufgelöst wird und das unlösliche Material als Protease aus der entstehenden Suspension durch eine Feststoff-Flüssigkeit-Trennung als feste Phase abgetrennt wird.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wiedergewonnenen Proteasen können wieder für die Peptidsynthesen verwendet werden.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren ist die Löslichkeit der Additionsverbindung aus einem gewählten Dipeptid und einer zweiten C-endständig geschützten Aminosäure in dem wäßrigen Medium relativ niedrig, wodurch das Reaktionsprodukt ausgeschieden wird.
Das wäßrige Medium ist normalerweise Wasser. Es ist möglich, ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel beizumischen, wenn die Protease nicht ausgefällt wird und die Präzipitation bzw. Ausfällung des Reaktionsproduktes durch die Zugabe des mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels nicht verhindert wird.
Der pH-Wert des wäßrigen Mediums bei der Reaktion liegt in einem Bereich, bei dem die Proteaseaktivität erhalten bleibt bzw. auftritt, und die Proteaseaktivität und die Bildungsreaktion der Additionsverbindung finden normalerweise bei einem pH-Wert von etwa 4 bis 9 statt.
Die erste Aminosäure, deren Aminogruppe mit einer Schutzgruppe geschützt ist, kann eine Aminosäure, wie Asparaginsäure, Glutaminsäure, sein, deren Aminogruppe mit der Schutzgruppe, wie einer aliphatischen Oxycarbonylgruppe, Benzyloxycarbonylgruppe, die Substituenten am Ring enthalten kann, Benzoylgruppe, einer aromatischen Sulfonylgruppe oder einer aromatischen Sulfinylgruppe, geschützt ist.
Asparaginsäure, deren Aminogruppe mit einer Benzyloxycarbonylgruppe oder einer Alkoxybenzyloxycarbonylgruppe, insbesondere einer Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, geschützt ist, und Glutaminsäure, deren Aminogruppe mit dieser Gruppe bzw. diesen Gruppen geschützt ist, sind besonders wichtige Ausgangsmaterialien.
Die zweite Aminosäure, deren Carboxylgruppe mit einer Schutzgruppe geschützt ist, kann eine Aminosäure sein, wie Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Phenylalanin, Methionin, Cystin (Cystein), Serin, Threonin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Lysin, Arginin, Histidin, Prolin, Oxyprolin, Tyrosin und Tryptophan, und ihre Carboxylgruppe ist mit der Schutzgruppe, wie einer niedrigen Alkoxygruppe, Benzyloxygruppe, Benzhydryloxygruppe, Anilinogruppe oder Amidogruppe, geschützt.
Monoaminomonocarbonsäuren, die keine andere funktionelle Gruppe enthalten, wie die niedrigen Alkylester von Phenylalanin, sind besonders wichtig als Ausgangsmaterial.
Die Mengen (Konzentrationen) dieser Ausgangsmaterialien sind nicht kritisch, und normalerweise können die Bereiche verwendet werden, die in der früheren Erfindung bzw. in der DE-OS 28 01 238 beschrieben werden. Beispielsweise werden diese Ausgangsmaterialien als Lösungen mit je einer Konzentration von etwa 0,001 bis 7 Mol verwendet.
In der älteren Anmeldung bzw. der DE-OS 28 01 238 ist das Verhältnis vom ersten Ausgangsmaterial zum zweiten Ausgangsmaterial ein Molverhältnis von 1 : 2.
Das Molverhältnis der Ausgangsmaterialien, das bei der praktischen Durchführung verwendet wird, ist nicht kritisch und liegt üblicherweise im Bereich von etwa 5 : 1 bis 1 : 5, bevorzugt etwa 2 : 1 bis 1 : 3.
Die Additionsverbindungen werden in der DE-OS 28 01 238 beschrieben und werden durch Addition der zweiten, C-endständigen, geschützten Aminosäure mit einem Dipeptid der ersten N-endständigen, geschützten Aminosäure und der zweiten C-endständigen, geschützten Aminosäure gebildet.
Die typischen Additionsverbindungen besitzen die Formel
in der
Aden Rest der Asparaginsäure oder Glutaminsäure, ausgenommen des C-endständigen und des N-endständigen, bedeutet, Bden Rest der zweiten Aminosäure, ausgenommen des C-endständigen oder des N-endständigen, bedeutet, Xeine N-endständige Schutzgruppe bedeutet und Yeine C-endständige Schutzgruppe bedeutet.
Die Reaktionstemperatur liegt in einem Bereich, bei dem die Proteaseaktivität aufrechterhalten wird, und beträgt bevorzugt etwa 20°C bis 50°C.
Die Reaktionszeit ist nicht kritisch und beträgt bevorzugt etwa 30 Minuten bis 24 Stunden.
Geeignete Proteasen umfassen saure Proteasen, wie Pepsin; Thiolproteasen, wie Papain, Stembromelein, Ficin, Cathepsin B, Chymopapain und Streptococcen-Proteasen; Metalloproteasen, wie neutrale Proteasen, die sich von Actinomyceten, Prolisin, Thermolysin, Collagenase, Crotulus atrox-Protease ableiten; und Serinproteasen, wie Subtilisin, alkalische Aspergillus-Protease, Elastase, α-Lytinprotease, Chymotrypsin und Chymotrypsin C.
Es ist besonders bevorzugt, Metalloproteasen wegen des geeigneten pH-Bereichs und der geeigneten Proteaseakti­ vität bei der Herstellung der Additionsverbindungen zu verwenden.
Die Menge an Protease kann gleich sein wie die Menge an Protease, die bei der früheren Erfindung bzw. der DE-OS 28 01 238 verwendet wird, und liegt normalerweise im Bereich von etwa 2 bis 400 mg (5×10-5 bis 1×10-2 mMol), insbesondere 5 bis 10 mg (1×10-4 bis 3×10-3 mMol) pro 1 mMol Ausgangmaterial.
Wenn ein mit Wasser mischbares, polares organisches Lösungsmittel zu dem das Präzipitat enthaltenden, wäßrigen Medium zugegeben wird, vermischt sich das organische Lösungsmittel mit dem wäßrigen Medium, und der Niederschlag bzw. das Präzipitat wird aufgelöst. Die Protease bleibt jedoch in der entstehenden Lösung suspendiert.
Die polaren organischen Lösungsmittel, die mit Wasser mischbar sind, können Alkohole, wie Methanol, Äthanol und Propanol; Ketone, wie Aceton; Sauerstoff enthaltende, polare organische Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran sein.
Die Menge an polarem organischem Lösungsmittel hängt von der Löslichkeit bei der Auflösung des Niederschlags ab, und normalerweise werden mehr als 10 Gew.-Teile, bevorzugt 20 bis 100 Gew.- Teile, pro 1 Gew.-Teil Präzipitat verwendet.
Die Temperatur bei der Auflösungsstufe des Präzipitats bei der Zugabe des mit Wasser mischbaren, polaren organischen Lösungsmittels liegt in dem Bereich, bei dem eine Deaktivierung der Protease verhindert wird, und beträgt normalerweise etwa -20°C bis 50°C, bevorzugt etwa -10°C bis 30°C.
Es ist erforderlich, daß man darauf achtet, daß ein Gefrieren des Reaktionsgemisches vermieden wird.
Die Protease wird als feste Phase nach einer geeigne­ ten Feststoff-Flüssigkeits-Trennung der entstehenden Suspen­ sion isoliert.
Die Feststoff-Flüssigkeits-Trennung kann irgendeines der bekannten Verfahren sein, wie Filtration, Zentrifugen­ abtrennung usw.
Es ist weiterhin möglich, ein Filterhilfsmittel zu verwenden.
Das Raktionsprodukt kann aus der isolierten Flüssig­ keitsphase nach an sich bekannten Verfahren, z. B. durch Ab­ destillation des organischen Lösungsmittels und dann Extrak­ tion mit einem geeigneten Lösungsmittel, erhalten werden.
Die wiedergewonnene Protease hat ihre Proteaseaktivi­ tät beibehalten und kann somit für die Peptidsynthese und andere Synthesen verwendet werden.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Wieder­ gewinnung und die Wiederverwendung der Protease möglich. Die Kosten der Protease sind ein wichtiger Faktor hinsichtlich der Gesamtkosten bei der Peptidsynthese.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1
In einen 30-ml-Kolben füllt man 0,534 g (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 0,863 g (4 mMol) L-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid und dann gibt man 5 ml Wasser zum Auflösen hinzu. Mit 7%igem ammoniakalischem Wasser wird der pH-Wert auf 6,4 eingestellt.
Die entstehende Lösung wird mit 30 mg Thermolysin vermischt und 2,5 h bei 38 bis 40°C zur Reaktion geschüttelt. 60 ml Aceton werden zu dem das ausgefallene Reaktionsprodukt enthaltenden Reaktionsgemisch zugegeben, es wird dann mit Eis abgekühlt, und das Gemisch wird 40 min stehengelassen. Das un­ lösliche Material wird durch Zentrifugalsedimentation isoliert. Die Proteaseaktivität wird nach dem Caseindigestionsverfahren bestimmt. Man stellt fest, daß die relative Proteaseaktivität des isolierten, unlöslichen Materials (wiedergewonnenes Ther­ molysin) gegenüber 30 mg des ursprünglichen Thermolysins 0,73 beträgt.
In den folgenden Beispielen wird die relative Protease­ aktivität nach dem Caseindigestionsverfahren bestimmt, sofern nicht anders angegeben.
Andererseits wird Aceton aus der isolierten Flüssig­ keitsphase bei 50 bis 60°C bei vermindertem Druck abdestil­ liert, und der Rückstand wird auf Zimmertemperatur abgekühlt, wobei sich Kristalle abscheiden.
Die Kristalle werden abfiltriert und mit 10 ml Wasser gewaschen und getrocknet; man erhält 0,851 g feine, nadel­ artige Kristalle, von denen bestätigt wird, daß sie die Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L- phenylalanin-methylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) sind (Ausbeute 70%).
Die Kristalle werden aus einem Lösungsmittelgemisch von Äthylacetat und n-Hexan umkristallisiert. Die physikali­ schen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse des Produktes sind wie folgt.
Fp.: 120 bis 124°C.
: +7,1 (C=1, Methanol)
Elementaranalyse: C₃₂H₃₇N₃O₉
berechnet:C 63,24  H 6,13  N 6,97% gefunden:C 63,21  H 6,15  N 7,00%
Die Infrarot- und NMR-Spektren des Produktes sind wie folgt:
Infrarotspektrum: 3260 cm-1 (N-H Streckvibration); 3000 bis 3200 cm-1 (C-H Streckvibration); 1740 cm-1 (C=Ester); 1720 cm-1 (Urethan); 1660 cm-1 (Amid 1. Absorption); 1630 cm-1 (Carboxylat); 1540 cm-1 (Amid 2. Absorption); 1430 und 1450 cm-1 (C-H Defor­ mationsvibration); 1390 cm-1 (Carboxylat); 1220 bis 1290 cm-1 (C-O-C Streckvibration und Amid 3. Absorption); 1050 cm-1 (Phenyl Vibration in der Ebene); und 740 und 695 cm-1 (monosub­ stituierter Benzolring Vibration aus der Ebene heraus).
NMR-Spektrum: δ=2,75 ppm; 3,02 ppm; 3,61 ppm; 3,7 ppm; 4,4-4,8 ppm; 5,05 ppm; 5,82 ppm; 7,3 ppm.
Beispiel 2
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1, mit der Aus­ nahme, daß man 3 ml Wasser zum Auflösen von N-Benzyloxycarb­ oxyl-L-asparaginsäure und L-Phenylalanin-methylester-hydro­ chlorid und eine wäßrige 1N NaOH-Lösung zur Einstellung des pH-Wertes auf 6,4 anstelle von 7%igem ammoniakalischem Wasser verwendet, werden die Reaktion und die Isolierung der Protease durchgeführt.
Die relative Proteaseaktivität (Caseindigestionsver­ fahren) des wiedergewonnenen Thermolysins gegenüber 30 mg des ursprünglichen Thermolysins beträgt 0,86.
Wird andererseits eine Testprobe hergestellt, indem man L-Asparaginsäure-β-benzylester zu dem Filtrat der Aceton­ lösung als innere Standardsubstanz gibt und die Ausbeute an Additionsverbindung aus N-Benzyloxycarbonyl-L-aspartyl-L- phenylalanin-methylester und L-Phenylalaninmethylester (1 : 1) nach der Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromatographie­ analyse bestimmt, so erhält man 60,2%.
Die Vorrichtung und die Bedingungen für die Hochge­ schwindigkeits-Flüssigkeitschromatographieanalyse sind wie folgt:
Vorrichtung:Hochgeschwindigkeits-Flüssigkeitschromato­ graphievorrichtung (TSK-HLC 801, hergestellt von Toyo Soda Industrial Co., Ltd.) Säule:Stärkegeltyp: Teilchengröße 5 µ (TSK-GEL LS 170, hergestell von Toyo Soda Industrial C., Ltd.) Eluierungsmittel:0,5%ige wäßrige Lösung aus Natriumacetat Strömungsrate:0,8 ml/min Druckverlust:20 kg/cm² Detektor:Differentialrefraktometer.
In den folgenden Beispielen werden die Ausbeuten an Produkten unter Verwendung der gleichen Vorrichtung bei den gleichen Bedingungen, sofern nicht anders angegeben, bestimmt.
Beispiel 3
In einen 30-ml-Kolben füllt man 0,534 g (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-asparaginsäure und 0,717 g (4 mMol) L-Phenylalanin-methylester, und 7 ml Wasser werden zum Auf­ lösen zugegeben. Der pH-Wert wird mit 7%igen ammoniakalischem Wasser auf 6,3 eingestellt.
Die entstehende Lösung wird mit 30 mg Thermolysin ver­ mischt, und die Reaktion und die Isolierung der Protease wer­ den entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 durchgeführt.
Die relative Proteaseaktivität der wiedergewonnen Protease gegenüber 30 mg des ursprünglichen Thermolysins be­ trägt. 0,71.
Die Ausbeute an Additionsverbindung aus N-Benzyloxy­ carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenyl­ alanin-methylester (1 : 1) beträgt 63,7%.
Beispiel 4
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß man 53 mg Thermolysin verwendet und während 2 h umsetzt, werden die Reaktion und die Isolierung der Protease durchgeführt. Die Reaktion und die Isolierung werden wie­ derholt, mit der Ausnahme, daß wiedergewonnenes Thermolysin verwendet wird.
Die Ausbeute an Additionsverbindung aus N-Benzyloxy­ carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenyl­ alanin-methylester (1 : 1) beträgt beim ersten Mal 82,9% und beim zweiten Mal 83,7%.
Die relative Proteaseaktivität der wiedergewonnenen Protease gegenüber 53 mg des ursprünglichen Thermolysins be­ trägt beim zweiten Mal 0,73.
Beispiel 5
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß man das Produkt mit 50 ml Tetrahydrofuran bei Zimmertemperatur löst anstelle von 60 ml Aceton und unter Eiskühlung, erfolgen die Reaktion und die Isolierung der Protease. Die relative Proteaseaktivität des wiedergewonnenen Enzyms gegenüber 30 mg des ursprünglichen Thermolysins beträgt 0,59.
Die Ausbeute an Additionsverbindung aus N-Benzyloxy­ carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenyl­ alanin-methylester (1 : 1) beträgt 67,3%.
Beispiel 6
Die Reaktion und die Isolierung der Protease erfolgen entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß man während 3 h umsetzt und das Produkt mit 40 ml Methanol bei 0°C anstelle von 60 ml Aceton unter Eiskühlung löst. Die relative Proteaseaktivität der wiedergewonnenen Protease gegenüber 30 mg des ursprünglichen Thermolysins beträgt 0,41.
Die Ausbeute an Additionsverbindung aus N-Benzyloxy­ carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenyl­ alanin-methylester (1 : 1) beträgt 75,4%.
Beispiel 7
Nach der Reaktion von Beispiel 1 werden 40 ml eines Lösungsmittelgemisches aus Methanol und Diäthyläther (1 : 1, ausgedrückt durch das Volumen) zu dem Reaktionsgemisch zuge­ geben. Das Gemisch wird 20 min bei Zimmertemperatur stehen­ gelassen. Die Isolierung der Protease erfolgt dann gemäß dem Verfahren von Beispiel 1.
Die relative Proteaseaktivität der wiedergewonnenen Protease gegenüber 30 mg des ursprünglichen Thermolysins be­ trägt 0,52.
Die Ausbeute an Additionsverbindung aus N-Benzyloxy­ carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenyl­ alanin-methylester (1 : 1) beträgt 65,0%.
Beispiel 8
In 3 ml Wasser werden 300 mg Thermoase (Titer 1 600 000 P/g) gelöst, und das unlösliche Material wird durch Zentrifugensedimentation abgetrennt. 40 mg Kartoffel- (potato)-Inhibitor werden zu 2,0 ml des überstehenden Mate­ rials zugegeben und das Gemisch wird 15 min stehengelassen.
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß man die entstehende Lösung anstellte von 30 mg Thermolysin verwendet, werden die Reaktion und die Isolie­ rung der Protease durchgeführt.
Die Reaktion und die Isolierung werden wiederholt, mit der Ausnahme, daß man die wiedergewonnene Protease an­ stelle der Lösung der Protease verwendet.
Die Ausbeute an Additionsverbindung aus N-Benzyloxy­ carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenyl­ alanin-methylester (1 : 1) beträgt 60,2% beim ersten Mal und 68,0% beim zweiten Mal.
Beispiel 9
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß man 50 mg Thermolysin verwendet und das Pro­ dukt mit 40 ml Acetonitril bei Zimmertemperatur anstelle von 60 ml Aceton unter Eiskühlung löst und während 15 min vermischt, werden die Reaktion und die Isolierung der Protease durchgeführt.
Die relative Proteaseaktivität der wiedergewonnenen Protease gegenüber 50 mg des ursprünglichen Thermolysins beträgt 0,68.
Die Ausbeute an Additionsverbindung aus N-Benzyloxy­ carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenyl­ alanin-methylester (1 : 1) beträgt 69,2%.
Beispiel 10
In einen 30-ml-Kolben füllt man 0,563 g (2 mMol) N-Benzyloxycarbonyl-L-glutaminsäure und 0,863 g (4 mMol) L-Phenylalanin-methylester-hydrochlorid. 5 ml Wasser werden zum Auflösen zugegeben, und der pH-Wert wird mit wäßriger 1N NaOH-Lösung auf 6,1 eingestellt.
Die entstehende Lösung wird mit 50 mg Thermolysin ver­ mischt. Das Gemisch wird 21 h bei 38 bis 40°C zur Reaktion gerührt. Dann werden 50 ml Aceton zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, das mit Eis gekühlt wird, und das Gemisch wird 40 min stehengelassen. Das unlösliche Material wird durch Zentrifugalsedimentation isoliert. Die relative Proteaseakti­ vität des unlöslichen Materials gegenüber 50 mg des ursprüng­ lichen Thermolysins beträgt 0,84.
Entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1 wird die isolierte Acetonlösung behandelt; man erhält 0,806 g (Ausbeu­ te 65,0%) rohe Kristalle aus eine Additionsverbindung von N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenylalanin-methylester (1 : 1).
Die physikalischen Eigenschaften und die Ergebnisse der Elementaranalyse des nach der Umkristallisation aus einem Lösungsmittelgemisch von Äthylacetat und n-Hexan er­ haltenen Produktes sind wie folgt:
Fp.: 93 bis 97°C.
: 0,1 (C=1, Methanol)
Elementaranalyse: C₃₃H₃₉N₃O₉
berechnet:C 63,75  H 6,32  N 6,75% gefunden:C 63,71  H 6,41  N 6,83%
Infrarotspektrum: 3340 cm-1 (N-H Streckvibration); 2950 bis 3030 cm-1 (C-H Streckvibration); 1730 und 1745 cm-1 (C=Ester); 1690 cm-1 (C=O Urethan); 1660 cm-1 (Amid 1. Absorption); 1620 cm-1 (Carboxylat); 1530 cm-1 (Amid 2. Absorption); 1440 cm-1 (C-H Deformationsvibration); 1405 cm-1 (Carboxylat); 1240 bis 1310 cm-1 (C-O-C Streckvibration und Amid 3. Absorption); 1050 cm-1 (Phenyl Vibration in der Ebene); 700 und 750 cm-1 (Phenyl Vibration in der Ebene heraus).
NMR-Spektrum: δ=2,0 ppm (2H), 2,3 ppm (2H), 3,0 ppm (4H), 3,6 ppm (3H), 3,7 ppm (3H), 3,8 ppm (1H), 4,3 ppm (1H), 4,8 ppm (1H), 5,0 ppm (2H), 5,8 ppm (3H), 5,8 ppm (1H), 7,2 ppm (1H), 7,2 ppm (10H), 7,3 ppm (5H)
Beispiel 11
Die Reaktion erfolgt entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß man 50 mg Thermolysin ver­ wendet und 0,8 g Dextrangel als Filterhilfsmittel zugibt und 2 h umsetzt.
Dann werden 40 ml Aceton zu dem Reaktionsgemisch zu­ gegeben, das mit Eis gekühlt wird, und das Gemisch wird 40 min stehengelassen und durch ein Glasfilter (G-3) filtriert; man erhält das unlösliche Material.
Die Reaktion und die Isolierung der Protease werden wiederholt, mit der Ausnahme, daß man das unlösliche Material anstelle von 50 mg Thermolysin und 0,8 g Filterhilfsmittel verwendet.
Die Ausbeute an Additionsverbindung aus N-Benzyloxy­ carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenyl­ alanin-methylester (1 : 1) beträgt beim ersten Mal 76,2% und beim zweiten Mal 57,8%.
Beispiel 12
Die Reaktion und die Auflösung des Prduktes erfolgen entsprechend dem Verfahren von Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß man 50 mg Thermolysin verwendet und 2 h umsetzt.
Das entstehende Gemisch wird durch ein Glasfilter (G-4) filtriert, und das unlösliche Material auf dem Glasfil­ ter wird mit 4 ml Wasser eluiert.
Die Reaktion und die Isolierung der Protease werden wiederholt, wobei man jedoch die entstehende Lösung anstelle von 50 mg Thermolysin verwendet und während 6,5 h umsetzt.
Die Ausbeute an Additionsverbindung aus N-Benzyloxy­ carbonyl-L-aspartyl-L-phenylalanin-methylester und L-Phenyl­ alanin-methylester (1 : 1) beträgt beim ersten Mal 51,8% und beim zweiten Mal 48,2%.

Claims (3)

1. Verfahren zum Wiedergewinnen von Protease aus ei­ nem wäßrigen Medium, in dem in Anwesenheit der Protea­ se eine erste Aminosäure, deren Aminogruppe mit einer Schutzgruppe geschützt ist, mit einer zweiten Aminosäure, deren Carboxylgruppe mit einer Schutzgruppe geschützt ist, unter Durchfürung einer Peptidsynthese umgesetzt wird und eine Additionsverbindung aus dem gebildeten Dipeptid und der zweiten C-endständig geschützten Amino­ säure ausgefällt wird. dadurch gekennzeichnet, daß die Addi­ tionsverbindung in dem wäßrigen Medium durch Zugabe eines polaren, mit Wasser mischbaren organischen Lö­ sungsmittels aufgelöst wird und das unlösliche Mate­ rial als Protease aus der entstehenden Suspension durch eine Feststoff-Flüssigkeits-Trennung als feste Phase abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man als Protease eine Metallo­ protease abtrennt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß man als polares, mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel einen niederen Alkohol oder Aceton einsetzt.
DE19782822527 1977-05-23 1978-05-23 Verfahren zur gewinnung von protease Granted DE2822527A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP5882777A JPS5411293A (en) 1977-05-23 1977-05-23 Recovery of protease

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE2822527A1 DE2822527A1 (de) 1978-12-07
DE2822527C2 true DE2822527C2 (de) 1988-10-27

Family

ID=13095471

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19782822527 Granted DE2822527A1 (de) 1977-05-23 1978-05-23 Verfahren zur gewinnung von protease

Country Status (4)

Country Link
US (1) US4212945A (de)
JP (1) JPS5411293A (de)
CA (1) CA1099653A (de)
DE (1) DE2822527A1 (de)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR8008024A (pt) * 1979-04-06 1981-03-31 Forenede Bryggerier As Processo para a producao enzimatica de peptideos
IT1212508B (it) * 1981-12-22 1989-11-22 Anic Spa Analoghi retro - invertiti dei penta - ed esapeptidi c - terminali della sostanza p. utili come vasodilatatori
JPS5917997A (ja) * 1982-07-23 1984-01-30 Toyo Soda Mfg Co Ltd ジペプチドエステルとアミノ酸エステルとの付加化合物の製造方法
JPS5928493A (ja) * 1982-08-06 1984-02-15 Toyo Soda Mfg Co Ltd アスパルチルフエニルアラニンアルキルエステルの製造法
AU1235992A (en) * 1991-01-25 1992-08-27 Novo Nordisk A/S Process for separation of two solid components
US5422261A (en) * 1993-04-16 1995-06-06 Baxter International Inc. Composition containing collagenase and chymopapain for hydrolyzing connective tissue to isolate cells
US5670358A (en) * 1995-10-19 1997-09-23 Baxter International Inc. Method for inhibiting chymopapain and papain enzyme activity with polysaccharides of animal origin
NL1006069C2 (nl) * 1997-05-16 1998-11-17 Dsm Nv Werkwijze voor de bereiding van peptiden.

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4119493A (en) * 1975-10-23 1978-10-10 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide
US4086136A (en) * 1975-10-23 1978-04-25 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center Process for producing a peptide using a serine or thiol proteinase
DE2801238C2 (de) * 1977-01-27 1986-06-05 (Zaidanhojin) Sagami Chemical Research Center, Tokio/Tokyo Verfahren zur Herstellung von Salzen aus L,L-Dipeptiden und Phenylalaninestern

Also Published As

Publication number Publication date
CA1099653A (en) 1981-04-21
JPS5713267B2 (de) 1982-03-16
JPS5411293A (en) 1979-01-27
DE2822527A1 (de) 1978-12-07
US4212945A (en) 1980-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE2801238C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Salzen aus L,L-Dipeptiden und Phenylalaninestern
DE2947140C2 (de)
DE2822528C2 (de)
DE2113707A1 (de) 9-Fluorenylmethoxycarbonyl-Verbindungen und deren Verwendung als Schutzgruppen fuer Aminosaeuren und Peptide
DE3012693A1 (de) Verfahren zur herstellung von dipeptiden
DE2822527C2 (de)
EP0029488A1 (de) Aminosäurederivate, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung zur Behandlung von Bluthochdruck
DE2647189C2 (de) Verfahren zur Herstellung von Oligopeptiden
DE60209458T2 (de) Verfahren zur Synthese von (2S,3aS,7aS)-1-(S)-Alanyl-octahydro-1H-2-carbonsäurederivaten und Verwendung in der Synthese von Perindopril
EP0052870A1 (de) Aminosäurederivate und Verfahren zu ihrer Herstellung
EP0292729B1 (de) Neue Festphasen-Peptidsynthesemethoden
DE2660626C2 (de) 3-Amino-2-hydroxy-4-phenyl-butansäure-Derivate und Verfahren zu ihrer Herstellung
EP0010587B1 (de) Adamantylalkyloxycarbonylderivate, deren Herstellung und Verwendung zur Darstellung von Peptiden
DE3203292C2 (de)
DE3013701C2 (de)
CH619468A5 (de)
DE3885671T2 (de) Verfahren zur Racemisierung von optisch aktivem Serin.
DE68928249T2 (de) Verfahren zur Trennung von Methylester von alpha-L-aspartyl-L-phenylalaninen
DE4214328A1 (de) Neue peptidderivate die als inhibitoren von bakteriellen kollagenasen verwendet werden koennen
DE3421303A1 (de) Salze aus 3-hydroxy-4-oxo-3,4-dihydro-1,2,3-benzotriazin und amino-verbindungen
DE2022032C3 (de) Verfahren zur Herstellung von Pepliden
WO1983000860A1 (en) Oligopeptidic ester and amide n-adn'-(2-chlorethyl)-n'-nitroso-carbomoylbd and production method thereof
DE1668876C3 (de) N-Acyl geschützte Aminosäuren und Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung bei Peptidsynthesen
DE4036130A1 (de) Neue peptidderivate, die als bakterienkollagenase-inhibitoren verwendbar sind, und sie enthaltende pharmazeutische zusammensetzung
DE1768246B2 (de) Tert.-alkylpentachlorphenylcarbonate, ihre herstellung sowie die herstellung von tert.-alkoxycarbonylaminen

Legal Events

Date Code Title Description
8110 Request for examination paragraph 44
D2 Grant after examination
8364 No opposition during term of opposition
8339 Ceased/non-payment of the annual fee