DE2816855A1 - Somatostatinanaloga, verfahren zu ihrer herstellung und zwischenprodukte hierfuer - Google Patents

Description

PFENNING-MAAS

MElNIG - LEMKE-SPOTT

6CHLElSSHHiMERSTR. 299

8000 MÜNCHEN 40

-t-

X-4747A

Eli Lilly and Company, Indianapolis, Indiana, V.St.A.

Somatostatinanaloga, Verfahren zu ihrer Herstellung und Zwischenprodukte hierfür

Die Erfindung bezieht sich auf Tetradecapeptide der Formel

Y-GIy-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-i

Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (Formel I),

worin Y D-VaI oder D-AIa bedeutet, ihre pharmazeutisch annehmbaren Säureadditonssalze sowie auf Zwischenprodukte, die während des Verfahrens zur Herstellung der Tetradecapeptide erzeugt werden.

Somatostatin, das auch als die Somatotropinfreisetzung inhibierender Faktor bekannt ist, ist ein Tetradecapeptid der Formel

L-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-

i , j

Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH.

Dieses Tetradecapeptid wurde aus Schafhypothalamusextrakten isoliert, und seine Wirkung ist die einer Inhibierung der Sekretion von Wachstumshormon (GH), das auch als Somatotropin bekannt ist, vergleiche P. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. Rivier und R. Guillemin, Science, Bd. 179, S. 77 (1973).

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Außerdem ist über die als D-Trp -Somatostatin bezeichnete Verbindung von Brown et al.. Endocrinology, Bd. 98, Nr. 2, S. 336 - 343 (1976) berichtet worden.

Die biologisch wirksamen Tetradecapeptide der oben angegebenen Formel I unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Struktur von der des Somatostatins durch das Vorhandensein eines D-Tryptophanrestes in Stellung 8 anstelle eines L-Tryptophanrestes und eines D-Valin- oder D-Alaninrestes in Stellung anstelle eines L-Alaninrestes. Der Einfachheit halber werden

1 8 die Tetradecapeptide der Formel I als D-VaI , D-Trp -Somatosta

1 8
tin und D-AIa , D-Trp -Somatostatin bezeichnet.

Die bei dem Verfahren zur Herstellung der Tetradecapeptide der Formel I gebildeten Zwischenprodukte haben die Formel

R-Y-Gly-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅)-L-Lys( L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄)-L-CyS(R₁)-X (Formel II),

worin bedeuten:

Y D-VaI oder D-AIa;

R Wasserstoff oder eine alpha-Aminoschutzgruppe,

R₁ Wasserstoff oder eine Thioschutzgruppe,

R~ Wasserstoff oder eine epsilon-Aminoschutzgruppe,

R₃ und R. Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe,

R₅ Wasserstoff oder eine Formylgruppe und

X eine Hydroxylgruppe oder die Gruppe

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Harz

in der "Harz" für Polystyrol steht,

wobei die einzelnen Reste R, R₁, R_, R₃, R₄ und R₅ Wasserstoff bedeuten, wenn X eine Hydroxylgruppe ist, und die Reste R, R₁, R₂, R.J und R. eine andere der oben angegebenen Bedeutungen haben, wenn X für die Gruppe

Harz

-O-CH —/ / >

steht.

Das Verfahren zur Herstellung der neuen Tetradecapeptide der Formel I ist dadurch gekennzeichnet, daß das entsprechende geradkettige Tetradecypeptid der Formel III

Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH,

worin Y die oben angegebene Bedeutung hat, mit einem Oxidationsmittel umgesetzt wird. Durch diese Umsetzung werden die beiden Sulfhydrylgruppen in eine Disulfidbrücke übergeführt.

Pharmazeutisch annehmbare nichttoxische Säureaddxtonssalze sind Salze mit organischen oder anorganischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Sulfonsäure, Weinsäure, Fumarsäure, Bromwasserstoffsäure, Glykolsäure, Citronensäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Bernsteinsäure, Essigsäure, Salpetersäure,

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- Mr-

Benzoesäure, Ascorbinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure und Propionsäure. Die bevorzugten Säureaddxtionssalze sind die mit Essigsäure hergestellten. Alle diese Salze können nach üblichen Methoden erhalten werden.

Im Rahmen der Erfindung liegen ferner Zwischenprodukte der Formel

R-Y-Gly-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅)-L-Lys(R L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄)-L-CyS(R₁)-X, Formel II,

worin die einzelnen Symbole die oben angegebenen Bedeutungen haben. Beispiele für diese Zwischenprodukte sind:

•R-D-Val-Gly-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R )-L-Lys(R₂)-L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄)-L-Cys(R₁J-X und

R-D-Ala-Gly-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp (R₅)-L-Lys(R₂)-L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R )-

Ein bevorzugtes Zwischenprodukt hat die Formel

Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH, Formel III,

worin Y die oben angegebene Bedeutung hat.

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Zu weiteren bevorzugten Zwischenprodukten gehören die folgenden:

H-D-Va1-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH;

11-Ό-Ρ la-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-

L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-

Ser-L-Cys-OH;

N- (BOC)-D-Val-Gly-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC) Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-(CBzOC) -

Lys-L-(BzI)Thr-L-Phe-L-(BzI)Thr-L-

·=· /Harz (BzI)3er-L-(PMB)Cys-O-CH-·^ _ym

^χ·~·^/ und

N-(BOC)-D-Ala-Gly-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC) Lys-L -Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-(CBzOC)Lys-

L-(BzL)Thr-L-Phe-L-(Bz])Thr-L-(BzI)Ser-L-

,·—«.Harz (PMB) «:ys-O-CH_-< .·

Die vorstehend zur Definition der Zwischenprodukte angegebenen Formeln umfassen Schutzgruppen für Amino-, Hydroxy- und Thio(sulfhydryl)-funktionen. Die Eigenschaft einer wie hierin definierten Schutzgruppe ist eine zweifache: Einmal verhindert die Schutzgruppe, daß eine in einem bestimmten Molekül vorhandene reaktionsfähige Gruppe eine umwandlung erfährt, wenn das Molekül Bedingungen unterworfen wird, die eine Abspaltung der sonst reaktionsfähigen Gruppe bewirken könnten. Zum anderen ist die Schutzgruppe von solcher Art, daß sie leicht unter Wiederherstellung ·

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der ursprünglichen aktiven Gruppe entfernt werden kann, und dies unter Bedingungen, die andere Teile des Moleküls nicht in Mitleidenschaft ziehen. Für diese Zwecke, d. h. zum Schutz von Amino-, Hydroxyl- und Thiogruppen geeignete Gruppen sind allgemein bekannt, und Verfahren zu ihrer Verwendung sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Ein Beispiel hierfür ist Protective Groups in Organic Chemistry, J. F. W. McOmie, Herausgeber, Plenum Press, New York, 1973.

In den vorstehend zur Definition der Zwischenprodukte angegebenen Formeln bedeutet R entweder ein alpha-Aminowasserstoffatom oder eine alpha-Aminoschutzgruppe. Die für R in Betracht kommenden alpha-Aminoschutzgruppen sind auf dem Peptidgebiet allgemein bekannt, und viele davon sind in Kapitel 2 der oben angegebenen Literaturstelle aufgeführt. Beispiele für solche Schutzgruppen sind: Benzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dxchlorbenzyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl (BOC), t-Amyloxycarbonyl, 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl (BpOC), Adamantyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl, Triphenylmethyl (Trityl) und p-Toluolsulfonyl. Die bevorzugte alpha-Aminoschutzgruppe ist t-Butyloxycarbonyl.

R₁ bedeutet entweder das Wasserstoffatom der Sulfhydrylgruppe des Cysteins oder die Schutzgruppe für den Sulfhydrylsubstituenten. Viele solcher Schutzgruppen sind in Kapitel 7 der oben angegebenen Literaturstelle beschrieben. Beispiele für geeignete Schutzgruppen dieser Art sind p-Methoxybenzyl, Benzyl, p-Tolyl, Benzhydryl, Acetamidomethyl, Trityl, p-Nitrobenzyl, t-Butyl, Isobutyloxymethyl und die verschiedensten Trity!derivate. Bezüglich weiterer Gruppen wird beispielsweise auf Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie,. "Synthese von Peptiden", Bd. 15/1 und 15/2 (1974), Stuttgart, verwiesen. Die bevorzugte Sulfhydrylschutzgruppe ist p-Methoxybenzyl.

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R„ bedeutet Wasserstoff an der epsilon-Aminofunktion des Lysinrestes oder eine geeignete epsilon-Aminoschutzgruppe. Beispiele für solche Schutzgruppe sind die oben in Verbindung mit der alpha-Aminoschutzgruppe aufgeführten. Typische Gruppen dieser Art sind Benzyloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl, p-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl, o-Chlorbenzyloxycarbonyl, 2,6-Dichlorbenzyloxycarbonyl, 2,4-Dichlorben- zyloxycarbonyl, o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Isopropyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl, Cycloheptyloxycarbonyl und p-Toluolsulfonyl.

Wie im folgenden noch eingehender dargelegt, erfolgt bei dem Verfahren zur Herstel]ung der Tetradecapeptide der Formel I periodische Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe der terminalen Aminosäure der Peptidkette. Die einzige Bedingung, die deshalb die epsilon-Aminoschutzgruppe an dem Lysinrest zu erfüllen hat, ist die, daß sie von solcher Art sein muß, daß sie unter den Bedingungen, die zur selektiven Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe angewandt werden, nicht abgespalten wird. Die entsprechende Wahl der alpha-Amino- und der epsilon-Aminoschutzgruppen liegt im Rahmen des durchschnittlichen Wissens und Könnens eines Peptidchemikers und hängt von den Unterschieden im Grad der Abspaltbarkeit der einzelnen Schutzgruppen ab. So sind Gruppen wie 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl (BpOC) und Trityl sehr labil und können schon in Gegenwart einer schwachen Säure abgespalten werden. Zur Abspaltung anderer Gruppen, wie t-Butyloxycarbonyl, t-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl und p-Methoxybenzyloxycarbony1, ist eine mäßig starke Säure, wie Chlorwasserstoffsäure, Trifluoressigsäure oder Bortrifluorid in Essigsäure, erforderlich. Noch stärker saure Bedingungen sind nötig, um andere Schutzgruppen, wie Benzyloxycarbonyl, Halogenbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, Cycloalkyloxycarbonyl und Isopropyloxycarbonyl, abzuspalten. Die Abspaltung der letztgenannten Gruppen erfordert

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drastisch saure Bedingungen, zum Beispiel die Verwendung von Bromwasserstoffsäure, Fluorwasserstoffsäure oder Bortrifluoracetat in Trifluoressigsäure. Unter den stärker sauren Bedingungen werden selbstverständlich auch die labileren Gruppen abgespalten. Bei der Wahl der einzelnen Aminoschutzgruppen muß daher berücksichtigt werden, daß die Schutzgruppen an der alpha-Aminofunktion in Verbindung mit den Spaltungsbedingungen, die zur selektiven Entfernung allein der Schutzgruppe an der alpha-Aminofunktion angewandt werden, labiler sind als die epsilon-Aminoschutzgruppe. Deshalb ist R„ vorzugsweise eine o-Chlorbenzyloxycarbonyl- oder Cyclopentyloxycarbonylgruppe, und in Verbindung damit ist die alpha-Aminoschutzgruppe der Wahl zur Verwendung in den einzelnen Aminosäuren, die an die Peptidkette angereiht werden, vorzugsweise die t-Butyloxycarbonylgruppe.

Die Gruppen R₃ und R₄ bedeuten Wasserstoff oder Schutzgruppen für die alkoholische Hydroxylgruppe von Threonin und Serin. Vieler solcher Schutzgruppen sind in Kapitel 3 der oben angegebenen Literaturstelle aufgeführt. Einzelne Beispiele für solche Schutzgruppen sind Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie Methyl, Ethyl und t-Butyl, Benzyl- und substituierte Benzylgruppen, wie p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, p-Chlorbenzyl und o-Chlorbenzyl, Alkanoylgruppen mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, wie Formyl, Acetyl und Propionyl, und die Triphenylmethyl(Trityl) · gruppe. Wenn R₃ und R. Schutzgruppen sind, dann ist die Schutzgruppe der Wahl in beiden Fällen die Benzylgruppe.

Die Gruppe R- bedeutet Wasserstoff oder eine Formylgruppe, die eine Schutzgruppe für die^NR--Gruppe des Tryptophanrestes darstellt. Die Verwendung einer solchen Schutzgruppe bleibt dem Belieben überlassen, weshalb R₅ genausogut Wasserstoff (N ungeschützt) wie die Formylgruppe (N geschützt) sein kann.

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-ßr -

Die Gruppe X steht am Carboxylende der Tetradecapeptidkette und kann eine Hydroxylgruppe sein, so daß sich eine freie Carboxylgruppe ergibt. X kann aber auch den festen Harzträger darstellen, an den die terminale Carboxylgruppe des Peptids während seiner Synthese gebunden ist. Dieses feste Harz kann durch folgende Formel wiedergegeben werden:

. . Harz

/ — γ

-O-CH ~»s »

In allen oben angegebenen Formeln steht R, R₁, R„, R_, R. und R₁. für Wasserstoff, wenn X eine Hydroxylgruppe bedeutet. Wenn X dem festen Harzträger entspricht, dann sind die Reste R, R₁, R„, R-., und R₄ Schutzgruppen.

Es werden folgende Abkürzungen, von denen die meisten allgemein bekannt sind und gemeinhin benutzt werden, verwendet:

AIa - Alanin

Asn - Asparagin

Cys - Cystein

GIy - Glycin

Lys - Lysin

Phe - Phenylalanin

Ser - Serin

Thr - Threonin

Trp - Tryptophan

VaI - Valin

DCC - NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid

DMF - N,N-Dimethylformamid

BOC - t-Butyloxycarbonyl

PMB - p-Methoxybenzyl

CBzOC - o-Chlorbenzyloxycarbonyl

CPOC - Cyclopentyloxycarbonyl

BzI - Benzyl

For - Formyl

BpOC - 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl

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- TA -

/5

Die Wahl der bei der Herstellung der Verbindungen der Formel I zu verwendenden Schutzgruppen gehört zwar zum Durchschnittswissen jedes synthetisch arbeitenden Peptidchemikers, doch soll noch einmal darauf hingewiesen werden, daß sich die Wahl der Schutzgruppen nach den einzelnen aufeinander folgenden Reaktionen, die durchgeführt werden müssen, richtet. So muß die Schutzgruppe der Wahl eine Gruppe sein, die gegenüber den bei der nachfolgenden Stufe der Reaktionsfolge angewandten Reagenzien und Bedingungen stabil ist. Beispielsweise muß, wie bereits oben bis zu einem gewissen Grad erörtert, die jeweils verwendete Schutzgruppe so beschaffen sein, daß sie unter den Bedingungen intakt bleibt, die bei der Abspaltung ' der alpha-Aminoschutzgruppe des terminalen Aminosäurerestes des Peptidfragments zur Vorbereitung der Anknüpfung des nächstfolgenden Aminosäurefragments an die Peptidkette angewandt werden. Bei der Auswahl der Schutzgruppe ist ferner zu berücksichtigen, daß sie während des Aufbaus der Peptidkette intakt bleiben muß und sich nach Abschluß der Synthese des gewünschten Tetradecapeptids leicht entfernen läßt. Alle diese Forderungen sind aber dem durchschnittlichen Peptidchemiker vertraut und geläufig.

Wie aus dem bereits Gesagten klar geworden sein dürfte, kann das Tetradecapeptid der Formel I durch Festphasensythese hergestellt werden. Diese Synthese besteht aus einem stufenweisen Aufbau der Peptidkette, der am C-terminalen Ende der Peptidkette beginnt. Zunächst wird Cystein durch Umsetzung von aminogeschütztem, S-geschütztem Cystein mit einem chlormethylierten Harz oder einem Hydroxymethylharz mit seiner Carboxylfunktion mit dem Harz verknüpft. Die Herstellung eines Hydroxymethylharzes ist von Bodanszky et al., Chem. Ind. (London), Bd. 38, S. 1597-98 (1966) beschrieben. Das chlormethylierte Harz ist im Handel erhältlich (Lab Systems, Inc., San Mateo, California, V.St.A.).

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- vr -

Zur Verknüpfung des C-terminalen Cysteins mit dem Harz wird das geschützte Cystein zunächst in sein Cäsiumsalz übergeführt. Dieses Salz wird dann nach der Methode von B. F. Gisin, HeIv. Chim. Acta, Bd. 56, S. 1476 (1973) umgesetzt. Das Cystein kann aber auch durch Aktivierung einer Carboxylfunktion nach bekannten Arbeitsweisen mit dem Harz verknüpft werden. Beispielsweise kann man das Cystein in Gegenwart einer die Carboxylgruppe aktivierenden Verbindung, wie Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC), mit dem Harz umsetzen.

Nach Verbinden des Cysteins mit freier Carboxylgruppe mit dem Harzträger besteht der übrige Anteil des Aufbaus des Peptids in der stufenweisen Anreihung jeder Aminosäure an den N-terminalen Teil der Peptidkette. Diese Anfügung einer Aminosäure erfordert eine Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe von der Aminosäure, die den N-terminalen Teil des Peptidfragments darstellt, und danach das Anknüpfen des nächstfolgenden Aminosäurerestes an die freie und reaktionsfähige N-terminale Aminosäure. Die Abspaltung der alpha-Aminoschutzgruppe erfolgt in Gegenwart einer Säure, wie Bromwasser stoff säure, Chlorwasserstoffsäure, Trifluoressxgsaure, p-Toluolsulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Naphthalinsulfonsäure oder Essigsäure, unter Bildung des entsprechenden Säureadditionssalzes. Bei einer anderen bekannten Methode zur Abspaltung der Aminoschutzgruppe wird Bortrifluorid verwendet. Beispielsweise wird durch Bortrifluorid-diethyletherat in Eisessig das aminogeschützte Peptidfragment in einen BF.,-Komplex übergeführt, der dann durch Behandlung mit einer Base, wie wäßrigem Kaliumbicarbonat, in das entblockierte Peptidfragment umgewandelt werden kann. Jede dieser Methoden kann angewandt werden, solange man darauf achtet, daß so gearbeitet wird, daß die Abspaltung der N-terminalen alpha-Aminoschutzgruppe die anderen an der Peptidkette vorliegenden Schutzgruppen nicht in Mitleidenschaft zieht. Zu diesem Zweck

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-rs--

ist es bevorzugt, die Abspaltung der N-terminalen Schutzgruppe mittels Trifluoressigsäure zu bewirken. Im allgemeinen wird die Abspaltung bei einer Tempratur von etwa 0 °C bis Zimmertemperatur durchgeführt.

Das nach der Abspaltung am N-Ende erhaltene Produkt liegt gewöhnlich in Form eines Säureadditionssalzes mit der Säure vor, die zum Abspalten der Schutzgruppe verwendet wurde. Das Produkt kann dann durch Umsetzung, mit einer schwachen Base, zum Beispiel einem tertiären Amin, wie Pyridin oder Triethylamin, in die freie terminale Aminoverbindung übergeführt werden.

Die Peptidkette ist dann in dem Zustand, in dem sie mit der nächstfolgenden Aminosäure umgesetzt werden kann. Dies kann nach jeder der verschiedenen bekannten Arbeitsweisen geschehen. Zur Anlagerung der nächstfolgenden Aminosäure an die N-terminale Peptidkette wird eine Aminosäure verwendet, die eine freie Carboxylgruppe aufweist, aber an der alpha-Aminofunktion sowie an etwa vorhandenen anderen aktiven Stellen geschützt ist. Die Aminosäure wird Bedingungen unterworfen, die die Carboxylfunktion für die Anlagerungsreaktion aktivieren. Eine solche Aktivierungsmaßnahme, die bei der Synthese angewandt werden kann, besteht in der Überführung der Aminosäure in ein gemischtes Anhydrid. Die freie CarboxyIfunktion der Aminosäure wird durch Umsetzung mit einer anderen Säure, zum Beispiel einer Carbonsäure, zum Beispiel in Form ihres Säurechlorids, aktiviert. Beispiele für solche Säurechloride, die zur*Ausbildung des gemischten Anhydrids verwendet werden können, sind Chlorameisensäureethylester, Chlorameisensäurephenylester, Chlorameisensäure-sec.-butylester, Chlorameisensäureisobutylester und Pivaloylchlorid.

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Eine andere Methode der Aktivierung der Carboxylfunktion der Aminosäure für die Anlagerung ist die der Überführung der Aminosäure in ein aktiviertes Esterderivat. Beispiele für solche aktiven Ester sind ein 2,4,5-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, p-Nitrophenylester und ein mit 1-Hydroxybenztriazol oder N-Hydroxysuccinimid gebildeter Ester. Eine weitere Methode zur Verknüpfung der C-terminalen Aminosäure mit dem Peptidfragment besteht darin, daß die Anlagerungsreaktion in Gegenwart wenigstens einer äquimolaren Menge N₁N¹-Dicyclohexylcarbodximid (DCC) durchgeführt wird. Die letztgenannte Methode wird für die Herstellung des Tetradecapeptids der Formel II, worin X

Harz

-O-CH -*f · ² Λ=.⁷

bedeutet, bevorzugt.

Wenn dann die gewünschte Aminosäuresequenz vorliegt, kann das Peptid von dem Harzträger entfernt werden. Hierzu wird das geschützte Harzträger-Tetradecapeptid mit Fluorwasserstoff behandelt. Dadurch wird das Peptid von dem Harz abgelöst. Außerdem werden dadurch jedoch alle noch vorhandenen Schutzgruppen an den reaktionsfähigen Stellen der Peptidkette sowie die alpha-Aminoschutzgruppe an der N-terminalen Aminosäure abgespalten. Bei Verwendung von Fluorwasserstoff zur Abspaltung des Peptids von dem Harz sowie zur Entfernung der Schutzgruppen ist es bevorzugt, die Reaktion in Gegenwart von Anisol durchzuführen. Es hat sich gezeigt, daß die Gegenwart von Anisol die mögliche Alkylierung bestimmter in der Peptidkette vorliegender Aminosäurereste inhibiert. Außerdem ist es bevorzugt, die Spaltung in Gegenwart von Ethy!mercaptan

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durchzuführen. Das Ethylmercaptan dient zum Schutz des Indolrings des Tryptophanrestes und erleichtert außerdem die überführung der geschützten Cysteinreste in ihre Thiolformen. Falls R₅ eine Formylgruppe ist, fördert die Gegenwart von Ethylmercaptan außerdem die Abspaltung der Formylgruppe durch Fluorwasserstoff.

Das nach der Abspaltungsreaktion erhaltene Produkt ist ein " geradkettiges Peptid mit 14 Aminosäureresten. Zur Erzielung des Endprodukts der Formel I muß das geradkettige Tetradecapeptid Bedingungen unterworfen werden, die zu seiner Oxidation führen, indem die beiden im Molekül vorhandenen SuIfhydry!gruppen, je eine an den Cysteinylanteilen, in eine Disulfidbrücke übergeführt werden. Dies kann durch Behandlung einer verdünnten Lösung des linearen Tetradecapeptids mit einem Oxidationsmittel, zum Beispiel Iod oder Kaliumferricyanid, erreicht werden. Auch Luft kann als Oxidationsmittel verwendet werden. Dabei liegt der pH-Wert der Mischung im allgemeinen zwischen etwa 2,5 und 9,0 und vorzugsweise zwischen 6,2 und 7,2. Wenn Luft als Oxidationsmittel verwendet wird, ist die Konzentration der Peptidlösung im allgemeinen nicht höher als etwa 0,4 mg Peptid/ml Lösung und liegt vorzugsweise bei etwa 50 μg/ml.

Die Verbindungen der Formel I können warmblütigen Säugern, einschließlich Menschen, verabreicht werden und eignen sich besonders gut zur Entspannung der glatten Muskulatur. Insbesondere der Gastroitestinaltrakt kann durch parenterale Verabreichung kleiner Mengen dieser Verbindungen und vorzugs-

1 8
weise von D-VaI ,D-Trp -Somatostatin entspannt werden. Diese Wirkung, die zu einer Verringerung der Darmmotilität führt, ist bei der hypotonischen Gastrointestinal-Radiographie besonders erwünscht. Außerdem eignen sich diese Verbindungen für die Behandlung von spastischem Colon, Pylorospasmen und anderen spastischen Zuständen des Gastrointestinaltrakts sowie von Ureter- und Gallenkoliken.

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Zur Erzielung einer Entspannung der glatten Muskulatur werden diese Verbindungen gewöhnlich in einer Dosis von etwa 0,1 bis 3 μg/kg Körpergewicht und vorzugsweise von etwa 0,3 bis 1,5 μg/kg Körpergewicht des Empfängers verabreicht. Die Verabreichung erfolgt parenteral und kann intramuskulär, subkutan oder intravenös sein. Vorzugsweise werden die Verbindungen intravenös oder intramuskulär verabreicht.

Für die parenterale Verabreichung werden im allgemeinen flüssige Dosierungseinhextsformen unter Verwendung der Verbindung mit einem pharmazeutischen Träger, wie isotonische Salzlösung, isotonisches Glycin, Lactose, Mannit, verdünnte Essigsäure, bacteriostatisches Wasser, zum Beispiel Wasser, das etwa 1 % Benzylalkohol enthält, und Phosphatpufferlösungen oder mit anderen geeigneten Kombinationen von herkömmlichen Trägern hergestellt. Das Verhältnis von Träger zu Wirkstoff liegt, bezogen auf das Gewicht, im allgemeinen zwischen 25 : 1 und 1000 : 1.

Die Verbindung kann je nach Träger und Konzentration in einem geeigneten sterilen Mittel, vorzugsweise Wasser, suspendiert oder gelöst werden. Zur Herstellung von Lösungen werden Verbindung und Träger in dem gewählten Mittel gelöst, die Lösung wird filtriert und in eine Phiole oder Ampulle eingefüllt, die verschlossen wird. Es ist von Vorteil, Hilfsstoffe, zum Beispiel ein Lokalanästhetikum, ein Konservierungsmittel oder ein Puffermittel zusätzlich aufzulösen. Zur Erhöhung der Stabilität kann die Verbindung zusammen mit dem Träger in Wasser gelöst und die wäßrige Lösung in einer Phiole lyophilisiert werden. Der trockene lyophilisierte Feststoff wird dann in der Phiole eingeschlossen, und zur Wiederherstellung des Präparats vor seiner Verwendung wird eine Phiole mit dem Lösungsmittel mitgeliefert. Parenterale Suspensionen können praktisch auf die gleiche Weise hergestellt werden, wobei jedoch der Wirkstoff in dem Mittel suspendiert und nicht gelöst ist.

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Die. Verbindungen der Formel I weisen eine weitere Wirksamkeit, wenn auch nicht unbedingt in äquivalentem Maße, auf, sie inhibieren die Freisetzung von Wachstumshormon. Diese inhibitorische Wirkung ist in den Fällen von Vorteil, in denen das behandelte Lebewesen wegen einer übermäßigen Sekretion von Somatotropin einer therapeutischen Behandlung bedarf; eine derartige Sekretion ist mit krankhaften Zuständen, zum Beispiel juvenilem Diabetes und Acromegalie, verbunden. Ferner zeigen diese Verbindungen andere physiologische Wirkungen, zum Beispiel eine Inhibierung der Magensäuresekretion, was sie für die Ulcerbehandlung geeignet macht, die Inhibierung von exokriner Pankreassekretion, was sie für die Behandlung von Pankreatitis geeignet macht, und die Inhibierung der Sekretion von Insulin und Glucagon. Die Verbindungen können in beliebiger Weise verabreicht werden, zum Beispiel oral, sublingual, subkutan, intramuskulär und intravenös. Für die sublinguale oder orale Verabreichung liegt die Dosis vorzugsweise zwischen etwa 1 und 100 mg/kg Körpergewicht. Die intravenösen, subkutanen oder intramuskulären Dosen liegen im allgemeinen zwischen etwa 1 ^g und 1 mg/kg Körpergewicht und vorzugsweise zwischen etwa 50 und 100 μg/kg Körpergewicht. Es ist offensichtlich, daß die Dosierung innerhalb eines weiten Bereichs schwankt, weil sie sich nach dem jeweils zu behandeinen Zustand und seinem Schweregrad zu richten hat.

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aa.

Die Verbindungen der Formel I können auch in Form von Tabletten oder Kapseln, die noch einen pharmazeutischen Träger enthalten, verabreicht werden. So können inerte Verdünnungsmittel oder Träger, zum Beispiel Magnesiumcarbonat oder Lactose, zusammen mit herkömmlichen Zerfallmitteln, wie Maisstärke und Alginsäure, und Gleitmitteln, wie Magnesxumstearat, verwendet werden. Die Menge an Träger oder Verdünnungsmittel macht im allgemeinen 5 bis 95 % und vorzugsweise 50 bis 85 % der fertigen Zubereitung aus. Aromagebende Stoffe können gleichfalls mitverwendet v/erden und führen dazu, daß das fertige Präparat für die Verabreichung geschmacklich verbessert wird.

Sollen die Verbindungen der Formel I parenteral verabreicht werden, dann eignen sich als Träger unter anderen die gleichen, wie sie oben in Verbindung mit der Verwendung dieser Verbindungen zur Entspannung der glatten Muskulatur beschrieben wurden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispile weiter erläutert.

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- rs -

Beispiel 1

N-t-Butyloxycarbonyl-S-p-methoxybenzyl-L-cysteinyl-methyliertes Polystyrolharz

Zu 1000 ml Ν,Ν-Dimethylformamid (DMF), die das Cäsiumsalz von N-t-Butyloxycarbonyl-(S-p-methoxybenzyl)-cystein (hergestellt aus 17,5 g der freien Säure) enthalten, werden 100 g chlormethylxertes Polystyrolharz (Lab Systems, Inc., 0,75 mMol Cl/g) gegeben. Die Mischung wird 5 Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Dann wird das Harz abfiltriert und dreimal abwechselnd mit einer Mischung aus 85 % DMF und 15 % Wasser und mit DMF und anschließend zweimal mit DMF gewaschen. Eine Suspension des Harzes in 1000 ml DMF wird mit einer Lösung von 16g (83,4 mMol) Cäsiumacetat versetzt. Die Mischung wird 9 Tage bei Zimmertemperatur gerührt. Danach wird das Harz abfiltriert und abwechselnd jeweils dreimal mit einer Mischung aus 85 % DMF und 15 % Wasser und mit DMF gewaschen. Das Harz wird mit CHCl₃ gewaschen und dann viermal in einem Scheidetrichter in CHCl₃ suspendiert, wobei die Flüssigkeit zur Entfernung von Feinteilen jedesmal abgezogen wird. Das Harz wird abfiltriert, mit 95-prozentigem Ethanol und dann abwechselnd jeweils dreimal mit Benzol und 95-prozentigem Ethanol gewaschen. Durch Trocknen des Harzes im Vakuum bei 30 ⁰C werden 115,3 g des in der Überschrift genannten Produkts erhalten. Die Aminosäureanalyse ergibt 0,254 mMol Cys/g Harz. Das Cystein wird als Cysteinsäure nach einer Säurehydrolyse bestimmt, die unter Verwendung einer 1:1 Mischung aus Dioxan und konzentrierter Salszäure, wozu eine kleine Menge Dimethylsulfoxid gegeben worden ist, durchgeführt wird.

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Beispiel 2

N-t-Butyloxycarbonyl-D-valyl-glycyl-L-(S-p-methoxybenzyl)-cysteinyl-L-(N^-o-chlorbenzyloxycarbonyl)-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-(N^-o-chlorbenzyloxycarbonyl)-lysyl-L-(O-benzyl)-threonyl-L-phenylalanyl-L-(O-benzyl)-threonyl-L-(O-benzyl)-seryl-L-(S-p-methoxybenzyl) cysteinylmethyliertes Polystyrolharz

5,0 g des nach Beispiel 1 erhaltenen Produkts werden in das Reaktionsgefäß eines automatischen Peptitsynthesegeräts, Beckman 990, gegeben und zwölf der übrigen dreizehn Aminosäuren werden unter Verwendung des automatischen Synthesegeräts angefügt. Das gebildete geschützte Tridecapeptidharz wird in zwei gleiche Anteile aufgeteilt, und in einen dieser Anteile wird der abschließende Rest eingeführt. Die verwendeten Aminosäuren sowie die Reihenfolge ihrer Verwendung sind wie folgt: (1) N-t-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-serin;

(2) N-t-Butyloxycarbonyl-(O-benzyl)-L-threonin; (3) N-t-Butyloxycarbonal-L-phenylalanin; (4) N-t-Butyloxycarbonyl-(0-benzyl)-L-threonin; (5) N^{a p a}-t-Butyloxycarbonyl-N^-o-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin; (6) N^a " -t-Butyloxycarbonyl-D-tryptophan; (7) N-t-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin; (8) N-1-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin; (9) N-t-Butyloxycarbonyl-L-asparagin-p-nitrophenylester; (10) N^a " -t-Butyloxycarbonyl-N -o-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin; (11) N-t-Butyloxycarbonyl-(S-p-methoxybenzyl)-L-cystein; (12) N-t-Butyloxycarbonylglycin und (13) N-t-Butyloxycarbonyl-D-valin. Die Reihenfolge von Schutzgruppenentfernung, Neutralisation, Anknüpfung und erneute Anknüpfung für die Einführung jeder einzelnen Aminosäure in das Peptid ist wie folgt: (1) Drei Wäschen von jeweils 3 Minuten mit Chloroform (10 ml/g Harz); (2) Entfernung der BOC-Gruppe durch zwei Behandlungen von jeweils 20 Minuten mit jeweils 10 ml/g Harz einer Mischung aus 29 % Trifluoressigsäure, 48 % Chloroform, 6 % Triethylsilan und 17 %

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- 20- -

Methylenchlorid; (3) zwei Wäschen von jeweils 3 Minuten mit Chloroform (10 ml/g Harz); (4) eine Wäsche von 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (5) drei Waschen von jeweils 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % t-Butylalkohol und 10 % t-Amylalkohol (10 ml/g Harz); (6) drei Waschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (7) Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 3 % Triethylamin in Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (8) drei Waschen von jeweils 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (9) drei Wäschen von jeweils 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % t-Butylalkohol und 10 % t-Amylalkohol (10 ml/g Harz); (10) drei Wäschen von jeweils 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (11) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz der geschützten Aminosäure und 1,0 mMol/g Harz N,N^I-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml/g Harz Methylenchlorid mit anschließendem Vermischen während 120 Minuten; (12) drei Wäschen von jeweils 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (13) drei Wäschen von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % t-Butylalkohol und 10 % t-Amylalkohol (10 ml/g Harz); (14) drei Waschen von jeweils 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (15) Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 3 % Triethylamin in Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (16) drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (17) drei Wäschen von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % t-Butylalkohol und 10 % t-Amylalkohol (10 ml/g Harz); (18) drei Waschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz);

(19) drei Waschen von je 3 Minuten mit DMF (10 ml/g Harz);

(20) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz der geschützten Aminosäure und 1,0 mMol/g Harz N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) in 10 ml/g Harz einer 1:1 Mischung aus DMF und Methylenchlorid mit anschließendem Vermischen während 120 Minuten; (21) drei Wäschen von je 3 Minuten mit DMF (10 ml/g Harz); (22) drei Wäschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (23) drei

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Wäschen von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % t-Butylalkohol und 10 % t-Amylalkohol (10 ml/g Harz); (24) drei Waschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz);

(25) Neutralisation durch drei Behandlungen von je 3 Minuten mit 3 % Triethylamin in Methylenchlorid (10 ml/g Harz);

(26) drei Waschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz); (27) drei Waschen von je 3 Minuten mit einer Mischung aus 90 % t-Butylalkohol und 10 % t-Amylalkohol (10 ml/g Harz); und (28) drei Waschen von je 3 Minuten mit Methylenchlorid (10 ml/g Harz).

Die obige Behandlungsfolge wird zur Anreihung jeder einzelnen Aminosäure mit Ausnahme der Glycin- und Asparaginreste angewandt. Die Anreihung des Glycins erfolgt unter Anwendung nur der Stufen 1 bis 18. Der Asparaginrest wird über seinen aktiven p-Nitrophenylester eingeführt. Hierzu wird die obige Stufe (11) zu der folgenden dreistufigen Reihenfolge abgewandelt: (a) drei Wäschen von je 3 Minuten mit DMF (10 ml/g Harz); (b) Zugabe von 1,0 mMol/g Harz des p-Nitrophenylesters von N-t-Butyloxycarbonyl-L-asparagin in 10 ml/g Harz einer 1:3-Mischung aus DMF und Methylenchlorid mit anschliessendem Vermischen während 720 Minuten; und (c) drei Wäschen von je 3 Minuten mit DMF (10 ml/g Harz). Auch die obige Stufe (20) wird durch die Verwendung des p-Nitrophenylesters von N-t-Butyloxycarbonyl-L-asparagin in einer 3:1-Mischung aus DMF und Methylenchlorid mit anschließendem Vermischen während 720 Minuten abgewandelt.

Das fertige Peptidharz wird im Vakuum getrocknet. Das Produkt wird durch 72-stündiges Sieden unter Rückfluß in einer 1:1-Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Dioxan hydrolysiert. Die Aminosäureanalyse des erhaltenen Produkts ergibt unter Verwendung von Lysin als Standard folgende Werte: Asn, 1,00; 2Thr, 2,18; Ser, 0,95; GIy, 1,00; VaI, 0,99; 3Phe, 3,45; 2Lys, 2,00.

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- 32 -

Beispiel 3

D-Valyl-glycyl-L-cysteinyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysyl-L-threonyl-L-phenylalanyl-L- threonyl-L-seryl-L-cy stein

Zu einer Mischung aus 7,2 ml Anisol und 7,2 ml Ethylmercaptan werden 3,914 g (bei einem Substitutionswert von 0,155 mMol/g) des geschützten Tetradecapeptidharzes von Beispiel 2 gegeben. Die Mischung wird in flüssigem Stickstoff gekühlt und durch Destillation mit 80 ml flüssigem Fluorwasserstoff versetzt. Die erhaltene Mischung wird sich auf 0 ⁰C erwärmen gelassen . und 2 Stunden gerührt. Der Fluorwasserstoff wird durch Destillation entfernt. Die zurückbleibende Mischung wird mit Ether versetzt und auf 0 ⁰C abgekühlt. Der gebildete Feststoff wird abfiltriert und mit Ether gewaschen. Das Produkt wird getrocknet, und das von Schutzgruppen befreite Tetradecapeptid wird unter Verwendung von 1m Essigsäure und 50-prozentiger Essigsäure aus der Harzmischung extrahiert. Die Essigsäurelösung wird sofort im Dunkeln gefriergetrocknet. Der so erhaltene schwachgelbliche Feststoff wird in einer Mischung aus 10 ml entgaster 0,2m Essigsäure und 4 ml Eisessig suspendiert. Die Suspension wird mit 6 ml 50-prozentiger Essigsäure gelinde erwärmt, bis eine klare gelbe Lösung gebildet ist, die auf eine Säule aus Sephadex G-25 F aufgebracht wird. Die Einzelheiten der Chromatgraphie sind wie folgt: Lösungsmittel, entgaste 0,2m Essigsäure; Säulengröße 7,5 χ 150 cm; Temperatur 26 ⁰C; Strömungsgeschwindigkeit 1670 ml/Stunde; Fraktionsvolumen 25,05 ml.

Die Absorption jeder Fraktion bei 280 ΐημ wird gegen die Fraktionsnummer aufgetragen und es ergibt sich ein großer breiter Höchstwertbereich mit einer anschließenden Schulter. Der größte Teil des Höchstwertbereichs entspricht aufgrund der UV-Spektroskopie dem Produkt. Diejenigen Fraktionen, die vereinigt werden, und ihre Austrittsvolumina sind wie folgt:

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Fraktionen 207 bis 233 (5160 bis 5837 ml, Spitze = 5515 ml).

Diese Fraktionenvereinigung umfaßt nicht die Schulter an der Rückseite. Die UV-Spektroskopie zeigt das Vorhandensein von 470 mg Produkt. (Ausbeute = 46,4 %). Eine Ellman-Titration einer Probe zeigt einen Gehalt an freiem Sulfhydryl von 95 % der Theorie.

Beispiel 4

1 8 Oxidation zu D-VaI , D-Trp -Somatostatin

677 ml der nach Beispiel 3 erhaltenen Lösung des reduzierten

Λ Q

D-VaI , D-Trp -Somatostatins werden mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 50 μg/ml verdünnt. Der pH-Wert der Mischung wird mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf 6,7 eingestellt. Die Lösung wird 64 Stunden im Dunkeln bei 4 ⁰C gerührt, wonach eine Ellman-Titration anzeigt, daß die Oxidation beendet ist.

Die Mischung wird im Vakuum auf ein Volumen von 45 ml eingeengt und mit 45 ml Eisessig versetzt. Danach wird die Mischung an einer Säule aus Sephadex G-25 F entsalzt. Die Einzelheiten der Chromatographie sind folgende: Lösungsmittel, entgaste 50-prozentige Essigsäure, Säulengröße 5,0 χ 215 cm. Temperatur 26 ⁰C, Strömungsgeschwindigkeit 148 ml/Stunde, Fraktionsvolumen 17,3 ml.

Die Absorption jeder Fraktion bei 280 πιμ wird gegen die Fraktionsnummer aufgetragen, wodurch zwei große Spitzen erhalten werden. Die erste Spitze entspricht den aggregierten Formen des Produkts und die zweite Spitze entspricht monomerein Produkt. Das der zweiten Spitze entsprechende Material wird vereinigt (Fraktionen 116 bis 155, 2000 bis 2685 ml). Die UV-Spektroskopie zeigt an, daß in der Probe 279 mg Produkt enthalten sind (Ausbeute = 59,4 %). Die Lösung wird im Dunklen gefiergetrocknet.

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2316855

Der so erhaltene weiße Feststoff wird in zwei ungefähr gleichen Teilen erneut chromatographiert. Der erste Teil wird in 25 ml entgaster 50-prozentiger Essigsäure gelöst und an einer Säule aus Sephadex G-25F adsorbiert. Einzelheiten der Chromatographie: Lösungsmittel, entgaste 50-prozentige Essigsäure; Säulengröße 5,0 χ 215 cm; Temperatur 26 ⁰C; Strömungsgeschwindigkeit 148 ml/Stunde; Fraktionsvolumen 17,3 ml.

Das Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 πιμ gegen die Fraktionsnummer ergibt zwei große Spitzen. Es wird ein üblicher Schnitt der zweiten Spitze vorgenommen. Die Fraktionen 119 bis 125 (Austrittsvoluminä 2128 bis 2256 ml) werden vereinigt. Die UV-Spektroskopie zeigt die Gegenwart von 65,3 mg Produkt in dieser Probe. Das gewünschte Produkt wird durch Gefriertrocknung der Lösung im Dunkeln erreicht.

Der zweite Teil wird genauso wie der erste erneut chromatographiert, wobei vergleichbare Ergebnisse erhalten werden. Die beiden guten Produkte werden vereinigt und ergeben zusammen nach der UV-Spektroskopie 126 mg (45,2 % gereinigtes Produkt). Das vereinigte Produkt wird in 15 ml entgaster 0,2m Essigsäure gelöst und auf eine Säule aus Sephadex G-25F aufgegeben. Einzelheiten der Chromatographie: Lösungsmittel entgaste 0,2m Essigsäure; Säulengröße 5,0 χ 150 cm; Temperatur 26 ⁰C; Strömungsgeschwindigkeit 466 ml/Stunde; Fraktionsvolumen 16,3 ml.

Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 ΐημ gegen die Fraktionsnummer wird ein großer Höchstwertbereich erhalten. Die UV-Spektroskopie ergibt, daß der größte Teil des Höchstwertbereichs aus ausgezeichnetem Produkt besteht. Die Fraktionen 160 bis 180 (2592 bis 2934 ml, Spitze = 2685 ml) werden vereinigt und im Dunkeln gefriergetrocknet. Die UV-Spektroskopie ergibt die Gegenwart von 90,4 mg Produkt (Ausbeute 71,7 %) .

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26
Optische Drehung /alpha/^ = -56,1° (1 % Essigsäure).

Aminosäureanalyse: VaI, 1,0; GIy, 0,97; 2Cys, 1,62; 2Lys, 2,00; Asn, 1,01; 3Phe, 2,87; Trp, 1,02; 2Thr, 1,83; Ser, 0,81 .

Die obigen Ergebnisse sind als Verhältnisse von Lys/2 = 1,0 ausgedrückt. Alle Werte sind Mittelwerte von zwei 21-stündigen Hydrolysen ohne Spüler. Trypthophan wird UV-spektroskopisch (als Verhältnis zu Lys/2) bestimmt. Serin wird nicht unter Berücksichtigung der Verluste während der Hydrolyse korrigiert.

Das obige Produkt enthält geringe Mengen an Verunreinigungen. Falls erwünscht, kann das Produkt durch präparat!ve Hochdurcksflüssigkeitschromatographie (HPLC) weiter gereinigt werden.

Ein anderes mögliches Verfahren zur Oxidation des reduzier-

Ί ο λ ο

ten D-VaI , D-Trp -Somatostatins zu D-VaI , D-Trp -Somatostatin besteht in der Behandlung mit Kaliumferricyanid. Die Oxidation wird in einer wäßrigen Lösung, die wie oben beschrieben auf pH 6,7 eingestellt ist, durchgeführt. Zu der Mischung wird eine wäßrige Lösung von Kaliumferricyanid bis zu einer Endkonzentration gegeben, die etwa dem 3,3-fachen

1 8
der des reduzierten D-VaI , D-Trp -Somatostatins entspricht. Die Lösung wird etwa 2 Stunden im Dunkeln bei Zimmertemperatur gerührt. Die Vollständigkeit der Oxidation wird durch eine Ellman-Titration ermittelt.

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- 3-fr -

Beispiel 5

N-t-Butyloxycarbonyl-D-alanyl-glycyl-L-(S-p-methoxybenzyl)cysteinyl-L-(N^-o-chlorbenzyloxycarbonyl)lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-(N^-o-chlor-benzyloxycarbonyl)-lysyl-L-(O-benzyl)threonyl-L-phenylalanyl-L-(O-benzyl)-threonyl-L-(O-benzyl)-seryl-L-(S-p-methoxybenzyl)-cysteinyl-methyliertes Polystyrolharz

Diese Verbindung wird unter Verwendung des zweiten Teils des nach Beispiel 2 hergestellten Tridecapeptids und Anreihung von N-t-Butyloxycarbonyl-D-alanin anstelle von N-t-Butyloxycarbonyl-D-valin hergestellt.

Die Aminosäureanalyse des nach 21-stündiger Hydrolyse in einer 1:1-Mischung aus konzentrierter Salzsäure und Dioxan beim Sieden unter Rückfluß erhaltenen Produkts ergibt die folgenden Werte, wobei Lysin als Standard verwendet wird: Asn, 1,16; 2Thr, 2,14; Ser, 1,04; GIy, 1,09; Ala, 1,17; 3Phe, 2,88; 2Lys, 2,00.

Beispiel 6

D-Alanyl-glycyl-L-cysteinyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-phenylalanyl-D-tryptophyl-L-lysy^L-threonyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cy stein

Die in der Überschrift genannte Verbindung wird nach der in Beispiel 3 beschriebenen Arbeitsweise unter Verwendung von 3,772 g (bei einem Substitutionswert von 0,156 mMol/g) des nach Beispiel 5 erhaltenen Produkts hergestellt. Die Reinigung des Produkts erfolgt durch Chromatographie an einer Säule aus Sephadex G-25F. Bedingungen der Chromatographie: Lösungsmittel entgaste 0,2m Essigsäure; Säulengröße 7,5 χ 150 cm; Temperatur 26 ⁰C; Strömungsgeschwindigkeit 1658 ml/Stunde; Fraktionsvolumen 24,87 ml.

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Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 πιμ gegen die Fraktionsnummer wird ein großer breiter Höchstwertbereich mit einer anschließenden Schulter erhalten. Aufgrund der UV-Spektroskopie entspricht der Hauptteil des Höchstwertbereichs dem Produkt.

Die Fraktionen, die vereinigt werden, und ihre Austrittsvolumina sind folgende:

Fraktionen 206 bis 230 (5098 bis 5720 ml).

Diese Fraktionsvereinigung umfaßt nicht die anschließende Schulter. Die UV-Spektroskopie ergibt, daß in der Probe 403,9 mg Produkt (Ausbeute = 41,9 %) enthalten sind. Eine Ellman-Titration einer Probe ergibt einen Gehalt an freiem Sulfhydryl von 93 % der Theorie.

Beispiel 7

1 8 Oxidation zu D-AIa , D-Trp -Somatostatin

1 8 Das nach Beispiel 6 erhaltene reduzierte D-AIa , D-Trp Somatostatin wird wie in Beispiel 4 beschrieben behandelt. 622 ml der Lösung (Theorie 403,9 mg) werden mit destilliertem Wasser bis zu einer Konzentration von 50 μg/ml verdünnt und dann mit konzentriertem Ammoniumhydroxid auf einen pH-Wert von 6,7 eingestellt. Die Mischung wird 41 Stunden bei Zimmertemperatur im Dunkeln gerührt. Die Mischung wird im Vakuum auf etwa 40 ml eingeengt und dann mit 40 ml Eisessig verdünnt. Die Mischung wird dann an einer Säule aus Sephadex G-25F adsorbiert. Bedingungen der Chromatographie: Lösungsmittel entgaste 50-prozentige Essigsäure; Säulengröße 5,0 χ 215 cm; Temperatur 26 ⁰C; Strömungsgeschwindigkeit 151 ml/Stunde; Fraktionsvolumen 17,61 ml.

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Durch Auftragen der Absorption dieser Fraktion bei 280 ΐημ gegen die Fraktionsnummer werden zwei große breite Höchstwertbereiche erhalten. Der erste Höchstwertbereich entspricht aggregierten Formen des Produkts und der zweite Bereich entspricht gutem monomerem Produkt. Das durch den zweiten Höchstwertbereich widergegebene Produkt (Fraktionen 113 bis 155, 1971 bis 2728 ml) wird vereinigt und im Dunkeln gefriergetrocknet. Der so erhaltene Feststoff wird in etwa zwei gleichen Anteilen erneut chromatographiert. Der erste Anteil wird in 22 ml entgaster 50-prozentiger Essigsäure gelöst, und die Lösung wird auf eine Säule aus Sephadex G-25F aufgegeben. Bedingungen der Chromatographie: Lösungsmittel entgaste 50-prozentige Essigsäure; Säulengröße 5,0 χ 215 cm; Temperatur 26 ⁰C; Strömungsgeschwindigkeit 153 ml/Stunde; Fraktionsvolumen 17,85 ml.

Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 πιμ gegen die Fraktionsnummer werden zwei große Höchstwertbereiche erhalten. Ein üblicher Schnitt des zweiten Höchstwertbereichs wird durch Vereinigung der Fraktionen 121 bis 127 (Austrittsvolumina von 2142 bis 2267 ml) vorgenommen. Die UV-Spektroskopie zeigt die Gegenwart von 56,7 mg Produkt in dieser Probe an. Das gewünschte Produkt wird durch Gefriertrockung und Lösung im Dunkeln erhalten.

Der zweite Anteil wird in der gleichen Weise wie der erste erneut chromatographiert. Die Produkte werden vereinigt (126,3 mg durch UV-Spektroskopie - 31,3 % Ausbeute aus der reduzierten Form). Das Produkt wird in 21 ml entgaster 0,2m Essigsäure gelöst und auf eine Säule aus Sephadex G-25F aufgebracht. Bedingungen der Chromatographie: Lösungsmittel entgaste 0,2m Essigsäure; Säulengröße 5,0 χ 150 cm; Temperatur 26 ⁰C; Strömungsgeschwindigkeit 449 ml/Stunde; Fraktionsvolumen 15,71 ml.

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Durch Auftragen der Absorption jeder Fraktion bei 280 ΐημ gegen die Fraktionsnummern wird ein großer Höchstwertbereich erhalten. Die UV-Spektroskopie zeigt, daß der größte Teil dieses Bereichs dem Produkt entspricht. Die Fraktionen 169 bis 188 (2640 bis 2953 ml, Spitze = 2705 ml) werden vereinigt und im Dunkeln gefriergetrocknet. Die UV-Spektroskopie ergibt die Gegenwart von 85,2 mg Produkt (67,5 %).

Optische Drehung /alpha/„ = -54,9° (1 % Essigsäure).

Aminsäureanalyse: AIa, 1,05; GIy, 1,0; 2Cys, 1,58; 2Lys, 2,0; Asn, 1,10; 3 Phe, 2,92; Trp, 1,02; 2Thr, 1,98; Ser, 0,88.

Die obigen Ergebnisse sind als Verhältnisse zu Lys/2 = 1,0 ausgedrückt. Alle Werte sind Mittelwerte von zwei einundzwanzigstündigen Hydrolysen ohne Spüler. Tryptophan wird UV-spektroskopisch (als Verhältnis zu Lys/2) bestimmt. Serin wird nicht unter Berücksichtigung der Verluste während der Hydrolyse korrigiert.

1 8

D-VaI , D-Trp -Somatostatin wird an Hunden auf seine Inhibition der Magensäuresekretion in vivo geprüft. Bei 6 Hunden mit chronischer Fistel und Heidenhain-Sack wird die HCl-Sekretion im Magen durch Infusion des C-terminalen Tetrapeptids von Gastrin in einer Geschwindigkeit von 0,5 μg/kg und Stunde induziert. Jeder Hund dient als seine eigene Blindprobe. Nach 1 Stun-

1 8 de konstanter Sekretion von HCl wird D-VaI , D-Trp -Somatostatin 1 Stunde lang mit einer Geschwindigkeit von 0,15 μg/kg und Stunde infusiert. Das Auffangen von Magensäureproben wird mit Zwischenräumen von 15 Minuten weitere 1,5 Stunden fortgesetzt. Die Proben werden mit Hilfe eines automatischen Titrationsgeräts auf pH 7 titriert. Die maximale inhibitorische Wirkung

1 8
des D-VaI , D-Trp -Somatostatins wird gegen die Dosis-Wirkungs-Kurve von Somatostatin extrapoliert und die relative Wirkungs-

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stärke des Analogem zu der von Somatostatin wird als prozentuale

1 8 Aktivität ausgedrückt. D-VaI , D-Trp -Somatostatin inhibiert die durch das C-terminale Tetrapeptid von Gastrin induzierte konstante Säuresektretion um 48,22 - 6,45 % (mittlere Fehlergrenze). Diese Wirkung ist der von 0,175 μg/kg und Stunde Somatostatin äquivalent. Die Aktivität im Verhältnis zu der von Somatostatin liegt somit bei 116 %. Eine noch höher gereinigte

1 8
Probe von D-VaI , D-Trp -Somatostatin, die in Dosen von 0,200, 0,166 und 0,138 μg/kg und Stunde verabreicht wird, inhibiert die durch das C-terminale Tetrapeptid von Gastrin induzierte konstante Säuresekretion um 77,63, 71,57 bzw. 67,8 %. Im Verhältnis zu der Aktivität von Somatostatin beträgt diese Aktivität 302 bis 325 %.

Bei 0,20 μg/kg und Stunde unter den gleichen Bedingungen ge-

1 8
prüftes D-AIa , D-Trp -Somatostatin inhibiert die durch das C-terminale Tetrapeptid von Gastrin induzierte konstante Säuresektretion um 73,61 - 3,66 % (mittlere Fehlergrenze). Diese Wirkung ist der von 0,550 μg/kg und Stunde Somatostatin äquivalent. Im Verhältnis zu der Aktivität von Somatostatin beträgt die Aktivität somit 275 %.

18 18

D-VaI , D-Trp -Somatostatin und D-AIa , D-Trp -Somatostatin wurden außerdem auf ihre Wirkung auf die Darmmotilität von bei Bewustsein befindlichen Hunden geprüft. Es werden 3 Hunde mit Intraluminalkatheder im Antrum, Duodeum und Pylorus verwendet. Druckänderungen in der Darmröhre werden auf einem Visicorder unter Verwendung von Belastungsmeßgeräten und Miniatur-Lichtstrahlgalvanometern aufgezeichnet. Nach Einstellung eines konstanten Kontrollwerts wird die zu prüfende Verbindung während 10 Minuten intravenös infusiert. Die zu prüfende Verbindung erhöht zunächst den intralumenalen Druck im Pylorus und senkt ihn dann, wohingegen der Druck im Duodenum und Antrum während des ganzen Versuchs erniedrigt bleibt. Das Minimum der wirksamen Dosis, die zur Erhöhung des Pylorusdrucks und zur Erniedrigung des Duodenum- und Antrumdrucks erforderlich ist, beträgt etwa

1 8 O,O5 μg/kg und 10 Minuten für D-VaI , D-Trp -Somatostatin

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- 3TT -

1 8 und etwa 0,1 Mg/kg und 10 Minuten für D-AIa , D-Trp -Somatostatin. Diese Werte stehen einem Wert für Somatostatin selbst von O,125 bis 0,25 μg/kg und 10 Minuten gegenüber.

1 ft -| Q

D-VaI , D-Trp -Somatostatin und D-AIa , D-Trp -Somatostatin wurden außerdem auf ihre Wirkung hinsichtlich der Freisetzung von Wachstumshormon geprüft. Bei der angewandten Arbeitsweise werden normale männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 100 bis 120 g (Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana) verwendet. Die Prüfung ist eine Abwandlung der Methode von P. Brazeau, W. VaIe und R. Guillemin, Endocrinology, Bd. 94, S. 184 (1974). Bei dieser Prüfung werden insgesamt fünf Gruppen von jeweils 8 Ratten für das Testen jeder Verbindung verwendet. Allen Ratten wird Natriumpentobarbital intraperitoneal verabreicht, um die Wachstumshormonsekretion zu stimulieren. Eine Gruppe dient als Kontrolle und erhält nur Salzlösung. Zwei Gruppen erhalten Somatostatin, eine in einer Menge von 2 μg/Ratte subkutan und die andere in einer Menge von 50 μg/Ratte subkutan. Die beiden anderen Gruppen erhalten die zu prüfende Verbindung, eine in einer Menge von 10 μg/Ratte subkutan und die andere in einer Menge von 0,4 μg/Ratte subkutan. Die Serumkonzentration an Wachstumshormon wird 20 Minuten nach der gleichzeitigen Verabreichung von Natriumpentobarbital und Testverbindung bestimmt. Dann wird das Maß der Inhibierung der Serumwachstumshormonkonzentration bei der Kontrollgruppe bestimmt, und die relativen Aktivitäten von Testverbindung und Somatostatin selbst werden verglichen.

In einer Dosierung von 0,4 μg/Ratte bzw. von 10 μg/Ratte

18 "

inhibiert D-VaI , D-Trp -Somatostatin die Steigerung der Wachstumshormonsekretion um 14 % bzw. um 42 % gegenüber der Kontrolle. In einer Dosis von 2 μg/Ratte hat Somatostatin keine Wirkung auf die Erhöhung der Wachstumshormonsekretion, wohingegen es bei 50 μg/Ratte die Steierung der Wachstumshormonsekretion um 56 % gegenüber der Kontrolle inhibiert.

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In einer Dosis von 0,4 μg/Ratte bzw. von 10 μg/Ratte inhi-

1 8

hiert D-AIa , D-Trp -Somatostatin die Steigerung der Wachstumshormonsekretion um 54 % bzw. um 91 % gegenüber der Kontrolle. Somatostatin in einer Dosis von 2 μg/Ratte bzw. von 50 μg/Ratte inhibiert die Steigerung der Wachstumshormonsekretion um 40 % bzw. um 87 % gegenüber der Kontrolle.

18 18

D-VaI , D-Trp -Somatostatin und D-AIa , D-Trp -Somatostatin wurden in vivo auf ihre Wirksamkeit der Inhibierung der Glucagon- und Insulinsekretion nach Stimulierung mit L-Alanin geprüft. Normale mischrassige Hunde beiderlei Geschlechts werden über Nacht ohne Futter belassen. Zur Kontrolle werden Blutproben entnommen und danach wird mit der intravenösen Infusion von Salzlösung, Somatostatin bzw. Testverbindung begonnen. 30 Minuten später wird L-Alanin zusätzlich intravenös während 15 Minuten verabreicht. Die Infusion von Salzlösung, Somatostatin bzw. Testverbindung wird nach Beendigung der L-Alanininfusion noch 15 Minuten fortgesetzt. Die Infusion von L-Alanin verursacht eine abrupte Steigerung der Serumkonzentration an Glucagon und Insulin, die nach Beendigung der L-Alanininfusion auf die Kontrollkonzentration zurückgeht. Bei dem obigen Versuch ergibt sich, daß die Mindest-

1 8
dosis an D-VaI , D-Trp -Somatostatin zur Inhibierung der Glucagonsekretxon 0,04 bis 0,11 μg/kg und Minute und für die Inhibierung der Insulinsekretion weniger als 0,004 μg/kg und

1 8 Minute beträgt. Die Mindestdosis an D-AIa , D-Trp -Somatostatin für die Inhibierung sowohl der Glucagon- als auch der Insulinsekretion liegt unter 0,03 μg/kg und Minute.

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Claims (13)

1. Patentansprüche

   ; 1. ) Verbindungen der allgemeinen Formel Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-

   Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (Formel I),

   worin Y D-VaI oder D-AIa bedeutet, und ihre pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Säureadditxonssalze.
2. 2. Als Verbindung nach Anspruch 1 H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-

   I

   D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

   und ihre pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Säureadditionssalze.
3. 3. Als Verbindung nach Anspruch 1

   H-D-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

   und ihre pharmazeutisch annehmbaren nichttoxischen Säureadditxonssalze.
4. 4. Verfahren zur Herstellung der Verbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das entsprechende geradkettige Tetradecapeptid der Formel III

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   Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp- -L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH,

   worin Y D-VaI oder D-AIa bedeutet, mit einem Oxidationsmittel umgesetzt wird.
5. 5. Als Zwischenprodukte Verbindungen der allgemeinen Formel

   R-Y-Gly-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅J-L-LyS L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄J-L-CyS(R₁)-X (Formel II),

   worin bedeuten:

   Y D-VaI oder D-AIa;

   R Wasserstoff oder eine alpha-Aminoschutzgruppe,

   R₁ Wasserstoff oder eine Thioschutzgruppe,

   Rj Wasserstoff oder eine epsilon-Aminoschutzgruppe,

   R₃ und R₄ Wasserstoff oder eine Hydroxyschutzgruppe,

   R₅ Wasserstoff oder eine Formylgruppe und

   X eine Hydroxylgruppe oder die Gruppe

   Harz

   in der "Harz" für Polystyrol steht,

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   - 35- -

   wobei R, R-, R-, R₃, R₄ und R₅ Wasserstoff bedeuten, wenn X Wasserstoff ist, und R, R₁, R₂, R₃ und R. eine andere Bedeutung als Wasserstoff haben, wenn X für die Gruppe

   Harz "

   steht.
6. 6. Als Zwischenprodukt eine Verbindung nach Anspruch 5 mit der Formel

   R-D-Val-Gly-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅) ■ L-Lys(R₂)-L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R₄J-L-CyS(R₁)-X.
7. 7. Als Zwischenprodukt eine Verbindung nach Anspruch 6, in deren Formel X eine Hydroxylgruppe bedeutet.
8. 8. Als Zwischenprodukt eine Verbindung nach Anspruch 6, in deren Formel X für die Gruppe

   Harz

   steht.
9. 9. Als Zwischenprodukt eine Verbindung nach Anspruch 8 mit der Formel

   N-(BOC)-D-Val-Gly-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC) - j

   Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-(CBzOC)Lys-L-(BzI)Thr-L-

   t τ Harz·

   Phe-L-(BzI)Thr-L-(BzI)Ser-L-(PMB)CyS-O-CH₂- "
10. 10. Als Zwischenprodukt eine Verbindung nach Anspruch 5 mit der Formel

    R-D-Ala-Gly-L-Cys(R₁)-L-Lys(R₃)-L-Asn-

    L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅) -i-Lys(R₃)-L-Thr(R₃)-L-Phe-L-Thr(R₃) L-Ser(R₄)-L-Cys(R₁)-X.
11. 11. Als Zwischenprodukt eine Verbindung nach Anspruch 10, in deren Formel X eine Hydroxylgruppe bedeutet.
12. 12. Als Zwischenprodukt eine Verbindung nach Anspruch 10, in deren Formel X die Gruppe

    bedeutet.

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13. 13. Als Zwxschenprodukt eine Verbindung nach Anspruch 12 mit der Formel

    N-(BOC)-D-Ala-Gly-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC) -

    Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-(CBzOC)Lys-L-(BzI)Thr-L-Phe-

    ·==·. ,Harz L- (BzI) Thr-L- (BzI) Ser-L- (PMB) Cys-O-CH,—*

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