FI64575C - Foerfarande foer framstaellning av en terapeutiskt anvaendbar somatostatinanalog - Google Patents

Description

ΓΒΐ (11)KUULUTUSjULKAISU /»COC

LJ ' ' UTLÄGGN1NGSSKR1FT '3 c (4¾ P'tait1" ^ y ^ (51) Kv.lk.^Int.CI.3 G 07 C IO3/52 SUOMI — FINLAND (21) P«*nttlhik«mui — Pu*nt«ntöknlnj Τ8ΐΐ83 (22) H«k*ml*p»lvl — An*ekninf$d*j l8.OU.78 (23) AlkupSIvl — Giltifh*t*d»j 18.Ol.78 (41) Tullut julkiseksi — Bllvlt offtntllg 22 10.78

Patentti- ja rekisterihallitus Nthaviksipanon kuuLJulk^n pvm.- ,, *

Patent· och registerstyrelsen ' Antttkan utiagd oeh utljkrKt«n publktnd jx.u0.u3 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus—Begird prlorltet 21. OU. 77 01.02.78 USA(US) 789^73, 87U173 (71) Eli Lilly and Company, 3Ο7 East McCarty Street, Indianapolis,

Indiana 46206, USA(US) (72) James Edwin Shields, Indianapolis, Indiana,

Tsung-Min Lin, Indianapolis, Indiana, USA(US) (7U) Qy Kolster Ab (54) Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen somatostatiinianalogin valmistamiseksi - Förfarande för framställning av en terapeutiskt anvandbar somatostatinanalog Tämä keksintö koskee menetelmää, jonka avulla voidaan valmistaa te trad e ka pe p t icliä H-D- Vai-G ly- L-Cys- L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L- Lys-L.-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Sep-L-Cys-OH (kaava I), sekä sen farmaseutt sesli vaarat Lomia happoadditiosuoloja.

Somatostatiini, joka tunnetaan myös somatotropiinin vapautumista ehkäisevänä tekijänä on tetradekapeptidi, jonka kaava on L-A1a-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Tnr-L-Ser-L-Cys-OH. Tämä tetradekapeptidi on eristetty lampaan hypotalamuksen uutteista ja sen on todettu ehkäisevän kasvu-hormoonin eritystä, joka tunnetaan myös somatotropiinina. Ks. lähemmin ?. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N-Ling, M. Butcher, J. Rivier ja R. Guiilemin. Science, 17 9 , 77 (1973 ).

Tämän lisäksi on tätä yhdistettä, jota mukavuussyistä nimite- g tään D-Trp -somatostatiiniksi, selostanut aikaisemmin Brown et ai, Endocrinology, 9_8, n:o 2 , 336-343 ( 1976 ).

2 64575

Kaavan I mukaisen biologisesti tehokkaan tetradekapeptidin kaava on esitetty edellä ja siihen kuuluu myös sen ei-toksiset happoadditiosuolat. Uuden yhdisteen rakenne eroaa somatostätiinin rakenteesta siinä suhteessa, että D-tryptofaani-jäännös on asemassa 8 L-tryptofaani-jäännöksen tilalla ja D-valiini-jäännös kohdassa 1 L-alaniini-jäännöksen tilalla. Mukavuussyistä voidaan merkitä

Ί B

kaavan I mukaisia tetradekapeptidejä seuraavasti: D-Val , D-Trp - somatostatiini.

Valmistettaessa kaavan I mukaista yhdistettä muodostuu välituotteena R-Y-Gly-L-Cys (R-^-L-Lys (R2 )-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R5)-L-Lys(R2)-L-Thr(R2)-L-Phe-L-Thr(R^)-L-Ser(R^)-L-Cys(R)-X, kaava II, jossa Y on D-Vai, R on vety tai it-amino-funktion suojaryhmä, R-^ on vety tai tio-funktion suojaryhmä, R2 on vety tai £-amino-funktion suojaryhmä,

Rg ja R^ merkitsevät kumpikin vetyä tai hydroksi-funktion suojaryhmää,

Rt- on vety tai formyyli, ja X on hydroksi tai / _____ . / <' \^.hartsi jossa kaavassa hartsi on polystyreeni, sillä ehdolla, että X:n ollessa hydroksi R, R^, R2, R3> R^ ja R& merkitsevät kukin vetyä, ja kun X on <~ " "~\,hartsi niin R, R-^, R2, ja R^ merkitsevät kukin muuta kuin vetyä.

Uutta kaavan I mukaista tetradekapeptidiä valmistetaan antamalla vastaavan suoraket juisen, kaavan III mukaisen to t;radeka-peptidin Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-l.-Phe-L-Phe-D-Trp-l.-Lys- h-Thr- 1,-

J—I

Phe-L-Thr-L-Ser·- L-Cys-OH, jossa Y on D-VuL, reagoida hapot I imen 3 64575 kanssa. Tämä reaktio muuttaa kaksi sulfhydryyliryhmää disulfidi-sillaksi.

Farmaseuttisesti sopivia ei-toksisia happoadditiosuoloja ovat orgaaniset ja epäorgaaniset happoadditiosuolat, esimerkiksi seuraavien happojen kanssa valmistetut: suolahappo, rikkihappo, sulfonihappo, viinihappo, fumaarihappo, bromivetyhappo, glykoli-happo, sitruunahappo, maleiinihappo, fosforihappo, meripihkahappo, etikkahappo, typpihappo, bentsoehappo, askorbiinihappo, p-tolueeni-sulfonihappo, bentseenisulfonihappo, naftaleenisulfonihappo ja propionihappo. Happoadditiosuolat ovat edullisimmin etikkahapon kanssa valmistettuja. Kaikki edellä olevat suolat voidaan valmistaa tavanmukaisin menetelmin.

Edellä oleva kaava, joka esittää välituotteita, sisältää amino-, hydroksi- ja tio-(sulfhydryyli)funktioiden suojaryhmät.

Tässä esitettyjen suojaryhmien ominaisuudet ovat kahdenlaatuisia. Ensiksi,suojaryhmä estää kulloinkin kyseessä olevan molekyylin reaktiokykyisen osan reagoimisen molekyylin joutuessa olosuhtei- ^ siin, jotka voisivat aiheuttaa muutoin aktiivisen osan irtoamisen. Toiseksi, suojaryhmä on sellainen, että se voidaan helposti poistaa palauttamalla entiselleen alkuperäinen aktiivinen osä^ sellaisissa olosuhteissa, jotka eivät epäedullisesti vaikuttaisi molekyylin muihin osiin. Alan asiantuntijat tuntevat hyvin tällaisiin tarkoituksiin käytettävät ryhmät, siis amino-, hydroksi- ja työryhmien suojelemiseen käytettävät ryhmät. Tällaisten ryhmien käyttämisen selostamista ja tarkastelua varten on tehty jopa kokonaisia teoksia. Eräs tällainen teos on oppikirja Protective Groups in Organic Chemistry, J. F. W. McOmie, julkaissut Plenum Press, f' New York, 1973. /

Edellä olevassa, välituotteita definoivassa kaavassa, esittää R joko ^—amino—vetyä tai — amino— funktiota suo jaavaa ryhmää. Peptidikemiaan perehtyneet tuntevat hyvin R:n esittämät t-amino-funktion suojaryhmät. Useita niistä on esitetty yksityiskohtaisesti teoksessa McOmie, supra, luku 2, julkaissut J. W. Barton. Esimerkkeinä tällaisista suojaryhmistä mainittakoon: “ 64575 bentsyylioksikarbonyyli, £-klooribentsyylioksikarbonyyli, £-bromibentsyylioksikarbonyyli, o-klooribentsyylioksikarbonyyli, 2,6-diklooribentsyylioksikarbonyyli , 2 ,4-diklooribervtsyylioksi-karbonyyli, o-bromibentsyylioksikarbonyyli, £-metoksibentsyylioksi-karbonyyli, £-nitrobentsyylioksikarbonyyli, t-butyylioksikarbonyy-li (BOC), t-amyylioksikarbonyyli, 2-(£-bifenylyyli)isopropyyliok-sikarbonyyli (BpOC), adamantyylioksikarbonyyli, isopropyylioksi-karbonyyli, syklopentyylioksikarbonyyli, sykloheksyylioksikarbonyyli, sykloheptyylioksikarbonyyli, trifenyylimetyyli (trityyli), ja £-tolueenisulfonyyli. R:n esittämä -aminofunktiota suojeleva ryhmä on edullisimmin t-butyylioksikarbonyyli.

esittää joko vetyä kysteiinin sulfhydryyliryhmässä tai sulfhydryylisubstituentin suojaryhmää. Useita tällaisia suojaryh-miä on esitetty teoksessa McOmie, supra, luku 7, R.G. Hickey, V.R. Rao ja W.G. Rhodes. Sopivia esimerkkejä sellaisista suojaryh-mistä ovat £-metoksibentsyyli, bentsyyli, £-tolyyli, bentshydryy-li, asetamidometyyli, trityyli, £-nitrobentsyyli, t-butyyli, iso-butyylioksimetyyli, samaten kuin mikä tahansa useista trityylijoh-dannaisista. Lisää tällaisia ryhmiä on esimerkiksi teoksessa Houben-Weyl, Methoden der Organischen Chemie, "Synthese von Pep-tiden" , osat 15/1 ja 15/2, (1974). Stuttgart, Saksan Liittotasavalta. R^:n esittämä sulfhydryylifunktiota suojeleva ryhmä on edullisimmin £-metoksibentsyyli.

R^ esittää joko vetyä lys.iinijäännöksen E-aminofunktiossa tai sopivaa E-aminofunktion suojaryhmää. Esimerkkeinä sellaisista ryhmistä on suurin osa edellä mainituista, jotka soveltuvat käytettäviksi o<-aminofunktion suojaryhminä. Tyypillisiä tällaisia ryhmiä ovat bentsyylioksikarbonyyli, t-butyylioksikarbonyyli, t-amyy-lioksikarbonyyli, syklopentyylioksikarbonyyli, adamantyylioksikarbonyyli , £-metoksibentsyylioksikarbonyyli, £-klooribentsyylioksi-karbonyyl.i , £-brom.ibent syyl i oks ikarbonyyl i , o-kloori bentsyyl i oksikarbonyyli , 2,6-diklooribentsyyli oksikarbonyyli , 2, 4-di klooribents-yylioksikarbonyyli, o-bromibentsyylioksikarbonyyli, £-nitrobents-yylioks ikarbonyyli, isopropyylioksikarbonyyli, sykloheksyy1i oks i-karbonyyli, sykloheptyylioksikarbonyyli ja p-tolueenisulfonyyli.

Kuten seuraavassa tulee esiin, kaavan I mukaisten tetrade-kapeptidien valmistusmenetelmä sisältää jaksoittain toistuvia pep- 5 64575 tidiketjun terminaalisen aminohapon ;x,-aminofunkt ion suojaryhmän lohkaisuja. Ainoa rajoitus, mikä siis tehdään £-aminofunktion suojaryhmän identtisyyteen nähden lysiinijäännöksessä, on se, että se ei lohkea niissä olosuhteissa, joissa lohkaistaan selektiivisesti <X-aminofunktiota suojeleva ryhmä. o(-aminofunkt ion ja £-aminofunk-tion suojaryhmien sopiva valinta on seikka, jonka alaan perehtyneet peptidikemistit tuntevat hyvin, ja valinta riippuu siitä suhteellisesta helppoudesta, millä jokin suojaryhmä voidaan lohkaista. Täten esimerkiksi sellaiset ryhmät kuin 2-(p-bifenylyyli)iso-propyylioksikarbonyyli (BpOC) ja trityyli ovat hyvin labiileja ja ne voidaan lohkaista jo hyvin heikkoa happoa käyttäen. Melko voimakasta happoa, kuten kloorivetyhappoa, trifluorietikkahappoa tai booritrifluoridia etikkahapossa tarvitaan lohkaistaessa muista ryhmiä, kuten t-butyylioksikarbonyyli, t-amyylioksikarbonyyli, ada-mantyylioksikarbonyyli ja p-metoksibentsyylioksikarbonyyli. Vielä voimakkaampia happo-olosuhteita tarvitaan aikaansaamaan eräiden muiden suojaryhmien lohkaisu, kuten esimerkiksi bentsyylioksikar-bonyylin, halogeenibentsyylioksikarbonyylin, p-nitrobentsyyl.ioksi-karbonyylin, sykloalkyylioksikarbonyylin ja isopropyylioksikarbo-nyylin lohkaisu. Näiden jälkimmäisten ryhmien lohkaisu vaatii erittäin voimakkaita happo-olosuhteita, kuten bromivedyn, fluorivedyn tai booritrifluoriasetaatin käyttöä trifluorietikkahapossa. Luonnollisesti myös kaikki labiilimmat ryhmät lohkeavat voimakkaammissa happo-olosuhteissa. Aminofunktion suojaryhmän sopiva valinta merkitsee siis sitä, että c<-aminofunktion suojeturyhmänä käytteitään labiilimpaa ryhmää kuin £-aminofunktion suojelemiseen ja tähän liittyvät myös lohkaisuolosuhteet, jotka on suunniteltu sellaisiksi, että selektiivisesti poistetaan vain <X-aminofunktio.

Tässä suhteessa on 1*2 edullisimmin o-klooribentsyylioksikarbonyy-li tai syklopentyylioksikarbonyyli ja niiden kanssa valitaan edullisimmin käytettäväksi o<-aminofunktion suojaryhmänä kussakin aminohapossa, joka lisätään peptidiket juun, t-butyyl.ioksikarbonyyli .

Ryhmät ja. esittävät hydroksyyliryhmän vetyä tai treo-niinin ja vastaavasti seriinin alkoholisen hydroksyyl.in suojaryh-mää. Useita sellaisia suojaryhmiä on esitetty teoksessa McOmie, supra, luku 3, C.B. Reese. Tyypillisiä tällaisia suojaryhmiä ovat esimerkiksi C^-C^ -alkyyli, kuten metyyli, etyyli ja t-butyyli; 6 64575 bentsyyli, substituoitu bentsyyli, kuten £-metoksibentsyyli, £-nit-robentsyyli, £-klooribentsyyli ja o-klooribentsyyli; C^-Cg -alkanyy-li, kuten formyyli, asetyyli ja propionyyli; trifenyylimetyyli (tri-tyyli). Kun Rg ja ovat suojaryhmiä, niin suojaryhmäksi valitaan kummassakin tapauksessa edullisimmin bentsyyli.

Ryhmä esittää joko vetyä tai formyyliä ja definoi osan ^NR<. tryptofaani-jäännöksessä. Formyyli toimii suojaryhmänä. Tällaisen suojaryhmän käyttäminen on valinnanvaraista ja sen vuoksi R^ voi sopivasti olla vety (suojaamaton N) tai formyyli (suojattu N) .

Ryhmä X tarkoittaa tetradekapeptidiketjun karboksyylipää-tettä; se voi olla hydroksyyli, mikä definoi vapaan karboksyyli-ryhmän. Tämän lisäksi X tarkoittaa kiinteää hartsitukiosaa, johon peptidin terminaalinen karboksyyli on liittynyt sen synteesin aikana. Tämä kiinteä hartsi voidaan esittää kaavalla .·=· hartsi -0-CH_— · 2 S ✓ •-·

Kaikissa edellä olevissa yhdisteissä merkitsee R, R^ , Rg,

Rg , R^ ja R,- kukin vetyä silloin, kun X on hydroksyyli. Kun X merkitsee kiinteää hartsitukiosaa, niin R, R^, Rg, Rg ja R^ ovat kukin suojaryhmiä.

Seuraavia lyhennyksiä, joista useimmat ovat hyvin tunnettu--'’ ja ja alalla yleisesti käytettyjä, käytetään tästä lähtien:

Ala - Alaniini

Asn - Asparagiini

Cys - Kysteiini

Gly - Glysiini

Lys - Lysiini

Phe - Fenyylialaniini

Ser - Seriini

Thr - Treoniini

Trp - Tryptofaani

Vai - Väliini 7 64575 DCC - N,Ν’-disykloheksyylikarbodi-imidi DMF - N,N-dimetyyliformamidi BOC - t-butyylioksikarbonyyli PMB - £-metoksibentsyyli CBzOC - o-klooribentsyylioksikarbonyyli CPOC - Syklopentyylioksikarbonyyli

Bzl - Bentsyyli

For - Formyyli j

BpOC - 2-(p-bifenyyli)isopropyylioksikarbonyyli

Vaikka siis ammattitaitoinen, synteettisten peptidien tutkimuksen parissa työskentelevä kemisti pystyy valitsemaan kaavan I j mukaisten yhdisteiden valmistuksessa kulloinkin käytettävät suoja-ryhmät, on kuitenkin hyvä tietää, että suoritettavien reaktioiden ! sekvenssi vaatii valitsemaan juuri nimenomaiset suojaryhmät. Toisin sanoen, valitun suojaryhmän on oltava stabiili sekä reagent-tien suhteen että niiden olosuhteiden suhteen, jotka vallitsevat reaktiosekvenssin peräkkäisissä vaiheissa. Kuten edellä on jo jonkin verran tuotu esiin, on jonkin määrätyn suojaryhmän oltava sellainen, joka pysyy koskemattomana niissä olosuhteissa, joita käytetään lohkaisemaan <X-aminofunktion suojaryhmä peptidifragmentin terminaalisesta aminohappojäännöksestä, kun valmistetaan seuraa-vaksi tulevan aminohappofragmentin liittämistä peptidiketjuun. On myös tärkeää valita suojaryhmäksi sellainen, joka pysyy koskemattomana peptidiketjua rakennettaessa, ja joka on helposti poistet- . ' tavissa, kun täydennetään halutun tetradekapeptidi-yhdisteen syli-teesiä. Kaikki nämä seikat ovat ammattitaitoisen peptidikemistiry'y tiedossa. /

Kaavan III mukaista lähtöaineena käytettyä tetradeka·^ peptidiä voidaan valmistaa kiinteän faasin synteesin avulfa.

Tämä synteesi käsittää peptidiketjun rakentamisen jaksöttaisesti alkaen peptidin C-terminaali -päästä. Tarkemmin sanottuna, ensin liitetään kysteiini karboksyylifunktiostaan hartsiin antamalla ' amino-suojatun, S-suojatun kysteiinin reagoida kloorimetyloidun hartsin tai hydroksimetyylihartsin kanssa. Hydroksimetyylihartsin valmistamisen ovat selostaneet Bodanszky et ai. Chem. Ind. (Lontoo), 3_8, 1 597-98 (1966). Kloorimetyloitua hartsia on saatavissa kaupallisesti Lnb. Systems, Inc. San Matero, Kalifornia.

ö 64575

Kun C-terminaalinen kysteiini on liitetty hartsiin, muutetaan suojattu kysteiini ensin cesiumsuolakseen. Tämän suolan annetaan sitten reagoida hartsin kanssa menetelmän mukaan, jonka on selostanut B.F. Gisin, Helv. Chim. Acta, J36, 1476 (1 973 ). Vaihtoehtoisesti voidaan kysteiini liittää hartsiin aktivoimalla kyste-iinimolekyylin karboksyylifunktio soveltamalla helposti tunnettavaa tekniikkaa. Kysteiinin voidaan esimerkiksi antaa reagoida hartsin kanssa käyttämällä apuna karboksyyliryhmää aktivoivaa yhdistettä, kuten N,N’-disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC).

Sen jälkeen, kun vapaan karboksyylin sisältävä kysteiini on liitetty sopivasti hartsi-tukiosaan, käsittää loppuosa peptidin ra-kentamissekvenssistä kunkin aminohapon jaksottain tapahtuvan lisäämisen peptidiketjun N-päätteiseen osaan. Tämän vuoksi jokaiseen yksityiseen sekvenssiin kuuluu *-aminofunktion suojaryhmän lohkai-su siitä aminohaposta, joka edustaa peptidifragmentin N-päätteis-tä osaa, minkä jälkeen seuraa järjestyksessä seuraavan aminohappo-jäännöksen liittäminen aminohapon N-päätteeseen, joka on tällöin vapaa ja reaktiokykyinen. o*-aminofunktion suojaryhmän lohkaisu voidaan suorittaa käyttämällä happoa, kuten bromivetyhappoa, kloo-rivetyhappoa, trifluorietikkahappoa, jp-tolueenisulfonihappoa, bentseenisulfonihappoa, naftaleenisulfonihappoa ja etikkahappoa, jolloin muodostuu vastaava happoadditiosuola-yhdiste. Eräs toinen menetelmä, jota voidaan käyttää lohkaisemaan aminosuojaryhmä, on booritrifluoridin käyttö. Esimerkiksi booritrifluoridi-di etyyli -eetteraatti jääetikassa muuttaa amino-suojatun peptidifragmentin BFg-kompleksiksi, joka sitten voidaan muuttaa ei-suojatuksi pepti-difragmentiksi käsittelemällä emäksellä, kuten kaliumbikarbonaatin vesiliuoksella. Kaikkia näitä menetelmiä voidaan käyttää, jos vain ollaan selvillä siitä, että valitun menetelmän avulla on voitava lohkaista N-terminaalinen °t-aminofunktion suojaryhmän ilman muiden peptidiketjussa olevien suojaryhmien irrottamista. Tämän vuoksi on edullisinta, että N-terminaalisen suojaryhmän lohkaisu suoritetaan käyttäen trif luor.iet ikkahappoa. Lohkaiseminen suoritetaan tavallisesti läinpiöt i lasso, joka on 0°C:n ja huoneen lämpötilan välillä.

Kun N-päätteen lohkaisu on suoritettu, niin tuloksena oleva yhdiste on tällöin normaalisti suojaryhmän lohkoisussa käytetyn hapon happoadditiosuolan muodossa. Sen jälkeen se voidaan muuttaa ! 9 64575 / yhdisteeksi, jonka päässä on vapaa amino, käsittelemällä sitä laimean emäksen avulla, tyypillisimmin tertiääri sen amiinin, kuten pyridiinin tai trietyyliamiinin avulla.

Peptidiketju on sitten valmis reagoimaan järjestyksessä seu-raavan aminohapon kanssa. Se voi tapahtua minkä tahansa tunnetun tekniikan vulla, joita on useita. Kun järjestyksessä seuraava aminohappo liitetään N-päätteiseen peptidiketjuun, käytetään aminohappoa, jossa on vapaa karboksyyli, mutta jonka -aminofunktio on sopivasti suojattu samoin kuin mikä tahansa sen muista reaktioky-kyisistä osista. Aminohappo joutuu sellaisiin olosuhteisiin, joissa sen karboksyylifunktio aktivoidaan liittämisreaktiota varten. Eräs tällainen aktivoimistekniikka, jota voidaan käyttää synteesissä, on aminohapon muuttaminen seka-anhydridiksi. Aminohapon vapaa karboksyylifunktio aktivoituu tällöin reagoidessaan toisen hapon, tyypillisimmin happokloridinsa muodossa olevan karboksyyliha-pon kanssa. Esimerkkejä tällaisista happoklorideista, joita voidaan käyttää sopivien seka-anhydridien muodostamiseen, ovat etyy-liklooriformiaatti, fenyyliklooriformiaatti, sek-butyylikloori-formiaatti, isobutyyliklooriformiaatti ja pivalyylikloridi.

Toinen menetelmä, jolla aminohapon karboksyylifunktio voidaan aktivoida liittymisreaktion aikaansaamiseksi, on muuttaa aminohappo reaktiokykyiseksi esterijohdannaisekseen. Esimerkkeinä tällaisista reaktiokykyisistä estereistä mainittakoon 2,'4,5-tri-kloorifenyyliesteri, pentakloorifenyyliesteri, £-nitrofenyylies-teri, 1-hydroksibentsotriatsolista muodostettu esteri ja N-hydrok-sisykkinimidistä muodostettu esteri. Vielä eräs menetelmä, jonka avulla saadaan aikaan C-terminaalisen aminohapon liittyminen pep-tidifragmenttiin, on sellainen, että liittymisreaktio suoritetaan siten, että mukana on vähintäin ekvimolaarinen määrä Ν,Ν'-disyk-loheksyylikarbodi-imidiä (DCC). Tämä jälkimmäinen menetelmä on parhaana pidetty valmistettaessa kaavan II mukaista tetradekapep-tidiä, jossa X on • —· hartsi

-0-QW-/' /S

\ / χ·=· 10 64575

Kun haluttu aminohapposekvenssi on valmis, voidaan tuloksena saatu peptidi poistaa hartsitukiosastaan. Tämä tapahtuu käsittelemällä suojattua, hartsitukiosan omaavaa tetradekapeptidiä fluo-rivedyllä. Fluorivedyllä käsittely lohkaisee peptidin hartsista; sen lisäksi se kuitenkin lohkaisee myös kaikki jäljellä olevat reak-tiokykyisten osien suojaryhmät peptidi ketjussa, samoin kuin N-ter-minaalisen aminohapon (Xr^minofunktion suojaryhmän. Kun käytetään fluorivetyä lohkaisemaan suojaryhmät, on edullisinta suorittaa reaktio siten, että mukana on anisolia. Anisolin mukanaolon on havaittu estävän peptidiketjussa olevien joidenkin aminohappojäännösten potentiaalinen alkyloituminen. Lisäksi on edullista suorittaa loh-kaisu siten, että mukana on etyylimerkaptaania. Etyylimerkaptaani auttaa suojaamaan tryptofaanijäännöksen indolirengasta ja lisäksi se helpottaa suojattujen kysteiinien konversiota tiolimuodoikseen. Kun R(. on formyyli, niin etyylimerkaptaanin mukanaolo helpottaa formyyliryhmän lohkaisua fluorivedyllä.

Kun lohkaisureaktio on suoritettu, niin saatu tuote on suo-raketjuinen peptidi, joka sisältää 14 aminohappojäännöstä. Jotta saataisiin lopullinen, kaavan I mukainen tuote, on välttämätöntä käsitellä suoraketjuista tetradekapeptidiä hapettavissa olosuhteissa, jolloin molekyylissä olevat kaksi sulfhydryyliryhmää, yksi kummassakin kysteiini-osassa, muuttuvat disulfidi-siliaksi. Tämä saadaan aikaan käsittelemällä lineaarisen tetradekapeptidin laimennettu liuos millä tahansa hapettavalla aineella, esimerkiksi jodilla tai kaliumferrisyanidilla. Myös ilmaa voidaan käyttää hapettavana aineena, jolloin seoksen pH-arvo on tavallisesti 2,5 -9,0 ja edullisimmin noin 6,2 - 7,2. Kun hapettavana aineena käytetään ilmaa, ei peptidiliuoksen konsentraatio ole tavallisesti suurempi kuin noin 0,4 mg peptidiä/ml kohti liuosta ja tavallisesti noin 50 pg/ml.

Kaavan I mukaista yhdistettä voidaan antaa lääkkeeksi lämminverisille imettäväisille, myös ihmisille, ja nimenomaan sitä voidaan käyttää sileän lihaksiston ve)aksoimiseen.

Varsinkin gas Lroin Les Linaali nen alue voidaan relaksoi.da anta- 1 fi maila parenteraalises Li pienaa määriä U-Val , D-Trp -somaLos-tutiinia. Tämä vaikutus, jonka tuloksena on suoli.ston liikkeiden väheneminen, on ei· i koi sen edu.l linen hypo ton j sessa gas Iroin- 11 64575 testinaalisessa röntgenkuvauksessa. Lisäksi tätä yhdistettä voidaan käyttää spastisen paksusuolen, pylorusspasmin ja muiden gast-rointestinaalialueen spastisten tilojen hoitoon, samoin kuin ure-terin ja sappirakon kollikin hoitoon.

Kun halutaan relaksoida sileitä lihaksia, yhdistettä annetaan lääkkeeksi tavallisesti annos, joka on noin 0,1 μg - 3 μg saajan ruumiin kiloa kohti ja edullisesti noin 3 pg - 1,5 pg ruumiinpainon kiloa kohti. Lääkkeenanto tapahtuu parenteraalisesti ja se voi olla intramuskuläärisesti, subkutaanisesti tai intravenöö-sisti; edullisimmin annetaan yhdisteet intravenöösisti tai intramuskuläär i s e s t i .

Parenteraalisesti annettavat yksikköannosmuodot valmistetaan tavallisesti käyttäen yhdistettä farmaseuttisen kantaja-aineen, kuten esimerkiksi isotonisen suolaliuoksen, isotonisen gly-siinin, laktoosin, mannitolin, laimennetun etikkahapon, bakterio-staattisen veden kanssa tai esimerkiksi veden kanssa, joka sisältää noin 1 %:n bentsyylialkoholia ja fosfaattipuskuriliuosten kanssa, samoin kuin sopivien mitä tahansa standardi-kantaja -ainetta sisältävien yhdistelmien kanssa. Kantaja-ainetta on tavallisesti mukana suhteessa vaikuttavaan aineeseen paino-osissa noin 25:1 - 1000:1.

Yhdiste, riippuen kantaja-aineesta ja käytetystä konsentraa-t.iosta, voidaan joko suspendoida tai liuottaa sopivaan steriiliin liuottimeen, joista parhaana pidetään vettä. Kun liuoksia valmistetaan, niin yhdiste ja kantaja-aine voidaan liuottaa valittuun liuottimeen, liuos suodatetaan ja pannaan sopivaan pieneen lääke* pulloon tai ampulliin ja lääkepullo tai ampulli suljetaan tiiviisti. Liuottimeen voidaan liuottaa edullisesti apuaineita, kuten paikallisesti käytettävää anestesia-suojalääkeainetta tai puskuroivaa ainetta. Stabilisuuden parantamiseksi yhdiste voidaan liuottaa kantaja-aineen kanssa veteen ja vesiliuos pannaan pieneen lääkepulloon ja sen jälkeen lyofilisoidaan. Kuiva lyofilisoitu kiinteä aine suljetaan sitten lääkepulloon ja varustetaan mukana olevalla lääke-pullolla, jossa on liuotin, jonka avulla seos muodostetaan uudelleen ennen käyttöä. Parenteraaliset suspensiot voidaan valmistaa olennaisesti samalla tavalla, paitsi että yhdiste suspendoidaan kantaja-aineeseen liuotuksen asemesta.

Kaavan I mukainen yhdiste on myös tehokas, vaikkei 12 64575 välttämättä yhtä suuressa määrin, inhiboimaan kasvuhormoonin eristystä. Tämä inhiboiva vaikutus on hyödyllinen niissä tapauksissa, joissa hoidettava henkilö tarvitsee terapeuttista käsittelyä liiallisen somatotropiinin erityksen takia, mikä liittyy haitallisiin tiloihin, kuten nuoruusiän diabetekseen ja akromegaliaan. Tällä yhdisteellä on myös muita fysiologisia vaikutuksia, kuten vatsahapon erityksen inhiboiminen, mikä on hyödyllistä vatsahaavan hoidossa; samoin pankreaksen eksokriinisen erityksen inhiboiminen, joka on mahdollisesti hyödyllinen pankreatitiksen hoidossa, ja insuliinin ja glukagonin erityksen inhiboiminen. Tätä yhdistettä voidaan antaa lääkkeeksi useilla eri tavoilla, kuten oraalisesti, sublinguaalisesti, subkutaanisesti, intramuskuläärisesti ja intra-venöösisti. Sublinguaalisen ja oraalisen antotavan ollessa kyseessä, on annos edullisimmin noin 1 mg - 100 mg/kg ruumiinpainoa kohti. Intravenöösi, subkutaaninen tai intramuskuläärinen annostus on tavallisesti näissä jälkimmäisissä indikaatioissa noin 1 pg -1 mg/kg ruumiin painoa kohti ja edullisimmin noin 50 pg - 100 pg/ kg ruumiin painoa kohti. On selvää, että annostus voi vaihdella laajasti riippuen kulloinkin kyseessä olevasta tilasta samoin kuin taudin tilan vakavuudesta.

Kaavan I mukaista yhdistettä voidaan antaa lääkkeeksi oraalisesti tai sublinguaalisesti yhdessä farmaseuttisen kantaja-aineen kanssa, esimerkiksi tablettien tai kapselien muodossa. Inert-tejä laimennusaineita tai kantaja-aineita, esimerkiksi magnesium-karbonaattia tai laktoosia voidaan käyttää yhdessä tavanmukaisten hajoamista edistävien aineiden, esimerkiksi maissitärkkelyksen ja algiinihapon kanssa ja voitelevien aineiden, kuten magnesiumstear· raatin kanssa. Kantaja-aineen tai laimennusaineen määrä on tyylillisesti noin 5-95 % lopullisesta seoksesta ja edullisimmin lioin 50-85 % lopullisesta seoksesta. Voidaan käyttää myös sopivia maustavia aineita lopullisessa valmistuksessa tekemään seoksesta paremman makuinen.

Kun kaavan I mukaista yhdistettä annetaan lääkkeeksi paren-teraalisesti, voidaan käyttää sopivia kantaja-aineita, kuten esimerkiksi mitä tahansa edellä näiden yhdisteiden sileän lihaksiston relaksoimiseen käyttämisen yhteydessä selostettuja.

i3 64575

Seuraavat esimerkit valaisevat kaavan I mukaisen yhdisteen ja sen välituotteiden valmistusta.

Esimerkki 1 N-t-butyylioksikarbonyyli-L-kysteinyyli(S-p-metoksibentsyy- li)-metyloitu polystyreeni-hartsi 1 000 mlraan N,N-dimetyyliformamidia (DMF), joka sisälsi N-t-butyylioksikarbonyyli-(S-p-metoksibentsyyli)-kysteiinin kesium-suolaa (valmistettu 17,5 g:sta vapaata happoa), lisättiin 100 g kloorimetyloitua polystyreeniharts ia (Lab. Systems, Inc., 0,75 mmoo-lia Cl/g). Seosta hämmennettiin huoneen lämmössä viiden päivän j ajan. Sen jälkeen suodatettiin hartsi ja pestiin vuorotellen kolme kertaa seoksella, jossa oli 85 % DMF ja 15 % vettä ja pelkästään DMF:11a, ja sitten kaksi kertaa DMF:11a. Hartsi suspendoitiin 1 000 ml:aan DMF:a ja siihen lisättiin liuos, jossa oli 16 g (83,4 mmoolia) kesiumasetaattia. Seosta hämmennettiin 9 päivän ajan huoneen lämmössä. Sen jälkeen hartsi suodatettiin ja pestiin vuorotellen kolme kertaa seoksella, jossa oli 85 % DMF:a ja 15 % vettä ja pelkästään DMF:11a. Hartsi pestiin CHCl^:11a ja suspendoitiin sitten neljä kertaa CHCl3:een erotussuppilossa ja vedettiin neste joka kerta pois hienojen hiukkasten poistamiseksi. Hartsi suodatettiin, pestiin 95-%:isella etanolilla ja sitten vuorotellen kolme kertaa bentseenillä ja 95-%:isella etanolilla. Sen jälkeen Ijtrt-si kuivattiin vakuumissa 30°C:ssa, jolloin saatiin 115,3 g otsakkeessa mainittua ainetta. Aminohappoanalyysi osoitti 0,254 mmoolia Cys/g kohti hartsia. Kysteiini määrättiin kysteiinihappona happohydrolyysistä, joka suoritettiin käyttäen 1:1 seosta diok-saania ja konsentroitua kloorivetyhappoa, johon oli lisätty pieni määrä dimetyylisulfoksidia.

i4 6 4 5 7 5

Esimerkki 2 N-t-butyyli oks ikarbonyyli-D-valyyli-glysyyli-L-(S-£-metoksi bent syy 1 i )kysteinyy1Ί-L-(N*-o-klooribentsyylioksikarbonyyli)-lysyyli-L-asparagi nyyl i -L-fenyylialanyyli -L-fenyyl i a] anyyli -D-trypt°fyyli-L-CN^-o-klooribentsyyl i oksikarbonyyli )lysyyli -L-(0-bentsyyli)treonyyli-L-fenyylialanyyli-L-(0-bentsyy1i)treonyyli-L-(0-bentsyyli)seryyli-L-(S-£-metoksibentsyyli)kysteinyyli metyloitu polystyreeni-hartsi

Esimerkissä 1 saatu tuote (5,0 g) pantiin Beckmanin reak-tioastiaan 990, automaattiseen peptidien synteesilaitteeseen, ja kaksitoista jäljellä olevista kolmestatoista aminohaposta lisättiin käyttäen automaattista synteesilaitetta. Tuloksena oleva suojattu tridekapeptidihartsi jaettiin kahteen samanlaiseen osaan ja lopullinen jäännös pantiin toiseen näistä osista. Käytettiin aminohappoja seuraavan käyttösekvenssin mukaisesti: (1) N-t-butyyli-oksikarbonyyli-(0-bentsyyli)-L-seriini; (2) N-t-butyylioksikarbo-nyyli-(0-bentsyyli)-L-treoniini; (3) N-t-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniini; (4) N-t-butyylioksikarbonyyli-(0-bentsyyli)-L-treoniini; (5) N^-t-butyylioksikarbonyyli-N^-o-klooribentsyyli-oksikarbonyyli-L-lysiini; (6) NÄ-t-butyylioksikarbonyyli-D-trypto-faani; (7) N-t-butyylioksikarbonyyli-L-fenyylialaniini; (8) N-t-butyylioksikarbonyyli-L-f enyylialaniini ; (9) N-t-butyylioksikarbo-nyyli-L-asparagiini, £-nitrofenyyli-esteri; (10) NA-t-butyylioksi-karbonyyli-N£-o-klooribentsyylioksikarbonyyli-L-lysiimi; (11) N-t-butyylioksikarbonyyli-(S-£-metoksibentsyyli)-L-kysteiini; (12) N-t-butyylioksikarbonyyli-glysiini; ja (13) N-t-butyylioksikarbo-nyyli-D-valiini. Suojaryhmän poistamisen, neutraloinnin, liittämisen ja uudelleenliittämisen sekvenssi, jonka mukaan kukin aminohappo liitetään peptidiin, on seuraava: 1) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, jokainen suoritetaan kloroformilla; 2) BOC-ryhmän poistaminen käsittelemällä kahdesti 20 minuutin ajan, kummallakin kerralla käyttäen (10 ml/g hartsia) seosta, jossa on 29 % trifluorietikkahappoa, 48 % kloroformia, 6 % trietyy-lisilaania ja 17 % metyleenikloridia; 3) kaksi pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kumpikin kloroformilla; 4) yksi pesu (10 ml/g hartsia) kolmcm minuutin ajan metyleenikloridi I1 a; 15 64575 5) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, käyttäen kussakin seosta, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 6) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin metyleenikloridilla; 7) neutralointi kolmen käsittelyn avulla, kolmen minuutin ajan kukin ja käyttäen (10 ml/g hartsia) seosta, jossa 3 % trietyyliamiinia metyleenikloridissa; 8) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan, metyleenikloridilla; 9) Kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 10) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan kukin metyleenikloridilla; 11) lisätään 1,0 mmoolia/g hartsia suojattua aminohappoa ja 1,0 mmoolia/g hartsia N ,N'-disykloheksyylikarbodi-imi-diä (DCC) 10 ml:ssa/g hartsia metyleeniklor.idia, jota seuraa sekoitus 120 minuutin ajan; 12) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla; 13) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan kukin seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 14) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan kukin, metyleenikloridilla; 15) neutralointi kolmen käsittelyn avulla, kukin kolmen minuutin ajan käyttäen 10 ml/g hartsia 3-%:ista trietyyliamiinia metyleenikloridissa; 16) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin metyleenikloridilla; 17) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 18) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin metyleenikloridilla; 19) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kolmen minuutin ajan, kukin DMF:lla; 20) lisätään 1,0 mmoolia/g hartsia suojattua aminohappoa ja 1,0 mmoolia/g hartsia n"n'-disykloheksyylikarbodi-imidiä (DCC) 10 ml:ssa/g hartsia seosta, jossa on 1:1 suhteessa DMF:a ja metyleenikloridia, mitä seuraa hämmentäminen 120 minuutin ajan; 21) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan DMF:11a; 22) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla; 23) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan seoksella, jossa on 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; 24) kolme pesua (10 ml/g hartsia) kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla; 25) neutralointi kolmen käsittelyn avulla, kukin kolmen minuutin ajan käyttäen 10 ml/g hartsia seosta, jossa on 3 % ie 64575 trietyyliamiinia metyleenikloridissa; 26) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla; 27) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan seoksella, jossa 90 % t-butyylialkoholia ja 10 % t-amyylialkoholia; ja 28) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan metyleenikloridilla .

Yllä olevaa sekvenssikäsittelyä käytettiin lisättäessä jokainen aminohappo, paitsi glysiini- ja asparagiinijäännökset. Gly-siinin lisäys suoritettiin käyttäen vain vaiheita 1-18. Asparagii-nijäännös lisättiin sen aktiivisen £-nitrofenyyli-esterin kautta. Näin menetellen yllä oleva vaihe 11) muutettiin seuraavaksi 3-vai-hesekvenssiksi: a) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan DMF:lla; b) lisättiin 1,0 mmoolia/g hartsia N-t-butyy-lioksikarbonyyli-L-asparagiinin p-nitrofenyyliesteriä 10 ml:ssa/g hartsia seosta, jossa on 1:3 suhteessa DMF:a ja metyleenikloridia, mitä seurasi hämmentämistä 720 minuutin ajan; ja c) kolme pesua (10 ml/g hartsia), kukin kolmen minuutin ajan käyttäen DMF:a. Samoin edellä oleva vaihe 20) muutettiin siten, että käytettiin N-t-butyylioksikarbonyyli-L-asparagiinin £-nitrofenyyliesteriä seoksessa, jossa oli 3:1 suhteessa DMF:a ja metyleenikloridia, mitä seurasi hämmentämistä 720 minuutin ajan.

' . Valmis peptidi-hartsi kuivattiin vakuumissa. Tuote hydrolysoit iinxpystyjäähdyttäjän olosuhteissa 72 tunnin ajan seoksessa, jossa oli 1:1 suhteessa konsentroitua kloorivetyhappoa ja dioksaa-nia. Tuloksena olevan yhdisteen aminohappoanalyysi antoi seuraavat tulokset: Asn 1,00; 2 Thr 2,18; Ser 0,95; Gly 1,00; Vai 0,99; 3 Phe 3,45; 2 Lys 2,00.

Esimerkki 3 D-valyyli-glysyyli-L-kysteinyyli-L-lysyyli-L-asparaginyyli-L-fenyylialanyyli-L-fenyylialanyyli-D-tryptofyyli-L-lysyyli-L-treonyyli-L-fenyylialanyyli-L-treonyyli-L-seryyli-L-kystei ini

Seokseen, jossa oli 7,2 ml anisolia ja 7,2 ml etyy.1 imerkap-taania, lisättiin 3,914 g (substituutiotaso 0,155 mmoolia/g) esimerkki 2:n suojattua tetradekapeptidihartsia. Seos jäähdytettiin nestemäisessä typessä ja 80 ml nestemäistä fluorivetyä lisättiin tislauksessa. Saadun seoksen annettiin lämmetä 0°C:seen ja sitä 17 64575 sekoitettiin kaksi tuntia. Fluorivety poistettiin sitten tislaamalla. Jäännökseen lisättiin eetteriä ja seos jäähdytettiin 0°C:seen.

Saatu sakka otettiin talteen suodattamalla ja pestiin eetterillä.

Tuote kuivattiin ja suojaamaton tetradekapeptidi uutettiin hartsi-seoksesta käyttäen 1 M etikkahappoa ja 50 % etikkahappoa. Etikka-happoliuos luofilisoitiin sitten välittömästi kuiviin pimeässä.

Saatu heikosti keltainen sakka suspendoitiin seokseen, jossa oli 10 ml 0,2 M etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu, ja 4 ml jää- j etikkahappoa. Saatu suspensio kuumennettiin hieman 6 ml:n kanssa 50-%:ista etikkahappoa, kunnes syntyi kirkas, keltainen liuos ja tämä liuos pantiin Sephadex G-25 F pylvääseen. Kromatografiset olosuhteet olivat: liuotin, 0,2 M etikkahappoa, josta kaasu oli poistettu; pylvään koko 7,5 -150 cm; lämpötila 26°C; virtausnopeus 1 670 ml/h; fraktion volyymi 25,05 ml.

Kunkin fraktion absorptio kohdassa 280 nm osoitti fraktio-numeroa kohti yhden leveän piikin, josta seurasi olka. US-spektro-skopia osoitti, että pääosa piikistä oli tuotetta. Fraktiot, jotka yhdistettiin ja niiden virtausvolyymit ovat seuraavat:

Fraktiot 207-233 (5160-5837 ml, piikki = 5515 ml).

Nämä yhdistetyt fraktiot eivät sisältäneet taustapuolen olkaa. UV-spektroskopia osoitti, että 470 mg tuotetta oli mukana, (saalis = 46,4 %). Ellman-titraus osoitti, että vapaiden sulfhvJ-ryylien määrä oli 95 % teoreettisesta.

Esimerkki 4 1 8

Hapetus D-Val , D-Trp -somatostatiiniksi 1 8

Pelkistetyn D-Val , D-Trp -somatostatiinin (677 ml) liuos esimerkistä 3 laimennettiin tislatulla vedellä konsentraatioon 50 pg/ml. Lisättiin konsentroitua ammoniumhydroksidia seoksen pH-ar-von säätämiseksi arvoon 6,7. Liuosta sekoitettiin 4°C:ssa pimeässä 64 tunnin ajan, minkä jälkeen Ellman-titraus osoitti, että hapettuminen oli tapahtunut täydelleen.

Seos konsentroitiin vakuumissa 45 ml:n volyymiin, ja lisättiin 45 ml jääetikkahappoa. Sitten seos absorboitiin Sephadex G-25 F pylvääseen. Kromatografiset olosuhteet olivat seuraavat: liuotin 50-%:ista etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu, pylvään koko 5,ϋ x 215 cm, lämpötila ?6°0, virtausnopeus 148 ml/h, fraktion vo iyyrn i 17,3 m] .

18 64 575

Absorptio kohdassa 280 mm kutakin fraktionumeroa kohti osoitti kaksi leveää piikkiä. Ensimmäinen piikki esitti yhdisteen agre-goituja muotoja ja toinen piikki esitti monomeeristä yhdistettä. Toisen piikin esittämä materiaali otettiin talteen /’fraktiot 116- 1 55 ( 2 000 - 2 685 ml)_7. UV-spektroskopia osoitti, että näytteessä oli 279 mg yhdistettä (saalis = 59,*+ %). Liuos lyofilisoitiin kuiviin pimeässä.

Tuloksena oleva valkea kiinteä aine kromatografioitiin uudelleen kahtena suunnilleen saman kokoisena osana. Ensimmäinen osa liuotettiin 25 ml:aan 50-%:ista etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu ja se absorboitiin Sephadex G-25 F pylvääseen. Kromatografiset olosuhteet olivat: liuos 50-%:ista etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu, pylvään koko 5,0 x 215 cm, lämpötila 26°C, virtausnopeus 148 ml/h, fraktion volyymi 17,3 ml.

Absorptio kohdassa 280 nm kutakin fraktionumeroa kohti osoitti kaksi leveää piikkiä. Tehtiin konservatiivinen jako toisesta piikistä. Fraktiot 119-125 (virtausvolyymit 2 128 - 2 256 ml) yhdistettiin. UV-spektroskopia osoitti, että tässä näytteessä oli 65,3 mg yhdistettä. Liuos lyofilisoitiin kuiviin pimeässä, jotta saatiin haluttu yhdiste.

Toinen osa kromatografioitiin samalla tavoin kuin ensimmäinen ja samoin tuloksin. Molemmat oikeat tuotteet yhdistettiin ja saatiin yhteensä 125 mg UV-spektroskopian mukaan (45,2 % saalis puhdasta tuotetta). Yhdistetty tuote liuotettiin 15 ml:aan 0,2 M etikkahappoa, josta oli poistettu kaasu, ja se pantiin Sephadex G-25 F pylvääseen. Kromatografiset olosuhteet olivat: liuotin 0,2 M etikkahappoa, josta kaasu poistettu, pylvään koko 5,0 x 150 cm, lämpötila 26°C, virtausnopeus 466 ml/h, fraktion volyymi 16,3 ml.

Absorptio kohdassa 280 nm kutakin fraktionumeroa kohti osoitti yhden leveän piikin. UV-spektroskopia osoitti, että suurin osa piikistä oli erinomaista tuotetta. Fraktiot 160-180 (2 592 - 2 934 ml, piikki = 2 685 ml) yhdistettiin ja lyofilisoitiin kuiviin pimeässä. UV-spektroskopia osoitti, että tuotetta oli 90,4 mg (71,7 % saalis).

Optinen kierto /öc7^6 - -56,1° (1-% : inen etikkahappo) .

Aminohappoanalyysi: Vai 1,0; Gly 0,97; 2 Cys 1,62; 2 Lys 2,00; Asn 1,01; 3 Phe 2,87; Trp 1,02; 2 Thr 1,83; Ser 0,81.

is 64 57 5

Yllä olevat tulokset on ilmaistu suhteessa Lys/2 = 1,0.

Kaikki arvot ovat keskiarvoja kahdesta 21 tunnin hydrolyysistä ilman huuhtelulaitteita (scavengers). Tryptofaani määrättiin UV-spektroskopian avulla (suhteessa Lys/2:een), seriinin arvoa ei korjattu hydrolyysin aikana tapahtuneista häviöistä.

Yllä oleva tuote sisältää pienempiä epäpuhtauksia. Mikäli halutaan, voidaan tuote puhdistaa edelleen panemalla se prepara- tiiviseen korkeapaine-nestekromatografia-laitteeseen (HPLC).

1 8

Vaihtoehtoinen menetelmä pelkistetyn D-Val , D-Trp -soma- X 8 ' tostatiinin hapettamiseksi D-Val , D-Trp -somatostatiiniksi on kä- j

sittely kaliumferrisyanidin avulla. Hapetus suoritetaan vesiliuok- J

sessa, jonka pH on säädetty arvoon 6,7, kuten on edellä selostettu tässä esimerkissä. Kaliumferrisyanidin vesiliuos lisätään seokseen, jolloin saadaan lopullinen konsentraatio, joka edustaa suun-nilleen 3,3 kertaa pelkistetyn D-Val , D-Trp -somatostatiinin kon-sentraatiota. Liuosta sekoitetaan pimeässä huoneen lämmössä noin kahden tunnin ajan. Hapetuksen täydellisyys voidaan todeta Ellman- titrauksella.

X 8 D-Val , D-Trp -somatostatiinia testattiin koiriin sen vatsa-hapon erittymistä in vivo ehkäisevän vaikutuksen suhteen. Kuudella koiralla, joilla oli krooninen fistula ja Heidenhainpussi, indusoi- ' tiin vatsaan HCl-eritystä infusoimalla gastriinin C-päätteistä tet-rapeptidiä 0,5 pg/kg/h. Kukin koira oli itsensä kontrollina. Kun HCl:a oli erittynyt jatkuvana vakiomääräisenä yhden tunnin ajan, infusoitiin D-Val , D-Trp -somatostatiinia yhden tunnin ajan 0,15 pg/kg/h. Vatsahapponäytteiden keräämistä jatkettiin vielä 1,5 tuntia 15 minuutin väliajoin. Näytteet titrattiin pH-arvoon 7 auto- X 8 maattisella titrauslaitteella. D-Val -D-Trp -somatostatiinin maksimaalinen ehkäisyvaikutus ekstrapoloitiin somatostatiinin annos-herkkyyskäyrän suhteen ja analogisen yhdisteen suhteellinen tehokkuus somatostatiinin tehokkuuteen nähden ilmoitetaan prosentuaalisena vaikutuksena.

X 8 D-Val , D-Trp -somatostatiini ehkäisi vakiotilan happoeri-tystä, joka oli indusoitu gastriinin C-päätteisen tetrapeptidin avulla, noin 48,22 +_ 6,45 %:lla (standardi keskimääräinen virhe).

Tämä vaikutus on ekvivalenttinen somatostatinnille 0,175 ^ig/kg/h.

Sen vaikutus on siis suhteessa somatostatiinin vaikutukseen J16 %.

20 64575 1 8 Täydellisemmin puhdistettu näyte D-Val , D-Trp -somatostatiinia, jota annettiin 0,200, 0,156 ja 0,138 pg/kg/h annoksina esti jatkuvaa vakiotilan happoeristystä, joka oli indusoitu gastriinin C-päät-teisen tetrapeptidin avulla, 77,63, 71,57 ja 67,8 %. Tämä merkitsee somatostatiinin vaikutukseen nähden 302-325-%:ista vaikutusta.

18 D-Val , D-Trp -somatostatiini testattiin myös sen suoliston liikeisiin vaikuttavan tehon suhteen tajuisaan olevilla koirilla. Testeissä käytettiin kolmea koiraa, joilla oli intralumenaaliset katetrit asetettuina antrumiin, duodenumiin ja pylorukseen. Paine-vaihtelut suolen lumenissa rekisteröitiin Visicorder-laitteella jännitysmittaimen avulla ja miniatyyrikokoa olevilla valonsäde-galvanometreillä. Kun oli suoritettu pysyvän olotilan tarkistus, infusoitiin testiyhdistettä intravenöösisesti 10 minuutin ajan. Aluksi testiyhdiste lisäsi intralumenaalipainetta pyloruksessa ja sen jälkeen pienensi sitä, kun taas paine duodenumissa ja antru-missa pysyivät alhaisina koko testin ajan. Minimi vaikuttava määrä, joka vaadittiin nostamaan pyloruksen painetta ja laskemaan duodenumin ja antrumin paineita, on noin 0,05 ng/kg - 10 min 18 r D-Val , D-Trp -somatostatiinille. Tämä vastaa itse somatostatiinin määrää 0,125 - 0,25 ug/kg - 10 min.

1 8 D-Val , D-Trp -somatostatiinia testattiin myös sen vaikutuksen suhteen kasvuhormoonin eritykseen. Käytetty menetelmä toteutettiin tavallisten Spraque-Dawley koirasrottien avulla, jotka painoi-vat 100-120 g ( laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana). Testi on muunnos menetelmästä, jonka ovat selostaneet P.Brazeau, W. Wale ja R. Guillman, Endocrinology, 9_4 184 (1974). Tässä kokeessa käytettiin kaiken kaikkiaan viittä ryhmää, kahdeksan rottaa kussakin, testaamaan kutakin yhdistettä. Natriumpentobarbitalia annettiin intraperitoneaalisesti kaikille rotille stimuloimaan kasvuhormoonin eritystä. Yksi ryhmä toimi kontrollina ja sai vain suolaliuosta. Kaksi ryhmää sai somatostatiinia, toinen niistä 2 pg/rottaa kohti subkutaanisesti, ja toinen ryhmä SU ^g/rottaa kohti subkutaanisesti. Kaksi muuta ryhmää sai testiyhdistettä, toinen 10 ug/rottaa kohti subkutaanisesti ja toinen 0,4 pg/rottaa kohti subkutaanisesti. Kasvuhormoonin seerurnikonsentraat io mitattiin 20 min kuluttua sen jälkeen, kun oli annettu simultaanisesti natriumpentobarbitalia ja testiyhdistettä. Kasvuhormoonin seerumin konsentraation inhibitioaste määrätä iin kontrolliryhmään nähden ia Lestiyhdisteen ja testiyhdistettä. Kasvuhormoonin seerumin kon- 21 64575 sentraation inhibitioaste määrättiin kontrolliryhmään nähden ja testiyhdisteen ja itse somatostatiinin suhteellisia tehokkuuksia verrattiin keskenään.

Annostasolla 0,4 hg/rotta ja 10 ug/rotta inhiboi D-Val1, 8 * D-Trp -somatostatiini kasvuhormoonin erityksen kasvua 14 %, ja 42 % yli kontrolliryhmän. Somatostatiini, annostasolla 2 ug/rotta, ei vaikuttanut lainkaan kasvuhormoonin erityksen kasvuun, kun taas annoksen ollessa 50 ug/rotta, se inhiboi kasvuhormoonin erityksen kasvua 56 % yli kontrollin.

1 o '

Annostasolla 0,4 ug/rotta ja 10 jig/rotta D-Ala , D-Trp -somatostatiini inhiboi kasvuhormoonierityksen lisäystä 54 % ja 91 % yli kontrolliryhmän. Somatostatiini annostasolla 2 pg/rotta ja 50 pg/rotta inhiboi kasvuhormoonierityksen kasvua 40 % ja 87 % yli kontrolliryhmän.

Ί Ö

Testattiin D-Val , D-Trp -somatostatiinin teho inhiboida in vivo glukagonin ja insuliinin eritystä sen jälkeen, kun sitä oli stimuloitu L-alaniinilla. Normaalien, sekarotuisten, molempia sukupuolta olevien koirien, annettiin infusoida suolaliuosta, soma-tostatiinia tai testiyhdistettä. 30 minuutin kuluttua annettiin vielä L-alaniinia intravenöösisesti 15 minuutin ajan. Suolaliuoksen, somatostatiinin tai testiyhdisteen infuusiota jatkettiin 15 minuuttia sen jälkeen, kun oli annettu L-alaniini. L-alaniinin infuusio aiheutti äkillisen glukagonin ja insuliinin konsentraation nousun seerumissa, mikä palautui takaisin kontrollikonsentraatioon, kun L-alaniinin irifusoiminen oli päättynyt. Yllä olevasta määri- 1 8 teltiin minimiannos D-Val , D-Trp -somatostatiinille 0,04 - 0,11 ug/kg/min, joka inhiboi glukagonin eritystä, ja insuliinin eritystä inhiboivaksi annokseksi vähemmän kuin 0,004 ug/kg/min.

Farmakologiset vertailukokeet

Vertailuna käytettiinsomatostatiinia. Esillä olevan keksin-X 8 nön mukaisella D-Val , D-Trp -somatostatiinilla oli somatostatii-niin verrattuna seuraavat aktiviteetit:

Vatsahapon eritys (koira, in vivo) 116 % ja enemmän puhdistetulla näytteellä 302-325 %. Suolen liikkuvuus (koira,in vivo) pienin tehokas annos 0,05 g/kg - 10 min verrattuna somatostatiinilla saatuun arvoon 0,125 - 0,25 ug/kg - 10 min. Kasvuhormoonien vapau hiin i ιητι (reittä) 0,4 pg/rottn - 14 %:n kasvuhormoonin erittymisen kasvu esto, 1() up/rot la = 47 %: n kanvuhormooni n kasvun