CS202097B2 - Způsob přípravy analogů somatostatinu - Google Patents

Description

Vynález se týká způsobu přípravy tetradekapeptidů obecného vzorce I

Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Ehe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH kde Y představuje D-Val nebo D-Ala a jejich farmaceuticky vhodných adičních soli s kyselinami, Vynález se týká též intermediárních sloučenin připravených při syntéze těchto tetradekapeptidů.

Somatostatin (rovněž známý jako inhibiční faktor uvolňování somatotropinu) je tetradekapeptid vzorce |----------η

L-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-L-Trp-L-íys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH

Tento tetradekapeptid byl izolován z extraktů hýpotalanu ovcí a zjistilo se, že je účinný při inhibici sekrece růstového hormonu, rovněž známého jako samatotropinj viz P. Brazeau, W. Vale, R. Burgus, N. Ling, M. Butcher, J. River a R. Ouillemin, Science, 179. 77 (1973).

Kromě toho sloučenina účelně označovaná jako D-Trp®-somatostatin byla nedávno zveřejněna v publikaci Brown a dalěí, Endocřinology, 98. č. 2, 336 až 343 (1976).

Struktura biologicky účinných tetradekapeptidů obecného vzorce a jejich netoxických edičních solí s kyselinami se liéí od struktury somatostatinu a příslušných solí přítomností D-tryptofanového zbytku v poloze 8 místo L-tryptofanového zbytku, a D-valinového nebo D-alaninového zbytku v poloze 1 místo L-alaninového zbytku. Účelně jsou tetradekapeptidy obecného vzorce I označovány jako D-Val', D-Trp®-somatostatin a D-Ala', D-Trp^-somatostatin. Vynález se tedy týká způsobu přípravy sloučenin obecného vzorce I

H-Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-cýs-OH (I) a jejich farmaceuticky vhodných netoxických adičních solí s kyselinami, a meziproduktů obecného vzorce II

R-Y-Gly-L-Cys(R1 )-L-Lys(R₂)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R₅)-L-Lys(R₂)-L-Thr(R3)-L-Phe-L-Thr(R₃)-L-Ser(R4)-L-Cys(Ri)-X (II) kde

Y představuje D-Val nebo D-Ala,

R představuje vodík nebo ochrannou skupinu alfa-aminoskupiny,

R, představuje vodík nebo ochrannou skupinu tioskupiny,

R₂ představuje vodík nebo ochrannou skupinu epsílon-aminoskupiny, každý ze symbolů

R3 a představuje vodík nebo ochrannou skupinu hydroxyskupiny,

R5 představuje vodík nebo formylskupinu a X představuje hydroxyskupinu nebo skupinu vzorce pryskyřice

-o-«»r<y kde pryskyřicí je polystyren s tou podmínkou, že když

X představuje hydroxyskupinu, každý ze symbolů

R, R,, R₂, R^, R4 a Rg představuje vodík a když X představuje zbytek vzorce pryskyřice

-O-CH^-ťQ^ každý ze symbolů

R, Ep R2, R3 a R4 je odlišný od vodíku.

Nové tetradekapeptidy obecného vzorce I

H-Y-Gly-L-cýs-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (I) kde

Y představuje D-Val nebo D-Ala se podle vynálezu připravují tak, že se na odpovídající tetradekapeptid s přímým řetězcem obecného vzorce III

Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (III) kde

Y představuje D-Val nebo D-Ala, působí oxidačním činidlem. Touto reakcí se převedou dvě sulfhydrylové skupiny na disulfidový můstek.

Jako farmaceuticky vhodné netoxické adiční soli s kyselinami přicházejí v úvahu adiční soli s organickými a anorganickými kyselinami, například soli odvozené od kyseliny chlorovo dikové, sírové, sulfonových kyselin, kyseliny vinné, fumarové, bromovodíkové, glykolové, citrónové, maleinové, fosforečné, jantarové, octové, dusičné, benzoové, askorbové, p-toluen sulfonové, benzensulfonové, naftalensulfonové a propionové. Přednostními adičními solemi s kyselinami jsou acetáty. Adiční soli s kyselinami se připravují běžnými způsoby.

Jako příklady intermediárních sloučenin obecného vzorce II

R-Y-Gly-L-Cys(Rj)-L-Lys(R₂)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R5)-L-Lys(R₂)-L-Thr(R3)-L-Phe-L-Thr(R3) -L-Ser(R₄)-L-Cys(Ri)-X _(II) kde různé symboly mají shora uvedený význam, lze uvést sloučeniny vzorců

R-D-Val-Gly-L-Cys(R])-L-Lys(R₂)-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp(R5)-L-Lys(R₂)-L-Thr(R3)-L-Ehe-L-Thr(R3)-L-Ser(R₄)~L-Cys(Ri)-X a

R-D-Ala-Gly-L-Cys (R1 ) -L-Lys (R₂) -L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp (R5) -I,-Lys (R₂) -L-Thr (R3) -L-Phe-L-Thr(R3)-L-Ser(R4)-L-Cys(R])-X.

Přednostními intermediárními sloučeninami jsou sloučeniny obecného vzorce III

Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (III), kde Y má shora uvedený význam.

Jinými přednostními intermediárními sloučeninami jsou sloučeniny těchto vzorců:

H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH,

H-D-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe~L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH,

N-(BOC)-D-Val-Gly-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC)-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-(CBzOG)-Lys-L-(Bzl)Thr

-L-Phe-L-(Bzl.)Thr-L-(Bzl)Ser-L-(PMB)Cys-0-CH₂ -4 7) pryskyřice

N-(BCC)-D-Ala-Gly-L-(PMB)Cys-L-(CBzOC)-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-(CBzOC)Lys-L-(Bzl)Thr-L-Phe-L-(Bzl)Thr-L-(Bzl)Ser-L-(PMB)Cys-0 —CHjpryskyřice

Shora uvedené vzorce, definující intermediární sloučeniny, zahrnují též sloučeniny obsahující ochranné skupiny amino-, hydroxy-, a tio(sulfhydryl-)skupin. Ochranné skupiny musí mít vlastnosti splňující dvě hlediska. Jednak musí ochranné skupiny zabraňovat tomu, aby reaktivní seskupení přítomné v určité molekule podlehlo reakci během vystaveni molekuly podmínkám, které by jinak měly za následek zánik tohoto reaktivního seskupení. Ochranná skupina však musí mít na druhé straně takovou povahu, aby ji bylo možno snadno odštěpit za současné regenerace původní reaktivní skupiny, a to za takových podmínek, které by neměly nežádoucí vliv na jiné části molekuly. Skupiny vhodné k těmto účelům, tj. k ochraně amino-, hydroxy- a tioskupiny jsou odborníkovi dobře známé. Popisu těchto ochranných skupin a jejioh použití byly věnovány celé svazky. Jedním z nich je práce Protective Groups in Organic Chemistry, red. J. F. W. McOmie, vyd., Plenům Press, New York, 1973.

Ve shora uvedených vzorcích definujících intermediární sloučeniny představuje R buň alfa-aminický vodík nebo ochrannou skupinu alfa-aminoskupiny. Ochranné skupiny aminoskupiny jsou dobře známé všem odborníkům v chemii peptidů a mnohé z nich jsou uvedeny ve shora citované McOmieově práci v kapitole 2, jejímž autorem je J. W. Bartoň. Jako ilustrativní pří<klady takových ochranných skupin lze uvést benzyloxykarbonyl-, p-chlorbenzyloxykarbonyl-, ρ-brombenzyloxykarbonyl-, o-chlorbenzyloxykarbonyl-, 2,6-diehlorbenzyloxykarbonyl-, 2,4-dichlorbenzyloxykarbonyl-, o-brombenzyloxykarbonyl-, ρ-metoxybenzyloxykarbonyl-, p-nitrobenzyloxykarbonyl-, terc.butyloxykarbonyl-(BOC), t-amyloxykarbonyl-, 2-(p-bifenylyl)isopropyloxykarbonyl(BpOC), adamantyloxykarbonyl-, isopropyloxykarbonyl-, cyklopentyloxykarbonyl-, cyklohexyloxykarbonyl-, cykloheptyloxykarbonyl-, trifenylmetyl-(trityl) a p-toluensulfonylskupinu. Přednostní ochrannou skupinou alfa-aminoskupiny ve významu R je terc.butyloxykarbonylskupina.

R, představuje buň atom vodíku nebo sulfhydrylovou skupinu cysteinu nebo ochrannou skupinu sulfhydrylového substituentu. Mnohé tyto ochranné skupiny jsou popsány v McOmieově práci, citované shora v kapitole 7, jejímiž autory jsou R. G. Hickey, V. R. Rao a W. G. Rhodes. Jako ilustrativní příklady těchto ochranných skupin lze uvést p-metoxybenzyl-, benzyl-, ρ-tolyl-, benzhydryl-, acetamidometyl-, trityl-, ρ-nitrobenzyl-, terc.butyl-, isobutyloxymetylskupinu a jakékoli z velkého počtu tritylových derivátů. < Další příklady lze nalézt například v encyklopedii Houben-Weyl, Methodes der Organischen Chemie, Synthese von Peptiden, sv. 15/1 a 15/2, (1974), Stuttgart, NSR. Přednostní ochrannou skupinou sulfhydrylskupiny ve významu Rj je p-metoxybenzylskupina.

R2 představuje buň vodík na epsílon-aminoskupině lysinového zbytku nebo vhodnou ochrannou skupinu epsílon-aminoskupiny. Jako ilustrativní příklady mohou sloužit skupiny uvedené shora jako skupiny vhodné pro ochranu alfa-aminoskupiny. Jako typické skupiny vhodné k tomuto účelu lze uvést benzyloxykarbonyl-, tero.butyloxykarbonyl-, terc.amyloxykarbonyl-, cyklopentyloxykarbonyl-, adamantyloxykarbonyl-, ρ-metoxybenzyloxykarbonyl-, p-ohlorbenzyloxykarbonyl-, ρ-brombenzyloxykarbonyl-, o-chlorbenzyloxykarbonyl-, 2,6-dichlorbenzyloxykarbonyl-, 2,4-dichlorbenzyloxykarbonyl-, ο-brombenzyloxykarbonyl-, p-nitrobenzyloxykarbonyl-, isopropyloxykarbonyl-, cyklohexyloxykarbonyl-, cykloheptyloxykarbonyl- a p-toluensulf onylskupinu .

Jak bude zřejmé z dalšího popisu, způsob přípravy tetradekapeptidů obeoného vzorce I zahrnuje periodické· odštěpování ochranné skupiny alfa-aminoskupiny z terminální aminokyseliny přítomné v peptidovém řetězci. Jediným omezením, pokud se týče totožnosti ochranné skupiny epsílon-aminoskupiny lysinového zbytku,spočívá tedy v tom, že ochranná skupina musí mít takovou povahu, aby se neodštěpovala za podmínek, používaných pro selektivní odštěpování álfa-aminoskupiny. Vhodná volba ochranných skupin alfa-amino a epsílon-aminoskupin je pro běžného odborníka v chemii peptidů snadná, je pouze třeba uvážit relativní snadnost, s jakou lze jednotlivé ochranné skupiny odštěpit. Tak například skupiny jako je 2-(p-bifenylyl)isopropyloxykarbonylskupina (BpOC) a tritylskupina jsou velmi labilní a lze je odštěpovat i v přítomnosti slabé kyseliny. Středně silná kyselina, jako kyselina chlorovodíková, trifluoroctová nebo fluorid boritý v kyselině octové je zapotřebí pro odštěpení jiných sku5 pin, jako terc.butyloxykarbonyl-, terc.amyloxykarbonyl-, adamantyloxykarbonyl- a p-metoxybenzyloxykarbonylskupiny. Pro odštěpení jiných ochranných skupin je nutno použít ještě silnějších kyselin, tak například odštěpování benzyloxykarbonyl-, halogenbenzyloxykarbonyl-, ρ-nitrobenzyloxykarbonyl-, cykloalkyloxykarbonyl- a isopropyloxykarbonylskupiny vyžaduje silně kyselé podmínky, tj. použití bromovodíku, fluorovodíku nebo trifluoracetátu bromitého v kyselině trifluoroctové. Samozřejmě, že za použití silnějších kyselin se rovněž odštěpí i všechny labilnější skupiny. Při volbě ochranných skupin aminoskupin je tedy třeba zajistit, aby skupina na alfa-aminoskupině byla labilnější,než ochranné skupina epsílon-aminoskupiny a podmínky odštěpování musí být selektivní, aby docházelo jen k odštěpování ochranné skupiny alfa-aminoskupiny. Přednostní kombinací ochranných skupin vyhovující těmto podmínkám je kombinace o-chlorbenzyloxykarbonyl- nebo cyklopentyloxykarbonylskupiny ve významu í<2 a terc.butyloxykarbonylskupiny, jako ochranné skupiny alfa-aminoskupiny používané u každé aminokyseliny addované na řetězec polypeptidu.

Skupiny R3 a R4 představují hydroxylové vodíky nebo ochranné skupiny alkoholické hydroxyskupiny threoninu a šeřinu. Mnohé takové ochranné skupiny jsou popsény ve shora citovanéMcOmieově práci, kapitole 3, jejímž autorem je C. B. Reese. Jako typické příklady takových ochranných skupin lze uvést C1-C4 alkylskupiny, jako metyl-, etyl- a terč.butylskupinu, benzylskupinu, substituovanou benzylskupinu, jako je ρ-metoxybenzyl-, p-nitrobenzyl-, p-chlorbenzyl-.a o-chlorbenzylskupina, C1-C3 alkanoylskupiny, jako je formyl-, acetyl- a propionylskupina, trifenylmetylskupinu (tritylskupinu). Když jsou R3 a R4 ochranné skupiny s výhodou se v obou případech jako tyto skupiny volí benzylskupiny.

Skupina R5 představuje bučí vodík nebo formylskupinu a definuje skupinu tryptofanového zbytku. Formylskupina slouží jako ochranná skupina. Použití této ochranné skupiny neni obligatorní, a proto R5 může představovat buá vodík (skupina nechráněná na dusíku) nebo formylskupinu (skupina chráněná na dusíku).

Skupina X definuje povahu karboxylové terminální skupiny tetradekapeptidového řetězce. Může jí být hydroxyskupina, a v takovém případě se jedná o volnou karboxyskupinu. X může kromě toho znamenat pevný pryskyřičný nosič, ke kterému je terminální karboxylová skupina peptidu vázána v průběhu jeho syntézy. Zbytek pevné pryskyřice lze znázornit vzorcem

Přitom platí, že vždy, když X představuje hydroxyskupinu, znamená každý ze symbolů R, R,, R2» ^r3> ^r4 ^{a r}5 vodík. Když X představuje pevný pryskyřičný nosič, představuje každý ze symbolů R, fi) , R2, R3 a R4 vždy ochrannou skupinu.

V popisu je používáno následujících zkratek, z nichž většina jsou zkratky v tomto oboru běžně zavedené.

Ala - alanin Asn - asparagin Cys - cystein Gly - glycin Lys - lysin Phe - fenylalanin Ser - serin Thr - treonin Trp - tryptofan

Val - valin

DCC - Ν,Ν'-dicyklohexylkarbodiimid

DMF - N,N-dimetylformamid

BOC - tere.butyloxykarbonyl

PMB - p-metoxybenzyl

CBzOC - o-chlorbenzyloxykařbonyl

CPOC - oyklopentyloxykarbonyl

Bzl - benzyl

For - formyl

BpOC - 2-(p-bifenyl)isopropyloxykarbonyl.

I když volba konkrétních ochranných skupin, kterých se má použít při přípravě sloučenin obecného vzorce I je v rozsahu zkušeností odborníka v syntéze peptidů, je samozřejmé, že sekvence reakci, které musí být provedeny, ovlivňuje volbu konkrétních ochranných skupin. Jinými slovy zvolené ochranné skupina musí být stálá jak vůči použitým reakčním složkám, tak za podmínek následujících reakčních stupňů. Tak například, jak již bylo v určitémrozsahu uvedeno, musí zůstat konkrétně použitá ochranná skupina netknuta za podmínek použitých při odštěpování ochranné skupiny alfa-aminoskupiny terminólního zbytku aminokyseliny peptidového fragmentu při přípravě pro kondenzaci následujícího aminokyselinového fragmentu na peptidový řetězec. Je rovněž důležité zvolit jako ochrannou skupinu takovou skupinu, které zůstane netknuta během budování peptidového řetězce a kterou lze snadno odštěpit po skončení syntézy požadovaného tetradekapeptidového produktu. Všechny tyto faktory jsou však v rozsahu zkušeností odborníka v tomto oboru.

Jak je ze shora uvedené diskuse zřejmé, mohou se tetradekapeptidy obecného vzorce I připravovat syntézou v pevné fázi. Tato syntéza spočívá v postupném budování peptidového řetězce, počínaje na terminálnim uhlíkovém konci peptidu. Většinou se postupuje tak, že se nejprve cystein váže prostřednictvím své karboxylové funkční skupiny k pryskyřici, reakcí cysteinu a chráněnou aminoskupinou a chráněnou sulfhydrylovou skupinou s chlormetylovanou nebo hydroxymetylovanou pryskyřici. Příprava hydroxymetylóvané pryskyřice jě popsána v práci Bodanszky a dalěi, Chem. Ind. (Londýn), 38. 1597-98 (1966). Chlormetylované pryskyřice je obchodně dostupná (Lab Systems, lne., San Mateo, California, USA).

Alternativně se může cystein vázat k pryskyřici tak, že se jeho karboxylové funkční skupina nejprve běžným způsobem aktivuje. Tak například se může nechat cystein reagovat s pryskyřicí v přítomnosti sloučeniny aktivující karjjoxyskupinu, jako je N,N'-dicyklohexylkarbodiimid (DCC). _;

Po navázáni volné karboxyskupiny cysteinu na pryskyřičný nosič se začne postupně budovat peptidový řetězec, postupnou kondenzací jednotlivých aminokyselin k N-terminální části peptidového řetězce. Přitom je tedy zapotřebí v každém stupni odštěpit ochrannou skupinu alfa-aminoskupiny z aminokyseliny v terminální části peptidového fragmentu a pak se připojí k volnému a reaktivnímu N-konci terminální aminokyseliny následující aminokyselinový zbytek. Odštěpování ochranně skupiny alfa-aminoskupiny se může provádět v přítomnosti kyseliny, jako kyseliny bromovodíkůvé, chlorovodíkové, trifluoroctové, p-toluensulfonpvé, benzensulfonové, naftalensulfonové a octové za vzniku odpovídající adiční soli produktu s kyselinou.

Jinou metodou, odštěpování ochranné skupiny aminoskupiny je působení fluoridem boritým. Tak například působením dietyléterétu fluoridu boritého v ledové kyselině octové se fragment peptidu s chráněnou aminoskupinou převede na komplex s fuloridem boritým, který se pak převede na volný peptidový fragment působením zásady, jako vodného hydrogenuhličitanu draselného. Může se použít kterékoli z těchto metod za předpokladu, že se jí dosáhne odštěpení ochranné skupiny N-terminální alfa-aminoskupiny bez porušení jakýchkoli dalších ochranných skupin, přítomných v peptidovém řetězci. S ohledem na tento požadavek se přednostně odštěpuje N-terminální ochranná skupina za použití kyseliny trifluoroctové. Obvykle se štěpeni provádí při teplotě od asi 0 °C do asi teploty místnosti.

Po odštěpení ochranné skupiny v N-terminální poloze je získaný produkt obvykle ve formě adíční soli s kyselinou, které bylo použito pro odštěpování ochranné skupiny. Tento produkt se pak může převést na sloučeninu s volnou aminoskupinou působením slabé zásady, typicky terciárního aminu, jako pyridinu nebo trietylaminu.

Nyní je řetězec peptidu připraven pro reakci,s následující aminokyselinou. Reakce s aminokyselinou se může provádět kteroukoli z několika známých technik. Pro připojováni následující aminokyseliny k N-konci řetězce peptidu se používá aminokyseliny, která má volnou karboxyskupinu, ale která má vhodně chráněnu alfa-aminoskupinu a věechny ostatní popřípadě přítomné reaktivní skupiny. Aminokyselinu je pro reakci s N-konpem řetězce peptidu třeba aktivovat. Jedním ze způsobů aktivace, kterého lze při syntéze použit, je převedení aminokyseliny na směsný anhydrid. Přitom se volná karboxylová funkční skupina aminokyseliny aktivuje reakci s jinou kyselinou, typicky s derivátem kyseliny uhličité ve formě chloridu kyseliny. Jako příklady takových chloridů kyselin, kterých lze použít pro tvorbu směsných anhydridů, lze uvést etylchlorformiét, fenylchlorformiét, sek.butylehlorformiát, isobutylchlorformiát a pivaloylchlorid.

Jiným způsobem aktivace karboxylové funkční skupiny aminokyseliny pro kondenzaci s řetězcem peptidu, je převedení aminokyseliny na reaktivní esterový derivát. Jako příklady takových reaktivních esterů lze uvést 2,4,5-trichlorfenylester, pentachlorfenylester, p-nitrofenylester, ester vzniklý z 1-hydroxybenzotriazolu a ester vzniklý z N-hydroxysukcinimidu. Jiným způsobem připojování C~terminální části aminokyseliny k peptidovému fragmentu je způsob, při kterém se kondenzace provádí v přítomnosti alespoň ekvimolárního množství N,N'-dicyklohexylkarbodiimidu (DCC). Posledně uvedeného způsobu se přednostně používá při přípravě tetradekapeptidu obecného vzorce II, kde X představuje skupinu vzorce

O-CH.

pryskyřice

Po připravení řetězce peptidu s požadovaným sledem aminokyselin se může výsledný peptid odstranit z pryskyřičného nosiče. To se provádí působením fluorovodíku na tetradekapeptid vázaný k pryskyřici s chráněnými reaktivními skupinami. Působením fluorovodíku se odštěpí peptid od pryskyřice, kromě toho se jím však odštěpí všechny ostatní ochranné skupiny přítomné na reaktivních skupinách peptidového řetězce, stejně tak jako ochranná skupina alfa-aminoskupiny terminální aminokyseliny. Když se peptid odštěpuje od pryskyřice za současného odštěpení ochranných skupin působením fluorovodíku, přednostně se reakce provádí v přítomnosti anisolu. Zjistilo se, že přítomnost anisolu inhibuje potenciální alkylaci určitých zbytků aminokyselin přítomných v řetězci peptidu. Kromě toho se odštěpování přednostně provádí v přítomnosti etylmerkaptanu. Etylmerkaptan slouží k ochraně indolového kruhu tr.ypťofanového zbytku a kromě toho usnadňuje převedení chráněných cysteinových zbytků do tiolové formy. Rovněž v případě, že R^ představuje formylskupinu, usnadňuje přítomnost etylmerkaptanu odštěpení formylskupiny fluorovodíkem. ,

Po shora popsaném štěpení se získá jako produkt peptid s přímým řetězcem, obsahujícím 14 zbytků aminokyselin. Pro získání konečného produktu obecného vzorce I je zapotřebí oxidovat tetradekapeptid s přímým řetězcem za takových podmínek, za kterých se sulfhydrylové skupiny přítomné v molekule, po jedné na každém zbytku cysteinu, zoxidují za vzniku disulfidového můstku. Oxidace se může provést tak, že se na zředěný roztok lineárního tetradekapeptidu, působí některým z řady oxidačních činidel, jako je například jod a ferrlkyanid draselný. Jako oxidačního činidla lze též použít vzduchu, přičemž pH směsi se obvykle udržuje od asi 2,5 do asi 9,0, přednostně od asi 6,2 do asi 7,2. Když se jako oxidačního činidla používá vzduchu, bývá koncentrace roztoku peptidu obvykle nižší než asi 0,4 mg peptidu/ml roztoku a obvykle asi 50 ;ig/ml.

Sloučeniny obecného vzorce I se mohou podávat teplokrevným živočichům, včetně lidem a jsou obzvláště užitečné pro relaxaci hladkých svalů. Zejména gastrointestinální trak,t lze uvést do stavu relaxace parenterálním podáním malých množství těchto sloučenin a -přednostně D-Val', D-Trp®-somat.ostatinu. Tento účinek, který má za následek snížení pohyblivosti střevy je obzvláště žádoucí při hypotonioké gastrointestinální radiografii. Sloučeniny podle vynálezu jsou kromě toho užitečné při léčení křečí tračníku, polyrospasmu a jiných spasmatiokýeh stavů gastrointestinélního traktu, křečí močového traktu a žlučníkových křečí.

Pro dosaženi relaxace hladkého svalstva se sloučeniny podle vynálezu obvykle podávají v dávce od asi 0,1 jug do asi 3 jug na kg tělesné hmotnosti příjemce a přednostně od asi 0,3 do asi 1 ,5/ig'na kg tělesné hmotnosti. Používá se parenterálního podávání, a to búž intramuskulárního, subkutánního nebo intravenózního. Přednostně se sloučeniny podle vynálezu podávají intravenózně nebo intramuskulárně.

Kapalné jednotkové dávkovači formy pro parenterální podávání se obvykle připravují smísením sloučeniny s farmaceutickým nosičem, například isotoniokým roztokem soli, isotonickým roztokem glyoinu, laktózy, mannitu, zředěnou kyselinou octovou, bakteriostatiokou vodou, například vodou obsahující asi 1 % benzylalkoholu a roztoky fosfátových pufrů a vhodnými kombinacemi jakýchkoli standardních nosičů. Nosič je obvykle přítomen v poměru k účinné sloučenině v hmotnostním poměru asi 25:1 do asi 1 000:1.

V závislosti na použitém nosiči a koncentraci může být sloučenina buá suspendována nebo rozpuštěna ve vhodném sterilním vehikulu, přednostně ve vodě. Při přípravě roztoků se sloučenina a nosič mohou rozpustit ve zvoleném vehikulu, roztok se přefiltruje a naplní se jím lahvičky nebo injekce, které se pak uzavřou. Ve vehikulu mohou být s výhodou rozpuštěny pomocné látky, jako lokální anestetika, konzervační látky nebo pufry. Aby se zvýšila stabilita, může se sloučenina ve Spojení s nosičem rozpustit ve vodě, vodný roztok umístit v lahvičce a pak lyofiližovat. Suchá lyofilizované pevná látka se pak uzavře v lahvičce a k balení se připojí lahvička s vehikulem, které slouží pro rekonstituci preparátu před použitím. Parenterální suspenze se mohou připravovat v podstatě stejným způsobem s tím rozdílem, že se sloučenina v nosiči suspenduje místo toho, aby se v něm rozpouštěla.

Sloučeniny obecného vzorce I jsou rovněž účinné, i když ne vždy ve stejné míře, jako inhibitory uvolňování růstového hormonu. Tento inhibiční ú,činek je prospěšný v těch případech, kdy je žádoucí léčit nadměrnou sekreci somatotropinu. Nadměrná sekrece somatotropinu může být spojena s nepříznivými poruchami, jako je juvenilní diabetes a akromegalie. Tyto sloučeniny mají rovněž jiné fyziologické účinky, jako je inhibice sekrece žaludeční kyseliny, užitečná při léčení vředů, inhibice exokrinní sekrece pankreasu, potenciálně užitečná při léčení pankreatitidy a inhibice sekrece inzulínu a glukagonu.

Sloučeniny se mohou podávat různými způsoby, jako orálně, sublinguálně, subkutánně, intramuskulárně a intravenózně. Rozmezí dávkování při sublinguálním nebo orálním podávání je přednostně asi 1 mg až asi 100 mg/kg tělesné hmotnosti. Dávkování při intravenózním, subkutánním nebo intramuskulárním podávání je při těchto indikacích obvykle od 1 jug do asi 1 mg/kg tělesné hmotnosti a přednostně od asi 50 jug do asi lOOjug/kg tělesné hmotnosti. Je samozřejmé, že dávkovači rozmezí je ve velké míře závislé na konkrétní léčené poruše a na její prudkosti.

Sloučeniny obecného vzorce I se mohou podávat orálně nebo sublinguálně ve spojení s farmaceutickým nosičem, například ve formě tablet nebo kapslí. Jako farmaceutických nosičů se používá běžných inertních ředidel a nosičů, jako například uhličitanu hořečnatého nebo laktózy ve spojení s běžnými desintegračními činidly, například kukuřičným škrobem a alginovou kyselinou a kluznými činidly, například stearanem hořečnatým. Typicky je množství nosiče nebo ředidla v rozmezí od asi 5 do asi 95 vztaženo na konečný preparát a přednostně od asi 50 do asi 85 %, vztaženo na konečný preparát. Do konečného preparátu se též mohou přidat vhodné ochuoovaoí přísady zlepšující chul dávkovačích forem. Když se mají sloučeniny obecného vzorce I podávat parenterálně, používá se jako vhodných nosičů napři9 klad nosičů shora popsaných, v souvislosti s použitím těchto sloučenin pro dosažení relaxace hladkého svalstva. Následující příklady blíže objasňují přípravu sloučenin obecného vzorce I a meziproduktů. Příklady mají pouze ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném směru neomezují.

Přikladl

N-terc,butyloxykarbonyl-L-cysteinyl(S-p-metoxybenzyl)metylovaná polystyrénová pryskyřice

K 1 000 ml Ν,Ν-dimetylformamidu (DMF) obsahujícímu česnou sůl N-terc.butyloxykarbonyl-(S-p-metoxybenzyl)cysteinu (připravenou ze 17,5 g volné kyseliny) se přidá 100 g chlormetylované polystyrénové pryskyřice (Lab Systems, lne., 0,75 nnnolu Cl/gram). -Směs se míchá 5 dnů při teplotě místnosti. Pryskyřice se odfiltruje a promyje střídavě třikrát směsí 85 % DMF a 15 % vody a DMF a pak ještě dvakrát DMF. K pryskyřici suspendované y 1 000 ml DMF se přidá roztok 16 g (83,4 mmolu) octanu česného. Směs se míchá 9 dnů při teplotě místnosti. Pryskyřice se pak odfiltruje a střídavě vždy třikrát promyje směsí 85 % DMF a 15 % vody a DMF. Pak se pryskyřice promyje chloroformem a čtyřikrát se v děličce suspenduje v chloroformu a kapalina se odpustí, aby se odstranil prach. Pryskyřice se odfiltruje, promyje 95% etenolem a pak se střídavě promyje vždy třikrát benzenem a 95% etanolem. Pryskyřice se za vakua vysuší při 30 °C a získá se 115,3 g titulního produktu. Analýza aminokyselin ukazuje, že na 1 gram pryskyřice připadá 0,254 mmolu cysteinu. Cystein se stanovuje jako kyselina cysteová v produktu hydrolýzy, prováděné za použití směsi dioxanu a koncentrované kyseliny chlorovodíkové 1:1, ke které bylo přidáno malé množství dimetylsulfoxidu.

Příklad 2

N-terc.butyloxykarbonyl-D-valyl-glycyl-L-(S-:p-metoxybenzyl)cysteinyl-L-(N^í-o-chlorbenzyloxykarbonyl)-lysyl-L-asparaginyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl-D-tryptofyl-L-(N^ř-o-chlorbenzyloxykarbonyl)lysyl-L-(o-benzyl)treonyl-L-fenylalanyl-L-(o-benzyl)třeonyl-L-(o-benzyl)seryl-L-(S-p-metoxybenzyl)cysteinylmetylovaná polystyrénová pryskyřice

Produkt z příkladu 1 (5,0 g) se umístí do reakční nádoby automatického syntetizátoru peptidů Beckman 990 a v tomto zařízení se k produktu připojí dvanáct ze zbývajících třinácti aminokyselin. Výsledný chráněný tridekapeptid vázaný k pryskyřici se rozdělí ná dva stejné díly a k produktu obsaženému v jednom z těchto dílů se připojí koncový zbytek. Použité aminokyseliny a jejich pořadí je toto:

1. N-terc.butyloxykarbonyl-(0-benzyl)-L-serin,

2. N-terc.butyloxykarbonyl-(O-benzyl)-L-threonin,

3. N-terc.butyloxykarbonyl-L-fenylalanin,

4., N-terc.butyloxykarbonyl-(O-benzyl)-L-threonin,

5. N*—terc.butyloxykarbonyl-N£-o-chlorbenzyloxykarbonyl-L-lysin,

6. N^-terc.butyloxykarbonyl-D-tryptofan,

7. N-terc.butyloxy-L-fenylalanin,

8. N-terc.butyloxykarbonyl-L-fenylalanin,

9. p-nitrofenylester N-terc.butyloxykárbonyl-L-asparaginu,

10. N^-tere.butyloxykarbonyl-NČ-o-ehlorbenzyloxykarbonyl-L-lysin,

11. N-terc.butyloxykarbonyl-(S-p-metoxybenzyl-L-cystein,

12. N-terc.butyloxykarbonylglycin a

13. N-terc.butyloxykarbonyl-D-valin.

Sled operací, kterými se provádí odštěpení ochranné skupiný7 neutralizace a připojení aminokyseliny v případě každé z aminokyselin zaváděných do peptidu je tento:

1. trojnásobné promytí chloroformem (vždy 10 ml/g pryskyřice), vždy po dobu 3 minut,

2. odštěpení BOC skupiny dvacetiminutovým působením směsi 29 % kyseliny trifluoroctové, % chloroformu a 6 % trietylsilanu v množství 10 ml/g po dobu 20 minut, postup se opakuje dvakrát,

3. dvojnásobné promytí chloroformem (vždy 10 ml/g pryskyřice, vždy po dobu 3 minut),

4. jedno promytí metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice, po dobu 3 minut),

5. trojnásobné promytí směsí 90 % terc.butylalkoholu a 10 % terč. amylalkoholu (vždy 10 ml/g pryskyřice, vždy po dobu 3 minut),

6. trojnásobné promytí metylenchloridem (vždy 10 ml/g pryskyřice) vždy po dobu 3 minut,

7. neutralizace 3 % trietylaminu v metylenchloridu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

8. promývání metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

9. promývání směsí 90 % terc.butylalkoholu a 10 % terč.amylalkoholu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje sé třikrát,

10. promývání metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

11. přidání 1,0 mmolu/g pryskyřice chráněné aminokyseliny a 1,0 mmolu/g pryskyřice N,N'-dicyklohexylkarbodiimidu (DCC) v 10 ml/g pryskyřice metylenchloridu a míšení po dobu 120 minut,

12. promývání metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

13. promývání směsí 90 % terc.butylalkoholu a 10 % terč.amylalkoholu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

14. promývání metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

15. neutralizace působením 10 ml/g pryskyřice 3 % trietylaminu v metylenchloridu po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

16. promývání metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

17. promývání směsí 90 % terc.butylalkoholu a 10 % terč. amylalkoholu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

18. promývání metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

19. promývání 10 ml/g pryskyřice dimetylformamidem po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

20. přidání 1,0 mmolu/g pryskyřice chráněné aminokyseliny a 1,0 mmolu/g pryskyřice Ν,Ν'-dieyklohexylkarbodiimidu (DCC) v 10 ml/g pryskyřice směsi DMP a metylenchloridu 1:1a míšení po dobu 120 minut, ,

21. promývání 10 ml/g dimetylformamidu po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

22. promývání metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

23. promývání směsí 90 % terc.butylalkoholu a 10 % terč.amylalkoholu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

24. promývání metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po* dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

25. neutralizace působením 10 ml/g pryskyřiée 3 % trietylaminu v metylenchloridu po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

26. promývání metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

27. promývání směsí 90 % terc.butylalkoholu a 10 % terč.amylalkoholu (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát, a

28. promývání metylenchloridem (10 ml/g pryskyřice) po dobu 3 minut - opakuje se třikrát.

Shora uvedeného sledu operací se používá pro připojení každé z aminokyselin s výjimkou glycinu a asparaginu. Připojení glycinu se provádí pouze za použiti stupňů 1 až 18. Asparaginový zbytek se zavádí prostřednictvím reaktivního p-nitrofenylesteru. Přitom se stupeň 11. nahradí následujícími třemi stupni:

a) promývání 10 ml/g pryskyřice dimetylformamidem po dobu 3 minut - opakuje se třikrát,

b) přidání 1,0 mmolu/g pryskyřice p-nitrofenylesteru N-terc.butyloxykarbonyl-L-asparaginu v 10 ml/g pryskyřice směsi dimetylformamidu a metylenchloridu.1:3 a míchání po dobu 720 minut a „

c) promývání 10 ml/g pryskyřice dimetylformamidem po dobu 3 minut - opakuje se třikrát.

Rovněž stupeň 20. se modifikuje tak, že se přidá p-nitrofenylester N-terc.but,oxykarbonyl-L-asparaginu ve směsi dimetylformamidu a metylenchloridu 3:1 a směs se míchá 720 minut.

Výsledný peptid vázaný k pryskyřici se za vakua vysuší. Produkt sehydrolyzuje za varu pod zpětným chladičem ve směsi koncentrované kyseliny chlorovodíkové a dioxánu po dobu 72 hodin. Analýza aminokyselin výsledného produktu poskytuje následující výsledky (jako standardu se používá lysinu) Asn, 1,00; 2Thr, 2,18; Ser, 0,95; Gly, 1,00; Val, 0,99; 3Phe, 3,45; 2Lys, 2,00.

Příklad 3

D-valyl-glycyl-L-cysteinyl-L-lysyl-L-asparaginyl~L-fenylalányl-L-fenylalanyl-D-tryptofyl-L-lysyl-L-threonyl-L-f enylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-gysWin

Ke směsi 7,2 ml anisolu a 7,2 ml etylmerkaptanu se přidá 3,914 g (při úrovni substituce 0,155 mmolu/g) chráněného teťradekapeptidu na pryskyřici z příkladu 2. Směs sé ochladí v kapalném dusíku a přidestiluje se 80 ml kapalného fluorovodíku. Výsledná směs se nechá ohřát na 0 °C a míchá se po dobu 2 hodin. Fluorovodík se pak oddestiluje. Ke zbylé směsi se přidá éter a vzniklá směs se ochladí na 0 °C. Vzniklá pevná látka se odfiltruje a promyje éterem. Produkt se vysuší a tetradekapeptid zbavený ochranných skupin se extrahuje ze směsi s pryskyřicí za použití 1 M kyseliny octové a 50 % kyseliny octové. Roztok v kyselině octové se pak ihned ve tmě lyofilizuje do sucha. Výsledná světle žlutá pevná látka se suspenduje ve směsi 10 ml odplyněné 0,2 M kyseliny octové.a 4 ml ledové kyseliny octové. Suspenze se mírně zahřívá se 6 ml 50% kyseliny octové, až se získá Sirý žlutý roztok a tento roztok se nanese na sloupec Sephadexu G-25F. Chromatografie se provádí za těchto podmínek:

rozpouštědlo: odplyněná 0,2 M kyselina octová rozměry sloupce: 75 x 1 500 mm teplota: 26 °C toková rychlost: 1 670 ml/h objem frakce: 25,05 ml ·

Absorbance při 280 nm každé frakce se vynese do grafu oproti Síslu frakce. Získá se křivka s velkým širokým maximem a přilehlým ramenem (inflexí). UV-spektroskopie ukazuje, že hlavní část maxima tvoří produkt. Spojí se frakce 207 až 233 (tj. eluát od 5 160 do 5 837 ml, maximum odpovídá průtoku celkem 5 515 ml eluátu).

Spojené frakce neobsahují produkt odpovídající rameni křivky. UV-spektroskopie ukazuje, že ve spojených frakcích je obsaženo 470 mg produktu (výtěžek 46,4 %). Ellmanovou titrací alikvotního vzorku se zjistí, že obsah sulfhydrylových skupin je 95 % teorie.

Příklad 4

Oxidace na D-Vall,'D-Trp®-somatostatin

Roztok redukovaného D-Val1, D-Trp^-somatostatinu (677 ml) z příkladu 3 se zředí destilovanou vodou na koncentraci 50 >ug/ml. Přidá se koncentrovaný hydroxid amonný, aby se pH směsi nastavilo na 6,7. Roztok se míchá při 4 °C ve tmě po dobu 64 hodin a pak se zjistí Ellmanovou titrací, že oxidace je skončena.

Směs se za vakua zkoncentruje na objem 45 ml a přidá se 45 ml ledové kyseliny octové. Směs se odsolí na sloupci Sephadexu G-25P. Chromatografie se provádí za těchto podmínek:

rozpouštědlo: odplyněná 50% kyselina octová rozměr sloupce: 50 x 2 150 mm teplota: 26 °C rychlost toku: 148' ml/h objem frakce: 17,3 ml

Absorbance při 280 nm každé frakce se vynese oproti pořadí frakce do grafu. Získaná křivka obsahuje dvě velká maxima. První maximum je tvořeno agregovanými formami produktu a druhé maximum tvoří monomerní produkt. Látka odpovídající druhému maximu se shromáždí (frakce 116 až 155 /2 000 až 2 685 ml/). UV spektroskopie ukazuje, že vzorek obsahuje 279 mg produktu (výtěžek 59,4 #). Roztok se lyofilizuje ve tmě do sucha..

Výsledná bílá pevná látka se rozdělí na dvě přibližně stejné části a každá část se znovu chromatografuje. První část se rozpustí ve 25 ml odplyněné 50# kyseliny octové a absorbuje na sloupci Sephadexu G-25F. Chromatografie se provádí za těchto podmínek:

rozpouětědlo: odplyněná 50# kyselina octová rozměr sloupce: 50 x 2 ,50 mm teplota: 26 °C rychlost toku; 148 ml/h objem frakce: 17,3 ml.

Absorbance při 280 nm každé frakce se vynese oproti pořadí frakce do grafu. Získaná frakce se vynese oproti pořadí frakce do grafu. Získaná křivka obsahuje dvě velké maxima. Shromáždí se frakce obsahující látku, která tvoří druhé maximum, tj. spojí se frakce 119 až 125 (eluát od 2 128 do 2 256 ml). UV spektroskopie ukazuje, že ve vzorku je obsaženo 65,3 mg produktu. Roztok se lyofilizuje do sucha ve tmě a získá se požadovaný produkt.

Druhá část se znovu chromatografuje stejným způsobem jako první část a dosáhne se podobných výsledků. Produkty získané při obou chromatografických postupech se spojí a podle UV-spektroskopie je celkový výtěžek 126 mg (45,2 # výtěžek přečištěného produktu). Spojený produkt se rozpustí v 15 ml odplyněné 0,2 M kyseliny octové a nanese na sloupec Sephadexu G-25F. Chromatografie se provádí za těchto podmínek:

rozpouětědlo: odplyněná 0,2 M kyselina octová, rozměry sloupce: 50 χ 1 500 mm teplota: 26 °C rychlost toku: 466 ml/h objem frakce: 16,3 ml.

Absorbance při 280 nm každé frakce se vynese do grafu oproti pořadí frakce. Získaná křivka obsahuje jedno velké maximum. UV-spektroskopie ukazuje, že hlavní část maxima je tvořena produktem o velmi dobré čistotě. Spojí se frakce 160 až ,80 (od průtoku 2 592 do průtoku 2 934 ml, maximum odpovídá průtoku 2 685 ml) a spojené frakce se ve tmě lyofilizují do sucha, UV-spektroskopie ukazuje přítomnost 90,4 mg produktu (71,7 # teorie).

Optická otáčivost = -56,1° (v 1# kyselině octové).

Analýza aminokyselin:

Val 1,0, Gly 0,97, 2Cys ,,62, 2Lys 2,00, Asn 1,01, 3Phe 2,87, Trp 1,02, 2Thr 1,83,

Ser 0,81.

Shora uvedené výsledky jsou vyjádřeny jako poměry vzhledem k jednotkovému množství lysinu (Lys/2 = 1,0). Všechny hodnoty jsou průměry ze dvou 21hodinových hydrolýz, prováděných bez akoeptorů, Tryptofan se stanoví UV-spektroskopií (jako poměr vůči Lys/2); množství šeřinu není opraveno s ohledem na ztráty při hydrolýze.

Získaný produkt obsahuje menší množství nečistot. Je-li to žádoucí, může se produkt dále přečistit preparativní vysokotlakou kapalnou chromatografii (HPLC).

Alternativní metodou oxidace redukovaného D-Val^, D-Trp®-somatostatinu na D-Val^,

D-Trp⁸-somatostatin je zpracování ferrikyanidem draselným. Oxidace se provádí ve vodném roztoku, jehož pH se upraví na 6,7 shora popsaným způsobem. Ke směsi se přidává vodný roztok ferrikyanidu draselného až do dosažení konečné koncentrace, odpovídající přibližně 3,3násobku množství redukovaného D-Vall, D-Trp⁸-somatostatinu. Roztok se míchá ve tmě při teplotě místnosti asi 2 hodiny. Dokončení oxidace se ověří Ellmanovou titrací.

Příklad 5

N-terc.butyloxykarbonyl-D-alanyl-glycyl-L-(S-p-metoxýbenzyl)cysteinyl-L-(N^e-o-chlorbenzyloxykarbonyl)lysyl-L-asparaginyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl-D-tryptofyl-L-ÍN^-o-chlorbenzyloxykarbonyl)lysyl-L-(O-benzyl)threonyl-L-fenylalanyl-L-(0-benzyl)threonyl-L-(0-benzyl)seryl-L-(S-p-metoxybenzyl)cysteinyl-metylovaná polystyrénová pryskyřice

Tato sloučenina se připraví za použití druhé části tridekapeptidu připraveného podle příkladu 2, přičemž se k tomuto fragmentu připojí N-terc.butyloxykárbonyl-D-alanin místo N-terc.butyloxykarbonyl-D-valinu.

Analýza aminokyselin výsledného produktu po hydrolýze prováděné 21 hodin za varu pod zpětným chladičem ve-směsi 1:1 koncentrované kyseliny chlorovodíkové a dioxanu poskytuje tyto výsledky (jako standardu se používá lysinu):

Asn 1,16, 2Thr 2,14, Ser 1,04, Gly 1,09, Ala 1,17, 3Phe 2,88, 2Lys 2,00.

P ř í k 1 a d 6

D-alanyl-glycyl-L-eysteinyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-fenylalanyl-L-fenylalanyl-D-trypťofyl-’ -L-lysyl-L-threonyl-L-fenylalanyl-L-threonyl-L-seryl-L-cystein

Titulní sloučenina se připraví způsobem popsaným v příkladě 3 za použití 3,772 g (při úrovni substituce 0,156 mmolu/g) produktu z příkladu 5. Přečištění produktu se provádí chromatografii na sloupci Sephadexu G-25F. Chromatografie se provádí za těchto podmínek:

rozpouštědlo: odplyněná 0,2 M kyselina octová rozměry sloupce: 75 χ 1 500 mm teplota: 26 °C rychlost toku: 1 658 ml/h objem frakce: 24,87 ml.

Absorbance při 280 nm každé frakce se vynese do grafu oproti číslu frakce. Získá se křivka s velkým širokým maximem a přilehlým ramenem (inflexí). UV-spektroskopie ukazuje, že hlavní část maxima tvoří produkt. Spojí se frakce 206 až 230 (tj. od průtoku 5 098 do průtoku 5 720 ml rozpouštědla).

Spojené frakce neobsahují produkt odpovídající rameni, křivky. UV-spektroskopie ukazuje teoretické množství 403,9 mg (výtěžek 41,9 %) produktu ve vzorku. Ellmanovou titrací alikvótního dílu se zjistí, že obsah volných sulfhydrylových skupin odpovídá 93 % teorie.

P ř í k 1 a d 7

Oxidace na D-Ala', D-Trp®-somatostatin ·

Redukovaný D-Ala', D-Trp⁸-somatostatin z příkladu 6 se zpracovává způsobem popsaným v příkladě 4. Roztok z příkladu 6 (622 ml, teoretický obsah produktu 403,9 mg) se zředí destilovanou vodou na koncentraci 50/jg/ml. Přidá še koncentrovaný hydroxid amonný, aby se pH směsi nastavilo na 6,7. Roztok se míchá při teplotě místnosti ve tmě po dobu 41 hodin.

Směs se za vakua zkonoentruje na asi 40 ml a zředí se 40 ml ledové kyseliny octové. Směs se absorbuje na sloupci Sephadexu G-25F. Chromatografie se provádí za těchto podmínek:

rozpouštědlo: odplyněné 50% kyselina octová rozměry sloupce: 50 x 2 150 mm teplota: 26 °C rychlost toku: 151 ml/h objem frakce: 17,61 ml.

Absorbance při 280 nm každé frakce se vynese oproti pořadí frakee do grafu. Získaná křivka obsahuje dvě velká maxima. První maximum je tvořeno agregovanými formami produktu a druhé maximum tvoří monomernl produkt. Látka odpovídající druhému maximu se shromáždí (frakce 113 až 155 /od průtoku 1971 do průtoku 2 728 ml' eluátu/). Roztok se ve tmě lyofilizuje do sucha.

Výsledná bílá pevná látka se rozdělí na dvě přibližně stejné části a každá část se znovu chromatografuje. První část se rozpustí ve 22 ml odplyněné 50% kyseliny a roztok se nanese na sloupec Sephadexu G-25F. Chromatografie se provádí za těchto podmínek:

rozpouštědlo: odplyněné 50% kyselina octová ’ rozměry sloupce: 50 x 2 150 mm teplota: 26 °C rychlost toku: 153 mí/h objem frakce: 17,85 ml.

Absorbance při 280 nm každé frakce se vynese oproti pořadí frakce do grafu. Získaná křivka obsahuje dvě velká maxima. Shromáždí se frakoe obsahujíoí látku, která tvoří druhé maximum, tj. spojí se frakoe 121 až 127 (proteklý objem rozpouštědla 2 142 až 2 267 ml). UV-spektroskopie vzorku ukazuje, že obsah produktu'je 56,7 mg. Roztok se ve tmě lyofilizuje do sucha. Získá se požadovaný produkt.

Druhé část se znovu chromatografuje stejným způsobem jako první část a dosáhne se podobných výsledků. Produkty získané při obou ohromatografickýoh postupech se spojí a podle UV-spektroskopie je celkový výtěžek 126,3 mg (31,3 % výtěžek, vztaženo na redukovanou formu). Spojený produkt se rozpustí ve 21 ml odplyněné 0,2 M kyseliny octové a nanese na sloupec Sephadexu G-25F. Chromatografie se provádí za těohto podmínek:

rozpouštědlo: odplyněná 0,2 M kyselina octová rozměry sloupce: 50 x 1 500 mm . teplota: 26 °C rychlost toku: 449 ml/h objem frakoe: 15,71 ml.

Absorbance při 280 nm každé frakce se vynese do grafu oproti pořadí frakce. Získaná křivka obsahuje jedno velké maximum.' UV-spektroskopie ukazuje, že hlavní část maxima je tvořena produktem. Spojí se frakce 169 až 188 (proteklý objem eluátu 2 640 až 2 953 ml, maximum odpovídá 2 705 ml) a lyofilizují do sucha ve tmě. UV-spektroskopie ukazuje přítomnost 85,2 mg produktu (výtěžek 67,5 %).

Optická otáčivost = -54,9° (1% kyselina octová).

Analýza aminokyselin:

Ala 1,05, Gly 1,0, 2Cys 1,58, 2Lys 2,0, Asn 1,10, 3Phe 2,92, Trp 1,02, 2Thr 1,9a,

Ser 0,88.

Shora uvedené výsledky jsou vyjádřeny jako poměry vzhledem k jednotkovému, množství ly15 sinu (Lys/2 = 1,0). Všechny hodnoty jsou průměry ze dvou 21hodinových hydrolýz, prováděných bez akceptorů. Tryptofan se stanoví UV-spektroskopií (jako poměr vůči Lys/2), množství šeřinu není opraveno s ohledem na ztráty při hydrolýze.

D-Val', D-Trp®-somatostatin byl zkoušen na psech,jakožto činidlo pro in vivo inhibici sekrece žaludeční kyseliny. Šesti psům s chronickým píštělem a Heidenhainovým váčkem se vyvolá sekrece žaludeční kyseliny chlorovodíkové infúzí C-terminálního tetrapeptidu gastrinu při dávkování 0,5/ig/kg.h. Každý pes slouží sám sobě rovněž pro kontrolu. Po jedné hodině sekrece kyseliny chlorovodíkové v ustáleném stavu se psům infuzí podává po dobu 1 hodiny D-Trp®-somatostatin v dávce 0,15>ug/kg.h. Pokračuje se v odebírání vzorků žaludeční kyseliny po dalších 1,5 hodiny při intervalu odběru 15 minut. Vzorky se v automatickém titrátoru titrují na pH 7. Maximální inhibični účinek D-Val^, D-Trp⁸-somatostatinu se extrapoluje proti křivce dávka-odezva somatostatinu a relativní účinnost analogu vůči účinnosti somatostatinu se vyjádří jako % aktivity. D-Val', D-Trp⁸-somatostatin inhibuje ustálenou sekreci žaludeční kyseliny, vyvolanou C-terminálním tetrapeptidem gastrinem z 48,22 i ± 6,45 % (standardní střední chyba měření). Tento účinek je ekvivalentní účinku 0,175/ig/kg .h somatostatinu. Relativní aktivita této látky vůči somatostatinu je tedy 116 %. Čistší vzorek D-Val', D-Trp⁸-somatostatinu, podávaný v dávce 0,200, 0,166 a 0,138/ig/kg.h, inhibuje -ustálenou sekreci, vyvolanou C~terminálním tetrapeptidem gastrinem z 77,63, 71,57 a 67,8 #. Účinnost relativně vzhledem k somatostatinu je 302 až 325 %.

D-Ala', D-Trp®-somatostatin zkoušený v dávce 0,20?ug/kg.h za stejných podmínek inhi- , buje ustálenou sekreci vyvolanou C-terminálním tetrapeptidem gastrinem z 73,61 t 3,66 % (standardní střední chyba). Tento účinek je ekvivalentní účinku 0,550/ig/kg.h somatostatinu. Účinnost této látky vzhledem k somatostatinu je 275 #.

D-Val’, D-Trp®-somatostatin a D-Ala), D-Trp⁸-somatostatin byly rovněž zkoušeny, pokud se týká jejich účinku na pohyblivost střev psů při vědomí. Jako zkušebních zvířat se používá tří psů se zavedenými intralumenálnimi kathetry, umístěnými v antru, doudenu a pyloru. Tlakové změny v lumeni střeva se zaznamenávají v zařízení Visicorder za použití měřičů napětí a miniaturních galvanometrů se světelným paprskem. Po ustavení ustáleného stavu se psům infuzí podává intravenózně po dobu 10 minut zkušební sloučenina, Zkušební sloučenina zpočátku zvyšuje intralumenální tlak v pyloru a pak ho snižuje, zatímco tlak v duodenu a antru zůstává během zkoušky snížen. Nejnižší účinná dávka nutná pro zvýšeni tlaku v pyloru a snížení tlaku v duodenu a antru je asi 0,05 Aig/kg.10 min pro D-Val', D-Trp⁸-somatostatin a asi 0,1 /ig/kg.1O min pro D-Ala',|D-Trp⁸-somatostatin. Ve srovnáni s tím, je tatéž hodnota pro samotný somatostatin 0,125 až 0,25 Aig/kg.10 min.

„ D-Val), D-Trp⁸-somatostain a D-Ala^, D-Trp®-somatostatin byly rovněž zkoušeny pokud se týče účinnosti na uvolňováni růstového hormonu. Použitý postup se prováděl za použití normálních samců krys Sprague-Dowley o hmotnosti ,100 až 120 g (Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana). Zkouška je modifikací metody P. Brazeau, W. Vale a R. Guilleman, Endocrinológy, 94. 184 (1974). Při zkoušce se použije celkem pěti skupin po osmi krysách pro zkoušení každé sloučeniny. Pro stimulaci sekrece růstového hormonu se všem krysám intraperitoneálně podá pentobarbital sodný. Jedna skupina slouží jako kontrolní a dostává pouze roztok soli. Zvířatům ze dvou skupin se subkutánně podá somatostatin, a to zvířatům z jedné skupiny v dávce 2/tg/zvíře a zvířatům z druhé skupiny v dávce 50/tg/zvíře.· Zvířatům ze zbývajících dvou skupin se subkutánně podá zkoušená sloučenina, a to zvířatům z jedné skupiny v dávce 10/tg/zvíře a zvířatům z druhé skupiny v dávce 0,4 jug/zvíře. Koncentrace růstového hormonu v séru se měří 20 minut po simultánním podání pentobarbitalu sodného a ' zkoušené sloučeniny. Určí se stupen inhibice koncentrace růstového hormonu v séru vzhledem ke kontrolní skupině a relativní účinnost zkoušených sloučenin vzhledem k samotnému somatostatinu.

Při dávce 0,4 JUg/zvíře a ,0 /xg/zvíře inhibuje D-Val', D-Trp®-somatostatin zvýšení sekrece růstového hormonu o 14 a o 42 % ve srovnání s kontrolní skupinou. Somatostatin nemá

202097 1.6 v dávce 2 /ig/krysu žádný účinek na zvýšení sekrece růstového hormonu, zatímco v dávce 50jug/krysu inhibuje zvýšení sekrece růstového hormonu z 56 % ve srovnání s kontrolní skupinou.

Při dávce 0,4/ug/krysua 10yug/krysu inhibuje D-Ala', D-Trp⁸-somatostatin zvýšení sekrece růstového hormonu o 54 a 91 Ií ve srovnání s kontrolní skupinou. Somatostatin v dávce 2 /íg/krysu a 50 ýig/krysu inhibuje zvýšení sekrece růstového hormonu o 40 a 87 % ve srovnání s kontrolní skupinou.

D-Val', D-Trp⁸-somatostatin a D-Ala', D-Trp⁸-somatostatin byly rovněž zkoušeny;pokud se týče jejich účinnosti in vivo, na inhibici sekrece glukagonu a insulinu po stimulaci L-Alaninem. Běžní nečistokrevní psi obojího pohlaví se nechají přes noc bez potravy. Odeberou se kontrolní vzorky krve a pak se zahájí intravenózní infúze solného roztoku, obsahujícího somatostatin nebo zkoušenou sloučeninu. Po 30 minutách se navíc intravenózně po dobu 15 minut podává L-alanin., V infúzi solného roztoku, obsahujícího somatostatin nebo zkoušenou sloučeninu, se pokračuje 15 minut po skončení podávání L-alaninové infúze. Infúze L-alaninu způsobí náhlé zvýšení koncentrace glukagonu a inzulínu v séru, která se vrátí na kontrolní koncentraci po skončení infúze í-alaninu. Tímto postupem se zjistilo, že minimální dávka D-Val', D-Trp⁸-somatostatinu pro inhibici sekrece glukagonu je 0,04 až 0,11 /ig/kg/min a pro inhibici sekrece insulinu je pod 0,004/ig/kg/min. Minimální dávka D-Ala', D-Trp⁸-somatostatinu inhibující sekreci jak glukagonu, tak insulinu, je nižší než 0,03 zig/kg/min.

Claims (5)

1. PŘEDMĚT .VYN'ÁLEZU

   1. Způsob přípravy analogů somatostatinu obecného vzorce I

   Y-Gly-L-cýs-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-cýs-OH (I), kde Y představuje D-Val nebo D-Ala, a jejich farmaceutický vhodných netoxických edičních solí s kyselinami, vyznačený tim, že se na odpovídající tetradekapeptid s přímým řetězcem obecného vzorce III

   Y-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH (III), kde Y má shora uvedený význam, působí oxidačním činidlem.
2. 2. Způsob podle bodu 1 pro přípravu sloučeniny vzoroe

   H-D-Val-Gly-L-cýs-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-cýs-OH a jejích farmaceuticky vhodných netoxických edičních solí s kyselinami, vyznačený tím, že se na odpovídající tetradekapeptid s přímým řetězcem vzorce

   H-D-Val-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH působí oxidačním činidlem.
3. 3. Způsob podle bodu 2, vyznačený tím, že se jako oxidačního činidla používá vzduchu.
4. 4. Způsob podle bodu 1 pro přípravu sloučeniny vzorce H-D-Ala-Gly-L-cýs-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-L-Cys-OH a jejích farmaceuticky vhodných netoxických adičních solí s kyselinami, vyznačený tím, že se na odpovídající tetradekapeptid s přímým řetězcem vzorce

   H-D-Ala-Gly-L-Cys-L-Lys-L-Asn-L-Phe-L-Phe-D-Trp-L-Lys-L-Thr-L-Phe-L-Thr-L-Ser-lj-Cys-OH působí oxidačním činidlem.
5. 5. Způsob podle bodu 3, vyznačený tím, že se jako oxidačního činidla používá vzduchu.