DE2811832C2

DE2811832C2 -

Info

Publication number: DE2811832C2
Application number: DE2811832A
Authority: DE
Inventors: Laurence Pierpont Lakewood N.J. Us Parmer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1978-03-17
Filing date: 1978-03-17
Publication date: 1987-12-17
Also published as: DE2811832A1

Description

Die Erfindung betrifft ein biologisch aktives Lipoidmaterial mit Blutplättchenfunktion-hemmender Wirkung, welches aus tierischer Milz durch Extraktions- und Chromatographieverfahren gewonnen wird sowie ein Verfahren zu seiner Gewinnung.

Die DE-AS 10 53 731 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung einer Substanz, welche die Bildung weißer Blutkörperchen im gesunden Knochenmark fördert. Diese Substanz wird aus tierischem Gewebe, jedoch hauptsächlich aus einer im wesentlichen fettfreien Milz ohne Anwendung chromatographischer Methoden isoliert.

Ebenfalls aus der Milz wird in einem Verfahren gemäß der US-PS 26 62 047 ein fett- und proteinfreies Glycosid isoliert, welches zur Bekämpfung allergischer Reaktionen verwendet werden soll.

Die US-PS 26 16 826 offenbart ein Extraktionsverfahren aus Tiermaterial, wie der Milz, zur Gewinnung von Substanzen, welche die Thrombozytenanzahl zu erhöhen oder zu verringern vermögen. Die Anwendung von Extrakten ist jedoch mit vielen Nachteilen behaftet, da ein Extrakt in jedem Falle ein Stoffgemisch darstellt. Zur Erzielung und Bewertung einer pharmakologischen Wirkung ist es jedoch von dringenstem Interesse, eine Reinsubstanz einzusetzen.

Der Erfindung liegt demnach die Aufgabe zugrunde, ein biologisch aktives Lipoidmaterial in reiner Form mit Blutplättchenfunktion-hemmender Wirkung und einem Verfahren zu seiner Gewinnung bereitzustellen.

Diese Aufgabe wird durch das Lipoidmaterial des Patentanspruchs 1 bzw. das Verfahren zu seiner Gewinnung gemäß Anspruch 6 gelöst.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht die Chromatographie zur selektiven Absorption mit Hilfe eines Elutionsmittels aus im folgenden mit TLC bezeichneter Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von Silicagel (Kieselgel) als Substrat. Für die TLC stellt Benzol das bevorzugte Elutionsmittel dar.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht die Chromatographie aus Siliciumdioxid-Säulenchromatographie, die im folgenden mit CC bezeichnet wird. Zur Durchführung der CC ist Benzol oder Methanol das bevorzugte Elutionsmittel.

Alternativen für Silicagel-TLC und Siliciumdioxid-CC sind die Verwendung von Sephadex LH-20, Florasil, Aluminiumoxid, Ionenaustauschern oder anderen Absorptionsmitteln und Elektrophoreseverfahren zur Fraktionierung des Extrakts durch selektive Absorption aus einem Elutionsmittel, und der verwendete Ausdruck "Chromatographie" soll alle diese Möglichkeiten umfassen.

Der R_f-Wert der durch Chromatographie Extraktfraktionen (d. h. der Wanderungsweg der Fraktion dividiert durch den Wanderungsweg des Lösungsmittels) hängt selbstverständlich von den zur Durchführung der Chromatographie verwendeten Bedingungen ab. Als Bezugsstandard gemäß der Erfindung wird, wie weiter unten noch näher erläutert, der R_f-Wert auf einer Analtech-Silicagel G. F.-Platte unter Bedingungen gemessen, bei denen als meßbarer Effekt die Farbstoffe Buttergelb, Sudanrot 6 und Indophenolblau bei Elution unter den gleichen Bedingungen R_f-Werte von 0,40, 0,17 bzw. 0,05 haben.

Das zur Extraktion der Milz verwendete polare Lösungsmittel sollte eine hohe Dielektrizitätskonstante von beispielsweise über 20 haben und vorzugsweise wird Aceton verwendet.

Verschiedene Fraktionen, die aus dem Extrakt durch Chromatographie gewonnen werden, besitzen die Eigenschaft, die Zahl der Blutplättchen zu vermindern, und die folgenden vier erfindungsgemäßen Fraktionen können durch ihren R_f-Wert und ihr Infrarot-Absorptionsspektrum definiert und identifiziert werden:

(1) Eine Fraktion mit einem R_f-Wert von 0,66 und einem Infrarot- Absorptionsspektrum, das einen Peak bei mindestens einer der folgenden Wellenzahlen, ausgedrückt in cm^-1, zeigt: 3560, 3150, 2900, 2860, 2800, 2300, 1580, 1460, 1440, 1360, 1340, 1300, 1230, 1210, 1140, 1010 und 845.
(2) Eine Fraktion mit einem R_f-Wert von 0,37 und einem Infrarot-Absorptionsspektrum, das einen Peak bei mindestens einer der folgenden Wellenzahlen, ausgedrückt in cm¹, zeigt: 2960, 2900, 2870, 2800, 1730, 1450, 1365, 1230, 1145, 1105 und 1090.
(3) Eine Fraktion mit einem R_f-Wert von 0,28 und einem Infrarot- Absorptionsspektrum, das einen Peak bei mindestens einer der folgenden Wellenzahlen, ausgedrückt in cm^-1, zeigt: 3300, 2900, 2860, 2800, 2270, 1720, 1710, 1570, 1420 und 1360 und
(4) eine Fraktion mit einem R_f-Wert von 0 und einem Infrarot- Absorptionsspektrum, das einen Peak bei mindestens einer der folgenden Wellenzahlen, ausgedrückt in cm^-1, zeigt: 3250, 2850, 2780, 2270, 1705, 1435, 1355, 1220, 1140, 1030 und 790.

Jede dieser Fraktionen ist ein Lipoidmaterial, das aus tierischer Milz gewonnen ist und einen Schmelzpunkt von nicht über 70°C aufweist, und das durch Aceton, Benzol und Äther extrahierbar und in diesen Lösungsmitteln löslich ist.

Die Fähigkeit dieser Fraktionen, die Blutplättchenzahl zu verringern wird an Versuchstieren wie Meerschweinchen, Kaninchen und Hunden gezeigt. Die Größe und Dauer der Verringerung hängt vom verwendeten Material, der verabreichten Dosis und der Art des eingesetzten Versuchstiers ab. In Kaninchen und Meerschweinchen werden Abnahmen, die 20 bis 50% der Grundwertzahl ausmachen und von einigen Stunden bis zu zwei Wochen dauern, beobachtet. Bei Hunden werden Änderungen von 20 bis 50% bei Verabreichung vergleichsweise kleiner Dosen an diesen Fraktionen gefunden.

Die Fähigkeit dieser Fraktionen, die Blutplättchenfunktion zu hemmen, wird nachgewiesen durch erhöhte Blutungszeiten von damit behandelten Mäusen, durch Hemmung der mit ADP ausgelösten Blutplättchenaggregation (Thrombagglutination) in vivo und in vitro, und durch die Fähigkeit zur Verhütung von experimentell ausgelöster Thrombose in Kaninchen. Ein weiteres Beispiel für die Hemmung der Blutplättchenfunktion ergab sich aus dem Befund, daß diese Extrakte befähigt sind, Mäuse gegen Dissemination- Intravaskulär-Koagulation (DIC) zu schützen, die durch Injektion letaler Dosen von bakteriellen Endotoxinen hervorgerufen ist. Von Mäusen, die mit den erfindungsgemäßen Extrakten geschützt waren, überlebten 68%, wohingegen ungeschützte Mäuse eine Überlebensrate von nur 20% hatten.

Zur Bestimmung der Blutungszeit wurde eine Mäuse-Mesenterialvene durchstochen und die Zeit bis zum Aufhören der Blutung gemessen. In behandelten Mäusen stiegen die Blutungszeiten beträchtlich auf 250+% an im Vergleich zu mit physiologischer Kochsalzlösung injizierten Vergleichstieren.

Zur Durchführung der die experimentell herbeigeführte Thrombose betreffenden Versuche wurde ein Plastikschlauch in die Großgefäße der Tiere zur Simulierung eines durch atherosklerotische Schäden verursachten Leidens eingesetzt, der zum Ausgangspunkt für Thrombusbildung wurde. Die mit dem erfindungsgemäßen Material behandelten Versuchstiere überlebten dieses Experiment, während alle ungeschützten Tiere starke Thrombose erlitten.

Die Versuche zur Bestimmung der durch ADP induzierten Blutplättchenaggregation zeigten den Hemmeffekt der erfindungsgemäßen Materialien in vitro und in vivo. Bei Verabreichung der Materialien an Hunde oder Kaninchen erfolgte eine Hemmung der Aggregation bis zu 50% der Grundwerte. Bei Zugabe der Materialien zu Blutplättchen-reichem Blutplasma von Menschen oder Hunden wurde eine Hemmung von bis zu 40+% erzielt ohne zuvorige Inkubation der Materialien mit den Zellen.

Es sind zahlreiche Mechanismen für die Hemmung der Blutplättchenfunktion denkbar. Erstens können die erfindungsgemäßen Materialien selbst eine Verbindung mit der Blutplättchenmembran eingehen und dadurch die reaktiven Zentren blockieren, so daß keine Aktivierung der Blutplättchen erfolgen kann. Zweitens nimmt die Blutplättchenaggregation ab mit abnehmbarer Blutplättchenzahl und da der letztgenannte Effekt durch das erfindungsgemäße Material in vivo bewirkt wird, werden weniger ADP und Fibrinogen (von den Blutplättchen) freigesetzt zur Förderung einer weiteren Aggregation. Drittens können aufgrund der Tatsache, daß weniger für die Gerinnung erforderliches Fibrinogen zur Verfügung steht, Blutplättchenaggregate nicht gebildet oder stabilisiert werden aufgrund der Unfähigkeit des Aggregats, ein Fibrinvernetzungsgeflecht zu bilden, wobei bekannt ist, daß die Blutplättchenaggregation direkt proportional der Menge an vorhandenem Fibrinogen ist. Viertens kann aufgrund der Tatsache, daß das erfindungsgemäße Material eine Aufnahme von 51 Cr-markierten Blutplättchen in der Milz, Lunge und Leber, d. h. in Organen, die reich an retikuloendothelialem Gewebe sind, erzeugt, der Effekt auch hervorgerufen sein durch eine stimulierende Wirkung auf das retikuloendotheliale System. Schließlich sind auch zahlreiche andere Mechanismen möglich, z. B. die Entfernung anderer Faktoren, welche für die Koagulation oder Blutplättchenfunktion erforderlich sind.

Bei Verabreichung des erfindungsgemäßen Materials an Hunde wurde gefunden, daß die Menge an gerinnbarem Fibrinogen im Plasma abnimmt. Die Größe dieser Abnahme kann jedoch nicht immer in Beziehung gebracht werden zur Änderung der Blutplättchenzahl. Es wurden Abnahmen von 20 bis 60% der Grundwerte beobachtet, ohne daß Fibrinspaltprodukte gefunden wurden. Dies könnte dafür sprechen, daß entweder das Fibrinogen in solcher Weise komplexgebunden ist, daß es in den Blutgerinnungsvorgang nicht eingreifen kann, oder daß es durch irgend ein Organ gebunden ist. Eine derartige Abnahme an gerinnbarem Fibrinogen kann teilweise die Verlängerung von Blutungszeiten, die Hemmung von ADP-induzierter Aggregation und die Verhinderung von experimenteller Thrombose erklären.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1: Herstellung von Milzextrakt

Sieben Rindermilzen mit einem Gesamtgewicht von etwa 6 kg wurden frisch geschlachteten Tieren entnommen und sofort in 15 l Aceton, also einem flüssigen Lösungsmittel mit hoher Dielektrizitätskonstante von mindestens 20, bei Raumtemperatur eingetaucht. In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, daß nicht nur die Milz von Rindern, sondern auch Hundemilz und Milz anderer Tierarten verwendbar ist. Die Milzen wurden aus dem Aceton entnommen, geschnitzelt und zu feinen Partikeln vermahlen. Die vermahlenen Milzpartikel wurden sodann in das bereits verwendete Aceton zurückgegeben, verrührt und etwa 4 Tage lang stehen gelassen, damit die Extraktion erfolgen konnte. Es zeigte sich, daß die Zeit des Stehenlassens von etwa 2 bis 30 Tage reichen kann.

Vorzugsweise 3 l Aceton wurden auf einmal entfernt und filtriert und das Lösungsmittel wurde mit Hilfe eines üblichen bekannten Buchler-Rotationsverdampfers entfernt. Während der Entfernung des Lösungsmittels wurde an das System ein Vakuum angelegt und die Temperatur des Extrakts wurde zwischen 40 und 50°C, vorzugsweise bei 45°C, gehalten. Sobald eine feuchte Paste zurückgeblieben war, wurden 2 l Benzol zugesetzt und der gesamte Gefäßinhalt wurde etwa 30 Minuten lang gerührt. Das Material wurde gefiltert und das benzollösliche Filtrat wurde konzentriert, indem das Benzol unter der Einwirkung eines Abzugs verdampfen gelassen wurde. Es zeigte sich, daß Äther, Chloroform, Dichlormethan und andere Lösungsmittel ebenfalls verwendbar waren. Danach wurde eine Silicagel-Dünnschichtchromatographie (TLC) oder eine Siliciumdioxid-Säulenchromatographie (CC) durchgeführt, um das erhaltene Gemisch weiter zu reinigen.

Beispiel 2: Dünnschichtchromatographie

In einer für Dünnschichtchromatographie typischen Weise wurde das benzollösliche Material auf eine mit Silicagel F-254 versehene handelsübliche Platte mit Glasrückseite von 20 × 20 cm (Brinkman silplate) mit einer Absorptionsmittelschichtdicke von 250 oder 500 Mikron aufgestrichen ohne die Platte durch Hitze zu aktivieren. Erforderlichenfalls wurde zusätzliches Benzol verwendet, um das gesamte Material zu lösen. Nach wiederholter Aufbringung des Materials auf die Siliciumdioxidschicht wurde das Lösungsmittel in üblicher bekannter Weise verdampft un die Platte in eine handelsübliche Brinkman- Entwicklungsküvette eingebracht, die Sättigungskissen und Benzol als Elutionsmittel enthielt. Das Lösungsmittel wurde mindestens 7 cm wandern gelassen, bevor die Platte aus dem Tank entnommen wurde, und das Lösungsmittel wurde sodann von der Platte verdampft. Danach wurde die Platte mit dem darauf befindlichen erfindungsgemäßen Material gewöhnlichem Licht und einer Ultraviolettlampe mit einer Wellenlänge von 254 µm exponiert, um das Material in Form der vom Auftragungspunkt der Platte ausgehenden Fraktionen zu beobachten. Die gefundenen Fraktionen werden im folgenden mit TLC 1, TLC 2 und TLC 3 bezeichnet. Wenn die Platte gegen das Licht gehalten wurde, wurde zunächst ein großer opaker Bereich beobachtet sowie ein bräunliches Material, das an der Auftragungsstelle sitzen geblieben war. In der Regel wurden für die Fraktionen die folgenden R_f-Werte (Wanderungsweg der Fraktion dividiert durch Wanderungsweg des Lösungsmittels) freigestellt:

die UV-sichtbare Fraktion TLC 1 von 0,72 bis 0,53,
die opake Fraktion TLC 2 von 0,53 bis 0,33 und
die aus bräunlichem Material bestehende Fraktion TLC 3 blieb auf der Auftragstelle sitzen.

Der weite Bereich der R_f-Werte ist vermutlich auf die unregelmäßige Ausgestaltung der Banden und auf die vergleichsweise große Menge an Material, die auf die Platte aufgebracht wurde, zurückzuführen.

Unter den angegeben Bedingungen hatten die Farbstoffe Buttergelb, Sudanrot 6 und Indophenolblau R_f-Werte von 0,40, 0,17 bzw. 0,05. Wurden geringere Mengen an Rohextrakt auf die Dünnschichtplatte aufgetragen, so waren die R_f-Werte der einzelnen Fraktionen wie folgt: TLC 1 etwa 0,6; TLC 2 etwa 0,4 bis 0,2 (der Einfachheit halber wurde als TLC 2 das Material mit R_f-Werten zwischen denjenigen der Farbstoffe Buttergelb und Sudanrot 6 bezeichnet, wobei diese Fraktion zwei Hauptkomponenten, nämlich eine schneller wandernde Komponente TLC 2A und eine langsamer wandernde Komponente TLC 2B, hat) und TLC 3 war die auf der Auftragstelle sitzen bleibende Fraktion.

Die gewünschten Fraktionen wurden sodann von der Glasrückseite abgekratzt und das sie absorbierende Siliciumdioxid wurde mit Benzol extrahiert. Die Fraktionen wurden sodann etwa 5 Minuten lang bei etwa 2500 UpM zentrifugiert zur Entfernung des Siliciumdioxids. Das Benzol wurde abdekantiert und danach mit Aceton versetzt und etwa 5 Minuten lang gerührt. Schließlich wurde das Material erneut zentrifugiert und das Aceton abdekantiert. Die erhaltenen Benzol- und Acetonanteile wurden kombiniert und schließlich in einem Luft- oder Stickstoffstrom entfernt, wobei ein Feststoff mit niedrigem Schmelzpunkt (F < 70°C) oder ein Öl zurückblieb. Die getrockneten Fraktionen TLC 1, 2 und 3 wurden sodann in einer Tiefkühleinrichtung bei einer Temperatur von etwa -20°C oder darunter aufbewahrt. Nach erneuter Chromatographie unter identischen Bedingungen ergaben die aktiven Fraktionen TLC 1, TLC 2 und TLC 3 die Flecken mit den R_f-Werten, unter denen sie isoliert worden waren, plus zusätzliche Flecken mit verschiedenen R_f-Werten (J₂-Sichtbarmachung).

Beispiel 3: Säulenchromatographie

In einer für Glassäulenchromatographie typischen Weise wurden 60 g Mallinckrodt-Kieselsäure (2847) in Petroläther suspendiert und die Aufschlämmung wurde in eine Glaschromatographensäule (2,75 × 40 cm), die mit einer Glasfrittenscheibe versehen war, geschüttet. Die fertig gepackte Säule hatte eine Höhe von 24,5 cm. Der gemäß Beispiel 1 hergestellte Benzolextrakt wurde in Benzol gelöst und auf die Säule aufgebracht und nach erfolgter Adsorption wurde mit Benzol eluiert. Das opake Material konnte beobachtet werden, wie es in der Säule nach unten wandert und es wurde gesammelt und als Fraktion CC 1 bezeichnet. Als nächstes wurde eine gelbliche Bande in der Säule beobachtet, die gesammelt und mit Fraktion CC 2 bezeichnet wurde. Der folgende Anteil der Lösung in der Säule wurde gesammelt, bis ein bräunlicher teerartiger Anteil zurückblieb, und der auf die Fraktion CC 2 folgende Anteil wurde mit Fraktion CC 3 bezeichnet und die bräunliche teerartige Lösung wurde mit CC 4 bezeichnet. Als Elutionsmittel für CC 3 und CC 4 wurde Methanol verwendet. Die Lösungsmittel wurden aus den angegebenen eluierten Fraktionen abgedampft unter einem Stickstoffstrom und die erhaltenen Fraktionen CC 1 bis CC 4 wurden in einer Gefriereinrichtung aufbewahrt. Gewünschtenfalls konnten die eluierten Fraktionen gereinigt werden, indem sie in ähnlicher Weise wie oben beschrieben chromatographiert wurden.

Beispiel 4

Die von zwei weiblichen Hunden gewonnene Milz mit einem Gesamtgewicht von 170 g wurde klein geschnitten und mit 850 ml (5 Volumteilen) Aceton vermahlen. Das erhaltene Gemisch wurde in einen 5 l-Kolben eingebracht, worauf der Kolben auf einem Dampfbad 30 Minuten lang unter Rückfluß erhitzt wurde. Das Material wurde heiß filtriert bei einer Temperatur von etwa 57°C, das Aceton wurde verdampft und das erhaltene Material wurde in einer Gefriereinrichtung des oben beschriebenen Typs aufbewahrt. Nach Entfernung des Acetons wurden die benzollöslichen Fraktionen in der oben beschriebenen Weise erhalten. Eine weitere Reinigung wurde erzielt durch Dünnschichtchromatographie, die in der oben beschriebenen Weise durchgeführt wurde. Es verdient hervorgehoben zu werden, daß bei allmählicher Verlängerung des Rückflußerhitzens eine geringere Ausbeute an aktiven Materialien erhalten wurde.

Beispiel 5

Das in Beispiel 4 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, jedoch mit der Ausnahme, daß das Erhitzen unter Rückfluß weggelassen und stattdessen das Gemisch 18 Stunden lang bei 45°C stehen gelassen wurde. Dabei wurden Fraktionen ähnlichen Typs erzielt, wie sie in Beispiel 4 erhalten worden waren.

Beispiel 6

Es wurde eine ähnliche Verfahrensweise wie in den Beispielen 4 und 5 angewandt, jedoch mit der Ausnahme, daß das Acetonfiltrat einer Chromatographiebehandlung ausgesetzt wurde. Zur Isolierung der gewünschten Materialien von dem Siliciumdioxid wurde Aceton verwendet. Gewünschtenfalls wurde eine fraktionierte Kristallisation dieser Acetonlösung durchgeführt mit dem löslicheren Material, das in der Regel eine höhere biologische Aktivität besitzt.

Beispiel 7

Es wurde eine ähnliche Verfahrensweise angewandt wie in Beispiel 6, jedoch mit der Ausnahme, daß dem Hund eine letale Dosis von E. Coli-Endotoxin verabreicht wurde, und 3 Stunden später wurde der Hund getötet und dessen Milz wie in Beispiel 6 beschrieben behandelt. Es zeigte sich, daß die dabei isolierten Fraktionen zumindest genauso aktiv waren wie die oben beschriebenen, was weiter unten noch näher erläutert werden wird.

Untersuchung der isolierten Fraktionen

Jede der isolierten Fraktionen, d. h. TLC 1 bis TLC 3 und CC 1 bis CC 4, die gemäß den Beispielen 2 bzw. 3 gewonnen worden waren, wurden gewogen, in Äther gelöst, filtriert und in Injektionsflaschen, die sterile physiologische Kochsalzlösung enthielten, gegeben unter Bildung einer Suspension. Der Äther wurde unter Vakuum entfernt und die erhaltenen Suspensionen wurden den Versuchstieren verabreicht. Die Applikation der Suspensionen kann subcutan, intramuskulär, intraperitoneal, oral oder intravenös erfolgen; falls nichts anderes angegeben ist, wurden die Injektionen subcutan verabreicht.

Die für die Untersuchung der Wirkung der suspendierten Fraktionen auf die Blutplättchenzahl herangezogenen Versuchstiere waren Kaninchen (6 kg) und Meerschweinchen (1 kg). Diese Tiere wurden mindestens zweimal wöchentlich über einen Zeitraum von mindestens 30 Tagen untersucht, bevor die Verabreichung der zu testenden Fraktionen erfolgte, um deren normale Blutplättchenzahl (große und kleine Blutplättchen), die Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen (TWC) und die Differentialzahl der weißen Blutkörperchen (DWC) zu bestimmen. Die angewandten Bestimmungsmethoden waren die Unoppette-Methode für die Blutplättchenzahl, Wrights′-Anfärbung für die Differenzzahl und ein Coulter-Zähler (Coulter Counter) für die Gesamt-Leukozytenzahl. Es wurden keine wesentlichen Abweichungen weder für die TWC noch für die DWC vor dem Test beobachtet.

Blut wurde aus der Marginal-Ohrvene jedes Versuchstiers vor der Injektion entnommen und mehrmals täglich nach der Injektion über einen Zeitraum von 2 Wochen. Typische Effekte der injizierten Fraktionen auf die Blutplättchenzahl sind in den Fig. 1 bis 5 wiedergegeben. Die Grundwerte differierten um nicht mehr als ± 50 000 Blutplättchen/ml von dem Wert bei der Zeit 0 in den wiedergegebenen Figuren.

Aus Fig. 1 ist ersichtlich, daß alle Fraktionen einen Blutplättchen- reduzierenden (thrombozytopenischen) Effekt bei Kaninchen hatten. Die Größe der Änderungen stellt einen Durchschnittswert bei der Injektion von etwa 20 mg der durch Dünnschichtchromatographie isolierten aktiven Fraktionen dar.

Die Fig. 2 zeigt die Änderung des Effekts bei Änderung der Menge an TLC 2, die weiblichen Kaninchen von gleichem Körpergewicht injiziert wurden. Wie ersichtlich, verursacht die größte Dosis die größte Abnahme an Bluttplättchen nach 5 Stunden, wobei jedoch nach 24 Stunden die prozentuelle Änderung in allen Fällen ähnlich ist. Die Kurven zeigen ferner, daß der thrombozytopenische Effekt 48 Stunden dauerte.

Die Fig. 3 gibt den Effekt verschiedener Dosen von TLC 2 in Meerschweinchen wieder. Wie ersichtlich dauerte der thrombozytopenische Effekt 72 Stunden.

Fig. 4 zeigt die graphische Auswertung der Ergebnisse von Versuchen, in denen die aus Hundemilz isolierte TLC 2-Fraktion in gleicher Dosierung an zwei Kaninchen verabreicht wurde. Wie ersichtlich, stieg die Blutplättchenzahl in einem Kaninchen an vom 5-Stunden- auf den 24-Stunden-Wert und nahm sodann ab vom 24-Stunden- auf den 48-Stunden-Wert. Es handelt sich hierbei um einen seltenen Befund, der jedoch erkennen läßt, daß die biologische Individualität der Säugetierart einen starken Einfluß auf die Größe des Effekts hat.

Fig. 5 zeigt die Ergebnisse mit verschiedenen Fraktionen, die durch Säulenchromatographie isoliert wurden. Die Größe des Effekts ist ausgeprägter, da 100 mg des biologisch aktiven Materials jedem Kaninchen injiziert wurden, während den Versuchstieren, von denen die erhaltenen Ergebnisse in den Fig. 1 bis 4 wiedergegeben sind, geringere Dosierungen verabreicht wurden. Es wurde gefunden, daß die Injektion von physiologischer Kochsalzlösung keinen Einfluß auf die Blutplättchenzahl hatte und nur sehr wenige isolierte Fraktionen erhöhten die Blutplättchenzahl.

In der Regel zeigte sich, daß zahlreiche Fraktionen, wenn sie frisch hergestellt und den Versuchstieren verabreicht wurden, zu einer Erniedrigung der Blutplättchenzahl führten. Wird ferner eine chromatographierte Fraktion etwa 3 Wochen lang aufbewahrt, so zersetzt sie sich und verliert ihre Aktivität. Bei Injektion einer zersetzten Fraktion an Kaninchen und Hunde zeigte sich, daß die Blutplättchenzahl erhöht wurde. Dies trifft insbesondere für die Fraktionen TLC 1, TLC 2, CC 1, CC 2 und CC 3 zu. Die Fraktionen CC 4 und TLC 3 scheinen ihre Wirkung bei der Lagerung entweder langsamer zu verlieren oder sie erhöhen die Blutplättchenzahl.

Es besteht die Möglichkeit, daß die aktive Komponente in sämtlichen biologisch aktiven Fraktionen vorliegt, obwohl die Matrix aus inerten Materialien verschieden sein kann. Es könnte auch sein, daß die Effekte der aktiven Fraktionen ähnlich, in ihrer Wirkung jedoch nicht identisch sind.

Es verdient besonders hervorgehoben zu werden, daß die eingesetzten Versuchstiere eine ausgezeichnete Gesundheit hatten und daß ausgeprägte Effekte gefunden wurden. Vermutlich wird die Injektion dieser Fraktionen an Patienten mit hohem Thromboserisiko zu noch tiefgreifenderen Änderungen in bezug auf Hämatologie, Blutplättchenfunktion und Koagulationswerte führen.

Blutungszeiten (BT)

Die Bestimmung der Blutungszeit ist bekanntlich ein grundlegender Test für die Blutplättchenfunktion und hier und im folgenden stellt die Blutungszeit eine Funktion der Qualität der Blutplättchen und bis zu einem geringeren Grad auch von deren Quantität dar. Zur Bestimmung der Blutungszeit wurde die von R. G. Herrmann, J. D. Frank und D. L. Marlett in Proc. Soc. Expl. Biol. Med. 128, 960 (1968) beschriebene Maus-Mesenterialmethode angewandt. Jede Blutungszeitbestimmung wurde an mindestens 5 Mäusen vorgenommen. Wie die weiter unten angegebene Tabelle I zeigt, wird ein Anstieg der Blutungszeit 3 Stunden nach intraperitonealer Injektion gefunden und die Blutungszeit blieb 24 Stunden lang nach Verabreichung des biologisch aktiven Materials erhöht und eine verlängerte BT wurde sogar 48 Stunden nach Verabreichung noch gefunden. In der Regel weniger als 0,2 mg des biologisch aktiven Materials bei Injektion in 20 g-Mäuse eine beträchtliche BT-Erhöhung innerhalb von 24 Stunden nach der Verabreichung. Aus der durch die injizierten Fraktionen bewirkten Erhöhung der Blutungszeit kann andererseits geschlossen werden, daß ein geringerer Grad der Aggregation von Blutplättchen und dementsprechend eine Abnahme des Risikos der Bildung eines Blutgerinsels erfolgt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

Tabelle I

Zusätzlich zur Erhöhung der Blutungszeit wurde ferner gefunden, daß beim Durchstechen der Venen der mit den biologisch aktiven Materialien behandelten Mäuse das Blut aus der Wunde hervorsprudelte, während in den unbehandelten, mit physiologischer Kochsalzlösung injizierten Vergleichstieren das Blut beim Durchstechen der Vene nur "heraussickerte".

Die Menge an aktiven Fraktionen, die verabreicht wird, soll einen tiefgreifenden Effekt auf die BT haben. Die optimalen Dosierungen liegen in der Regel zwischen 3 und 16 mg/kg Körpergewicht.

Andere Dosierungen können gegebenenfalls zu keiner Änderung in der BT führen oder sogar deren Erniedrigung zur Folge haben, wenn sehr große Mengen verabreicht werden.

In einigen Fällen zeigte sich, daß Fraktionen, die keinen merklichen Einfluß auf die Erniedrigung der Blutplättchenzahl in Kaninchen oder Meerschweinchen hatten, trotzdem die Fähigkeit besaßen, die Blutungszeiten zu erhöhen. Dies ist vermutlich zurückzuführen auf entweder (a) eine qualitative Änderung des Blutplättchens oder seiner Funktion, oder (b) auf eine Abnahme der effektiven Fibrinogenmenge, die wirksam ist zur Verhinderung der Blutplättchenaggregation und Bildung eines Gerinnsels, oder (c) auf beide Gegebenheiten.

ADP-induzierte Blutplättchenaggregation

Die am weitesten verbreitete Technik für die Untersuchung antithrombotischer Mittel ist in der Regel die Bestimmung der ADP-induzierten Blutplättchenaggregation. Menschliches PRP (Blutplättchen-reiches Plasma) von zu Koronarbeschwerden neigenden Individuen sowie von krebskranken Patienten wurde in vitro mit den erfindungsgemäßen Extrakten getestet, um die prozentuelle Abnahme an Blutplättchenaggregation im Vergleich zu der Wirkung von physiologischer Kochsalzlösung zu messen. Die Extrakte wurden wie oben beschrieben hergestellt und in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert, worauf zentrifugiert und die erhaltene Lösung dem an Blutplättchen reichen Plasma zugesetzt wurde. Es wurden 0,1 ml Kochsalzlösung (Vergleichsversuche) oder Extrakt in Kochsalzlösung, 0,3 ml PRP und 0,04 ml (20 µg/ml) ADP eingesetzt. Die Aggregation wurde 2 oder 3 Minuten lang mit einer handelsüblichen Meßvorrichtung (Chrono-Log Platelet Aggregometer) verfolgt. Gewünschtenfalls können aus diesen Extraktlösungen verschiedene Verdünnungen mit Kochsalzlösung hergestellt werden. Die erhaltenen Ergebnisse waren wie folgt:

Der Grund für die Verwendung von PRP von zu Koronarkrankheiten neigenden Individuen und von Krebspatienten bei der Untersuchung der erfindungsgemäßen Extrakte ist darin zu sehen, daß für die Blutplättchen dieser Personengruppen eine sehr viel höhere Empfindlichkeit gegenüber ADP im besonderen und Aggregation im allgemeinen gefunden wird im Vergleich zu den Blutplättchen aus Individuen, die weniger zu Koronaraffekten neigen und frei von Krebs sind.

Es muß erneut betont werden, daß die Hemmung der ADP-induzierten Aggregation durch diese Extrakte eine Funktion des den betreffenden Individuen entnommenen PRP und der Konzentration an "aktivem" Material in dem Extrakt ist. Verbleibt der Extrakt in Kochsalzlösung, so nimmt dessen Fähigkeit zur Aggregationshemmung mit der Zeit ab und nach einigen Tagen bewirkt ein solcher Extrakt eine größere prozentuelle Aggregation als die Kochsalz-Vergleichsproben. Diese experimentellen Befunde bestätigen die labile Natur der in den Fraktionen vorliegenden aktiven Materialien.

In vivo-Aggregationsversuche

Zu Vergleichszwecken wurde einem Hund Blut abgenommen und zu jeweils 9 ml Blut wurde 1 ml 3,8%ige Natriumcitratlösung zugegeben, um auf diese Weise ein Vergleichs-PRP zu erhalten. Pro kg Körpergewicht wurden dem Hunde jeweils 2 mg der Fraktionen TLC 1 und TLC 2 injiziert und nach 2 bis 3 Stunden wurde erneut Blut abgenommen und PRP in gleicher Weise wie oben angegeben hergestellt. Es zeigte sich, daß die ADP-induzierte Aggregation um etwa 50% gehemmt wurde (Blutplättchenzahl 122 000/ml) bezogen auf das Vergleichs-PRP (Blutplättchenzahl 325 000/ml). Aufgrund wiederholter Versuche wurde festgestellt, daß die Hemmung der Aggregation nicht notwendigerweise proportional der Abnahme der Blutplättchenzahl ist.

Thrombosetests

Es wurden Thrombosetests durchgeführt zur weiteren Untersuchung des Effekts der isolierten Fraktionen auf Blutplättchen. Weibliche Kaninchen wurden geschützt durch Injektion einer Blutplättchen-reduzierenden erfindungsgemäßen Fraktion (im folgenden als Gruppe A bezeichnet) und eine gleiche Zahl ungeschützter weiblicher Kaninchen diente als Vergleichsversuch (im folgenden als Gruppe B bezeichnet).

Zunächst wurden 10 ml physiologische Kochsalzlösung in eine unter Vakuum gehaltene 30 ml-Flasche eingebracht und für jede zu testende Fraktion wurde eine Flasche vorbereitet. Jede mit Kochsalzlösung versehene Flasche wurde sterilisiert, worauf jede der Fraktionen TLC 1, TLC 2 und TLC 3 (etwa 10 mg/kg) in Äther gelöst und danach in eine der vorbereiteten Flaschen eingebracht wurde. Jede Flasche wurde geschüttelt und der Äther wurde aus der Lösung unter Vakuum abgedampft.

Jedem Kaninchen der Gruppe A wurden 10 ml des aktiven Materials intramuskulär injiziert, während jedem Vergleichstier der Gruppe B 10 ml einer nur aus Kochsalzlösung bestehenden Lösung intramuskulär injiziert wurden. Es fielen somit 3 Gruppen A und 3 Gruppen B an, da der Test für jede Gruppe A und B die Verwendung von TLC 1, TLC 2 bzw. TLC 3 umfaßte. Nach 24 Stunden wurde jedes Kaninchen der Gruppe A und B operiert, wobei ein 2 bis 3 cm langer Polyäthylenschlauch in die Abdominalaorta von 2 Kaninchen der Gruppe A und 2 Kaninchen der Gruppe B eingeführt wurde, und ein 2 bis 3 cm langer ähnlicher Schlauch wurde in die untere Hohlvene der anderen beiden Kaninchen der Gruppe A bzw. B eingeführt.

Jede der angegebenen Operationen wurde nach der Freidman- Methode durchgeführt.

35 Stunden nach der Operation waren alle ungeschützten Kaninchen der Gruppe B tot, wohingegen alle geschützten Kaninchen der Gruppe A lebten und normal waren. Eine Untersuchung der Kaninchen der Gruppe B ergab, daß eine intravaskuläre Thrombose in jedem Kaninchen erzeugt worden war und die Thromben erstreckten sich innerhalb des Schlauchs und standen in axialer Richtung etwa 2 cm an jedem Ende hervor.

Nach 3 Tagen wurden die geschützten Kaninchen der Gruppe A getötet. Bei einer Untersuchung dieser Kaninchen wurden keine Anzeichen für irgend einen Thrombus, ein Gerinnsel oder eine Koagulation von Blut in irgend einem Teil des Gefäßsystems gefunden. Daraus konnte geschlossen werden, daß die Verabreichung der Blutplättchen- reduzierenden Fraktionen in den drei Tests die Blutplättchen in gewünschter Weise steuerte unter Verhinderung einer intravaskulären Thrombose, die normalerweise hätte auftreten müssen aufgrund der Einführung einer Fremdsubstanz, nämlich des Polyäthylenschlauches, in das Gefäßsystem.

Wirkung der biologisch aktiven Fraktionen auf die Koagulation

Es gibt bekanntlich verschiedene Stufen der klinischen Parameter zur Messung der Koagulation, z. B. die Aktivierungspartial-Thromboplastinzeit (APTT), die Prothrombinzeit (PT), die Thrombinzeit (TT), bei der sich Fibrin bildet, und die Konzentration an gerinnbarem Fibrinogen. Es wurden entsprechende Tests unter Verwendung der erfindungsgemäßen Fraktionen mit menschlichem und tierischem Plasma durchgeführt.

Zu menschlichem Plasma wurden in vitro die Fraktionen TLC 2 und TLC 3 in solchen Mengen zugegeben, daß die Endkonzentration im Plasma 0,05 mg/ml betrug. Es wurde gefunden, daß die APTT um 15 bzw. 5% erhöht wurde gegenüber einer mit Kochsalzlösung und menschlichem Plasma durchgeführten Vergleichsprobe, während das Fibrinogen durch beide Fraktionen merklich vermindert wurde um bis zu 30%.

Bei intraperitonealer Injektion von 30 mg TLC 2 an weibliche Hunde mit etwa 15 kg Körpergewicht traten beträchtliche Änderungen im Koagulationsverhalten des Plasmas auf, wie aus Fig. 6 ersichtlich ist. Nach 3 Stunden trat eine 15%ige Erhöhung der TT ein und es erfolgte eine 30%ige Verminderung der Konzentration an gerinnbarem Fibrinogen. Ähnliche Ergebnisse wurden mit anderen Hunden erhalten mit Ausnahme des Zeitpunkts, an dem die Blutplättchenzahl und die Fibrinogenkonzentration abnahmen und die TT zunahm. Wie aus Fig. 7 ersichtlich, zeigten einige Hunde eine 80%ige Abnahme der Fibrinogenkonzentration und eine 40%ige Zunahme der TT 30 Minuten nach intraperiotnealer Injektion des erfindungsgemäßen Materials.

Fig. 8 zeigt die graphische Auswertung von Versuchsergebnissen, die innerhalb von 1 Stunde ab intravenöser Injektion von 20 mg TLC 3 in einen weiblichen Hund von 15 kg Körpergewicht erzielt wurden. Es trat eine wesentliche Hemmung der ADP-induzierten Blutplättchenaggregation (60%) ein, die 4 Stunden lang während der weiteren Versuchsdurchführung anhielt. Es zeigt sich ferner, daß die Abnahme der Blutplättchenzahl und die Hemmung der ADP-induzierten Blutplättchenaggregation offensichtlich parallel zueinander verlaufen.

Zwei männlichen Hunden von jeweils etwa 15 kg Körpergewicht wurden 30 mg TLC 3 durch intrapertitoneale Injektion verabreicht. Blut wurde den Hunden kurz vor der Injektion und 24 Stunden nach der Injektion entnommen. Die gefundenen Werte für Blutplättchenzahl, Hämatokrit, Thrombinzeit, Fibrinogen und prozentuelle ADP-Aggregation sind in der folgenden Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II

Die Ergebnisse zeigen, daß die Ansprechbarkeit von Tier zu Tier sehr beträchtlich variiert. Es ist jedoch festzustellen, daß in jedem Falle das PRP der Tiere gegenüber ADP eine Hemmung um minestens 30% 24 Stunden nach Verabreichung zeigte. Der Hund II zeigte eine sehr viel größere Änderung der Blutplättchenzahl und Thrombinzeit als Hund I. Es ist interessant, festzustellen, daß trotz der Tatsache, daß in Hund I die Blutplättchenzahl und die ADP-induzierte Blutplättchenaggregation abnahm, die Konzentration an Plasmafibrinogen anstieg.

Fig. 9 zeigt die Änderungen in bezug auf vier Parameter, die für die quantitative Blutkoagulation herangezogen werden. Innerhalb von 3 Stunden nach i. v.-Injektion von 2 mg/kg TLC 2 in 18 Bastardhunde trat das Erscheinungsbild eines hypokoagulierbaren Zustands auf. Die ADP-induzierte Blutplättchenaggregation war um 75% in bezug auf die Vergleichswerte gehemmt und eine ähnliche Verminderung erfolgte in bezug auf Blutplättchenzahl. Nach anfänglichem Anstieg der Fibrinogenkonzentration fiel diese Konzentration nach 3 Stunden auf einen unterhalb des Vergleichswerts liegenden Wert ab. Die Thrombinzeiten erhöhten sich nach Verabreichung des Extrakts. Nach 24 Stunden befanden sich die Tiere noch immer in einem hypokoagulierbaren Zustand.

Bakterientests

Die Verabreichung von Bakterienendotoxinen an Tiere zur Erzeugung einer intravaskulären Koagulation als eine ihrer Erscheinungsformen stellt eine bekannte Methode dar. Wenn daher Dissemination- Intravaskulär-Koagulation (DIC) verhindert oder vermindert werden kann, erhöht sich die Überlebenschance der Tiere. Es wurde eine letale Dosis, nämlich 10 mg handelsübliches E. coli 0111:B4-Lipopolysaccharid B intraperitoneal injiziert in 20 aus der Kreuzung entferntverwandter oder nicht zuchtverwandter Individuen gezüchteter weißer Mäuse Swiss, von denen jede etwa 20 g wog. 10 Mäusen wurden 0,2 mg TLC 1 oder TLC 3 und den verbleibenden 10 Mäusen physiologische Kochsalzlösung 3 Stunden vor Verabreichung der angegebenen letalen Dosis injiziert. Innerhalb von 2 Tagen waren 9 von den mit den Extrakten injizierten Mäusen noch am Leben, wohingegen 9 von 10 ungeschützten, mit Kochsalzlösung behandelten Vergleichsmäusen tot waren.

Der Schutzeffekt von TLC 2 gegen Endotoxin ist aus Fig. 10 ersichtlich. Die Daten geben die zusammengefaßten Ergebnisse aus 12 Untersuchungen wieder, die unter Verwendung verschiedener Chargen von Hundemilzextrakten und Mäusepartien erhalten wurden. Die Vergleichstiere hatten Überlebensraten von 20 und 13% nach 24 bzw. 48 Stunden ab Endotoxingabe, wohingegen 68 bzw. 54% Überlebensrate bei Mäusen gefunden wurde, die etwa 10 mg/kg Extrakt 3 Stunden vor der Endotoxingabe erhalten hatten. Mäuse, denen Extrakt und Endotoxin gleichzeitig injiziert wurde, zeigten eine Überlebensrate von 38% 24 Stunden nach Verabreichung.

Es ergibt sich somit, daß die erfindungsgemäßen Fraktionen die Fähigkeit besitzen, Mäuse gegen die Letalwirkung von Bakterienendotoxinen zu schützen durch Hemmung der Blutplättchenfunktion, wodurch eine Dissemination-Intravaskulär-Koagulation verhindert wird.

Versuche mit radioaktiv markierten Blutplättchen

51 Cr-markierte autologe Blutplättchen (Methode von Jandl) wurden an insgesamt 7 Hunde verabreicht, von denen 3 1 Stunde später 2 mg/kg TLC 2 erhielten und 4 (Vergleichstiere) unbehandelt blieben. Die Blutplättchenzahl der mit Extrakt behandelten Tiere wurde in Halbstundenintervallen gezählt und die Tiere wurden getötet, wenn zwei aufeinanderfolgende Blutplättchenzahlwerte 20% unter dem Vergleichsniveau lagen (3 Stunden). Die Vergleichstiere wurden nach 3 Stunden getötet. Gewebe-Radioaktivitätswerte (CPM/g) verschiedener Organe wurden bestimmt und berechnet als Verhältnis zur myokardialen Gewebe-Radioaktivität. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 11 wiedergegeben.

Keine Veränderungen wurden für Myokardgewebe oder Niere festgestellt, doch traten ausgeprägte Veränderungen in Organen auf, die reich an reticulo-endothelialem Gewebe sind. 4,5 mal mehr Blutplättchen traten in der Lunge auf, 8,9 mal mehr in der Milz und 5,0 mal mehr in der Leber von mit den Extrakten behandelten Hunden im Vergleich zu den Vergleichstieren. Diese offensichtliche Stimulierung des reticolo-endothelialen Systems in mit diesen Extrakten behandelten Hunden erklärt teilweise auch das Überleben von Extrakt-behandelten Mäusen im Endotoxinschock. S. Reichard (vgl. J. Reticuloendothel. Soc. 12, 654 (1972)) stellte fest, daß eine Stimulierung des reticulo-endothelialen Systems die Überlebensrate bei traumatischem und Endotoxinschock erhöht. Umgekehrt stellte er fest, daß eine Unterdrückung der phagozytischen Funktion des reticolo-endothelialen Systems diese erworbene Widerstandsfähigkeit gegenüber Schock aufhob.

Eine Verträglichkeit gegen Endotoxin kann erworben werden durch Injizierung einer oder mehrerer subletaler Dosen von Endotoxin vor der Verabreichung einer letalen Dosis. Während dieses Zustands von Endotoxintoleranz wird das reticolo-endotheliale System stimuliert, wie gemessen werden kann durch die erhöhte Rate an Spielraum gegenüber Bakterien, Kohlenstoffpartikeln oder markiertem Endotoxin für das Blut. Ferner kann die Verträglichkeit aufgehoben werden durch Reticoloendothelial-Blockierung.

Toxizität

Kaninchen und Meerschweinchen wurden wöchentlich über Zeiträume von bis zu 1 Jahr mit dem erfindungsgemäßen Material injiziert und zeigten keine erkennbaren histopathologische, hämatologische oder physiologische Toxizitätseffekte bezüglich Geweben oder Knochenmark.

In Versuchen zur Bestimmung der akuten Toxizität wurden Mäusen Einzeldosen an Fraktionen in einer Menge von 1,0 g/kg Körpergewicht injiziert, wobei keine Todesfälle auftraten.

Untersuchungen der aktiven Extrakte

Die Extraktionsmethode mit nachfolgender Dünnschichtchromatographie (unter Isolierung von Fraktionen mit bestimmten R_f-Werten unter bestimmten Bedingungen in bezug auf Lösungsmittel und Absorptionsmittel) stellt das beste Verfahren zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Materialien dar. Gegebenenfalls werden die nach Dünnschichtchromatographie isolierten Materialien einer Trennung aufgrund unterschiedlicher Löslichkeit unterworfen (fraktionierte Kristallisation), wobei die acetonlöslicheren Materialien eine größere biologische Aktivität zeigen als die weniger acetonlöslichen.

Zur Zeit bestehen die zuverlässigsten Methoden zur Untersuchung der Wirkungen dieser Extrakte auf die Blutplättchenfunktion in den Bestimmungen über die Erhöhung der Überlebensrate bei Verabreichung von Bakterienendotoxin (E. coli) in Mäusen und über die Hemmung der ADP-induzierten Blutplättchenaggregation in menschlichem blutplättchenreichem Plasma (PRP).

Zur Durchführung dieser Tests werden wie angegeben weißen Mäusen vom Typ Swiss TLC 1, TLC 2 und TLC 3 (3 bis 15 mg/kg Körpergewicht) oder physiologische Kochsalzlösung (0,1 ml) 3 Stunden vor der Verabreichung des E. Coli-Endotoxins (0,1 mg/Maus) intraperitoneal injiziert. Je größer die prozentuelle Überlebensrate bei einer konstanten Dosis an Extrakt ist, um so größer ist die Menge an appliziertem aktivem Material. In ähnlicher Weise kann davon ausgegangen werden, daß Fraktionen, welche die ADP-induzierte Blutplättchenaggregation bei einer bestimmten Konzentration am weitgehendsten hemmen, die größte Menge an aktiver Komponente im applizierten Material aufweisen.

Fraktionen mit Blutplättchen-erhöhender Wirkung

Es wurde bereits darauf verwiesen, daß die erfindungsgemäßen Fraktionen nach erfolgtem Abbau während der Lagerung die Fähigkeit besitzen, die Blutplättchenzahl zu erhöhen und es wurde auch ein Verfahren ausgearbeitet zur Isolierung von Fraktionen mit Blutplättchen-erhöhender Wirkung aus der Milz.

Es wurde ein Verfahren ähnlich demjenigen gemäß Beispiel 3 angewandt bis zu der Verfahrensstufe, wo das Milzmaterial aus dem Azeton entfernt wird. Zu diesem Gemisch aus Milzmaterial wurden 2 l Benzol zugegeben. Das erhaltene Gemisch wurde 18 Stunden lang auf 50°C erwärmt, worauf filtriert und das Benzol abgedampft wurde. Wurde das erhaltene Gemisch durch Dünnschichtchromatographie getrennt, so ergab sich ein Chromatogramm, das ähnlich demjenigen der Blutplättchen-vermindernden Fraktion war. Der opake Bereich der nach diesem Verfahren aus dem Siliciumdioxid mit Benzol und Aceton extrahierten Fraktion entsprach jedoch der oben beschriebenen Fraktion TLC 2 mit der Ausnahme, daß sie bei den getesteten Versuchstieren einen Blutplättchen-erhöhenden Effekt bewirkte.

Untersuchungen an Blutplättchen-erhöhenden Fraktionen

40 mg des angegebenen lösungsmittelfreien Blutplättchen-erhöhenden Materials wurden Kaninchen injiziert, was zu einer Erhöhung der Blutplättchenzahl um 40% (im Durchschnitt 469 000 bis 665 000 pro ml) während eines Zeitraums von 3 Tagen führte. Wurden 20 mg 2 Hunden injiziert, so verdoppelte sich die durchschnittliche Blutplättchenzahl von 230 000 auf 480 000 pro ml innerhalb von 1 Stunde und behielt diesen Wert 3 Stunden lang während der Versuchsdurchführung bei. Versuche zur Entnahme von Blutproben für Koagulationsstudien zeigten die extreme Hyperkoagulierbarkeit des Bluts dieser behandelten Hunde. Zahlreiche dieser Proben geronnen in den Reagenzgläsern, die Antikoagulatien wie Citrat oder Oxalat enthielten.

Diejenigen Proben, die nicht geronnen waren, zeigten eine 30%ige Abnahme der Thrombinzeit, eine 15%ige Zunahme an Plasmafibrinogen und eine 30%ige Zunahme an ADP-induzierter Blutplättchenaggregation, bezogen auf die Vergleichswerte und bewiesen die Herbeiführung eines hyperkoagulierbaren Zustands.

Es ist anzunehmen, daß das Überwiegen dieser Blutplättchen-erhöhenden Fraktionen, die einen hyperkoagulierbaren Zustand erzeugen, über die Blutplättchen-vermindernden Fraktionen, welche einen hypokoagulierbaren Zustand erzeugen, teilweise verantwortlich ist für thrombotische Erkrankungen beim Menschen, während dann, wenn die einen hypokoagulierbaren Zustand erzeugenden Faktoren überhand nehmen, sich die Blutungs- oder hämmorrhagischen Syndrome, z. B. Purpura, entwickeln. Zur Aufrechterhaltung normaler Koagulationsfunktionen müssen diese Fraktionen oder Faktoren im Gleichgewicht miteinander stehen.

Charakterisierung der aktiven Fraktionen

Die angegebenen Isolierverfahren einschließlich der Dünnschichtchromatographie sind die besten Methoden zur Isolierung und Charakterisierung dieser biologisch aktiven Fraktionen. Das Hauptproblem für die Charakterisierung dieser Materialien ist deren labile Natur und Komplexheit. Trotz ihrer komplexen Natur sind diese isolierten Materialien chromatographisch "rein" (in Dünnschichtchromatographie) und ergeben eine reproduzierbare Bioaktivität. Werden die Fraktionen TLC 1 bis 3 wie angegeben isoliert und danach unter identischen Bedingungen erneut chromatographiert, so werden Zersetzungsprodukte beobachtet (Materialien mit R_f-Werten, die sich von denjenigen bei der Isolierung unterscheiden). Werden die isolierten Materialien über längere Zeiträume aufbewahrt, so nimmt die Menge an Zersetzungsprodukten proportional zur Lagerdauer zu bei einer gleichzeitigen unerklärlichen Abnahme der Hemmwirkung dieser Materialien auf die Blutplättchenfunktion. Bei ausreichend langer Lagerung können die Zersetzungsprodukte dieser Fraktionen eine Stimulierung der Blutplättchenfunktion (einen hyperkoagulierbaren Zustand) hervorrufen, z. B. eine Zunahme der Sterblichkeit bei Endotoxingaben, eine Erhöhung der ADP-induzierten Blutplättchenaggregation und eine Abnahme der Blutungszeiten.

Die R_f-Werte der aktiven Fraktionen sind in der unten angegebenen Aufstellung zusammengefaßt. Die Blutplättchen wurden ohne Vorerhitzen angewandt. In qualitativer Hinsicht stellt TLC 1 eine vergleichsweise schnell wandernde Bande mit R_f-Werten von 0,6 bis 0,7 in den eingesetzten Lösungsmittelsystemen dar. TLC 2 besteht aus 2 oder mehr Komponenten, die der Einfachheit halber gemeinsam gesammelt werden. TLC 2A wandert schneller als TLC 2B. Diese Materialien haben R_f-Werte zwischen denjenigen der Farbstoffe Buttergelb und Sudanrot in den angewandten Lösungsmittelsystemen. TLC 3 ist dasjenige Material, das auf dem Auftragungsort sitzen bleibt.

R_f-Werte × 100

Verseifung von aktiven Fraktionen

Werden die Fraktionen TLC 1 bis 3 unter milden Bedingungen verseift (1 M-KOH in Methanol bei Raumtemperatur), so treten in jedem Dünnschichtchromatogramm (unter den gleichen Bedingungen wie oben angegeben) eine große Zahl unterschiedlicher Materialien auf (mindestens vier). Dies spricht dafür, daß diese biologisch aktiven Materialien eine komplexe Natur aufweisen.

Die Peaks oder Gipfel des Infrarotspektrums der Fraktionen TLC 1, TLC 2A, TLC 2B und TLC 3 sind in der unten angegebenen Aufstellung zusammengefaßt. Die Materialien wurden in CHCl₃ gelöst und auf NaCl-Scheiben pipettiert. Das Lösungsmittel wurde sodann verdampft unter Zurücklassung eines Films aus diesem Material. Die Spektren wurden an einem handelsüblichen Gerät aufgenommen. In der folgenden tabellarischen Aufstellung können einige der bei TLC 1 aufgeführten Peaks von BHT stammen, das denselben R_f-Wert wie TLC 1 hat.

Die erwähnte Analtech-Silicagel G. F.-Platte ist eine Platte, die unter der Bezeichnung "Pre-coated thin layer chromatography plates-uniplate (TM)" in den Handel gebracht wird und mit einem Kieselgel G. F. zuvor beschichtet worden ist, wobei G. F. "Gipsfluoreszierendes Mittel" bedeutet, d. h. daß der Überzug Gips (Calciumsulfat-Dihydrat) und einen fluoreszierenden Indikator enthält.

Die verwendete Abkürzung Analtech-Silicagel GF M. H. bedeutet "Gips-fluoreszierendes Mittel - mittelhart". Es handelt sich dabei um einen als mittelhart in den Handel gebrachten Plattentyp.

BHT bedeutet butyliertes Hydroxytoluol, das in herkömmlicher Weise als Antioxydationsmittel eingesetzt wird.

Claims

1. Biologisch aktives Lipoidmaterial mit Blutplättchenfunktionhemmender Wirkung, das einen Schmelzpunkt von nicht über 70°C aufweist, mit Aceton, Benzol und Äther extrahierbar und darin löslich ist; bei chromatographischer Behandlung auf einer 250 Mikron dicken Analtech-Silicagel G. F.-Platte unter Verwendung von Benzol als Elutionsmittel einen R_f-Wert im Bereich von 0 bis 0,73 unter Bedingungen aufweist, bei denen die Farbstoffe Buttergelb, Sudanrot 6 und Indophenolblau R_f-Werte von 0,40, 0,17 bzw. 0,05 haben; und aus tierischer Milz dadurch erhältlich ist, daß man
die Milz mit einem polaren Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von über 20 extrahiert, den gebildeten Extrakt vom polaren Lösungsmittel isoliert,
den isolierten Extrakt mit einem Elutionsmittel eluiert zur Fraktionierung des Extrakts durch Chromatographie und
diejenigen Fraktionen isoliert, die bei chromatographischer Behandlung auf einer Analtech-Silicagel G. F.-Platte einen R_f-Wert im Bereich von 0 bis 0,73 aufweisen.

2. Biologisch aktive Lipoidfraktion mit Blutplättchenfunktionhemmender Wirkung aus tierischer Milz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Schmelzpunkt von nicht über 70°C aufweist, mit Aceton, Benzol und Äther extrahierbar und darin löslich ist, bei chromatographischer Behandlung auf einer 250 Mikron dicken Analtech-Silicagel G. F.-Platte unter Verwendung von Benzol als Elutionsmittel einen R_f-Wert von 0,66 unter Bedingungen aufweist, bei denen die Farbstoffe Buttergelb, Sudanrot 6 und Indophenolblau R_f-Werte von 0,40, 0,17 bzw. 0,05 haben, und ein Infrarot-Absorptionsspektrum aufweist, das einen Peak bei mindestens einer der folgenden Wellenzahlen, ausgedrückt in cm^-1, zeigt: 3560, 3150, 2900, 2860, 2800, 2300, 1580, 1460, 1440, 1360, 1340, 1300, 1230, 1210, 1140, 1010 und 845.

3. Biologisch aktive Lipoidfraktion mit Blutplättchenfunktionhemmender Wirkung aus tierischer Milz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Schmelzpunkt von nicht über 70°C aufweist, mit Aceton, Benzol und Äther extrahierbar und darin löslich ist, bei chromatographischer Behandlung auf einer 250 Mikron dicken Analtech-Silicagel G. F.-Platte unter Verwendung von Benzol als Elutionsmittel einen R_f-Wert von 0,37 unter Bedingungen aufweist, bei denen die Farbstoffe Buttergelb, Sudanrot 6 und Indophenolblau R_f-Werte von 0,40, 0,17 bzw. 0,05 haben, und ein Infrarot-Absorptionsspektrum aufweist, das einen Peak bei mindestens einer der folgenden Wellenzahlen, ausgedrückt in cm^-1, zeigt: 2960, 2900, 2870, 2800, 1730, 1450, 1365, 1230, 1145, 1105 und 1090.

4. Biologisch aktive Lipoidfraktion mit Blutplättchenfunktionhemmender Wirkung aus tierischer Milz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Schmelzpunkt von nicht über 70°C aufweist, mit Aceton, Benzol und Äther extrahierbar und darin löslich ist, bei chromatographischer Behandlung auf einer 250 Mikron dicken Analtech-Silicagel G. F.-Platte unter Verwendung von Benzol als Elutionsmittel einen R_f-Wert von 0,28 unter Bedingungen aufweist, bei denen die Farbstoffe Buttergelb, Sudanrot 6 und Indophenolblau R_f-Werte von 0,40, 0,17 bzw. 0,05 haben, und ein Infrarot-Absorptionsspektrum aufweist, das einen Peak bei mindestens einer der folgenden Wellenzahlen, ausgedrückt in cm^-1, zeigt: 3300, 2900, 2860, 2800, 2270, 1720, 1710, 1570, 1420 und 1360.

5. Biologisch aktive Lipoidfraktion mit Blutplättchenfunktionhemmender Wirkung aus tierischer Milz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie einen Schmelzpunkt von nicht über 70°C aufweist, mit Aceton, Benzol und Äther extrahierbar und darin löslich ist, bei chromatographischer Behandlung auf einer 250 Mikron dicken Analtech-Silicagel G. F.-Platte unter Verwendung von Benzol als Elutionsmittel einen R_f-Wert von 0 unter Bedingungen aufweist, bei denen die Farbstoffe Buttergelb, Sudanrot 6 und Indophenolblau R_f-Werte von 0,40, 0,17 bzw. 0,05 haben, und ein Infrarot-Absorptionsspektrum aufweist, das einen Peak bei mindestens einer der folgenden Wellenzahlen, ausgedrückt in cm^-1, zeigt: 3250, 2850, 2780, 2270, 1705, 1435, 1355, 1220, 1140, 1030 und 790.

6. Verfahren zur Gewinnung des biologisch aktiven Materials mit Blutplättchenfunktionhemmender Wirkung aus der Milz nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man
die Milz mit einem polaren Lösungsmittel mit einer Dielektrizitätskonstante von über 20 extrahiert, den gebildeten Extrakt vom polaren Lösungsmittel isoliert,
den isolierten Extrakt mit einem Elutionsmittel eluiert zur Fraktionierung des Extrakts durch Chromatographie und
diejenigen Fraktionen isoliert, die bei chromatographischer Behandlung auf einer Analtech-Silicagel G. F.-Platte einen R_f-Wert im Bereich von 0 bis 0,73 aufweisen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fraktionierung des Extrakts durch Silicagel- Dünnschichtchromatographie mit Benzol als Elutionsmittel durchführt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fraktionierung des Extrakts durch Glassäulenchromatographie mit Benzol oder Methanol als Elutionsmittel durchführt.

9. Verfahren nach Ansprüchen 6 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Fraktion mit einem R_f-Wert von 0,66, 0,37, 0,28 oder 0 isoliert unter Messung der R_f-Werte auf einer 250 µ dicken Analtech-Silicagel G. F.-Platte mit Benzol als Elutionsmittel unter Bedingungen, bei denen die Farbstoffe Buttergelb, Sudanrot 6 und Indophenol R_f-Werte von 0,40, 0,17 bzw. 0,05 haben.