DE2748013A1

DE2748013A1 - Verfahren und vorrichtung zum herstellen einer suspension

Info

Publication number: DE2748013A1
Application number: DE19772748013
Authority: DE
Inventors: Gunter F Bahr; James H Puls; George L Wied
Original assignee: Miles Laboratories Inc
Current assignee: Bayer Corp
Priority date: 1976-10-28
Filing date: 1977-10-26
Publication date: 1978-05-03
Also published as: US4129381A; CA1075036A; FR2369616A1; JPS5721647B2; GB1577810A; JPS5386299A; FR2369616B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Herstellen einer Suspension, insbesondere zum Messen und Einstellen der Konzentration der Suspension gleichzeitig mit dem körperlichen Dispergieren der Peststoffteilchen.

Die mikroskopische Untersuchung von Zellproben ist eine ermüdende, zeitraubende und eintönige Aufgabe, die von Labortechnikern jeden Arbeitstag häufig hundertmal und öfters ausgeführt werden muß.

Alle Gewebe sind aus Zellen zusammengesetzt, den kleinsten lebenden Einheiten tierischer und pflanzlicher Organismen. Viele Körperorgane bestehen aus Epithelgewebe oder sind mit solchem bedeckt. Als Folge des ständigen Wachstums und Erneuerns werden die an der äußersten Oberfläche liegenden Zellen eines Epithelioms ständig abgestoßen und durch jüngere Zellen ersetzt: es findet eine spontane Exfoliation oder Abblätterung statt. Durch Exfoliation abgestoßene Zellen sind in Körperflüssigkeiten feststellbar, wie z.B. in Absonderungen aus dem weiblichen Genitaltrakt,

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in Hagenflüssigkeit, im Urin, in Gehirn- und Rückenmarkflüssigkeiten, in Zellaufschlämmungen, die durch Funktieren, Ausdrücken oder Ausspülen von Epitheloberflächen gewonnen werden. Diese durch Exfoliation abgestoßenen Zellen können von bestimmten Körperstellen zur mikroskopischen Untersuchung abgenommen werden. Außerdem können durch spontane Abblätterung abgestoßene Zellen durch Zellen ergänzt werden, die von bestimmten Organen unter Zuhilfenahme von entsprechenden Instrumenten direkt abgenommen werden. Derartige Zellen lassen sich zum Feststellen und Diagnostizieren verschiedener pathologischer Zustände verwenden.

Die Automatisierung dieser Aufgabe würde das Erkennen von abnormalen Zellen beschleunigen, das mit der mikroskopischen Analyse verbundene Problem der Ermüdung des Laboranten ausschalten und zu einer Reduzierung der Geaamtkosten einer solchen Analyse führen. Die Identifizierung einzelner abnormaler Zellen ist der Kern jedes erfolgreichen automatisierten Verfahrene. Zum Erreichen dieses Ziels ist es notwendig, Untersuchungsproben mit getrennten einzelnen Zellen für Durchflußzähler oder eine Probe herzustellen, die einer monozellularen Schicht für die mikroskopische Analyse nahekommt. Für die Identifizierung des vollständigen Spektrums von zur gynäkologischen Untersuchung gewonnenen Zellen in einer sauberen Probe von getrennten Zellen gibt es bereits Verfahren. Derzeit bestehen jedoch keine Verfahren für die angemessene Herstellung einer Probe, die eine Suspension von getrennten einzelnen Zellen ohne Zellüberlappung, Zellvereinigung, Zellverlust oder Zellbeschädigung bildet. Sich überlappende Zellkerne, Gruppen von dichtgepackten polymorphkernigen Leukozyten und dunkle Bereiche la Zytoplasma werden bei automatischer oder halb-automatischer maschineller Untersuchung häufig fälschlicherweise als große, dunkle "maligne** Kerne gedeutet. Sobald eine einwandfreie Suspension hergestellt worden ist, lassen sich die bei den nach dem Durchfluß-Prinzip oder mit Objektträgern arbeitenden automatisierten Systemen spezifischen Probleme mit den von der derzeitigen Technologie gebotenen Möglichkeiten überwinden.

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Die Entdeckung von Karzinomen im weiblichen Genitaltrakt ist ein Hauptanwendungsbeispiel für die diagnostische Zytologie oder die Beurteilung von menschlichen Zellen. Durch Abblätterung abgestoßene Zellen, die sich in der Vagina ansammeln, liefern zusammen mit Zellabstrichen vom Gebärmutterhals dem Zytopathologen Informationen, die ihm die Entdeckung von Karzinomen mit einem hohen Zuverlässigkeitsgrad erlauben. Zellmaterial, das vom Arzt oder von geschultem medizinischem Assistenzpersonal aus der Vagina oder vom Gebärmutterhals und/oder aus der Gebärmutterhöhle gewonnen wird, wird derzeit als Ausstrich auf ein Glasplättchen oder Objektträger aufgebracht und zur Bewahrung der morphologischen und chemischen Struktur fixiert. Die Proben werden einem zytologisehen Laboratorium zugeschickt, wo sie in einem komplizierten Vorgang gefärbt werden, z.B. nach Papanicolaou. Nach dem Färben werden die Objektträger unter dem Mikroskop von Zytotechnikern untersucht, die durch entsprechende Ausbildung in die Lage versetzt sind, normale und abnormale Zellen zu erkennen. Da von der großen Mehrzahl der Ausstriche angenommen werden kann, daß sie normal sind, leuchtet es ein, daß irgendeine automatische Vorrichtung beim Aussondern aller deutlich normalen Ausstriche von bedeutendem Wert wäre, wobei fragliche und abnormale Ausstriche für die weitere Untersuchung durch Zytotechniker und Pathologen blieben.

Für die Überprüfung von Zellen sind verschiedene selbsttätige Varichtungen gebaut worden, deren Arbeitsweise hauptsächlich auf Unterschieden in der Zellgröße und auf der Gesamtzellstrahlung, Absorption oder der optischen Zelldichte beruht. Die Zuverlässigkeit einer solchen Vorrichtung hat sich beim Trennen des Spektrums der betrachteten Zellen als äußerst gering erwiesen.

Das einzige bedeutsamste Problem beim Herstellen von Proben war das Zusammenklumpen von Zellen, das es einer Maschine unmöglich macht, zwischen dem beispielsweise von einer einzelnen Krebszelle erzeugten Signal und dem Signal zu unterscheiden,

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das sich aus einer Gruppe von banignen Zellen ergibt, die, elektronisch gesehen, ähnliche Parameter haben könnten. Die in den letzten Jahren eingeführten verschiedenen Versuche zur Automatisierung, unter denen Bewegen, Homogenisieren, Ansaugen mit einer Spritze, Druckfiltrieren, Behandeln mit Ultraschall, Schütteln, Rühren u.dgl. zum Auflösen von Zellansammlungen zu nennen sind, haben diese Schwierigkeit nicht aus dem Wege geräumt. Derartige Zellansammlungen, die häufig aus nur zwei oder drei Zellen bestehen, sind nach wie vor das Haupthindernis auf dem Wege zur Vollautomatisierung, da sie für automatisierte Vorrichtungen besonders irreführend sein können. Auf der Gegenseite hat der Mensch wenig Schwierigkeiten, fremde visuelle Informationen zu unterdrücken, und Zytologen vermögen Objektträger auszuwerten, die Gewebsfragmente, sich überlappende Zellen u.dgl. enthalten.

Die Schwierigkeit bei den Bemühungen zum künstlichen oder chemischen Trennen von Zellen bestand in der ausgedehnten Beschädigung, die während solcher Versuche normalerweise eintritt. Bei einigen mechanischen Verfahren beispielsweise werden Zellen voneinander losgerissen, und dabei kann es vorkommen, daß auch Teile von Zellmembranen und Zytoplasma abgerissen werden. Die sich daraus ergebende Zellbeschädigung kann die Probe für eine automatische Analyse unbrauchbar machen, da die Zellen zerstört sind und automatisierte Vorrichtungen die sich ergebenden Bruchstücke nicht beurteilen können, ültraschalldispergierung im besonderen ist zu kräftig, um als Verfahren für die Zelltrennung angewandt zu werden. Sie führt häufig zu ausgedehnter Zellbeschädigung mit Ausbildung von Zytoplasmafragmenten. Die Behandlung mit einem Homogenisiergerät, z.B. mit einem Haushalt- oder Labormixer, beispielsweise mit einem Waring-Mischer, führt zu einem besonders heftigen Ergebnis, das ausgedehnte Beschädigungen und Zerstörung der Zelle hervorrufen kann.

Das Ansaugen mit einer Spritze ist eines der einfachsten Verfahren zum Trennen von Zellen, muß jedoch sehr sorgfältig

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durchgeführt werden, wenn das angestrebte Ergebnis erzielt werden soll. Mit der Druckfiltrierung wurde wenig erreicht. Anscheinend sind die Scherkräfte ungenügend groß und wirken während einer ungenügenden Zeitdauer ein, als daß sie die Zellbindungen aufbrechen könnten. Mit raschem Schütteln, beispielsweise mit einem Vortex-Mischer, lassen sich Zellklumpen ohne weiteres auflösen, die Wirkung auf Gewebefragmente ist jedoch gering oder nicht vorhanden.

Es sind auch Versuche unternommen worden, Zellansammlungen chemisch zu trennen. Die Analyse der Zelljunktion bei Zervikalproben führt zu der Vermutung, daß Desmosomen (desmones) endozervikale normale und maligne Zellen in situ binden. Desmosomen sind gleichzeitig überall zu findende ZeIljunktionen. Es ist äußerst schwierig, Zellen durch Aufbrechen der Desmosomen voneinander zu trennen, ohne die Zellmembran zu zerstören. Folglich haben die meisten chemischen Lösungsversuche fehlgeschlagen, da Angriffe auf die Zelljunktion auch zur Zerstörung der Zellmembranen selbst führten.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Messen und Einstellen der Konzentration einer Suspension, während die Suspension körperlich bewegt wird, zu schaffen, insbesondere ein Verfahren und eine Vorrichtung zum Herstellen einer Zellsuspension einer Probe für zytologische Untersuchungen, wobei diese Suspension an Objektträgern In¹Wesentlichen monozellularen Schichten aufbringbar sein soll. Ferner soll es möglich sein, getrennte einzelne Zellen ohne Zellüberlappung, Zellverlust oder Zellbeschädigung zu dispergieren und gleichzeitig mit dem Aufbrechen von Feststoffteilchenansammlungen eine Suspension davon zu verdünnen. Weitere Aufgabe der Erfindung ist die Herstellung einer Feststoffteilchen-Suspension, die einer exakten maschinellen Analyse unterworfen werden kann.

Zur Lösung dieser Aufgabe sieht die Erfindung vor, das Dispergieren und das Trennen von Feststoffteilchen in einem Gefäß vorzunehmen. Die Suspension wird ständig bewegt,

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während die Verdünnung der Suspension gemessen und reguliert wird. Durch die Suspension wird Licht hindurchgesandt und von Lichtabtastvorrichtungen gemessen, die gestreutes und direktes Licht abtasten. Der sich ergebende Meßwert wird überwacht, um die Konzentration der Suspension mit einer vorbestimmten Konzentration zu vergleichen und das Zusetzen von Verdünnungsmittel zur Suspension zu steuern. Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden sowohl zum Dispergieren als auch zum Verdünnen zytologischer Proben Spritzen für einmaligen Gebrauch verwendet.

Vorteilhafte Merkmale und Ausgestaltungen der Erfindung

sind in der nachstehenden Beschreibung und in den beigefügten

Ansprüchen gekennzeichnet.

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden im folgenden anhand schematischer üchnungen erläutert. Es zeigt:

Fig. 1 eine vereinfachte Ansicht, teilweise im Schnitt, einer Vorrichtung nach der Erfindung,

Fig. 2 die Ansicht 2-2 in Fig. 1,

Fig. 3 eine vereinfachte Ansicht, teilweise im Schnitt, einer abgewandelten Ausführungsform eines für die Durchführung der Erfindung nützlichen Gefäßes, und

Fig. 4 ein Blockschaltbild eines für die Durchführung der Erfindung nützlichen Steuerungssystems.

Die in Fig. 1 dargestellte Vorrichtung nach der Erfindung zum Überwachen und Einstellen der Konzentration einer Suspension während des aktiven Dispergieren der Peststoffteilchen hat eine Kammer 10, die ein lichtdurchlässiges Gefäß 12 zur Aufnahme einer Probe suspension enthält, beispielsweise einer Zellsuspension, aus der eine Probe für zytologische Untersuchungen hergestellt werden soll. In das Gefäß 12 dringt ein langes Rohr 17 mit verengter Bohrung ein, das an eine Pumpe 15 des Kolben-Typs angeschlossen

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ist und mit dieser eine Dispergierungseinheit 14 bildet. Die Pumpe 15 und das Rohr 17 können, wie beim gezeigten Beispiel, die Form einer Spritze für subkutane Injektionen und der zugehörigen Nadel für einmaligen Gebrauch haben. Der Kolben der Pumpe 15 ist von einer hin- und hergehenden Antriebsvorrichtung 16 angetrieben und pumpt die Suspension wiederholt alternierend in entgegengesetzten Richtungen durch das Rohr 17.

Überschüssiges fließfähiges Medium läßt sich aus dem Gefäß 12 durch eine Entnahmeeinheit 19 mit einer Pumpe 23 entnehmen. Die Verdünnung der Suspension reguliert eine Steuereinheit 21, die eine Pumpe 25 aufweisen kann, welche zum Erzielen einer angestrebten Verdünnung dem Gefäß 12 nach Bedarf Verdünnungsmittel zuzuführen vermag. Die Kolben der Pumpen 23 und 25 sind durch eine Betätigungsvorrichtung oder Motor 27 bzw. 29 mit hin- und hergehender Bewegung antreibbar. Die Pumpen 23 und 25 können die Form von Einmal-Spritzen für subkutane Injektion haben.

Im Betrieb sendet eine Lichtquelle 32 Licht durch die Suspension im Gefäß 12, welches von Lichtabtasteinrichtungen gemessen wird, die die Form von fotoelektrischen Zellen und 35 haben können. Diese sind so angeordnet, daß sie gestreutes bzw. direktes Licht abzutasten vermögen. Die von den fotoelektrischen Zellen 34 und 35 erzeugten Signale werden in einer Überwachungseinheit 37 überwacht, welche die Signale mit vorbestimmten Normalen vergleicht. Wie nachstehend näher erläutert, ist mit den Motoren 27 und eine Rückkopplungsschaltung zur Regulierung der Entnahme oder des Zusatzes von fließfähigem Medium verbunden.

Die Erfindung findet spezielle Anwendung beim Herstellen einer zytologischen bzw. Zellprobe von im wesentlichen gleichmäßiger Dichte , welche sich zur maschinellen Analyse eignet. Das Verfahren und die Vorrichtung nach der Erfindung werden demgemäß nachstehend im Zusammenhang mit dem Messen und Einstellen der Konzentration einer Suspension von

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Körpergewebezellen beschrieben. Es versteht sich jedoch, daß die Erfindung im weitesten Sinne auf jede Art von Suspension anwendbar ist, einschließlich auf das Dispergieren von Pigmenten in der Farbenindustrie, auf das Verdünnen von Druckfarbenpigmenten, das Dispergieren von Farbstoffen für die Textilindustrie, das Verdünnen von Polystyrol-Latex u.dgl. in solchen Fällen, wo das Hessen und automatische Einstellen der Konzentration der Suspension notwendig sind.

Die Pumpe 15 gemäß Fig. 1 und 2 vermag Zellen in einer Probe zu dispergieren, wie sie aus einem normalen PAP-Abstrich gewonnen wird. Zum Gewinnen der Probe können herkömmliche Probesammeiverfahren angewandt werden, darunter das Abkratzen, Ansaugen, Tupfen u.a. Zum Sammeln der Proben, die für automatische Analyse gedacht sind, sollten jedoch herkömmliche Spateln aus Holz vermieden werden, da ihre Verwendung die Verunreinigung der Probe mit Holzteilchen hervorrufen kann. Anstelle von Spateln aus Holz lassen sich solche aus Kunststoff verwenden, die zum Entfernen loser Kunststoffteilchen abgebürstet worden sind. Mit Vorteil wird die Probe, beispielsweise ein Zervikalabstrich, in einem fließfähigen Medium dispergiert, z.B. in einer im Gleichgewicht befindlichen Salzlösung (balanced salt solution), welche die Zellen gut schützt und das nachfolgende Färben nur wenig oder gar nicht stört. Eine normale Salzlösung allein kann als Aufnahmeflüssigkeit verwendet werden, wenn die Probe unverzüglich weiterverarbeitet wird. Eine andere Aufnähmeflüssigkeit hat die folgende Zusammensetzung:

NaCl 8,00 g

KCl 0,20 g

NaH₂PO₄H₂O 0,005 g

NaHCO₃ 1,00 g

KH₂PO₃ 0,2 g

H₂O 1000 ml.

Praktisch alle routinemäßig als Abstrich gewonnenen Zervikalproben enthalten einige Zeilzusammenballungen. Der mittlere

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Anteil von Zellen in Form von Zellzusammenballungen wurde mit etwa 47,4$ ermittelt. Die Pumpe 15 und das Rohr 17 erfüllen die Aufgabe einer Zerlegungs- oder Auflösungseinheit, welche Zellklumpen zerlegt oder aufbricht, ohne die betreffenden Zellen zu zerstören. In den meisten Fällen handelt es sich bei der Pumpe 15 um eine Einmal-Spritze für subkutane Injektion von 5 oder 10 Kubikzentimeter Inhalt mit einer Nadel von etwa 1,12, 0,94 oder 0,86 mm (19, 20 oder 21 gauge (S.W.G.)) Durchmesser, welche das Rohr 17 bildet. Der Kolben der Pumpe 15 ist mit hin- und hergehender Bewegung durch die Antriebsvorrichtung 16 antreibbar, die einen Elektromotor aufweisen kann; diese Kolbenwirkung bewirkt ein wiederholtes Pumpen von Suspension durch das Rohr 17 vom und zum Gefäß 12. Diese wiederholte Pumpwirkung führt möglicherweise dazu, daß Zellen oder Feststoffteilchen durch den stattfindenden Scherungsprozeß dispergiert werden. Die von der Firma Harvard Apparatus in Millis, Massachusetts/USA gelieferte hin- und hergehende Betätigungsvorrichtung Modell 681 hat sich für die Verwendung als Antriebsvorrichtung 16 für den Kolben der Pumpe 15 als geeignet herausgestellt. Mit einer Betätigungsvorrichtung dieses Typs lassen sich sowohl die Hublänge als auch die Hubzahl der Kolbenbewegung innerhalb eines ziemlich großen Bereiches verändern. Die Geschwindigkeit und die Einschaltdauer der Pumpe 15 lassen sich mit einer Steuervorrichtung 40 für die Antriebsvorrichtung 16 einstellen. Die Steuervorrichtung 40 kann beispielsweise ein einfaches Zeitschaltwerk und/oder ein Rheostat sein. Alternativ kann ein digital gesteuerter Schrittschaltmotor verwendet werden, der die doppelte Aufgabe der Antriebsvorrichtung 16 und der Steuervorrichtung 40 wahrnimmt. Zum Steuern der Bewegung kann die Zahl der Schritte reguliert werden, da derartige Motoren eine inkrementale Bewegung mit einem Schritt je Impuls ausführen. Ein Schrittschaltmotor mit einer Schrittzahl von 200 schaltet beispielsweise bei jedem Impuls um 1,8 Grad weiter. Durch Verändern der Impulsfrequenz läßt sich die Drehgeschwindigkeit des Motors steuern. Ein solcher Schrittmotor wäre selbstverständlich mit einem mechanischen Umwandler zum Umwandeln der drehenden Bewegung in hin- und hergehende Bewegung ausgestattet.

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Wenngleich für das Rohr 17 Rohre mit etwa 1,12, 0,94 oder 0,86 mm Durchmesser bevorzugt werden, lassen sich Rohre oder Nadeln auch anderer Abmessungen, beispielsweise von etwa 1,27 mm oder 0,71 mm Durchmesser (18 or 23 gauge) anwenden. Wichtig ist, daß die innerhalb einer gegebenen Zeitspanne durch das Rohr 17 fließende Fluidmenge und die Abmessungen des Rohres 17 so sind, daß die Zellen während des Durchführens der angestrebten Auflösung nicht beschädigt werden.

Viele der früher angewandten Techniken zum Dispergieren von Zellen haben sich beim Dispergieren von in einer Gewebekultur gezüchteten Zellen als wirkungsvoll herausgestellt, jedoch nicht bei Anwendung auf klinisches gynäkologisches Material. Selbstverständlich besteht das Hauptinteresse bei der Diagnose in der Analyse von Proben normaler, atypischer, dysplastischer und maligner Zellen.

Die Kammer 10, in der die Zellen dispergiert und die Zellauf schlämmung verdünnt wird, ist vorzugsweise an der Innenseite matt schwarz angestrichen, um fremde Lichtreflexe auf ein Mindestmaß herabzusetzen, Die Kammer 10 ist groß genug, um einen Behälter 11 aufzunehmen. Die Temperatur der Kammer 10 kann zur Steuerung der Temperatur der Suspension im Gefäß 12 verändert werden. Eine der Möglichkeiten hierfür ist die Verwendung von nicht gezeichneten Heiz- oder Kühlschlangen.

Der Behälter 11 kann eine Wanne sein, die das Gefäß 12 aufzunehmen vermag, welches beispielsweise ein Probenglas oder ein Glasfläschchen sein kann, das die Zellsupsension in einer vorbestimmten Menge von z.B. 5 ml einer Ausgangsdispersionslösung enthält. Bei Bedarf kann die in der Ausgangsdispersionslösung vorhandene Probe unter Verwendung eines Vortex-Mischere vorsichtig gemischt werden, bevor das Probenglas oder das Glasfläschchen in die Prüfkammer 10 eingesetzt wird. Um Lichtstreuung zu verringern, ist der Raum zwischen dem Behälter 11 und dem Gefäß 12 mit

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einem fließfähigen Medium 13 aufgefüllt, z.B. mit Ittineral- oder Paraffinöl mit ungefähr derselben Brechzahl wie Pyrex Glas. Mit Vorteil sind am Behälter 11 beim gezeigten Beispiel als plan-zylindrische Linsen 42 und 43 ausgebildete Linsen angeordnet, die durch die Suspension im Gefäß 12 hindurchgehendes Licht zerstreuen und sammeln. Die Linsen 42 und 43 sind am Behälter 11 vorzugsweise mit optischem Kitt befestigt, könnten jedoch auch mit mechanischen Hilfsmitteln in Stellung gehalten sein.

Im Bedarfsfall kann die Kombination aus Behälter 11 und Gefäß 12 durch einen einzigen Behälter aus Kunststoff oder Glas, an dem Linsen oder keine Linsen befestigt sind, ersetzt werden, wodurch sich die Verwendung mehrerer Behälter und das Vorhandensein von fließfähigem Medium zwischen den Behältern zum Stärkstmöglichen Herabsetzen der Refraktion erübrigen. Eine solche Ausführungsform zeigt Fig. 3» bei der in die Kammer 10 ein einzelnes Gefäß 55 eingesetzt ist. Am Gefäß 55 können Linsen 57 und 58 befestigt sein.

Die Beleuchtung erfolgt von der Lichtquelle 32 aus, die kohärente oder inkohärente Lichtwellen aussenden kann. Als Lichtquelle 32 wird ein Laser bevorzugt, z.B. der von der Firma Edmund Scientific Company in Barrington, New Jersey/ USA vertriebene Helium-Neon-Laser Nr. 79050. Dieser Laser bildet eine Lichtquelle, die Licht mit einer Wellenlänge von etwa 6000 A aussendet. Die Ausbildung der Beleuchtungsquelle als Laserstrahl ist zweckmäßig, da beim Laserstrahl keine spezielle Strahlformung erforderlich ist, der Laserstrahl sehr schmal ist und daher für Meßzwecke außerordentlich gut geeignet ist. Die Vorrichtung ist jedoch nicht auf die Anwendung eines dünnen Lichtbandes beschränkt, und in einigen Anwendungsfällen wird es unzweifelhaft zweckmäßig sein, einen Lichtstrahl von dickerem Querschnitt zu verwenden.

Das Licht tritt durch eine Öffnung 45 in der Kammer 10 ein, durchdringt die Suspension im Gefäß 12 (Fig. 1 und 2) oder

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im Gefäß 55 (Pig· 3) und wird dann von Lichtabtasteinrichtungen wie die fotoelektrischen Zellen 34 und 35 gemessen, die an der der Lichtquelle 32 abgewandten Seite der Kammer angeordnet sind. Bevorzugte fotoelektrische Zellen sind die von der Firma E.G. and G. in Salem, Massachusetts/USA unter der Artikel-Nr. HAV1OOOA vertriebenen fotoelektrischen Zellen. Die fotoelektrische Zelle 35 spricht auf direktes Licht, die fotoelektrische Zelle 34 auf gestreutes Licht an. Die zueinander unter einem Winkel von etwa 15 Grad angeordneten fotoelektrischen Zellen 34 und 35 sind so angeschlossen, daß sie die Überwachungseinheit 37 steuern, welche die von den fotoelektrischen Zellen 34 und 35 empfangenen Signale verstärkt und vorzugsweise eine visuelle Anzeige der bestehenden Konzentration der Zellsuspension im Gefäß 12 liefert. Eine geeignete Überwachungseinheit 37 könnte einen von der Firma Intel in Santa Clara, Kalifornien/USA vertriebenen SRC 80/10-Mikroprozessor mit entsprechenden Schnittstellen zu den Motoren 27 und 29, zu den fotoelektrischen Zellen 34 und 35 und zur Steuervorrichtung 40 sowie zu einer Stromquelle aufweisen. Zum bequemeren Überwachen der Signale könnten digitale Heßgeräte verwendet werden, z.B. solche, wie sie die Firma Andlogic in Wakefield, Massachusetts/USA unter der Artikel-Nr. 2533LP vertreibt.

Maximaler Lichtdurchlaß durch das Gefäß 12 besteht, wenn darin keine Suspension vorhanden ist. Somit ist die Streuung auf einem Minimum, wenn keine Suspension vorhanden ist, und steigt mit zunehmender Konzentration an. Die Überwachungseinheit 37, die ein logisches Folgesteuerungselement oder ein Mikroprozessor sein kann, läßt sich im voraus auf eine gewünschte Konzentration einstellen und dadurch so programmieren, daß sie die Aufeinanderfolge von Arbeitsgängen beendet, sobald eine gewunechte Konzentration hergestellt worden ist. Signale aus der Überwachungseinheit 37 werden dazu verwendet, die Motoren 29 und 27 zu steuern und dadurch Verdünnungsmittel dem Gefäß 12 zuzuführen oder überschüssiges Verdünnungsmittel aus dem Gefäß 12 abzuführen, und die Steuervorrichtung 40 zu betätigen.

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Der Motor 29, der beispielsweise ein digitaler Schrittmotor ist, wird dazu benutzt, einen Kolben in der Pumpe 25 für Verdünnungsmittel niederzudrücken. Die Pumpe 25 kann eine Tuberkulin-Spritze für einmaligen Gebrauch sein und kann über ein Dreiwegeventil 47 mit einem Vorratstank 49 verbunden sein, der ein entsprechendes, für dispergierte Zellen unschädliches Verdünnungsmittel enthält. Eine geeignete Lösung ist die Hank BSS-Lösung, die ohne Calcium, Magnesium oder Phenolrot hergestellt ist. Somit wird nach Einschalten des Motors 29 der Kolben in der Pumpe 25 nach unten geschoben und Verdünnungsmittel aus dem Vorratstank 49 in das Gefäß gepumpt, bis eine korrekte Konzentration der dispergierten Zellen erzielt ist.

Um ein Überfließen der Probe zu verhindern, ist es von Zeit zu Zeit notwendig, Suspension aus dem Gefäß 12 abzuführen. Dies geschieht durch Einschalten des Motors 27, der ein digitaler Schrittmotor sein kann, und durch Nachobenziehen des Kolbens in der Pumpe 23, wodurch gleichzeitig Suspension aus dem Gefäß 12 entfernt wird. Die Regulierung des Motors 27 durch die Überwachungseinheit 37 läßt sich leicht steuern, da die abzuziehende Pluidmenge und der Zeitpunkt hierfür auf der Basis der im Gefäß 12 anfänglich vorhandenen und der durch die Pumpe 25 zugesetzten Pluidmengen bestimmbar sind. Sobald die Summe aus der anfänglich im Gefäß 12 vorhandenen Fluidmenge und der durch die Pumpe 25 zugesetzten Pluidmenge einen vorbestimmten Betrag überschreitet, kann der Motor 27 zum Abziehen überschüssigen fließfähigen Mediums eingeschaltet werden. Dementsprechend kann die Einrichtung zum Abziehen von fließfähigem Medium von sehr ähnlicher Ausbildung wie die Einrichtung zum Verdünnen der fließfähigen Suspension im Gefäß 12 sein. Zum Aufbewahren von aus dem Gefäß 12 abgezogenem fließfähigem Medium kann eine getrennte Kammer oder ein Überlauftank 52 über ein Dreiwegeventil angeschlossen sein.

Fig. 4 zeigt ein Blockschaltbild eines für die Durchführung der Erfindung verwendbaren Steuersystems. Lichtabtast-

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einrichtungen oder Sensoren wie die fotoelektrischen Zellen 34 und 35 messen das durch die Suspension hindurchtretende Licht. Im Bedarfsfall können die von den fotoelektrischen Zellen 34 und 33 erzeugten Signale an Meßgeräten 60 und 61 angezeigt werden, die beispielsweise Meßgeräte mit Digitalanzeige sein können. Me Signale aus den Sensoren oder den fotoelektrischen Zellen 34 und 35 werden durch eine Multiplexer-Einheit 63 hindurch einem Analog-Digital-(A-D)Umwandler 65 und dann einem von einem Speicher 68 gesteuerten Rechner 67 zugeleitet. Im Rechner 67 werden die vom Analog-Digital-Umwandler 65 kommenden Signale mit im voraus festgelegten Werten für eine gewünschte Suspension verglichen. Das Signal von der fotoelektrischen Zelle 34 dient zum Steuern der Dispergierung durch Regulieren der Steuervorrichtung 40, das Signal von der fotoelektrischen Zelle 35 zum Steuern der Verdünnung durch Regulieren des Motors 29. Bis zu dem Zeitpunkt, wo die gewünschte Suspension hergestellt ist und die genannten, im voraus festgelegten Werte erreicht sind, bleiben die Steuervorrichtung 40 und der Motor 29 eingeschaltet, um Klumpenauflösung und Verdünnung gleichzeitig herbeizuführen. Wenn durch das Verdünnen das maximale Fassungsvermögen der Verdünnungskammer oder des Gefäßes 12 erreicht wird, wird der Motor 27 während einer gegebenen Zeitdauer eingeschaltet, um fließfähiges Medium aus dem Gefäß 12 abzuziehen. Sobald der im voraus festgelegte Verdünnungsgrad erreicht worden ist, werden sowohl Verdünnung als auch Bewegung oder Mischen durch den Rechner gestoppt.

Das die verdünnte Probe enthaltende Gefäß 12 kann dann aus der Vorrichtung herausgenommen werden, und die verdünnte Probe kann in eine automatische Zählvorrichtung eingegeben, an Objektträgern zur Analyse der verdünnten Feststoffteilchen aufgebracht oder in anderer Weise entsprechend bekannten Verfahren behandelt werden. Ein Verfahren besteht beispielsweise nur darin, die Suspension auf einen Objektträger aufzutropfen. Ein anderer. Weg ist das Eingtten· der verdünnten

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Probe in eine Beschickungszentrifuge für Objektträger und das Übergehenlassen einer Feststoffteilchen enthaltenden Flüssigkeit auf einen Objektträger während eines Zentrifugiervorganges. Selbstverständlich bildet die Art und Weise, in der die verdünnten Proben verwendet werden, nicht Teil der Erfindung.

Die Vorrichtung ist so ausgelegt, daß die einzigen Vorrichtungsteile, die mit der Zellsuspension in Berührung kommen, vom Wegwerf-Typ für einmaligen Gebrauch sein können. Dies ist besonders wichtig, um Kontamination zwischen einer Krebszellen enthaltenden Probe und einer normalen Probe zu vermeiden. Auch müssen in das Gefäß 12 nur drei Nadeln oder Rohre eingesetzt werden. Dies ist wichtig, weil die Platzverhältnisse in der Vorrichtung beschränkt sind, und weil es das Arbeiten mit sehr kleinen Probenvolumen erleichtert. Aus Gründen der Vereinfachung sind die entsprechenden Rohre zum Anschließen an die Dispergierungseinheit 14, an die Entnahmeeinheit 19 und an die Steuereinheit 21 in Fig. 2 mit geradliniger Anordnung im Gefäß 12 gezeichnet. Die Rohre müssen nicht so angeordnet sein und können im Bedarfsfall bis in jede beliebige Tiefe im Gefäß 12 eingesetzt sein.

Bei der Vorrichtung nach der Erfindung sind als Vorteile die geschickte Anordnung, ihre Einfachheit, relative Billigkeit, Wirksamkeit, Haltbarkeit, Genauigkeit und Direktheit der Wirkung zu nennen. Die Erfindung löst im wesentlichen das Problem der Erzielung einer Suspension, in der biologische Zellen in einer monozellularen Schicht dispergiert sind und wie sie notwendig ist, um für die maschinelle Analyse geeignete Objektträger mit Ausstrichen einheitlicher Dichte aus gleichmäßig dispergiertem Untersuchungsgut herzustellen. Ein kleines, die Probe enthaltendes Glasfläschchen kann zur Analyse an eine zentrale Untersuchungsstelle geschickt werden, wo dann die richtige Verdünnung auf etwa 30 000 Zellen/ml vorgenommen wird. Zellenklumpen werden durch die Pumpwirkung mit Richtungswechsel mittels einer Pumpe, z.B.

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einer Spritze mit Nadel für subkutane Injektion, aufgelöst. Ein weiterer Vorteil der Vorrichtung besteht darin, daß die Verwendung eines Vergleichslichts nicht erforderlich ist. Sobald eine bekannte Konzentration zubereitet worden ist, lassen sich zum Herstellen einer Probe für die maschinelle Analyse übliche Verfahren anwenden. Die sich ergebenden verdünnten Proben sind praktisch frei von den dichten Klumpen sich überlappender schuppenförmiger und endozervikaler Zellen, die an nach herkömmlichen Ausstrichtechniken beschickten Objektträgern häufig anzutreffen sind. Außerdem sind die Zellen gut geschützt, bei geringen Anzeichen irgendwelcher Beschädigung. Objektträger mit nach der Erfindung hergestellten, in ihrer Konzentration verringerten Proben sind wegen der gleichmäßigeren Verteilung der Zellen für die automatische Analyse viel besser geeignet als direkte Ausstriche. Sie verdünnten Proben lassen sich an Objektträgern nach jedem herkömmlichen Verfahren, auch durch Zentrifugieren auftragen.

Wenngleich Lichtstreuung eine bekannte Methode zum Messen der Feststoffteilchenkonzentration ist, war es nicht möglich, eine ständige Überwachung der Suspensionskonzentration bei gleichzeitigem aktivem Dispergieren von Feststoffteilchen, insbesondere von biologischen Proben, vorzunehmen, in der Weise, daß Zellansammlungen ohne Zellverlust oder Zellzerstörung aufgelöst werden.

Obgleich die Anwendung der Pumpe 15 und des Rohres 17 zum Aufbrechen von Feststoffklumpen,, z.B. von Zellansammlungen, bevorzugt wird, lassen sich auch andere Hilfsmittel, wie z.B. Ultraschallsonden, anwenden, wenn die Natur der dispergierten Feststoffteilchen so ist, daß die Feststoffteilchen durch die Anwendung heftigerer Mischungs- oder Bewegungsformen nicht zerstört oder beschädigt werden.

Das Verfahren nach der Erfindung bietet die Möglichkeit zur automatischen Regulierung. Im Bedarfsfall jedoch läßt

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sich die Betätigung der Pumpen und/oder die Geschwindigkeitsregulierung der Pumpen von Hand vornehmen.

Wie weiter oben schon angegeben, hat die Erfindung viele praktische Anwendungen. So ist die Vorrichtung beispielsweise anwendbar, um eine optimale Konzentrationsverringerung der Probe sicherzustellen, um Flüssigkeiten in Kläranlagen zu überwachen, zur Kontrolle der Konsistenz von Erzeugnissen der Lebensmittelindustrie, zur Überwachung des Feststoffanteils in Industrieabgasen, zur Regulierung der Pigmentkonzentration in Anstrichfarben, Druckfarben und Farbstoffen, zur Erzielung einer gewünschten Suspension von Zementteilchen, und zur optimalen Konzentrationsverringerung einer Probe für Gel-Elektrophoresesäulen.

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Claims

PATENTANSPRÜCHE

(T) Verfahren zum Herstellen einer Suspension, in der die Peststoffteilchen als getrennte einzelne Teilchen in einer vorbestimmten Konzentration vorhanden sind, dadurch gekennzeichnet , daß eine als Probe verwendete Suspension einer Peststoffteilchen dispergierenden Bewegung unterworfen wird, und daß, während die genannte Suspension so bewegt wird, die Konzentration der Feststoffteilchen in der Suspension gemessen und nach Bedarf so eingestellt wird, daß die vorbestimmte Konzentration erzeugt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dispersion der Feststoffteilchen daran gemessen wird, wie stark durch sie hindurchgesandtes Licht gestreut wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Konzentration der Peststoffteilchen durch Zusetzen von Verdünnungsmittel zur genannten Suspension eingestellt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Peststoffteilchenkonzentration bis zum Erreichen der vorbestimmten Konzentration kontinuierlich gemessen und eingestellt wird.
5. Verfahren zum Messen und Einstellen der Konzentration einer fließfähigen Suspension von Zellen, während die Suspension zum Dispergieren der Peststoffteilchen körperlich bewegt wird, dadurch gekennzeichnet , daß

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- eine fließfähige Suspension von Zellen in ein lichtdurchlässiges Gefäß (12) gegeben wird,

- die fließfähige Suspension im Gefäß (12) körperlich bewegt wird, um Zellklumpen ohne Zerstörung von Zellen aufzulösen,

- ein Lichtstrahl durch die fließfähige Suspension im Gefäß (12) gesandt wird,

- das durch das Gefäß (12) hindurch übertragene direkte Licht gemessen wird,

- das durch das Gefäß (12) hindurch übertragene gestreute Licht gemessen wird,

- das genannte direkte Licht mit einem ersten vorbestimmten Lichtwert verglichen wird,

- das genannte gestreute Licht mit einem zweiten vorbestimmten Lichtwert verglichen wird,

- das Verdünnen der fließfähigen Suspension im Gefäß (12) beendet wird, wenn das direkte Licht mit dem ersten vorbestimmten Lichtwert ungefähr gleich ist, und

- das Bewegen der fließfähigen Suspension im Gefäß (12) beendet wird, wenn das gestreute Licht mit dem zweiten vorbestimmten Lichtwert ungefähr gleich ist.
6. Vorrichtung zum Herstellen einer Suspension von vorbestimmter Konzentration, gekennzeichnet durch ein Gefäß (12) zur Aufnahme einer fließfähigen Suspension von als Proben gewonnenen Peststoffteilchen, eine Einrichtung (Dispergierungseinheit 14) zum Peststoffteilchen dispergierenden Bewegen der Suspension im Gefäß (12), eine Einrichtung zum Messen der Peststoffteilchenkonzentration der Suspension im Gefäß (12), eine Einrichtung (Steuereinheit 21) zum Einstellen der Konzentration der Suspension im Gefäß (12), und durch eine Steuereinrichtung für die Einstelleinrichtung (21), welche mit der Meßeinrichtung verbunden ist und auf von letzterer ermittelte Meßwerte anspricht, um zu bewirken, daß die Einstelleinrichtung (21) die Konzentration der gemessenen Suspension nach Bedarf einstellt, um die vorbestimmte Konzentration darin zu erzeugen.

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7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß eine Einrichtung (Entnahmeeinheit 19) vorhanden ist, welche Flüssigkeit aus dem Gefäß (12) zu entnehmen vermag.
8. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Meßeinrichtung eine Vorrichtung (Lichtquelle 32) aufweist, die Licht durch die zu messende Suspension zu senden vermag, und Lichtabtasteinrichtungen, die auf durch diese Suspension hindurchgesandtes direktes und gestreutes Licht ansprechen.
9. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Einstelleinrichtung (21) eine Vorrichtung (Pumpe 25) zum Zufuhren von Verdünnungsmittel in das Gefäß (12) aufweist.
10. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Meßeinrichtung und die Einstelleinrichtung (21) gleichzeitig mit dem Betätigen der Einrichtung (14) zum Erteilen von Peststoffteilchen dispergierender Bewegung betätigbar sind.
11. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung (14) zum Erteilen von Feststoffteilchen dispergierender Bewegung ein langes Rohr (17) von verengter Bohrung und eine Pumpe (15) zum Verpumpen von Suspension alternierend in entgegengesetzten Richtungen durch das Bohr (17) aufweist.
12. Vorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , daß die Vorrichtung (32) zum Senden von Licht durch die genannte Suspension eine Laserstrahlquelle aufweist, und daß die Lichtabtasteinrichtung fotoelektrische Zellen (35,34) hat, die je so angeordnet sind, daß sie durch diese Suspension hindurchgesandtes direktes und gestreutes Licht abzutasten vermögen.

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13· Vorrichtung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Steuereinrichtung den mit der Meßeinrichtung erhaltenen Meßwert mit einem Normal vergleicht und bewirkt, daß die Einstelleinrichtung (21) dem Gefäß (12) Verdünnungsmittel zuführt, wenn der Meßwert von dem genannten Normal abweicht.
14. Vorrichtung zum Messen und Einstellen der Konzentration einer fließfähigen Suspension von Zellen, während die Suspension zum Dispergieren der Feststoffteilchen körperlich bewegt wird, gekennzeichnet durch

- ein lichtdurchlässiges Gefäß (12) zur Aufnahme einer ZeilSuspension,

- eine Bewegungseinheit (Dispergierungseinheit 14) zum körperlichen Bewegen einer Zellsuspension im Gefäß (12), um Zellenklumpen ohne Zerstörung von Zellen aufzulösen,

- eine Verdünnungseinrichtung (Steuereinheit 21) zum Verdünnen einer Zellsuspension im Gefäß (12), um eine angestrebte Peststoffteilchenkonzentration zu erzielen,

- eine Lichtquelle (32) zum Senden eines Lichtstrahls durch das Gefäß (12),

- eine erste Lichtabtasteinrichtung (fotoelektrische Zelle 35), die so angeordnet ist, daß sie von der Lichtquelle (32) durch das Gefäß (12) hindurchgesandtes direktes Licht empfängt und ein erstes Lichtsignal erzeugt,

- eine zweite Lichtabtasteinrichtung (fotoelektrische Zelle (34), die so angeordnet ist, daß sie von der Lichtquelle (32) durch das Gefäß (12) hindurchgesandtes gestreutes Licht empfängt und ein zweites Lichtsignal erzeugt,

- eine Überwachungseinrichtung (37)» die das erste Lichtsignal empfängt und mit der Verdünnungseinrichtung (21) verbunden ist, um zum Erzielen der angestrebten Zellkonzentration in der Suspension im Gefäß (12) das von der ersten Lichtabtasteinrichtung (35) abgetastete Licht mit einem vorbestimmten Wert für die Verdünnung zu vergleichen und die Verdünnungseinrichtung (21) dementsprechend zu regulieren,

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- und durch eine überwachungseinrichtung (37), die das zweite Lichtsignal empfängt und mit der Bewegungseinrichtung (14) verbunden ist, um zum Erzielen der angestrebten Dispersion von Zellen in der Suspension im Gefäß (12) das von der zweiten Lichtabtasteinrichtung (34) abgetastete Licht mit einem vorbestimmten Wert für die Suspension zu vergleichen und die Bewegungseinrichtung (14) dementsprechend zu regulieren.
15· Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Entnahmeeinrichtung (19) zum Entfernen von überschüssigem fließfähigem Medium aus dem Gefäß (12) aufweist.
16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Bewegungs-, Verdünnungs- und die Entnahmeeinrichtung (14,21,19) je eine kolbenbetätigte Vorrichtung bilden.
17. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die erste und die zweite Lichtabtasteinrichtung je fotoelektrische Zellen (34,35) sind, die unter einem Winkel von etwa 15 Grad zueinander angeordnet sind.
18. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß sie weiterhin an entgegengesetzten Seiten des Gefäßes (12) angeordnete Linsen (42,43) zum Zerstreuen bzw. Sammeln von Licht bei dessen Durchtritt durch das Gefäß (12) aufweist.

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