DE2729490A1 - Verfahren zur aktivierung immobilisierter lebender mikroorganismen - Google Patents
Verfahren zur aktivierung immobilisierter lebender mikroorganismenInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivierung immobilisierter
Mikroorganismen. Speziell betrifft die Erfindung eine Methode zur Aktivierung immobilisierter lebender Mikroorganismen
in Anwendung für Umformungen von Steroiden, Antibiotika und anderen Verbindungen.
Immobilisierte Mikroorganismen erhielten in den letzten Jahren steigendes Interesse als Katalysatoren (Biotechnol. Bioeng. 17,
Seiten 1797 bis 1804, 1975), J. Appl. Chem. Biotechnol. 25,
Seiten 115 bis 141 (1975), Biotechnol. Bioeng. 12, Seiten 19 bis 27 (1970). Sie zeigen die gleichen Betriebsvorteile wie immobilisierte
Enzyme (FEBS Lett. 62, Ergänzung, E 80 bis E 90, 1976).
Sie wieder verwendbar, gut geeignet für kontinuierliches Arbeiten unter geregelten Bedingungen und außerdem vergleichsweise
resistent gegen mikrobiologischen Angriff, da sie von dem Polymer geschützt sind. Immobilisierte Mikroorganismen liefern den
zusätzlichen Vorteil, daß eine langwierige und kostspielige Enzymisolierung vermieden wird, daß das Enzym gewöhnlich infolge
seiner Lokalisierung in seiner "natürlichen Umgebung" stabiler ist und daß es gewöhnlich nicht das Erfordernis eines Cofaktors
gibt. So sind immobilisierte Mikroorganismen sehr viel versprechende Katalysatoren, vorausgesetzt daß Konkurrenzreaktionen
ausgeschaltet werden können. Bei kontinuierlichem oder wiederholtem ansatzweisem Arbeiten des Umwandlungsverfahrens nimmt
aber die Aktivität ziemlich rasch ab, wenn immobiliserte Mikroorganismen verwendet werden. Dieses Problem wurde bisher in Verbindung
mit immobilisierten lebenden Mikroorganismen noch nicht zufriedenstellend gelöst.
709882/0906
Die vorliegende Erfindung betrachtet besonders eine einzigartige Eigenschaft für immobilisierte lebende Ganzzellenkatalysatoren,
nämlich die Möglichkeit, in situ die mobiliserte Enzymaktivität
zu aktivieren.
Geeignete Substrate für Umformungen, bei denen die Aktivierung nach der Erfindung angewendet werden kann, sind
1. Steroide, besonders Corticosteroide, wie beispielsweise Cortisol,
2. Antibiotika, wie Penicillin G und
3. andere Verbindungen wie
a) Alkaloide, z.B. Solasodin, Tomatidin,
b) organische Säuren, z.B. N-Acetyl-L-aminosäuren,
c) Kohlenhydrate, wie Glucose, Sorbose,
d) Purinbasen, Nucleoside und Nucleotide, wie 6-Chlorpurin,
6-Chlorpurinribosid.
Die Aktivierung kann auf verschiedene Systeme angewendet werden, wie auf die Corticosteroidumwandlung: Cortisol
Prednisolon. Die Umsetzung kann durch in Polyacrylamid eingeschlossenes Corynebakterium simplex (Arthrobacter simplex)
katalysiert werden.
Unter den Umformungen, die für die Aktivierung nach der Erfindung geeignet sind, können folgende erwähnt werden:
1. Δ -Dehydrierung. Einarbeitung einer Doppelbindung in die 1,2-Stellung des Steroidmoleküls. Beispiel:
Δ1-Dehydrierung von Cortisol und Cortisolderivaten, wie
Cortisol zu Prednisolon,
9et-Fluor-16ß-methylcortieol zu ^-Pluor-ieß-methylprednisolon (Betametason)
^09882/0905
9 A-Fluor-ieA-methylcortisol zu 9<*-Fluor-16<*-methylprednisolon (Dexametason),
öd-Methylcortisol zu 6d-Methy!prednisolon,
6<^-Fluor-1 öA-methylcortisol zu 6<A-Fluor-1 öflU-methylprednisolon (Parametason),
9d^-Fluor-16dHiydroxycortisol zu 9öl-Fluor-16d-hydroxyprednisolon (Triamcinolon),
9d^-Fluorcortisol zu 9A-Fluorprednisolon,
6<A, 94-Dlf luor-16dl,1 ΤΛ-isopropylidendioxycortisol zu 60\,9eA-Difluor-16 A, 17^-isopropylidendioxyprednisolon,
2. 1 "!^-Hydroxylierung. Einarbeitung einer Hydroxylgruppe in
die Umstellung des Steroidmoleküls. Beispiel: umformung
von Cortexolon und Cortexolonderivaten in 1 M-Hydroxycortexolon (Epicortisol) und Epicortisolderivate.
3. Hß-Hydroxylierung. Einarbeitung einer Hydroxylgruppe in die
11B-Steilung des Steroidmoleküls. Beispiel: 11ß-Hydroxylierung von Cortexolon und Cortexolonderivaten, wie Cortexolon
zu Cortisol,
9ot-Fluor-16ß-methylcortexölon zu got-Fluor-löß-methylcortisol,
9A-Fluor-16A-niethylcortexolon zu 9<A-Fluor-16o^-methylcortisol,
9db-Fluorcortexolon zu 9fl^-Fluorcortisol,
6^-Fluor-1 eok-methylcortexolon zu öfll-Fluor-ieol-methylcortisol,
6(^-Methylcortexolon zu 6<VNethylcortisol,
6(A, 9*-Dif luor cortexolon zu 60(,9dL-Di£luorcortisol,
64, g^-Difluor-ie^iiTol-isopropylidendioxycortexolon zu
6*, 9<Ä-Difluor-16<λ, 1 'M-isopropylidendioxycortisol.
4. 16d^-Hydroxylierung. Einarbeitung einer Hydroxylgruppe in die
16^-Steilung des Steroidmoleküls. Beispiel:
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16et-Hydroxylierung von Cortisol und Cortisolderivaten, wie
βΑ-Fluorcortisol zu edl-Fluor-löc^-hydroxycortisol,
9 efc-Fluorcortisol zu 9<A-Fluor-16o(-hydoxycortisol,
64,9etrDifluorCortisol zu 6e(,9o(-Difluor-iö^-hydroxycortisol.
5. Penicillin G-Umwandlung. Umwandlung von Benzylpenicillin
(Penicillin G) in 6-Aminopenicillansäure,
6. Seitenketteneliminierung. Beispiel: Umwandlung von Sitoste-
4
rol in Δ -Androsten-S^T-dion.
Cholesterol in Δ ' -Androstadien-3, 17-dion,
7. 12^-Hydroxyelimierung. Beispiel: Umwandlung von Cholinsäure
in Chenodesoxycholinsäure.
Geeignete Organismen, die in Verbindung mit dieser Erfindung verwendet werden können, sind:
1. Arthrobacter simplex (auch genannt Corynebacterium simplex,
beispielsweise ATCC 6946). Dieser Organismus kann für die Δ -Dehydrierung verwendet werden.
2. Rhiζopus nigricans (auch Rhizopus stolinifer genannt, wie
beispielsweise ATCC 6227b). Dieser Organismus kann für die 11 (/»,-Hydroxylierung verwendet werden.
3. Curvularia lunata, wie beispielsweise ATCC 12017. Dieser Organismus
kann für die 11ß-Hydroxylierung verwendet werden.
4. Escherichia coli, wie beispielsweise ATCC 9637. Dieser Organismus
kann für die 6-Aminopenicillansäureherstellung aus Penicillin G verwendet werden.
5. Aspergillus niger. Dieser Organismus kann für die 16c(-Hydroxylierung
verwendet werden.
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6. Streptomyces venezuelae. Dieser Organismus kann für die Isomerisierung von Glucose verwendet werden.
7. Brevibacterium ammoniogenes. Dieser Organismus kann für die
Umwandlung von Purinbasen, Nucleosiden und Nucleotiden verwendet werden.
Die Mikroorganismen werden in einem geeigneten Träger, wie Poly
acrylamid, Agar (2,5 bis 15 % Gewicht/Volumen), Collagen (Zellen zu Collagen 1:1) oder Calciumalginat (1 bis 5 %) t immobili
siert.
Die Erfindung liefert ein Verfahren zur Verhinderung der Aktivitätsabnahme immobilisierter lebender Mikroorganismen und
selbst zur Verbesserung der Aktivität bei wiederholtem oder kon tinuierlichem Arbeiten. Spezieller liefert die Erfindung ein
Verfahren zur Aktivierung immobilisierter lebender Mikroorganis men in Anwendung auf Utaformungen von Steroiden, Antibiotika und
anderen Verbindungen, wo immobilisierte Mikroorganismen verwendet werden, und dieses Verfahren ist durch die Zugabe von Pepton und Glucose zu dem Reaktionsgemisch gekennzeichnet. Vorzugs
weise sollte Pepton in dem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1,0 (Gewicht/Volumen) verwendet werden. 0,1 % (Gewicht/Volumen)
Pepton und 0,2 % (Gewicht/Volumen) Glucose in Kombination mit·;
einander erbringen auch gute Ergebnisse. Die Temperatur bei dem Verfahren sollte 20 bis 30° C betragen, und das Verfahren sollte bei aeroben Bedingungen durchgeführt werden.
In diesem Experiment war das untersuchte System die wichtige Corticosteroidumwandlung: Cortisol
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Die umsetzung wurde durch in Polyacrylamid eingeschlossenen
Arthrobacter simplex (auch als Corynebacterium simplex bezeichnet)
katalysiert.
Ά. simplex-Zellen wurden in einem Medium von 0,25 % Hefeextrakt
gezüchtet. Die Δ -Dehydrogenaseaktivität wurde durch Zugabe von Cortisol zu der Kultur 12 Stunden vor der Isolierung durch kontinuierliches
Zentrifugieren bei 10 000 χ g induziert. Die Zellen (5 g Naßgewicht) wurden in 20 ml eiskaltem 0,1 M Tris-HCl-Puffer,
pZ 7,5, suspendiert und mit 25 ml eiskalter wäßriger Monomerlösung, die 7,13 g Acrylamid und 0,38 g N,N -Methylenbisacrylamid
enthielt, vermischt. Das Gemisch wurde in einen sandwichartigen Polymerisationskessel (aus zwei Glaspletten
20 χ 20 χ 0,2 cm, mit einem Stück Latexröhre 2 mm voneinander
beabstandet) gegossen, und die Katalysatoren Kaliumpersulfat
(50 mg) und Tetramethyläthylendiamin (100 mg) wurden in Wasser (1 ml) zugegeben. Stickstoffgas wurde durch die Suspension
hindurchgeperlt, und die Polymerisation begann innerhalb von 2 Minuten. Der Polyacrylamidgelbogen wurde in einem Mischer zerkleinert,
und die Gelgranalien (mittlere Korngröße 0,2 mm) wurden intensiv mit Tris-Puffer gewaschen und dann bei -20° C gelagert,
bei welcher Temperatur das Präparat über mehrere Monate stabil war.
Die 3-Ketosteroid-Δ -dehydrogenaseaktivität des immobi user ten
λ. simplex wurde bequeraerweise nach einem spektrophotcnetrischen
Verfahren untersucht, und das einzige Produkt, Prednisolon, wurde durch Dünnschichtchromatographie identifiert. Etwa 40 1 der
Dehydrogenaseaktivität wurden während des Immobilisierungeverfahrens behalten (alle zugesetzten Bakterien waren inmobilisiert,
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und während der Inkubationen wurde keine Bakterienabgabe beobachtet)
. Anfangsexperimente ergaben jedoch, daß die Aktivität ziemlich rasch bei wiederholten ansatzweisen Umwandlungen hoher
Cortisolbelastungen abnahmen, und dies konnte nur in begrenztem Umfang durch Zugabe des künstlichen Elektronenakzeptors
Menadion kompensiert werden. Stattdessen wurde der stabilisierende Einfluß verschiedener Nährstoffe und Salze untersucht.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen I und II zusammengefaßt. In Medien, die aus Wasser oder Puffer bestanden, nahm die Aktivität
ab, während in Pepton und Glucose enthaltenden Medien die Aktivität
nicht nur erhalten blieb, sondern sogar stark auf das Mehrfache der ursprünglichen Aktivität anstieg. Das Medium mit
0,5 % Pepton und das Medien mit 0,1 % Pepton plus 0,2 % Glucose wurden für weitere Studien ausgewählt, und ein Experiment mit
wiederholter ansatzweiser Umwandlung wurde durchgeführt. Beide Medien waren etwa gleich wirksam, und in Tabelle III sind die
mit dem Medium mit 0,5 % Pepton erhaltenen Ergebnisse aufgeführt. Wie ersichtlich ist, stieg die Umwandlungskapazität merklich
mit jedem Versuch. So war der letzte Ansatz in weniger als 2 Stunden beendet, während in dem ersten Ansatz eine 100 %-ige
Umwandlung erst nach 18 Stunden erhalten wurde. Die Umwandlungskapazität am Ende des Experimentes betrug etwa 0,5 g Steroid
je Tag je Gramm Gel (Naßgewicht).
Jüngste Vorexperimente zeigten, daß die sogenannte Pseudokristallofermentiermethode auch auf eingeschlossenes A. simplex anwendbar ist. So wurde Cortisol in einer Menge (3,6 g/l), die
seine Löslichkeit in dem Medium weit überstieg, zugesetzt und
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vollständig mit etwa der gleichen Geschwindigkeit wie in Experimenten
mit gelöstem Cortisol umgewandelt. Das Produkt Prednisolon, das ausfiel, konnte einfach durch Filtration isoliert
werden, nachdem man die ziemlich dichten Gelgranalien hatte absitzen lassen. Diese Methode gestattet die Verminderung des
Volumens der Medien um Größenordnungen und somit auch die Verminderung der Nährstoffe.
Aktivierungswirkung von Nährstoffen, Puffern und Salzen auf die 3-Ketosteroid-Ä -dehydrogenaseaktivität von immobilisiertem
A. simplex.
Anfangsumwandlungsgeschwindigkeit
Mediuma) | PH | 7,0 | 0 | 2 | in 6 |
% nach 10 |
16 |
Pepton 0,5 % | M, | pH 7,0 | 100 | 460 | 500 | 650 | 530 |
Glucose 0,2 % | PH | 7,0 | 100 | 210 | 17O | 11O | 9O |
K2HPO4, 0,1 M, | PH | 7,0 | 100 | 70 | 50 | 60 | 60 |
Tris-HCl, 0,05 | PH | 7,0 | 100 | 100 | 70 | 70 | 30 |
K2HPO4, 0,1 M, ZnCl2,FeCl2 |
pH | 7,0 | 100 | 50 | 25 | 15 | 10 |
K2HPO4, 0,1 M, CoCl2, MgSO4 |
100 | 40 | 40 | 0 | 0 | ||
K2HPO4, 0,1 M, MgCl2,CaCl2 |
100 | 160 | 130 | 80 | 90 | ||
K3HPO4, 0,1 M, Pepton 0,5 % Glucose 0,2 % MgCl2, CaCl2 |
100 | 560 | 650 | 6OO | 550 | ||
H2O | 100 | 60 | 40 | 40 | 20 | ||
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a) Die Konzentration der anorganischen Salze MgCl-»
CoCl2, FeCl2, CaCl2 und MnSO4 war 1 mMol.
b) Die Aktivität des frisch hergestellten Gels wurde als 1OO %
agenommen.
Ά. simplex-Gel (0,5 g) wurde in 9,0 ml Medium, wie angegeben,
inkubiert, und 0,5 ml 20 mMol Cortisol (in Methanol) wurden zugegeben. Die Suspension wurde auf einem Rotationsschüttler bei
25° C geschüttelt, und in Abständen von 48 Stunden wurde das Medium durch frisches cortisolhaltiges Medium ersetzt. In den
angegebenen Abständen wurde das Gel abfiltriert, gewaschen und hinsichtlich der Δ. -Dehydrogenaseaktivität untersucht.
Aktivierende Wirkung von Pepton/Glucose auf die 3-Ketosteroid-/V -dehydrogenaseaktivität von immobilisertem A. simplex .
Anfangsumwandlungsgeschwindigkeit ' in % nach
Pepton 1 %
0,5 %
0,1 %
0,01 %
Pepton O,1 % Glucose O,2 %
Pepton 0,01 % 100 110 55 0 0
Glucose 0,2 %
Glucose 0,2 % 1OO 210 170 110 90
a) Di· experimentellen Bedingungen sind in Tabelle I angegeben.
b) Di· Aktivität des frisch bereiteten Gels wurde alt 1OO %
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2 | in | % nach | 16 | |
0 | 290 | 6 | 10 | 55O |
100 | 460 | 320 | 38O | 530 |
100 | 200 | 500 | 65O | 120 |
100 | 125 | 225 | 165 | O |
100 | 250 | 30 | 0 | 350 |
100 | 225 | 240 | ||
Wiederholte ansatzweise Umwandlung von Cortisol in Prednisolon. Ver- Umwandlungskapazität (mg
such Prednisolon je Stunde je Zeit für 100 %-ige Umwand-
1 | 3,1 | 17,4 |
2 | 5,0 | 10,8 |
3 | 13,5 | 4,0 |
4 | 18,1 | 3,0 |
5 | 26,3 | 2,1 |
6 | 27,1 | 2,0 |
7 | 27,1 | 2,0 |
8 | 29,6 | 1,8 |
9 | 30,8 | 1,8 |
10 | 31,7 | 1,7 |
A. simplex-Gel (2,0 g) wurde in 285 ml 0,5 %-igem Pepton, pH 7,0,
plus 15 ml 20 mMol Cortisol (in Methanol) suspendiert. Der Fortschritt der Umwandlung wurde spektrophotometrisch verfolgt,
und wenn 100 % Umwandlung in Prednisolon erreicht waren, wurde das Gel gewaschen und wieder mit frischem cortisolhaltxgem
Medium inkubiert. Das gesamte Experiment dauerte vier Tage.
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Claims (7)
- Dr. Hans-Heinrich Willrath tDr. Dieter Weber Dipl.-Phys. Klaus SeiffertPATENTANWÄLTED - 62 WIESBADEN I 29. Juni 1 97 Postfach MV 6145Gmav-Freyt*«-Smt« K Dr . We /W« (061(1) S7t7*0 TdcgiMuMdnsso WlOPATiNT Tatex: 4-186 247LG-535-Aktiebolaget Fermenta, S-152 00 SträngnäsVerfahren zur Aktivierung immobilisierter lebender MikroorganismenPriorität; Schwedische Patentanmeldung Nr. 7607698-3 vom 6. Juli 1976Patentansprüche1/ Verfahren zur Aktivierung immobilisierter lebender Mikroorganismen für die Umformung von Steroiden, Antibiotika und anderen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man zu dem Reaktionsgemisch Pepton und/oder Glucose zusetzt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Cortisol oder ein Derivat desselben in Prednisolon bzw. ein Derivat desselben umwandelt.709882/0905Posuch«*: Frankfurt/Main 676I-«M Bank:Buk AG. Wksbnitn. KoMo-Nr. 176·»ORIGINAL INSPECTED2729A90
- 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Steroid 11- oder 16-hydroxyliert.
- 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Arthrobacter simplex verwendet.
- 5. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß man als Umformung eine Δ -Dehydrierung durchführt.
- 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man in Polyacrylamidgel eingeschlossenen bzw. auf Polyacrylamidgel fixierten Mikroorganismus verwendet.
- 7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man dem Reaktionsgemisch Pepton und/oder Glucose in einer Menge von 0,1 bis 1,0 % (Gewicht je Volumen) zusetzt.709882/0905
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