CH634348A5 - Process for the activation of immobilised microorganisms - Google Patents

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CH634348A5
CH634348A5 CH835577A CH835577A CH634348A5 CH 634348 A5 CH634348 A5 CH 634348A5 CH 835577 A CH835577 A CH 835577A CH 835577 A CH835577 A CH 835577A CH 634348 A5 CH634348 A5 CH 634348A5
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    • C12N11/00—Carrier-bound or immobilised enzymes; Carrier-bound or immobilised microbial cells; Preparation thereof
    • C12N11/02—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier
    • C12N11/04—Enzymes or microbial cells immobilised on or in an organic carrier entrapped within the carrier, e.g. gel or hollow fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aktivierung immobilisierter Mikroorganismen. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Aktivierung immobilisierter lebender Mikroorganismen zur Umwandlung von Steroiden, Antibiotika und anderen Verbindungen.
Immobilisierte Mikroorganismen haben in den letzten Jahren steigendes Interesse als Katalysatoren gefunden (Biotech-nol. Bioeng. 17,1797-1804 (1975); J. Appi. Chem. Biotechnol. 25, 115-141 (1975); Biotechnol. Bioeng. 12,19-27 [1970]). Sie zeigen die gleichen verfahrenstechnischen Vorteile, wie sie immobilisierte Enzyme zeigen (FEBS Lett. 62. (Supplement) E 80 - E 90 ([1976]); sie sind wiederverwendbar, sie sind sehr gut geeignet für kontinuierliche Arbeitsweise unter gesteuerten Bedingungen, und ferner sind sie verhältnismässig widerstandsfähig gegen mikrobiellen Angriff, da sie durch das Polymer geschützt sind. Immobilisierte Mikroorganismen bieten den zusätzlichen Vorteil, dass sie mühsame und kostspielige Enzymisolation vermeiden, dass das Enzym als Folge einer Lokalisierung in seiner «natürlichen Umgebung» stabiler ist und dass üblicherweise kein Kofaktor erforderlich ist. Daher sind immobilisierte Mikroorganismen vielversprechende Katalysatoren, vorausgesetzt, dass kompetitive Reaktionen eliminiert werden können. Bei kontinuierlichen oder wiederholten Chargenoperationen von Transformationsverfahren sinkt die Aktivität jedoch rasch, wenn immobilisierte Mikroorganismen verwendet werden. Dieses im Zusammenhang mit immobilisierten, lebenden Mikroorganismen auftretende Problem konnte bisher nicht in zufriedenstellender Weise gelöst werden.
Bei der vorliegenden Erfindung wird insbesondere eine Eigenschaft in Betracht gezogen, die immobilisierten lebenden Ganzzellenkatalysatoren eigen ist, nämlich die Möglichkeit der In-situ-Aktivierung der immobilisierten Enzymaktivität.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Aktivierung immobilisierter lebender Mikroorganismen für die Umwandlung von Steroiden, Antibiotika und anderen Verbindungen ist im vorangehenden Patentanspruch 1 charakterisiert.
Geeignete Substrate für Umwandlungen, bei denen die Aktivierung nach dem erfindungsgemässen Verfahren angewendet werden kann, sind
1. Steroide, insbesondere Corticosteroide, z.B. Cortisol,
2. Antibiotika, wie beispielsweise Penicillin G,
з. andere Verbindungen, beispielsweise a) Alkaloide, z.B. Solasodin, Tomatidin, b) organische Säuren, z.B. N-Acetyl-L-amino-säuren, c) Kohlenhydrate, z.B. Glucose, Sorbose, und d) Purin-basen, Nucleoside und Nucleotide, z.B. 6-Chlorpurin und 6-Chlorpurinribosid.
Die Aktivierung kann auf verschiedene Systeme angewendet werden, wie beispielsweise die Corticosteroidumwandlung
Cortisol A'-Dehydrogenase Prednisolon
Die Reaktion kann durch Corynebacterium simplex (Arthrobacter simplex), eingeschlossen in Polyacrylamid, katalysiert werden.
Unter den für die Aktivierung nach dem erfindungsgemässen Verfahren geeigneten Umwandlungen können als Beispiele die folgenden erwähnt werden:
1. A'-Dehydrierung. Einführung einer Doppelbindung in 1,2-StelIung des Steroidmoleküls. Beispiel: À'-Dehydrierung von Cortisol und Derivaten von Cortisol, z.B. Cortisol zu Pred-nisolen, 9a-Fluor-16ß-methylcortisol zu 9a-Fluor-16ß-methyl-prednisolon (Betametason), 9a-Fluor-l 6a-methylcortisol zu 9oc-Fluor-16a-methylprednisolon (Dexametason), 6a-Methyl-cortisol zu 6a-Methylprednisolon, 6a-Fluor-16a-methylcortisol. zu 6a-Fluor-16a-methyIprednisolon (Parametason), 9a-Fluor-16a-hydroxycortisol zu 9a-Fluor-16a-hydroxyprednisolon (Triamcinolon), 9a-Fluorcortisol zu 9<x-Fluorprednisolon, 6a,9a-Difluor-16a,17a-isopropylidendioxycortisol zu 6a, 9a-Difluor-16a, 17 a-isopropylidendioxyprednisolon.
2.1 la-Hydroxylierung. Einführung einer Hydroxygruppe in 1 la-Stellung des Steroidmoleküls. Beispiel: Umwandlung von Cortexolon und Cortexolonderivaten in 1 la-Hydroxycortexo-lon (Epicortisol) und Derivaten davon.
3.1 lß-Hydroxylierung. Einführung einer Hydroxylgruppe in die 1 lß-Stellung des Steroidmoleküls. Beispiel: 1 lß-Hydroxylierung von Cortexolon und Cortexolonderivaten, z.B. Cortexolon zu Cortisol, 9a-Fluor-16ß-methylcortexolon zu 9a-Fluor-16ß-methylcortisol, 9a-Fluor-16ß-methylcortexolon zu 9a-Fluor-16a-methylcortisol, 9a-Fluorcortexolon zu 9a-Fluorcortisol, 6a-Fluor-16a-methylcortexolon zu 6a-Fluor-16a-methylcorti-sol, 6a-Methylcortexolon zu 6a-Methylcortisol, 6a,9a-Difluor-cortexolon zu 6a,9a-Difluorcortisol, 6a,9a-Difluor-16a,17a-iso-propylidendioxycortexolon zu 6a,9a-Difluor-16a,17a-isopropy-lidendioxycortisol.
4.16a-Hydroxylierung. Einführung einer Hydroxylgruppe in die 16a-Stellung des Steroidmoleküls. Beispiel: 16a-Hydroxy-lierung von Cortisol und Cortisolderivaten, z.B. Cortisol zu 16a-Hydroxycortisol, 6a-Fluorcortisol zu 6a-Fluor-16a-hydro-xycortisol, 9a-Fluorcortisol zu 9a-Fluor-16a-hydroxycortisol, 6a,9a-Difluorcortisol zu 6a,9a-Difluor-16a-hydroxycortisol.
5. Penicillin-G-Umwandlung. Umwandlung von Benzylpenicillin (Penicillin G) zu 6-Aminopenicillansäure.
6. Seitenkettenabspaltung. Beispiel: Umwandlung von Sito-sterol zu A4-Androsten-3,17-dion, Cholesterin zu A1AA.ndrosta-dien-3,17-dion.
7.12a-Hydroxyabspaltung. Beispiel: Umwandlung von Cholinsäure zu Chenodesoxycholsäure.
Geeignete Organismen, die in Verbindung mit dem erfindungsgemässen Verfahren angewendet werden können, sind
и.a.
1. Arthrobacter simplex (auch Corynebacterium simplex genannt, z.B. ATCC 6946). Dieser Organismus kann für A'-Dehydrierung verwendet werden.
2. Rhizopus nigricans (auch Rhizopus stolinifer genannt, z.B. ATCC 6227b). Dieser Organismus kann für 1 la-Hydroxylierung verwendet werden.
3. Curvularia lunata, z.B. ATCC 12017. Dieser Organismus kann für 1 lß-Hydroxylierung verwendet werden.
4. Escherichia coli, z.B. ATCC 9637. Dieser Organismus
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kann für die Herstellung von 6-Aminopenicillansäure aus Penicillin G verwendet werden.
5. Aspergillus niger. Dieser Organismus kann für 16a-Hydroxylierung verwendet werden.
6. Streptomyces venezuelae. Dieser Organismus kann für die Isomerisierung von Glucose verwendet werden.
7. Brevibacterium ammoniogenes. Dieser Organismus kann zur Umwandlung von Purinbasen, Nucleosiden und Nucleoti-den verwendet werden.
Die Mikroorganismen werden in einem geeigneten Träger immobilisiert, beispielsweise in Polyacrylamid, Agar (2,5-15% GewyVol.), Kollagen (Zelle :Kollagen 1:1) oder Calciumalginat (1-5%).
Die vorliegende Erfindung liefert also ein Verfahren zur Verhinderung der Aktivitätsverminderung von immobilisierten lebenden Mikroorganismen und sogar zur Erhöhung der Aktivität bei wiederholter oder kontinuierlicher Arbeitsweise.
Im folgenden werden anhand von Beispielen bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung näher erläutert.
Beispiel 1
Bei diesem Versuch wurde die wichtige Corticosteroidum-wandlung mit A'-Dehydrogenase Cortisol — Prednisolon untersucht. Die Umsetzung wurde durch polyacrylamideingeschlos-senen Arthrobacter simplex (auch Corynebacterium simplex genannt) katalysiert.
A.-simplex-Zellen wurden in einem 0,25% Hefeextrakt-Medium gezüchtet; die A'-Dehydrogenaseaktivität wurde durch Zugabe von Cortisol zu der Kultur induziert; nach 12 Stunden wurde die Produktgewinnung durch kontinuierliches Zentrifugieren bei 10 000 x g vorgenommen. Die Zellen (5 g Nassgewicht) wurden in 20 ml eiskaltem 0,1 m Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 7,5, suspendiert und mit 25 ml eiskalter wässriger Monomerlösung, die 7,13 g Acrylamid und 0,38 g N.N'-Methy-lenbisacrylamid enthielt, vermischt. Die Mischung wurde in ein sandwichähnliches Polymerisationsgefäss (bestehend aus zwei Glasplatten 20x20x0,2, mit einem Stück Gummischlauch auf einen Abstand von 2 mm gebracht) gegossen, und die Katalysatoren Kaliumpersulfat (50 mg) und Tetramethyläthylendiamin (100 mg) wurden in Wasser (1 ml) zugegeben. Stickstoff wurde durch die Suspension perlen gelassen, und die Polymerisation begann innerhalb von 2 Minuten. Die Polyacrylamidgelfolie wurde in einem Mischer zerteilt, und die Gelkörnchen (durchschnittliche Grösse 0,2 mm) wurden extensiv mit Trispuffer gewaschen und dann bei —20 °C aufbewahrt; bei dieser Temperatur war das Präparat mehrere Monate stabil.
Die 3-Ketosteroid- A'-Dehydrogenase-Aktivität des immobilisierten A. simplex wurde in herkömmlicher Weise nach einem spektrophotometrischen Verfahren bestimmt, und das alleinige Produkt, Prednisolon, wurde durch Dünnschichtchromatographie identifiziert. Etwa 40% der Dehydrogenaseaktivi-tät blieb während des Immobilisierungsverfahrens erhalten (sämtliche zugesetzten Bakterien waren immobilisiert, und keine Freisetzung von Bakterien wurde während Inkubierun-gen beobachtet). Anfängliche Versuche zeigten jedoch, dass die Aktivität bei wiederholten chargenweisen Umwandlungen grosser Mengen von Cortisol ziemlich rasch abnahm, und dies konnte in beschränktem Mass nur durch Zugabe des künstlichen Elektronenakzeptors Menadion kompensiert werden. Statt dessen wurde der stabilisierende Einfluss verschiedener Nährstoffe und Salze untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen I und II angegeben. In Medien, die aus Wasser oder Puffer bestanden, nahm die Aktivität ab, während in Medien, die Pepton und Glucose enthielten, die Aktivität nicht nur aufrechterhalten wurde, sondern dramatisch auf ein mehrfaches der ursprünglichen Aktivität erhöht wurde. Das Medium mit 0,5% Pepton und das mit 0,1% Pepton + 0,2% Glucose wurde für weitere Untersuchungen ausgewählt, und ein Versuch mit wiederholter chargenweiser Umwandlung wurde durchgeführt. Beide Medien waren etwa gleich wirksam, und in Tabelle III sind die mit dem 0,5% Pepton enthaltenden Medium erhaltenen Resultate angegeben. Wie ersichtlich ist, wird die s Umwandlungskapazität mit jeder Charge deutlich erhöht, während bei der ersten Charge 100%ige Umwandlung nach 18 Stunden erhalten wurde, war die letzte Charge in weniger als 2 Stunden vollständig umgewandelt. Die Umwandlungskapazität am Ende des Versuchs war etwa 0,5 g Steroid/Tag/Gramm io Gel (Nassgewicht).
Beispiel 2
Kürzlich durchgeführte Vorversuche zeigten, dass die sogenannte Pseudokristallofermentationstechnik auch auf einge-i5 schlossenes A. simplex anwendbar ist. Cortisol wurde daher in einer Menge von 3,6 g pro Liter zugesetzt, wodurch die Löslichkeit von Cortisol im Medium weit überschritten wurde. Cortisol wurde etwa mit der gleichen Geschwindigkeit umgewandelt, wie in Versuchen mit gelöstem Cortisol. Das Produkt, 20 Prednisolon, das ausfiel, konnte einfach abfiltriert werden, nachdem man die ziemlich dichten Gelkörnchen hatte absetzen gelassen. Diese Technik erlaubt eine Verminderung des Medienvolumens um mehrere Grössenordnungen und daher auch Verminderung der Nährstoffe.
25
Tabelle I
30 Aktivierungswirkung von Nährstoffen, Puffern und Salzen auf die 3-Ketosteroid- A'-Dehydrogenase-Aktivität von immobilisiertem Arthrobacter simplex
Medium3
35
Anfängliche Umwandlungsrateb (%)nach
0 2 6 10 16 Tagen
Pepton 0,5%
Glucose 0,2% 40 K2HP04,0,1 m, pH 7,0 Tris-HCl, 0,05 m, pH 7,0 K2HPO4,0,1 m, pH 7,0 ZnCh, FeCh K2HPO4,0,1 m, pH 7,0 45 C0Cl2,M9S04
K2HPO4,0,1 m, pH 7,0 MgCl2,CaCl2 K2HP04,0,1 m, pH 7,0 Pepton 0,5%
Glucose 0,2% MgCh.CaCk H2O
100 460 500 650 530 90
100 210 170 110 100 70 50 60
100 100 100 50 100 40
70 25 40
100 160 130
70 15 0 80
60 30
10
0
90
50
100 560 650 600 550 100 60 40 40 20
a Die Konzentration der anorganischen Salze MgCk, ZnCb, 55 C0CI2, FeCl2, CaCk und MnS04 betrug 1 mMol.
b Die Aktivität des frisch hergestellten Gels wurde zu 100% gesetzt.
A.-simplex-Gel (0,5 g) wurde in 9,0 ml des angegebenen Mediums inkubiert, und 0,5 ml 20 mMol Cortisol (Methanol) wurde zugegeben. Die Suspension wurde auf einem Rotationsschüttler bei 25 °C geschüttelt, und in Abständen von 48 Stun-65 den wurde das Medium durch frisches cortisolhaltiges Medium ersetzt. In den angegebenen Abständen wurde das Gel abfiltriert, gewaschen und auf A'-Dehydrogenase-Aktivität untersucht.
634348
4
Tabelle II
Aktivierungswirkung von Pepton/Glucose auf 3-Ketosteroid-A'-Dehydrogenase-Aktivität von immobilisiertem Arthrobacter simplex3
Medium3 Anfängliche Umwandlungsrateb
(%)nach
0
2
6
10
16 Tagen
Pepton 1%
100
290
320
380
550
Pepton 0,5%
100
460
500
650
530
Pepton 0,1%
100
200
225
165
120
Pepton 0,01%
100
125
30
0
0
Pepton 0,1%
Glucose 0,2%
100
250
225
240
350
Pepton 0,01%
Glucose 0,2%
100
110
55
0
0
Glucose 0,2%
100
210
170
110
90
3 Versuchsbedingungen sind in Tabelle I angegeben. b Aktivität des frisch hergestellten Gels = 100% gesetzt.
Tabelle III
Wiederholte chargenweise Umwandlung von Cortisol in Prednisolon
Charge Umwandlungskapazität Zeit für 100% Umwandlung
5 (Nr.) (mg Prednisolon/Std. (Std.)
Ig Gel Nassgewicht)
1
3,1
17,4
2
5,0
10,8
3
13,5
4,0
4
18,1
3,0
5
26,3
2,1
6
27,1
2,0
7
27,1
2,0
8
29,6
1,8
9
30,8
1,8
10
31,7
1,7
2o A.-simplex-Gel (2,0 g) wurde in 285 ml einer Mischung von 0,5% Pepton, pH-Wert 7,0, und 15 ml 20 mMol Cortisol (Methanol) suspendiert. Das Fortschreiten der Umwandlung wurde spektrophotometrisch verfolgt, und bei 100%iger Umwandlung Prednisolon wurde das Gel gewaschen und mit frischem corti-25 solhaltigem Medium inkubiert. Der ganze Versuch dauerte 4 Tage.

Claims (7)

  1. 634348
    PATENTANSPRÜCHE
    1. Verfahren zur Aktivierung immobilisierter lebender Mikroorganismen für die Umwandlung von Steroiden, Antibiotika und anderen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass der Reaktionsmischung Pepton, Glucose oder ein Gemisch von Pepton und Glucose zugesetzt wird.
  2. 2. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Cortisol oder ein Derivat davon in Prednisolon oder einem Derivat davon umgewandelt wird.
  3. 3. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Steroid in 11- oder 16-Stellung hydroxyliert wird.
  4. 4. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Arthrobacter simplex ist.
  5. 5. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein Steroid in 1-Stellung dehydriert wird.
  6. 6. Verfahren gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus in ein Polyacrylamidgel eingeschlossen ist.
  7. 7. Verfahren gemäss einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass Pepton oder Glucose oder ein Gemisch von Pepton und Glucose in einer Konzentration von 0,1 bis 1,0% (Gew./Vol.) der Reaktionsmischung zugesetzt wird.
CH835577A 1976-07-06 1977-07-06 Process for the activation of immobilised microorganisms CH634348A5 (en)

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