FI58941C - Foerfarande foer aktivering av levande immobiliserade mikroorganismer som anvaendes som transformerare i 1-dehydrogenerings- eller 11beta-hydroxyleringsreaktioner av steroider och i transformationsreaktioner av benzylpenicillin - Google Patents

Description

Γοΐ nn KUULUTUSJULKAISU cqQA1 TOfik lBJ (11) UTLÄGGNI NGSSKRIFT 3 ÖV 4 1 vS&W C /4« Patentti ay;r..'.: tty 11 05 1«JC1 ” Patent ineddelat (51) K».ik.3/mt.a.3 C 12 N 11/08 (21) l*Uanttihak«mut — PK«ntant6knlnf T72012 (22) Haktmiipilvl — Amttknlngfdig 28.06.77 (FI) (23) Alkuplivft —GIMfhetadai 28.06.77 (41) Tullut julklMkal — Bllvlt offwKlif 07-01.78

Patentti- ja rekisterihallitus (44) Nihttviksipunon ]· kuuLjuiiui«<n pvm.—

Patent- och regiiterstyrelsen ' Ansekan utiagd och utUkriften pubiicand 30.01.81 (32)(33)(31) Pretty atuotkuus—B«flrd prloritvt 06.07-76

Ruotsi-Sverige(SE) 7607698-3 (71) Aktiebolaget Fermenta, Fack, S-152 00 Strängnäs, Ruotsi-Sverige(SE) (72) Per-01of Larsson, Lund, Klaus Hermann Mosbach, Furulunds Station,

Sten Albert Ohlson, Lund, Ruotsi-Sverige(SE) (7*0 Berggren Oy Ab (5*0 Menetelmä immobilisoitujen elävien mikro-organismien, joita käytetään muuntajina steroidien Δΐ-dehydrogenoimis- tai ιιβ -hydroksyloimis- ja bentsyylipenisilliinin muuntamisreaktioissa, aktivoimiseksi - Förfarande för aktivering av levande immobiliserade mikroorganismer, som användes som transformerare i Δΐ-dehydrogenerings- eller 11^-hydroxyleringsreak-tioner av steroider och i transformationsreaktioner av benzylpenicillin Tämä keksintö kohdistuu menetelmään immobilisoitujen mikro-organismien aktivoimiseksi. Erityisesti tämä keksintö kohdistuu menetelmään sellaisten immobilisoitujen elävien mikro-organismien aktivoimiseksi, joita käytetään steroidien ΔΙ-dehydrogenoimiseksi tai 113-hydroksyloimiseksi ja bentsyylipenisilliinin muuntamiseksi.

Immobilisoidut mikro-organismit ovat saaneet osakseen lisääntyvää mielenkiintoa katalyytteinä viime vuosina (Biotechnol. Bioeng. 17, 1797-1804 (1975); J. Appi. Chem. Biotechnol. 25, 115-141 (1975); Biotechnol. Bioeng. 12, 19-27 (1970). Niillä on samat toiminnalliset edut kuin immobilisoiduilla entsyymeillä (FEBS Lett. 62. (supplement) E 80 - E 90 (1976)); niitä voidaan käyttää uudelleen, ne soveltuvat hyvin jatkuvaan käyttöön säädetyissä olosuhteissa ja ne ovat lisäksi suhteellisen vastustuskykyisiä mikrobeja vastaan, koska polymeeri suojaa niitä. Immobilisoidut mikro-organismit tarjoavat sen lisäedun, että vältytään entsyymin hankalalta ja kalliilta erottamiselta, entsyymi on tavallisimmin pysyvä johtuen siitä, että se on "luonnollisessa ympäristössään" eikä taval- 58941 lisesti tarvita mitään yhteistekijää. Immobilisoidut mikro-organismit ovat siten hyvin lupaavia katalyyttejä, edellyttäen, että kilpailevat reaktiot voidaan eliminoida. Muuntamisprosessin ajossa jatkuvatoimisesti tai toistuvasti panoksittain aktiviteetti kuitenkin heikkenee melko nopeasti käytettäessä immobilisoituja mikro-organismeja. Tätä ongelmaa ei tähän asti ole kyetty tyydyttävästi ratkaisemaan immobilisoitujen elävien mikro-organismien yhteydessä.

Esillä olevassa keksinnössä tarkastellaan erityisesti immobilisoi-duille eläville kokonaissolukatalyyteille ominaista ainutlaatuista ominaisuutta, nimittäin mahdollisuutta paikan päällä aktivoida im-mobilisoitha entsymaattista aktiviteettia.

Sopivia muuntosubstraatteja, joilla keksinnön mukaista aktivointia voidaan soveltaa ovat 1) steroidit, erityisesti kortikosteroidit, esim. kortisoli

2) antibiootit, kuten penisilliini G

Aktivointia voidaan soveltaa useisiin järjestelmiin kuten kortiko-steroidi-muuntamiseen kortisoli A^-dehydrogenaasi^ prednisoloniksi. Reaktiota voidaan katalysoida polyakryyliamidiin suljetulla Coryne-bacterium simpleksillä (Arthrobacter simplex).

Keksinnön mukaiseen aktivointiin sopivista muuntamisista voidaan mainita 1) A^-dehydrogenaatio. Kaksoissidoksen lisääminen steroidimo- lekyylin 1,2-asemaan. Esimerkki:

Kortisolin ja kortisolin johdannaisien A1_dehydrogenaatio, esim. kortisoli prednisoloniksi.

2) llg-hydroksylointi. Hydroksiryhmän liittäminen steroidimo- lekyylin llg-asemaan. Esimerkki:

Korteksolonin ja sen johdannaisien lls-hydroksylointi, esim. kor-teksoloni kortisoliksi.

58941 3) Penisilliinin G muuntaminen. Bentsyylipenisilliinin (penisilliinin G) muuntaminen 6-aminopenisillaanihapoksi.

Keksinnön yhteydessä käyttökelpoisia sopivia organismeja ovat 1) Arthrobacter simplex (kutsutaan myös Corynebacterium simplex' iksi, esim. ATCC 6946). Tätä organismia voidaan käyttää Δ^-dehydro-genointiin.

2) Curvularia lunata, esim. ATCC 12017. Tätä organismia voidaan käyttää 110-hydroksylointiin.

3) Escherichia coli, esimerkiksi ATCC 9637. Tätä organismia voidaan käyttää 6-aminopenisillaanihapon valmistamiseen penisilliinistä G.

Mikro-organismit immobilisoidaan sopivassa kantajassa, kuten poly-akryyliamidissa, agarissa (2,5-15 % p/t) tai kalsiumalginaatissa (1-5 %).

Tämän keksinnön tarkoituksena on aikaansaada menetelmä immobili-soitujen elävien mikro-organismien aktiviteetin heikkenemisen ehkäisemiseksi ja aktiviteetin kohottamiseksi toistuvassa tai jatkuvassa käytössä. Tämän keksinnön tarkoituksena on erityisesti aikaansaada menetelmä sellaisten immobilisoitujen elävien mikro-organismien aktivoimiseksi, joita käytetään steroidien ΔΙ-dehydro-genointiin tai Ιΐβ-hydroksylointiin ja bentsyylipenisilliinin muuntamiseen immobilisoituja mikro-organismeja käytettäessä ja keksintö tunnetaan pääasiallisesti siitä, että reaktioseokseen, joka sisältää elatusainetta, immobilisoituja mikro-organismeja ja muunnettavaa substraattia, lisätään peptonia, glukoosia tai peptonin ja glukoosin seosta, edullisesti määrässä 0,1-1,0 % (p/t). Peptonia tulee edullisesti käyttää 0,1-1,0%(p/t). Hyviä tuloksia saadaan myös 0,1 %:11a (p/t) peptonia yhdessä 0,2 %:n kanssa (p/t) glukoosia. Prosessilämpötilan tulee olla 20-30°C ja prosessi on suoritettava aerobisissa olosuhteissa.

Keksintöä selostetaan alla lähemmin esimerkkien avulla.

58941

Esimerkki 1 Tässä kokeessa tutkittiin kortikosteroidin muuntojärjestelmää kortisoli A^-dehydrogenaasi^ prednisoloniksi. Tätä reaktiota katalysoitiin polyakryyliamidiin suljetulla Arthrobacter simplex'illä (kutsutaan myös Corynebacterium simplex'iksi).

A. simplex-soluja kasvatettiin 0,25 %:sessa hiivauuteväliaineessa. A^-dehydrogenaasiaktiviteetti käynnistettiin lisäämällä kortisolia viljelmään 12 tuntia ennen korjaamista, joka suoritettiin sentri-fugoimalla jatkuvasti 10 000 x g:11a. Solut (5 g märkäpaino) suspen-doitiin 20 ml:aan jääkylmää 0,1 M tris-HCl-puskuria, pH 7,5 ja sekoitettiin 25 ml:an kanssa jääkylmää vesipitoista monomeeriliuosta, joka sisälsi 7,13 g akryyliamidia ja 0,38 g N,N -metyleeni-bis-akryyliamidia. Tämä seos kaadettiin laminoituun polymerointiastiaan (valmistettu kahdesta 20 x 20 x 0,2 cm:n suuruisesta lasilevystä, jotka on erotettu 2 mm:n päähän toisistaan lateksiputken palasella) ja katalyytit, kaliumpersulfaatti (50 mg) ja tetrametyylietyleeni-diamiini (100 mg) lisättiin veteen (1 ml). Typpikaasua kuplitettiin suspension läpi ja polymerointi aloitettiin 2 minuutin sisällä. Polyakryyliamidigeelilevy jaettiin osiin sekoittimessa ja geelira-keet (keskimääräinen koko 0,2 mm) pestiin tarkoin tris-puskurilla ja varastoitiin sen jälkeen -20°C:ssa, jossa lämpötilassa valmiste oli pysyvä useita kuukausia.

Immobilisoidun A. simplex*in 3-ketosteroidi-A^-dehydrogenaasiak-tiviteetti analysoitiin spektrofotometrisellä menetelmällä ja ainoa tuote, prednisoloni identifioitiin ohutkerroskromatografiällä. Noin 40 % dehydrogenaasiaktiviteetista säilyi immobilisoinnin aikana (kaikki lisätyt bakteerit tulivat liikkumattomiksi eikä bakteerien vapautumista havaittu inkubointien aikana). Alkukokeet osoittivat kuitenkin, että aktiviteetti heikkeni suhteellisen nopeasti, kun kortisolia muunnettiin suuria määriä toistuvasti annoksittain ja tämä oli kompensoitavissa ainoastaan rajoitetussa määrin lisäämällä keinotekoista elektronia vastaanottavaa 2-metyyli-l,4-naftokinonia (menadionia). Sen sijaan tutkittiin erilaisten ravintoaineiden ja suolojen stabiloivaa vaikutusta. Tulokset on esitetty taulukoissa I ja II. Vettä tai puskuria olevissa väliaineissa aktiviteetti heikkeni. Peptonia ja glukoosia sisältävissä väliaineissa sen sijaan aktiviteetti ei ainoastaan säilynyt vaan kohosi lisäksi tuntuvasti useita kertoja suuremmaksi kuin 5 58941 alkuperäinen aktiviteetti. 0,5 %:nen peptoniväliaine ja 0,1 %:nen peptoni + 0,2 %:nen glukoosiväliaine valittiin jatkotutkimusta varten ja suoritettiin koe toistuvilla panoksittaisilla muuntamisilla. Molemmat väliaineet olivat suurin piirtein yhtä tehokkaita ja taulukossa III on esitetty 0,5 %:sella peptoniväliaineella saatuja tuloksia. Kuten nähdään lisääntyi muuntokapasiteetti huomattavasti jokaisessa ajossa, siten 100 %:nen muuntuminen saatiin ensimmäisessä ajossa vasta 18 tunnin jälkeen kun taas viimeinen panos oli suoritettu loppuun vähemmässä kuin 2 tunnissa. Muunto-kapasiteetti oli kokeen lopussa noin 0,5 g steroidia/päivä/g geeliä (märkäpaino).

Esimerkki 2

Esikokeet ovat osoittaneet, että n.k. pseudo-kidekäymistekniikka on sovellettavissa myös suljettuun A. simplex*iin. Kortisolia lisättiin määrässä (3,6 g/1), joka huomattavasti ylitti sen liukoisuuden väliaineeseen ja muunnettiin täydellisesti suurin piirtein samalla nopeudella kuin liuenneella kortisolilla suoritetuissa kokeissa. Saostuva prednisolonituote voitiin erottaa yksinkertaisesti suodattamalla, sen jälkeen kun suhteellisen tiiviit geeli-rakeet ensin olivat saaneet laskeutua. Tällä tekniikalla voitiin väliainetilavuuksia pienentää kooltaan ja myös ravinteiltaan.

5 g akryyliamidigeeliä sisältäen 10 % A. simplex*iä inkuboitiin 20 mlrssa väliainetta ravistelupöydällä. Väliaine sisälsi 181 mg kortisolia, 5 % metanolia sekä joko vettä tai 0,5 % peptonia + 0,2 % glukoosia. Tietyin aikavälein otettiin näytteitä, jotka analysoitiin korkeapaine-nestekromatografiällä (HPLC). 24 tunnin kuluttua geelit suodatettiin talteen ja inkuboitiin tuoreen väliaineen kanssa. Tulokset on esitetty taulukossa I.

Taulukko I

Ravintoaineiden aktivoiva vaikutus kortisolin pseudo-kidekäymi-sessä predhisoloniksi käyttäen polyakryyliamidiin immobilisoitua A. simplex'iä.

Väliaine Muuntonopeus (= % muodostunut prednisoloni 5 tunnin aikana) inkuboinnissa n:o 1 2 3 4 5 0,5 % Peptoni 38 50 67 77 77 0,2 % Glukoosi H20 32 21 20 15 13 58941

Taulukko II

Ravintoaineiden, puskurien ja suolojen aktivoiva vaikutus polvakryyliamidiin irnmobilisoituun A. simplex’in 3-ketosteroidi-A^-dehydrogenaasi-aktiviteettiin cl) b} Väliaine3· Alkuperäinen muuntonopeus solussa0 (%) 0 2 6 10 16 päivän jälkeen

Peptoni 0,5 % 100 460 500 650 530

Glukoosi 0,2 % 100 210 170 110 90 K2HP04, 0,IM, pH 7,0 100 70 50 60 60

Tris-HCl, 0,05M, pH 7,0 100 100 70 70 30 / K-HPO4, 0,IM, pH 7,0 (zncl2. Fed, 100 50 25 15 10 fK-HPO., 0,IM, pH 7,0 lcoCl2; MgSO, 100 40 40 0 0 |Ί<2ΗΡ04, 0, IM, pH 7,0 100 160 130 8Q g0 \MgCl2/ CaCl2 rK2HP04, 0,IM, pH 7,0 JPeptoni 0,5 % \n, . · n o a 10° 560 650 600 550

Glukoosi 0,2 % ^MgCl2, CaCl2 H20 100 60 40 40 20 a) epäorgaanisten suolojen MgCl2/ ZnCl2f CoCl2» FeCl2/ CaCl2 ja MnS04 pitoisuus oli 1 mM, b) vastavalmistetun geelin aktiviteetti määritelty 100 %:ksi.

A. simplex-geeliä (0,5 g) haudutettiin 9,0 ml:ssa väliainetta, kuten on esitetty ja 0,5 ml 20 millimolaarista kortisolia liuotettuna metanoliin lisättiin. Supensiota ravistettiin pyörivässä ravistimessa 25°C:ssa ja 48 tunnin välein väliaine korvattiin vastavalmistetulla kortisolia sisältävällä väliaineella. Esitettyjen intervallien jälkeen poistettiin geeli suodattamalla, pestiin ja Δ^-dehydrogenaasiaktivi-teetti analysoitiin.

7 58941

Taulukko III

Peptoni/glukoosin aktivoiva vaikutus rolyakryyliamidiin inmobilisoituun A.

a) 1 simplex'in 3-ketosteroidi-A -dehydrogenaasiaktiviteettiin Väliaine Alkuperäinen muuntonopeus0' (%) 0 2 6 10 16 päivän jälkeen

Peptoni 1 % 100 290 320 380 550 0,5 % 100 460 500 650 530 0,1 % 100 200 225 165 120 0,01% 100 125 30 0 0 (Peptoni 0,1 % χοθ 250 225 240 350 (Glukoosi 0,2 %

Peptoni 0,01 % iqO 110 55 0 0 ^Glukoosi 0,2 %

Glukoosi 0,2 % 100 210 170 110 90 a) koeolosuhteet esitetty taulukossa II.

b) vastavalmistetun geelin aktiviteetti määritetty 100 %:ksi.

Taulukko XV

Kortisolin toistuva panoksittainen muuntaminen prednisoloniksi

Ajo Muuntokapasiteetti Aika 100 %:seen konversioon (n:o) (mg prednisolonia/h/g ,,, geeliä (märkäpaino)) 1 3,1 17,4 2 5,0 10,8 3 13,5 4,0 4 18,1 3,0 5 26,3 2,1 6 27,1 2,0 7 27,1 2,0 8 29,6 1,8 9 30,8 1,8 10 31,7 1,7 A. simplex-geeliä (2,0 g) suspendoitiin 285 ml:an 0,5 %:sta peptonia, 1¾ 7,0 + 15 ml:an 20 millimolaarista kortisolia liuotettuna metanoliin. Konversion edistymistä seurattiin spektrofotometrisesti ja kun oli saavutettu 100 %:nen prednisolonin konversio pestiin geeli ja haudutettiin jälleen tuoreella kortisolia sisältävällä väliaineella. Koko koe kesti 4 päivää.

8 58941

Esimerkki 3 Tässä kokeessa steroidia muuntava mikro-organismi A. simplex im-mobilisoitiin kalsiumalginaattiin. Immobilisointi suoritettiin seuraavalla tavalla: A. simplex (0,5 g märkäpaino), kasvatettu kuten esimerkissä 1, suspendoitiin 9,5 ml:aan natriumalginaattiliuos-ta. Tämä seos vietiin tipoittain 0,1 M CaCl2 liuokseen, jolloin muodostui pallomaisia bakteeripitoisia partikkeleita (halkaisija 2 mm). Partikkeleiden annettiin olla 0,1 M. CaCl2:ssa 20 tunnin ajan. Tämän jälkeen geelit aktivoitiin ravintoaineilla ja steroidia muuntava aktiviteetti määritettiin tietyin aika-välein. Tulokset ilmenevät taulukosta V.

Taulukko V

Ravintoaineiden vaikutus kalsiumalginaattigeeliin immobilisoidun A. simplex'in 3-ketosteroidi-A^-dehydrogenaasiaktiviteettiin.

Väliaine Alkuperäinen muuntonopeus solussa (%) 0 1 2 4 6 11 päivän jälkeen 0,5 % Peptoni 100 280 330 460 480 670 0,5 % Peptoni 100 260 310 500 560 930 0,2 % Glukoosi H20 100 90 70 35 20 a) Vastavalmistetun geelin aktiviteetti on 100 %.

Esimerkki 4 Tässä esimerkissä A. simplex immobilisoitiin 2 % kalsiumalginaattigeeliin (halkaisija 1 mm).

5 g alginaattigeeliä sisältäen 10 % A. simplex'iä inkuboitiin 20 ml:ssa väliainetta ravisteluptfydällä. Väliaine sisälsi 181 mg kortisolia, 5 % metanolia sekä joko vettä tai 0,5 % peptonia + 0,2 % glukoosia ja siinä oli lisäksi 0,05 M CaCl2· Tietyin aikavälein otettiin näytteitä, jotka analysoitiin korkeapaine-neste-kromatografiällä (HPLC). 24 tunnin kuluttua geelit suodatettiin talteen ja inkuboitiin tuoreen väliaineen kanssa. Tulokset ilmenevät taulukosta VI.

9 58941

Taulukko VI

Ravintoaineiden aktivoiva vaikutus kortisolin pseudo-kidekäymi-sessä prednisoloniksi käyttäen kalsiumalginaattigeeliin immobi-lisoitua A. simplex'iä.

Väliaine Muuntonopeus (= % muodostunutta prednisolonia 5 tunnin aikana) inkuboinnissa n:o 1 2 3 4 5 0,5 % Peptoni 11 23 38 45 53 0,2 % Glukoosi H20 22 17 15 12 11

Esimerkki 5 Tässä kokeessa lohkaistiin fenyylietikkahappoa penisilliini G:stä kalsiumalginaattigeeliin immobilisoiduilla Escherichia coli'lla.

E. colia kasvatettiin 36 tunnin ajan väliaineessa, joka sisälsi 3 % maissin liuotusvettä, 0,15 % ammoniumsulfaattia ja 0,4 % fenyylietikkahappoa; pH = 6,5. Bakteerit otettiin talteen sentrifu-goimalla. Bakteerit immobilisoitiin 2 %:seen kalsiumalginaattiin (bakteeripitoisuus 15 %). Saatua bakteerigeeliä käytettiin akti-vointikokeessa, jossa käytettiin eri väliaineita. 24 tunnin aktivoinnin jälkeen mitattiin penisilliiniasylaasiaktiviteetti (tit-raamalla), jonka jälkeen aktivointia jatkettiin ja todettiin kvalitatiivisesti korkeapaine-nestekromatografiällä (HPLC). Tulokset ilmenevät taulukosta VII.

Taulukko VIi

Aktivointi- Alkuperäinen aktiviteetti väliaine 0123 päivän jälkeen H20 100 75 140 0 0,1 % fenyyli- 100 - 50 - etikkahappo 0,5 % Peptoni 100 140 30 0 0,5 % Peptoni + 100 840 1100 1900 0,1 % fenyyli-etikkahappo a) Kaikki aktivointivälineet sisälsivät 0,05 M CaCl2:ta.

b) Aktiviteetti määritettiin titraamalla pH:ssa 7,5. Titrausastia sisälsi 0,25 g E. coli-geeliä suspendoituna 3 mlraan 0,05 M CaCl2 + 5 mH penisilliini G.

Tuoreen geelin aktiviteetti on 100 %.

5 8 9 A 1 10

Esimerkki 6 Tässä esimerkissä tutkittiin korteksolonin muuntamista kortisoliksi immobilisoidun Curvularia lunata'n avulla.

C. lunata'n itiöitä immobilisoitiin 3 % kalsiumalginaattigeeliin (10 000 itiötä/ml geeliä). Geeliä inkuboitiin 24 tunnin ajan väliaineessa, joka sisälsi 1 % maissin liuotusvettä, 0,5 % glukoosia, 0,05 M CaCl2, pH 4,0. Tällöin itiöt itivät ja kasvoivat muodostaen immobilisoidun verkkorakenteen.

C. lunata'lla suoritettiin muuntamiskokeet seuraavasti: 1 g alginaattigeeliä suspendoitiin 25 ml:aan väliainetta, joka 0,01 mM korteksolonin, 2 % metanolin ja 0,05 M CaCl2:n lisäksi sisälsi 0,5 % peptonia +0,2 % glukoosia, pH 4, tai 1 % maissin liuotusvettä +0,5 % glukoosia. Näytteitä otettiin tietyn ajan välein ja ne analysoitiin korkeapaine-nestekromatografiällä (HPLC).

48 tunnin kuluttua geeli suodatettiin pois ja suoritettiin uusi inkubointi tuoreella väliaineella. Tulokset ilmenevät taulukosta VIII.

Taulukko VIII

8.) Väliaine Steroidi-116-hydroksylaasiaktiviteetti (= % muodostunut kortisoli 24 tunnin aikana) eri ravintoliuoksissa inkuboinnissa n:o 12 3 1 % Maissin liuotusvesi + 65 75 81 0,5 % Glukoosi 0,5 % Peptoni + 59 23 - 0,2 % Glukoosi H20 67 23 24 a) Kaikki väliaineet sisälsivät 0,1 mM korteksolonia, 2 % metanolia, ja 0,05 M CaCl2:ta.

58941 Föreliggande uppfinning avser ett förfarande för aktivering av immobiliserade raikroorganismer. Föreliggande uppfinning avser speciellt ett förfarande för aktivering av iminobiliserade levande mikroorganismer som används för ΔΙ-dehydrogenisering eller 11β-hydroxylering av steroider och transformation av benzylpenicillin.

Under de senaste ären har iminobiliserade mikroorganismer tilldelats ökat intresse som katalysatorer (Biotechnol. Bioeng. 17, 1797-1804 (1975) ; J. Appi. Chem. Biotechnol. 25, 115-141 (1975); Biotechnol. Bioeng. 12, 19-27 (1970). De uppvisar sanana funktionella fördelar som iminobiliserade enzymer (FEBS Lett. 62. (supplement) E 80 - E 90 (1976) ; de kan äteranvändas, de är lämpliga för kontinuerlig an-vändning under kontrollerade förhällanden och de är dessutom rela-tivt motständskraftiga mot mikrober, eftersom polymeren skyddar dem. Iminobiliserade mikroorganismer erbjuder den extra förmänen, att den omständiga och dyra separationen av enzymen bortfaller, enzymen är mer än vanligt stabil beroende pä att den befinner sig i sin "naturliga omgivning", och utan att det behövs nägon gemensam faktor. Sälunda är iminobiliserade mikroorganismer mycket lovande katalysatorer, förutsatt att tävlande reaktioner kan elimineras.

Vid kontinuerlig eller upprepad satsvis drift av transformations-processen försvagas emellertid aktiviteten relativt snabbt vid an-vändning av iminobiliserade mikroorganismer. Detta problem har man inte hittills lyckats nöjaktigt lösa i samband med iminobiliserade levande mikroorganismer.

I föreliggande uppfinning betraktas speciellt en egenskap som är unik för immobiliserade levande helcellkatalysatorer, nämligen möjligheten att in situ aktivera den immobiliserade enzvmatiska aktiviteten.

Lämpliga substrat för transformationer i vilka aktiveringen enligt uppfinningen kan tillämpas är 1) steroider, speciellt cortikosteroider, exempelvis cortisol

2) antibioter, säsom penicillin G

Aktiveringen kan tillämpas pä flera system, säsom cortikosteroid-transformationen cortisol A^-dehydrogena^ prednisolon. Reaktionen kan katalyseras med en i polyakrylamid innesluten Corynebacterium simplex (Arthrobacter simplex).

12 5 894 1

Bland transformationer lämpliga för aktivering enligt uppfinningen kan nämnas 1) Δ^-dehydrogenation. Införandet av en dubbelbindning i steroidmolekylens 1,2-ställning. Exempel: Δ^-dehydrogenation av cortisol och cortisolderivat, exempelvis cortisol till prednisolon.

2) llg-hydroxylering. Införandet av en hydroxigrupp i steroidmolekylens 11B-position. Exempel: 113-hydroxylering av cortexolon och derivat därav, exempelvis cortexolon till cortisol.

3) Penicillin G transformation. Transformation av benzylpeni-cillin (penicillin G) tili 6-aminopenicillansyra.

Lämpliga organismer för användning i samband med uppfinningen är 1) Arthrobacter simplex (även kallad Corynebacterium simplex, exempelvis ATCC 6946). Denna organism kan användas för A^-dehydro-genation.

2) Curvularia lunata, exempelvis ATCC 12017. Denna organism kan användas för Ιΐβ-hydroxylering.

3) Escherichia coli, exempelvis ATCC 9637. Denna organism kan användas för framställning av 6-aminopenicillansyra frän penicillin G.

Mikroorganismerna immobiliseras i en lämplig bärare, säsom poly-akrylamid, agar (2,5-15 % v/v) eller kalciumalginat (1-5 %).

Ändamälet med föreliggande uppfinning är att ästadkomma ett för-farande för förhindrande av försvagningen av aktiviteten av immo-biliserade levande mikroorganismer och höja aktiviteten vid upp-repad eller kontinuerlig användning. Ändamälet med föreliggande uppfinning är speciellt att ästadkomma ett förfarande för aktivering av sädana immobiliserade levande mikroorganismer som används för A1-dehydrogenisering eller llg-hydroxylering av steroider och transformation av benzylpenicillin vid användning av immobiliserade mikroorganismer och uppfinningen kännetecknas huvudsakligen därav, 13 58941 att reaktionsblandningen, sora innehäller näringsmedium, immobili-serade mikroorganismer och substrat för transforraationen, tillförs pepton, glykos eller en blandning av pepton och glykos, fördelaktigen i mängden 0,1-1,0 % (v/v). Pepton bör fördelaktigen användas 0,1- 1,0 % (v/v). Goda resultat erhälls även med 0,1 % (v/v) pepton tillsammas raed 0,2 % (v/v) glykos. Processtemperaturen bör vara 20-30°C och processen bör utföras under aeroba förhällanden.

Uppfinningen skall nedan beskrivas närmare med hjälp av exempel.

Exerapel 1 I detta experiment studerades cortikosteroidens transformations-system cortisol A^-dehvdrogenas^ prednisolon. Reaktionen katalyse-rades med i polyakrylamid innesluten Arthrobacter simplex (kallas även Corynebacterium simplex).

A. simplexceller odlades i ett 0,25 %:igt jästextraktmedium. Δ^-dehydrogenasaktiviteten inducerades genom att tillföra cortisol till odlingen 12 timmar före skördning, som utfördes genom att centrifugera kontinuerligt vid 10 000 g. Cellerna (5 g vätvikt) suspenderades i 20 ml iskall 0,1 M tris-HCl-buffert, pH 7,5 och omrördes med 25 ml iskall vattenhaltig monomerlösning inneh&llande 7,13 g akrylamid och 0,38 g Ν,Ν^-metylen-bis-akrylamid. Blandningen hälldes i ett laminerat polymeriseringskärl (tillverkat av tvä glasskivor av storleken 20 x 20 x 0,2 cm, som separerats pä ett avständ av 2 mm frän varandra med en latexrörstump) och katalysa-torerna, kaliumpersulfaten (50 mg) och tetrametyletylendiaminen (100 mg) sattes till vatten (1 ml). Kvävgas fick bubbla genom sus-pensionen och polymeriseringen startades inom 2 minuter. Poly-akrylaraidgelplattan fragmenterades i en omrörare och geldragöerna (medelstorlek 0,2 mm) tvättades noggrant med tris-buffert och lag-rades därefter vid -20°C, vid vilken temperatur produkten var stabil flera mänader.

3-ketosteroid-A^-dehydrogenasaktiviteten av den immobiliserade A. simplex analyserades spektrofotometriskt och den enda produkten, prednisolon identifierades med tunnskiktskromatografi. Omkring 40 % av dehydrogenasaktiviteten bibehölls under immobiliseringen (alla tillförda bakterier blev immobila och ingen frigöring av bakterier kunde konstateras under inkuberingen). Initialexperiment avslöjade 14 58941 emellertid, att aktiviteten försvagades relativt snabbt, dä stora mängder cortisol transformerades upprepade ganger snabbt i doser och att detta kunde kompenseras endast i begränsad omfattning genom att tillsätta artificiellt elektronaccepterande 2-metyl-l,4-nafto-kinon (menadion). Däremot studerades den stabiliserande effekten av olika näringsmedel och salter. Resultaten framgär av tabellerna I och II. I medium av vatten eller buffert försvagades aktiviteten.

I medium av pepton och glykos bibehölls däremot icke endast aktiviteten utan den steg dessutom märkbart till flera ganger större värden än den ursprungliga aktiviteten. 0,5 % :igtpeptonmedium och 0,1 % :igtpepton + 0,2 %:igtglykosmedium utvaldes för fortsatt studium och experi-mentet utfördes med upprepade satsvisa tranformationer. Bäda medlen var i stort sett lika effektiva och i tabell III har resultaten erhällna med 0,5 %: igt peptonmedium ätergivits. Man ser att transfor-mationskapaciteten ökade märkbart i varje försök, sä att 100 %:ig transformation erhölls i det första försöket först efter 18 timraar me-dan den sista satsen hade slutförts pä mindre än 2 timmar. Trans-formationskapaciteten var vid försökets slut ca 0,5 g steroid/dag/g gel (vätvikt).

Exempel 2

Preliminära försöka har visat, att den s.k. pseudo-kristallofermen-tationstekniken ocksä är tillämpbar pä innesluten A. simplex. Cortisol tillsattes i en mängd (3,6 g/1), som märkbart översteg dess lös-lighet i mediet och transformerades fullständigt med i stort sett samma hastighet som i försöken utförda med löst cortisol. Predniso-lonprodukten som utföll, kunde enkelt separeras genom filtrering, efter det att de relativt tätä gelgranulerna först hade fätt sjunka ned. Med denna teknik kunde man reducera mediavolymerna tili stor-leksordningen och även tili näringsmedlen.

5 g akrylamidgel innehällande 10 % A. simplex inkuberades i 20 ml medium pä skakbord. Mediet innehöll 181 mg cortisol, 5 % metanol samt antingen vatten eller 0,5 % pepton +0,2 % glykos. Prov uttogs med vissa mellanrum och analyserades med högtrycks-vätskekromato-grafi (HPLC). Efter 24 timmar ätervanns gelerna genom filtrering och inkuberades med färskt medium. Resultaten framgär av Tabell I.

Tabell I

58941

Aktiverande effekt av näringsämnen pä pseudo-kristallofermenta-tionen av cortisol till prednisolon vid användning av i poly-akrylamid immobiliserad A. simplex.

iMedium Transformationshastighet (= % bildad prednisolon inom 5 timmars tid) vid inkubering nr 1 2 3 4 5 0,5 % Pepton 38 50 67 77 77 0,2 % Glykos H2C 32 21 20 15 13

Tabell II

Aktiverande effekt av näringsämnen, buffertar och salter pä S-ketosteroid-A^-dehydrogenasaktiviteten hos A. simplex immobiliserad i polyakrylamid.

Medium3 Initial transformationshastighet ;(%) efter 0 2 6 10 16 dagar

Pepton 0,5 % 100 460 500 650 530

Glykos 0,2 % 100 210 170 110 90 K2HP04, 0,1M, pH 7,0 100 70 50 60 60

Tris-HCl, 0,05M, pH 7,0 100 100 70 70 30 (k2HP04, 0,1M, pH 7,0 jznCl2, FeCl2 100 50 25 15 10 (k2HP04, 0,1M, pH 7,0 (CoCl2, MgS04 100 40 40 0 0 iK~HPO,, 0,1M, pH 7,0 „ 100 160 130 80 90

MgCl2, CaCl2 (K2HP04, 0, lM, pH 7,0 jPepton 0,5 % < Λ „ 100 560 650 600 550 IGly.kos 0,2 % ($HqCl2t CaCl2 H20 100 60 40 40 20 a) halten oorganiska salter MgCl2, ZnCl2, CoCl2, FeCl2, CaCl2 och MnS04 var 1 mM, b) aktiviteten hos nypreparerad gel bestämdes till 100 %.

16 58941 A. simplex-gel (0,5 g) inkuberades i 9,0 ml medium, sasom be-skrivits och 0,5 ml 20 millimolär cortisol upplöst i metanol till-sattes. Suspensionen skakades i en roterande skakanordning vid 25°C och medlet ersattes med nypreparerad cortisol innehallande medium med 48 timmars mellanrum. Efter de angivna intervallerna avlägsnades gelen genom filtrering, tvättades och A^-dehydrogenas-aktiviteten analyserades.

Tabell III

Aktiverande effekt av pepton/glykos pi. 3-ketosteroid-A^-dehydro-genasaktiviteten hos A. simplex3^ immobiliserad i polyakrylamid

Medium Initial transformationshastighet^ (%) efter 0 2 6 10 16 dagar

Pepton 1 % 100 290 320 380 550 0,5 % 100 460 500 650 530 0,1 % 100 200 225 165 120 0,01 % 100 125 30 0 0 ^Pepton 0,1 % . P ' 100 250 225 240 350 ( Glykos 0,2 % {Pepton 0,01 % F 100 110 55 0 0

Glykos 0,2 %

Glykos 0,2 % 100 210 170 110 90 a) testförhällandena angivna i tabell II.

b) aktiviteten hos nypreparerad gel är 100 %.

Tabell IV

Upprepad satsvis transformation av cortisol till prednisolon Försök Transformationskapacitet Tid för 100 %:ig konversion (nr) (mg prednisolon/h/g gel ...

(vätvikt)) 1 3,1 17,4 2 5,0 10,8 3 13,5 4,0 ~4 iin n 5 26,3 2,1 _6_27,1_2,0 7 27,1 2,0 8 29,6 1,8 9 30,8 1,8 10 31,7 1,7 17 5 89 41 A. simplex-gel (2,0 g) suspenderades i 285 ml 0,5 %:ig pepton, pH 7,0 + 15 ml 20 millimolär- cortisol upplöst i metanol. Konver-sionens gang följdes spektrofotometriskt och vid uppnädd 100 %:ig prednisolon konversion tvättades gelen och inkuberades äter med medium innehällande färsk cortisol. Hela försöket tog 4 dagar i anspräk.

Exemoel 3 _______-, ..

I detta experiment har den steroidomvandlande mikroorganismen A. simplex immobiliserats i kalciumalginat. Immobiliseringen skedde pä följande sätt: A. simplex (0,5 g vätvikt), uppodlad som i experiment 1, suspenderades i 9,5 ml 2,1 % natriumalginatlösning. Denna blandning droppades ner i 0,1 M CaC^ lösning, varvid sfäriska bakteriehaltiga partiklar bildades (diameter 2 mm). Partiklarna fick stä i 0,1 M CaC^ i 20 h. Därefter aktiverades gelerna med näringsämnen och den steroidomvandlande aktiviteten undersöktes vid olika tider. Resultaten framgär av Tabell V.

Tabell V

Effekt av näringsämnen pä 3-ketosteroid-A -dehydrogenasaktiviteten hos A. simplex immobiliserad i kalciumalginatgel

Medium Initial transformationshastighet (%) efter 0 1 2 4 6 11 dagar 0,5 % Pepton 100 280 330 460 480 670 0,5 % Pepton 100 260 310 500 560 930 0,2 % Glykos H20 100 90 70 35 20 a) Aktiviteten hos nypreparerad gel är 100 %.

Exempel 4 I detta experiment immobiliserades A. simplex i 2 % kalciumalginatgel (diameter 1 mm).

5 g alginatgel innehällande 10 % A. simplex inkuberades med 20 ml medium pä skakbord. Mediet innehöll 181 mg cortisol, 5 % metanol samt antingen vatten eller 0,5 % pepton + 0,2 % glykos och det innehöll dessutom 0,05 M CaC^. Prover togs ut vid olika tider och ana-lyserades med högtrycksvätskekromatografi (HPLC). Efter 24 timmar avfiltrerades gelerna och inkuberades med färskt medium. Resultaten framgär av tabell VI.

18 58941

Tabell VI

Aktiverande effekt av näringsämnen vid pseudokristallofermen-tering av cortisol till prednisolon med A. simplex immobiliserad i kacliumalginatgel.

Medium Transformationshastighet (= % bildad prednisolon inom 5 timmar) under inkubering nr 1 2 3 4 5 0,5 % Pepton 11 23 38 45 53 0,2 % Glykos H20 22 17 15 12 11

Exempel 5 I detta experiment spjälkades fenylättiksyra frän penicillin G med Eschericia coli immobiliserad i kalciumalginatgel.

E. coli odlades i 36 timmar i ett medium innehällande 3 % corn steep liquor, 0,15 % ammoniumsulfat och 0,4 % fenylättiksyra; pH = 6,5. Bakterierna skördades genom centrifugering. Bakterierna immobili-serades i 2 %:ig kalciumalginat (bakteriehalt 15 %). Bakteriegelen användes i ett aktiveringsexperiment, där olika medier användes. Efter 24 timmar aktivering mättes penicillinacylasaktiviteten (titrimetriskt), varefter aktiveringen fortsattes och verifierades kvalitativt med högtrycksvätskekromatografi (HPLC). Resultaten fram-gär av tabell VII.

Tabell VII

Aktiverings- Initial aktivitet efter medium 0 1 23 dagar H20 100 75 140 0 0,1 % fenyl- 100 - 50 - ättiksyra 0,5 % Pepton 100 140 30 0 0,5 % Pepton + 100 840 1100 1900 0,1 % fenylättiksyra a) Samtliga aktiveringsraedier innehöll 0,05 M CaCl2· b) Aktiviteten mättes titrimetriskt vid pH 7,5. Titrerkärlet innehöll 0,25 g E. coli-gel suspenderad i 3 ml 0,05 M CaCl2 + 5 mM penicillin G.

Aktiviteten hos färsk gel Hr 100 %.

19 58941

Exempel 6 I detta exempel studerades omvandling av cortexolon till cortisol med immobiliserad Curvularia lunata.

Sporer av C. lunata immobiliserades i 3 %:ig kalciumalginatgel (10 000 sporer/ml gel). Gelen inkuberades under 24 timmar i ett medium bestäende av 1 % corn steep liquior, 0,5 % glykos, 0,05 M CaCl2, pH 4,0. Därvid grodde sporerna och växte ut till ett immobiliserat nätverk.

Qmvandlingsförsök med immobiliserad C. lunata utfördes pä följande sätt: 1 g alginatgel suspenderades i 25 ml medium som förutom 0,1 itiM cortexolon, 2 % metanol, 0,05 M CaCl2 även innehöll 0,5 % pepton + 0,2 % glykos, pH 4, eller 1 % corn steep liquor + 0,5 % glykos.

Prover togs vid olika tider och analyserades med högtrycksvätske-kromatografi (HPLC). Efter 48 timmar avfiltrerades gelen och ny inkubering med färskt medium vidtog. Resultaten framgär av tabell VIII.

Tabell VIII

3}

Medium ' Steroid-llB-hydroxylasaktivitet (= % bildad cortisol efter 24 timmar) i olika näringsmedier under inkubering nr 12 3 1 % corn steep liquor + 65 75 81 0,5 % Glykos 0,5 % Pepton + 59 23 - 0,2 % Glykos H20 67 23 24 a) Samtliga medier innehöll 0,1 mM cortexolon, 2 % metanol och 0,05 M CaCl2.