DE2714708A1 - Verfahren zum zuechten von zellen - Google Patents

Verfahren zum zuechten von zellen

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DE2714708A1 DE19772714708 DE2714708A DE2714708A1 DE 2714708 A1 DE2714708 A1 DE 2714708A1 DE 19772714708 DE19772714708 DE 19772714708 DE 2714708 A DE2714708 A DE 2714708A DE 2714708 A1 DE2714708 A1 DE 2714708A1
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Description

TD \£ C* Patentanwälte:
TlEDTKE - DOHLING " KlNNE « SIRUPE Dpi hg Tiedtke
„1/r)no Dipl.-Chem. Bühling
L I I k I UQ Dipl.-lng. Kinne
Dipl.-lng. Grupe
Bavariaring 4, Postfach 20 24 . a 8000 München 2
Tel.:(0 89)53 96 53-56
Telex: 5 24 845 tipat
cable. Germaniapatent München
1. April 1977
B 8072/ ICI case B 28671/29218
IMPERIAL CHEMICAL INDUSTRIES LIMITED
London, Großbritannxen
Verfahren zum Züchten von Zellen
A 1
Dresdner Bank (Münciion) KIo 3939 844 Postscheck (München) KIo 670 43-804
Ll I 4708
/0
Zykluszeiten (Sekunden)
0,02 1800
kleiner als 0,01 3600
709841 /09U
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Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Züchten von Zellen und insbesondere auf ein Verfahren zur Züchtung von Mikroorganismen, z.B. Bakterien, Hefen und Pilze. Das Verfahren ist jedoch nicht auf das Züchten von Mikroorganismen beschränkt und kann ebenfalls z. B. bei Gewebekulturen zur Anwendung kommen.
Die Ausbeute, die in Biomasse ausgedrückt wird, welche aus Energie nach unserem praktischen mikrobiologischen Verfahren gewonnen wird, lag häufig unter der maximalen Ausbeute, die bekanntlich erreichbar war. Es wurde gefunden, daß dafür die intermittierende Natur der für die Zellen verfügbaren Energie der Grund ist.
Wenn in dieser Anmeldung auf eine Energiequelle Bezug genommen wird, so bedeutet das eine Energiequelle, die einen begrenzenden Faktor für die Wachstumsgeschwindigkeit der betreffenden Kultur darstellt. Wenn daher die Energiequelle die Kohlenstoffquelle ist, so wird auf eine Kultur Bezug genommen, die unter einer "Kohlenstoffbegrenzung" wächst.
Unter der intermittierenden Natur der Energieverfügbarkeit sind die Veränderungen der Konzentration der Energiequelle der wachsenden Kultur zu verstehen, die von den Abweichungen von einer konstanten Versorgung der Energiequelle in dem Substrat herrühren. Diese Konzentrationsschwankungen in der Kultur führen zu Veränderungen der spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit oder umgekehrt. Es ist das Auftreten dieser Perioden der im wesentlichen spezifischen Nullwachstumsgeschwindigkeit, das den gesamten bioenergetischen Wirkungsgrad der Organismen eher als die scheinbaren Effekte der Veränderlichkeit der Energieversorgung
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der gesamten Kultur beeinflußt.
Die letztere wird durch Beschaffung mechanischer Vorrichtungen vorgesehen, die pulsierend einer Mikroben betreffenden Kultur Energiequellen zuführen kann.
Wenn eine Energiequelle pulsierend einer Kultur zugeführt wird, so geschieht das in diskreten Mengen während gegebener zeitlicher Perioden. Jeder Versorgungsperiode folgt eine Periode, während der die Energie, die hinzugefügt worden ist, zum Verbrauch in der Kultur verfügbar ist.
Wenn die gesamte Energie, die zugeführt worden ist, verbraucht worden ist, folgt eine Periode, während der keine Energie zugeführt oder für die Kultur verfügbar ist. Unter dem Ausdruck "Impulszeit" (pulse time) wird eine Zeitperiode verstanden, während der der Kultur Energie zugeführt wird, plus die folgende Periode, während der die Energie, die zugeführt worden ist, zum Gebrauch durch die Kultur verfügbar ist. Unter "Zykluszeit" wird die Impulszeit plus das folgende Zeitintervall verstanden, in dem keine exogene Energie für die Kultur verfügbar ist, d.h. die gesamte Periode zwischen dem Beginn der einen Periode der Energiezufuhr und dem Beginn der nächsten derartigen Periode, wobei die gesamte Periode notwendigerweise eine Periode erfaßt, wenn keine exogene Energie für die Kultur verfügbar ist.
Es wurden Versuche durchgeführt, bei denen eine Energiequelle, wie eine Kohlenstoffquelle, für eine wachsende Kultur von Mikroorganismen mit Impulsen sowohl regelmäßiger als auch unregelmäßiger Frequenz verfügbar gemacht worden ist. Unter Impulsen regelmäßiger Frequenz sollen Impulse verstanden werden, die gleiche Mengen an Energiequelle erfassen, z.B. der Kohlenstoffquelle, und die in Perioden gleicher Zeit zugeführt werden und in ande-
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ren gleichen Zeitdauern getrennt werden. Unter Impulsen unregelmäßiger Frequenz sollen Perioden der Energiequelle verstanden werden, in denen diese auf eine andere Weise als bei der vorstehend definierten regelmäßigen Frequenz verfügbar gemacht wird , z.B. Perioden, bei denen die Frequenz in zufälliger Weise schwankt, und auch Perioden differierender Frequenz, wobei die differierenden Frequenzen einem wiederholt ablaufenden Muster folgen. Anhand der Ergebnisse dieser Experimente wurde das in Figur 1 der Zeichnungen dargestellte Diagramm gebildet. In diesem Diagramm zeigt die Ordinate das Biomassenwirkungsgradverhältnis (schwankend von 0 - 1,0) der Kultur, wobei es sich um das Verhältnis des beobachteten Energieumsetzungswirkungsgrades des biologischen Systems (das nachfolgend definiert wird) handelt, das in einer Umwelt erhalten wurde, in der Energie diskontinuierlich verfügbar gemacht wurde, zu dem Energieumsetzungswirkungsgrad eines ähnlichen Systems, dem kontinuierlich eine Energiequelle verfügbe\r gemacht wurde. In dem Diagramm stellt die Abszisse in logarithmischer Darstellung die Zykluszeit dar.
Die Abszisse ist auch die arithmetische mittlere Zykluszeit, wenn die Zyklen unregelmäßig sind. Wenn solche unregelmäßigen Zyklen nicht weit um das Mittel verteilt sind, steht das gemessene Wirkungsgradverhältnis im wesentlichen in Übereinstimmung mit der in Fig. 1 gezeigten graphischen Darstellung. Wenn jedoch eine v/ei te Verteilung der Zyklen um das Mittel vorliegt, stimmt das gemessene Wirkungsgradverhältnis (efficiency ratio) mit diesem Diagramm nicht überein, jedoch steht es in Übereinstimmung mit einer Berechnung des Faktors, der bei der Berücksichtigung des gemessenen Mittels des Wirkunqsgrad-verhältnisses betreffend einzelne Zyklen erscheint. Das Diagramm zeigt besonders drei Bereiche:
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Einen ersten Bereich, bei dem die Zykluszeit kurz ist, d.h. die Impulsgeschwindigkeit (Zyklen pro Zeiteinheit) ist hoch und das Wirkungsgradverhältnis der Energieumsetzung zur Biomasse ist praktisch gleichförmig und im wesentliehen konstant. Somit werden keine schädlichen Effekte bei der energetischen Leistungsfähigkeit beobachtet.
Einen ersten Bereich, bei dem die Zykluszeit größer ist als in dem ersten Bereich, d.h. die Impulsgeschwindigkeit ist niedriger und das Wirkungsgradverhältnis (Energie zur TO Bicniasse) neigt sich zuerst zu einem Minimum und nähert sich dann wieder mit ansteigender Zykluszeit einem konstanten höheren Wert, d.h. unter Bildung einer Mulde in dem Diagramm.
Einen ersten Bereich, bei dem die Zykluszeit größer ist als in dem zweiten Bereich, d.h. die Impulsgeschwindigkeit ist niedriger und das Wirkungsgradverhältnis ist im wesentlichen konstant. Das Wirkungsgradverhältnis in diesem Bereich kann gleich oder niedriger als sein Wert in dem ersten Bereich sein. Dieser dritte Bereich endet, wenn die Impulsgeschwindigkeit so niedrig wird, daß der gesamte Wirkungsgrad der Kultur abfällt, wenn die in der Kultur vorliegenden Mikroorganismen in einer beachtlichen Anzahl absterben.
Das oben beschriebene Diagramm bezieht sich auf den Fall, bei dem die Zeit, während der die Kultur bei hoher Geschwindigkeit während eines Zyklusses aufgrund der Zurverfügungstellung der Energiequelle wächst, im wesentlichen kleiner als die gesamte Zykluszeit ist. Für praktische Zwecke kann der Bruchteil der Zeit, der für das Wachsen auf diesem Wege vorgesehen ist, näherungsweise dargestellt werden durch das Verhältnis der auferlegten spezifischen Gesamtwachstumsgeschwindigkeit (μ) zur maximalen spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit (μ ) (μ ), erreichbar durch die Kultur,
max m
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wenn sie nicht durch die Verfügbarkeit des Kohlenstoffs und der Energiequelle begrenzt ist. Es wurde gefunden, daß sich die vorgeschriebene spezifische Gesamtwachstumsgeschwindigkeit μ nähert oder wenn μ so reduziert wird, daß es sich ^m m
u nähert, daß dann der Einfluß des Wirkungsgradverhältnisses auf das energetische Leistungsvermögen der Kulturen bis zu irgendeiner konstanten Impulsgeschwindigkeit ansteigt. Es ist festzuhalten, daß die Veränderungen der spezifischen Wachstumsgeschwindigkeit der Kultur bei kontinuierlich verfügbarer, jedoch begrenzter Energiequelle selbst Wechsel der energetischen Leistungsfähigkeit einer Kultur hervorrufen können. Das Wirkungsgradverhältnis, das vorstehend beschrieben wurde, bezieht sich allein auf die zusätzlichen Effekte, die durch eine diskontinuierlich verfügbare Energiequelle hervorgerufen werden. Umgekehrt geben Abnahmen des Verhältnisses von u zu μ in einer Kultur, bei der die Energiequelle diskontinuierlich verfügbar ist, verminderte energetische Wirksamkeit bei jeder konstanten Impulsgeschwindigkeit, wenn mit einer entsprechenden Kultur verglichen wird, bei der die Energiequelle kontinuierlich verfügbar ist. Diese Ergebnisse werden in einem zweiten Diagramm (Fig. 2) gezeigt, das die gleichen Koordinaten wie das Diagramm nach Fig. 1 hat, und werden dargestellt durch eine Serie von Linien verschiedener Werte μ/μ ,die den Effekt der Änderung des Anteils der Zeit zeigen, injder in irgendeinem Zyklus schnelles Wachstum ablief.
Ein drittes Diagramm, Fig. 3, zeigt den Effekt, der erhalten werden kann, wenn die Zyklen der Energiezurverfügungstellung exakt regelmäßig sind. Eine bedeutende Verminderung des Effektes wird beobachtet, der bei der diskontinuierlichen Zurverfügungstellung von Energie auftritt. In dieser Anmeldung ist der Energieumsetzungswirkungsgrad
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als das Verhältnis der Energiequelle, die zur Bildung der Biomasse beibehalten wird, geteilt durch die gesamte genutzte Energiequelle zu verstehen; wenn z.B. die einzige Energiequelle eine Kohlenstoff enthaltende Verbindung ist, ist es das Verhältnis der Kohlenstoffmasse, die der hergestellten Biomasse einverleibt ist, geteilt durch die gesamte Masse des verwerteten Kohlenstoffs.
Veränderungen oder Impulse bei der der Kultur zugeführten Energie können zu den vorgenannten Zyklen der Energieverfügbarkeit und NichtVerfügbarkeit für die Kultur führen, wobei die Impulse der Versorgung ausreichen, um es den Organismen zu ermöglichen, die Energiequellenreserven in dem Kulturmedium zu erschöpfen. Die pulsierenden Energiezufuhren zu der Kultur, d.h. das Auftreten von zeitlichen Intervallen zwischen aufeinanderfolgenden Zufuhren zur Kultur, können auf zwei gesonderten Wegen oder durch irgendeine Kombination dieser zwei gesonderten Wege erfolgen. Auf dem ersten Weg kann die Energie einer Kultur, z.B. in einem Gärbottich, in Impulsen zugeführt werden, die durch Zeitintervalle getrennt sind, wobei die Zeitintervalle geregelt werden können. Alternativ können nach dem zweiten Weg räumliche Intervalle zwischen den aufeinanderfolgenden Energiezufuhrpunkten für eine Kultur liegen, die entlang eines durch physikalische Beschränkungen definierten Wegs strömt und wobei die Energiequelle kontinuierlich an den Versorgungspunkten zugeführt wird. Diese beiden Wege können kombiniert werden, indem die Energie in Form von Impulsen zugeführt wird, die durch zeitliche Intervalle an den räumlich getrennten Versorgungspunkten des zweiten Weges getrennt sind. Bei dem zweiten Weg besteht der Effekt darin, einzelne Zellen in der Kultur hervorzurufen, wenn sie entlang eines definierten Wegs fließen, um Konzentrationsschwankungen ausgesetzt zu werden, die das Äquivalent
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einer pulsierenden Energiequelle darstellen. Bei dem zweiten Weg bestimmten die Entfernung zwischen den fortlaufenden Energiezufuhrpunkten und die Fließgeschwindigkeit der Kultur zwischen den Punkten das Äquivalent der Zykluszeit auf dem ersten Weg. Diese äquivalente Zykluszeit wird nachfolgend auch als Zykluszeit bezeichnet. Der zweite Weg kann in Gärbottichen nach den GB-PSen 1 3 53 008, 1 417 486 und 1 417 487 oder nach den gleichfalls laufenden britischen Patentanmeldungen 35754/74 und 21288/75 der Anmelderin verwirklicht werden, wobei die letzte Patentschrift auf einen Gärbottich mit einer Vielzahl von Nähr(stoff)zufuhrstellen Bezug nimmt.
Nach einer ersten Ausgestaltung einer ersten Form der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zum Züchten von ZeI-len, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Zellenkultur entlang eines durch physikalische Beschränkungen definierten Weges strömen gelassen und die Kultur an einer oder mehreren Stellen mit einer Energiequelle versorgt wird, wodurch einzelne Zellen der Kultur während des Strömens entlang des Weges Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die entweder effektiv vernachläßigbar oder einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, so daß die Zykluszeit (wie vorstehend definiert) entweder effektiv Null ist oder unter den gewählten Umweltverhältnissen der Kultur in den ersten Bereich einer graphischen Darstellung der Zykluszeit gegen das Biomassenwirkungsgradverhältnis fällt oder in den Teil des zweiten Bereiches der graphischen Darstellung fällt, der dem ersten Bereich unmittelbar folgt und derartig ist, daß das Energiewirkungsgradverhältnis weniger oder gleich 15 % des Wertes in dem ersten Bereich beträgt.
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Eine zweite Ausgestaltung der ersten Form der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Züchten von Zellen, das sich dadurch auszeichnet, daß eine Zellenkultur entlang eines durch physikalische Beschränkungen definierten Weges strömen gelassen und die Kultur an einer oder mehreren Stellen mit einer Energiequelle versorgt wird, wodurch einzelne Zellen in der Kultur während des Strömens entlang des Weges Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, die derartig ist, daß die Zykluszeit (wie vorstehend de-finiert) unter den gewählten Umweltverhältnissen der Kultur in den ersten Bereich einer graphischen Darstellung der Zykluszeit gegen das Biomassenwirkungsgradverhältnis fällt oder in den Teil des zweiten Bereiches der graphischen Darstellung fällt, der dem ersten Bereich unmittelbar folgt und derartig ist, daß das Energiewirkungsgradverhältnis innerhalb 15 % des Wertes in dem ersten Bereich liegt.
Eine dritte Ausgestaltung der ersten Form der vorliegenden Erfindung befaßt sich mit einem Verfahren zum Züchten von Zellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Zellenkultur entlang eines durch physikalische Beschränkungen definierten Weges strömen gelassen und die Kultur an einer oder mehreren Stellen mit einer Energiequelle versorgt wird, wodurch einzelne Zellen in der Kultur während des Strömens entlang des Weges Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die entweder effektiv vernachläßigbar oder einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, so daß die Zykluszeit (vorstehend definiert) entweder effektiv Null oder - bei einem gegebenen Wert μ/μ nicht größer als die unten tabellarisch erfaßte ist, wobei die maximalen Zykluszeiten für Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zyklusimperial Chemical Ind. Ltd. 709841 /09U . ig _
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Zeiten für das Paar stehen:
μ/μπι als 0,5 Zykluszeiten
(Sekunden)
größer 30
0,2 6
0,1 4
0,05 als 0,02 3
kleiner 2,5
Vorzugsweise ist bei der ersten Form der Erfindung die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert von μ/μ nicht größer als die nachfolgend in der Tabelle erfaßte, wobei die maximalen Zykluszeiten für Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten des Paares stehen:
μ/μΐη als 0,5 Zykluszeiten
(Sekunden)
größer 15
0,2 5
0,1 3,5
0,05 als 0,02 2,5
kleiner 2
Die erste Form der Erfindung ist für Verfahren geeignet, bei denen ein hoher Umsetzungswirkungsgrad Kohlenstoff/ Zelle erforderlich ist, z.B. bei Prozessen zur Herstellung von Einzelzellenprotein (single cell protein) beim Züchten von Mikroorganismen auf einer geeigneten Kohlenstoffquelle, z.B. Methanol. Ein derartiges Verfahren wird in der GB-PS 1 370 892 der Anmelderin beschrieben. Die
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erste Form der Erfindung wird vorzugsweise in einem Gärbottich durchgeführt, der in den GB-PSen 1 353 008, 1 4 17 48G oder 1 417 487 oder in den schwebenden britischen Patentanmeldungen 35754/74 und 21288/75 (gleichen Sachverhalts) der Anmelderin beschrieben wird, die sich auf einen Gärbottich mit einer Vielzahl von Nähr(stoff)-zufuhrpunkten befassen. Bei der Durchführung eines Verfahrens, bei dem in einer Vorrichtung ein hoher Umsetzungswirkungsgrad Kohlenstoff/Zelle erforderlich ist, in der eine Kultur entlang eines durch physikalische Beschränkungen definierten Weges strömt, wird es vorgezogen, die Kohlenstoffquelle effektiv kontinuierlich einer Kultur zuzuführen, um eine sofortige homogene Verteilung der Kohlenstoffquelle zu erreichen. Aus nach dem Stande der Technik bekannten praktischen Gründen kann diese Situation nicht unter gewissen Umständen erreicht werden, z.B., wenn das Substrat eine stark lösliche Flüssigkeit ist und/oder wenn die Organismen eine starke Affinität zu der Energiequelle zeigen. Bei dem Verfahren nach der ersten Form der Erfindung wird es vorgezogen, die Energie, z.B. die Kohlenstoffquelle, der Kultur in einer möglichst kurzen Zykluszeit unter den bei jedem besonderen Prozeß gegebenen Beschränkungen zuzuführen. Vorzugsweise sollte eine Vielzahl von Energiequellenzufuhrstellen vorgesehen werden. Die Entfernungen zwischen den aufeinanderfolgenden Zufuhrpunkten an allen Seiten des Weges - notwendig zur Erreichung einer geeigneten Zykluszeit - hängen von der Geschwindigkeit des Kulturstroms entlang des Weges (pathway) ab.
Schwierigkeiten bei der effektiv kontinuierlichen Zufuhr einer Energiequelle können gelegentlich durch Verwendung eines schwach löslichen Substrates, wie ein Alkan, ein langkettiger Alkohol oder ein Kohlenwasserstoff, der
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als Gas oder Dampf durch Mitführen durch einen Träger zugeführt wird, oder durch Modifizierung der Affinität der Organismen für das Substrat überwunden werden.
Die obengenannten Zykluszeiten sind sehr geeignet für Prozesse zur Herstellung von Einzelzellenprotein als Methanol, wobei insbesondere Stämme der Art Methylophilus methylotrophus (früher als Pseudomonas methylotropha bekannt) bevorzugt werden. Die Charakteristiken dieser Arten werden in der GB-PS 1 370 892 der Anmelderin beschrieben. Sehr geeignete Stämme dieser Arten sind die Stämme NCIB Nr. 10508 bis 10515 und 10592 bis 10596 (äquivalent zu NRRL Nr. B 5352-64 und FERM 1215-27). Vorzugsweise wird die Geschwindigkeit der Kultur entlang des Weges geregelt und/oder die Geschv/indigkeit der Energiezufuhr, z.B. der Kohlenstoffquelle, an den Versorgungsstellen geregelt.
Nach einer ersten Ausgestaltung einer zweiten Form der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur biologischen Behandlung einer Flüssigkeit,die ein biologisch degenerierbares bzw. abbaubares Material in Lösung und/oder Suspension enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Flüssigkeit kontinuierlich und/oder pulsierend in einem Behandlungsbehälter an einer oder mehreren Stellen zugeführt wird, der eine Mikroorganismenkultur enthält, wobei einzelne Mikroorganismen in der Kultur einer pulsierenden Quelle biologisch degenerierbaren Materials oder einer solchen pulsierenden Quelle äquivalenten Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die derartig ist, daß die Zykluszeit (wie vorstehend definiert) in den zweiten Bereich einer graphischen Darstellung der Zykluszeit gegen den Biomassenwirkungsgrad (biomass efficiency) unter den für die Kultur gewählten Umweltverhältnissen fällt.
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Nach einer zweiten Ausgestaltung dieser zweiten Form der vorliegenden Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur biologischen Behandlung einer Flüssigkeit, die ein bioligisch degenerierbares Material in Lösung und/oder Suspension enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Flüssigkeit kontinuierlich und/oder pulsierend einem Behandlungsbehälter an einer oder mehreren Stellen zugeführt wird, der eine Mikroorganismenkultur enthält, wobei einzelne Mikroorganismen in der Kultur einer pulsierenden Quelle biologisch degenerierbaren Materials oder einer solchen pulsierenden Quelle äquivalenten Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die derartig ist, daß die Zykluszeit (wie vorstehend de-finiert) bei einem gegebenen Wert μ/μ in den unten tabellarisch erfaßten Bereich des Wertes μ/μ fällt, wobei die Bereiche für die Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten für das Paar stehen:
Zykluszeiten (Sekunden)
grüßer als 0,2 8 bis 60
0,1 4,5 bis 120
0,05 3,5 bis 240
0,02 2,5 bis 600
kleiner als 0,01 2 bis 1200
Vorzugsweise liegt bei der zweiten Form der Erfindung die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert μ/μ innerhalb des unten für den Wert μ/μ tabellarisch erfaßten Bereiches, wobei die Bereiche für die Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten für das Paar stehen:
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Zykluszeiten (Sekunden)
größer als 0,1 8 bis 40
0,05 5 bis 80
0,02 3,5 bis 200
0,01 3 bis 400
kleiner als 0,005 2,5 bis 900
Die zweite Form der Erfindung ist als ein Schritt in jedem Verfahren zur biologischen Behandlung von Abwasser höchst geeignet. Sie kann in einem aeroben Verfahren zur Herstellung von Kohlendioxid verwendet werden. Als Beispiel dieses Verfahrenstyps kann das Verfahren nach den schwebenden britischen Patentanmeldungen 23328/73 und 53921/73 (gleichen Sachverhalts) genannt werden. Bei der Behandlung von Abwasser ist es erstrebenswert, daß die Schlammproduktion auf ein Minimum reduziert wird und daß der KohlenstoffUmsetzungswirkungsgrad der Mirkoorganismen, die an der biologischen Behandlung beteiligt sind, niedrig ist. Somit wird es bevorzugt, daß die Energiequelle, in diesem Beispiel Zuführungen von Abwasser mit biologisch zersetzbarem Material, in der gleichen, oben beschriebenen Weise zugeführt wird. Zusätzlich wird jedoch in der graphischen Darstellung der Fig. 3 gesehen, daß die Anwendung unregelmäßiger Impulse (pulses) von größerem Vorteil sein kann als die Anwendung gleichmäßiger Impulse bei diesem Anwendungsfall.
Nach einer ersten Ausgestaltung einer dritten Form der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur Fermentation einer Zellenkultur zur Herstellung eines organischen Lösungsmittels und/oder einfacher organischer Moleküle, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kultur kontinuierlich und/oder pulsierend an einer oder mehreren Stellen
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B 8072
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mit einer Energiequelle versorgt wird, wobei einzelne Zellen in der Kultur einer pulsierenden Energiequelle oder Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, die derart ist, daß die Zykluszeit (wie vorstehend definiert) in den zweiten Bereich einer graphischen Darstellung der Zykluszeit gegen das Biomassenwirkungsgradverhältnis unter den für die Kultur infragekommenden Umweltverhältnissen fällt.
Nach einer zweiten Ausgestaltung dieser dritten Form der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zur Herstellung eines organischen Lösungsmittels und/oder einfacher organischer Moleküle durch Züchten von Zellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Kultur kontinuierlich und/ oder pulsierend mit einer Energiequelle an einer oder mehreren Stellen versorgt wird, wobei die einzelnen Zellen in der Kultur einer pulsierenden Energiequelle oder zu einer solchen Energiequelle äquivalenten Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die derartig ist, daß die Zyklusdauer bei einem gegebenen Wert μ/μ innerhalb des für den Wert μ/μ unten tabellarisch erfaßten Bereiches liegt, wobei die Bereiche der Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten des Paares stehen:
Zykluszeiten (Sekunden)
größer als 0,2 8 bis 60
0,1 4,5 bis 120
0,05 3,5 bis 240
0,02 2,5 bis 600
kleiner als 0,01 2 bis 1200
Imperial Chemical Ind. Ltd. 709841/0944
- 25 -
27U/Ü8
- 25 -
Vorzugsweise liegt bei der dritten Form der Erfindung die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert μ/μ innerhalb des
unten für den Wert μ/μ tabellarisch erfaßten Bereiches, wobei die Bereiche für die Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten für das Paar stehen:
μ/μΐη als 0,1 Zykluszeiten
(Sekunden)
größer 8 bis 40
0,05 5 bis 80
0,02 3,5 bis 200
0,01 als 0,005 3 bis 400
kleiner 2,5 bis 900
Beispiele von Lösungsmittelfermentationen, bei denen die dritte Form mit Vorteil zur Anwendung kommen kann, erfassen Fermentationen zur Herstellung von Äthanol, anderen ' Alkoholen, organischen Säuren, Ketonen, Diolen und Aldehyden. Die Energiequelle ist gewöhnlich die Kohlenstoffquelle.
Die zweite und die dritte Form der Erfindung sind einander darin ähnlich, daß bei solchen Prozessen, bei denen es angestrebt wird, der Wirkungsgrad der Kohlenstoffumsetzung zu Zellen niedrig ist. Daher sollten die Zuführungen biologisch degenerierbaren Materials nach der zweiten Form oder die Energie bei der dritten Form in einer solchen Weise pulsierend zugeführt werden, daß die Verfahren bei oder nahe den minimalen Werten des Energiewirkungsgradverhältnisses betrieben werden. Vorzugsweise wird ein biologisch degenerierbares Material oder Energie mittels unregelmäßiger Impulse zugeführt, um den ange-
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2 7 U708
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strebten Effekt auf ein Höchstmaß zu bringen.
Vorzugsweise liegt bei der ersten und dritten Form der Erfindung die Zykluszeit so, daß sie in einen Teil des zweiten Bereiches der graphischen Darstellung fällt, wo das Wirkungsgradverhältnis weniger als 85 % der Werte in den ersten bzw. dritten Bereichen ist.
Nach einer ersten Ausgestaltung einer vierten Form der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zum Züchten von Zellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kultur kontinuierlich und/oder pulsierend an einer oder mehreren Stellen mit einer Energiequelle versorgt wird, wobei einzelne Zellen in der Kultur einer pulsierenden Energiequelle oder Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, die derartig ist, daß die Zykluszeit (wie vorstehend definiert) in den besagten dritten Bereich der graphischen Darstellung der Zykluszeit gegen das Biomassenwirkungsgradverhältnis unter den für die Kultur infragekommenden Umweltverhältnissen fällt oder in den Teil des zweiten Bereiches der graphischen Darstellung fällt, der dem dritten Bereich unmittelbar vorgeht und derartig ist, daß das Energiewirkungsgradverhältnis innerhalb 15 % des Wertes in dem dritten Bereich ist.
Nach einer zweiten Ausgestaltung der vierten Form der Erfindung betrifft diese ein Verfahren zum Züchten von Zellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kultur an einer oder mehreren Stellen kontinuierlich und/oder pulsierend mit einer Energiequelle versorgt wird, wobei einzelne Zellen in der Kultur einer pulsierenden Energiequelle oder Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, die derartig ist, daß die Zykluszeit (wie vorstehend definiert)
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27U7G8
- 27 -
bei einem gegebenen Wert μ/μ innerhalb eines unten tabellarisch erfaßten minimalen Wertes und eines maximalen Viertes liegt, bei dem der Gesamtwxrkungsgrad der Kultur abfällt und die in der Kultur vorliegenden Mikroorganismen in beträchtlicher Zahl absterben, wobei die Minima der Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten für dieses Paar stehen:
Zykluszeiten
(Sekunden)
größer als 0,5 40
0,2 120
0,1 230
0,05 450
0,02 1000
kleiner als 0,01 2000
Vorzugsweise ist die minimale Zykluszeit bei der vierten Form der Erfindung bei einem gegebenen Wert μ/μ gleich der unten tabellarisch erfaßten, wobei die minimale Zeit für Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fällt, die in einem linearen Verhältnis zu den minimalen Zeiten für dieses Paar stehen:
μ/μ Zykluszeiten
(Sekunden)
größer als 0,5 65
0,2 170
0,1 350
0,05 700
Imperial Chemical Ind. Ltd. 709841/0944 28 -
27U7Q&,
- 28 -
Zykluszeiten (Sekunden)
0,02 1800
kleiner als 0,01 3600
Die vierte Form der Erfindung kann bei Verfahren zur Herstellung von Einzelzellenprotein verwendet werden, vorzugsweise bei Verfahren unter Verwendung von Gärbottichen, die vorstehend im Zusammenhang mit der ersten Ausgestaltung beschrieben wurden. Jedoch ist die vierte Form der Erfindung besser bei Prozessen zur Herstellung von extrazellularen oder intra-zellularen Stoffwechselprodukten z.B. Zitronensäure, Aminosäuren und Antibiotika, geeignet. Diese Verfahren können auch bequem in Gärbottichen durchgeführt werden, die oben im Zusammenhang mit der ersten Form erwähnt wurden.
Vorzugsweise wird bei der vierten Form der Erfindung Energie, gewöhnlich als Kohlenstoffquelle, der Kultur mittels regelmäßiger Impulse zugeführt.
Die zweite, dritte und vierte Form der Erfindung kann in jedem geeigneten Apparat durchgeführt werden, der einen Behälterreaktor erfaßt, und in passenden Apparaturen, in denen die Kultur entlang eines durch physikalische Beschränkungen definierten Weges strömt. Es ist verständlich, daß dann, wenn der Apparat ein Behälterreaktor ist, die Flüssigkeit oder die Energiequelle der Kultur darin in Form von Impulsen an einer oder mehreren Stellen zugeführt wird, und daß, wenn die Kultur entlang eines durch physikalische Beschränkungen definierten Wegss fließt, die Flüssigkeit oder die Energiequelle der Kultur, die entlang des Weges fließt, an einer oder mehreren Stellen kontinuierlich und/oder in Form von Impulsen zugeführt wird.
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B 8072
27U7O8
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Somit kann das Verfahren gemäß der Erfindung weitestgehende Anwendung finden und ist sehr nützlich bei Verfahren, die eine kontinuierliche Züchtung von Mikroorganismen erfassen. Es kann entweder zur Steigerung oder zur Verminderung der Wirksamkeit der Zellenproduktion in Form der verwendeten Energie angewandt werden, was von der Art des Verfahrens, bei dem es eingesetzt wird, abhängt. Zur Herstellung von Einzelzellenprotein oder von Zellenstofwechselprodukten sollte der Wirkungsgrad auf einen Höchstwert angehoben werden. Während er - wie bereist erwähnt bei der Abwasserbehandlung und bei der Herstellung von organischen Lösungsmitteln auf ein Minimum gebracht werden sollte.
Die Energiequelle ist geeignteterweise die Kohlenstoffquelle. Jedoch kann es auch eine schwache (light) Quelle bei der photosynthetischen Reaktion oder Wasserstoff bei Kulturen sein, bei denen Wasserstoff als eine Energiequelle ausgenutzt wird, und andere verminderte anorganische Energiequellen bei chemolithotropischen Mikroorganismen.
Die Versuche, die durchgeführt worden sind und von deren Ergebnissen die in den Fig. 1 bis 3 der Zeichnungen dargestellten graphischen Darstellungen abgeleitet sind, sind im wesentlichen die vier folgenden Typen:
1. Versuche, bei denen eine Kultur von Mirkoorganismen in einem System aus einem Paar oder verbundenen identischen Gärbottichen zirkuliert wird. Eine Kohi.enstoffquelle wurde der Kultur insbesondere auf verschiedenen Wegen zugeführt:
(a) bei einer gleichen Geschwindigkeit für jeden Gärbottich,
(b) lediglich in einen Gärbottich und
(c) zu jedem Gärbottich, jedoch mit einer Geschwindigkeit
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für einen Gärbottich, die von dem des anderen differiert.
2. Versuche, bei denen eine Kohlenstoffquelle pulsierend über eine Serie von verschiedenen Wegen in eine Kultur in einem standardisierten 2-Liter-Laborgärbottich zugeführt wird.
3. Versuche, bei denen eine Kohlenstoffquelle kontinuierlich an einer Serie von Stellen in einen Kreislauf-Gärbottich eines Fassungsvermögens von 50 000 Liter kontinuierlich eingespeist wird.
4. Versuche, bei denen Abwasser in ein aktiviertes Kreislaufschlammsystem eines Fassungsvermögens von 20 Liter eingeleitet wird.
In eine kontinuierliche Kultur, in der Organismen wachsen, wird eine Kohlenstoff-und/oder Energiequelle eingeleitet, so daß Perioden des Energieverbrauchs (energy starvation) auftreten. Es wird angenommen, daß, wenn Energie den Zellen nach einer Periode des Energieverbrauches zugeführt wird, ein Teil der zugeführten Energie anfänglich von den Zellen in einer Periode der Anpassung an den Wachstumsvorgang verbraucht wird und daher für ein wirksames Wachsen effektiv nicht verfügbar ist. Dieses zeigt einen Gesamtabfall der Leistungsfähigkeit der Herstellung der Biomasse in Form der Energiequelle, die über eine lange Periode verbraucht wird.
Es lassen sich Gründe dafür anführen, daß Zellen, die einer vollkommen kontinuierlichen Versorgung durch eine Energiequelle unterzogen werden, wie einer Kohlenstoffquelle, in einem tatsächlich unveränderlichen Stadium wachsen, in
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2.71 Α,ϊ.«*!
- 3t -
dem Stoffwechselproduktansammlungen und Enzymaktivitäten effektiv auf konstanten Niveaus stehen, was im Einklang mit der Bildung wirksamer Biomasse steht. Derartige Kulturen können durch Zufuhr von Energiequellen in Form von Impulsen, die durch Zeitintervalle getrennt sind, unwirksam gemacht werden. Das Wirkungsgradverhältnis, das dadurch eingeführt wird, kann weitgehend durch eine Gleichung der folgenden vereinfachten Form definiert werden:
X/(X + ίΥμ^μ^
worin X sich auf die Energie bezieht, die für eine nützliche Biosynthese unter Wachstumsbedingungen unveränderlichen Zustands bei einer Geschwindigkeit gleich dem Wert μ erforderlich ist, die Größe Y sich auf die Energie bezieht, die zur Wiedereinrichtung der StoffWechselapparatur nach einer in die Länge gezogenen Periode der Nichtzurverfügungstellung exogener Energie erforderlich ist, t die Zykluszeit - wie vorstehend definiert - darstellt und f einen Faktor bedeutet, der zwischen 0 und 1,0 liegt und den Anteil bzw. das Verhältnis der Reorganisationsenergie beschreibt, die als eine Funktion der Zeit erforderlich ist, die ohne verfügbare exogene Energie verstreicht.
f Yu.
Wenn der Ausdruck m klein ist, dann nähert sich das
Wirkungsgradverhältnis der Einheit. Das kann erreicht werden durch Heraufsetzen von μ auf das konstante μ , durch das Herabsetzen von μ auf ein konstantes μ oder durch den Wert der Funktion f mit veränderter Zykluszeit. Die Funktion f ist eine komplexe Funktion, die den Bruchteil der Stoffwechselprcduktansammlungen beschreibt (während einer Periode ohne verfügbare exogene Energie), und erfaßt als solche: Die Geschwindigkeitskonstanten (k) für Ansammlungsstoffwechsel (pool metabolism), eine Anlaufzeit
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2 7 U/08
- 32 -
(t ) zwischen der Energieerschöpfung und dem Einsetzen des Abbaus der Stoffwechselprodukte, die Gesamtzykluszeit (t) und den proportionalen Wachstumsfaktor μ/μ .
Unter der Annahme, daß nach der Erschöpfung der Energiezufuhr die Organismen während einer Anlaufzeit (t ) unbeeinflußt bleiben und danach die Stoffwechselproduktansammlungen (metabolite pools) bei einer Geschwindigkeit aufgebraucht werden, die zu deren Restkonzentration proportional ist, dann kann sie wiedergegeben werden durch:
f = 1 - exp (ktr - kt (1 - μ/ßj )
(Vorausgesetzt, daß f = 0 substituiert ist, wenn Werte weniger als Null abgeleitet sind).
Hier handelt es sich um eine gute Annährung, die eine gute Wiedergabe ermöglicht, mit der Ausnahme des Endes der Anlaufzeit, wenn ein augenblicklicher Wechsel von Null zu einer begrenzten Geschwindigkeit der Stoffwechselproduktbenutzung vorausbestimmt wird. Dies steht nicht in Übereinstimmung mit dem Verständnis eines wirklichen mikrobiologischen Systems, so daß ein gewisser Ausgleich der Funktion in diesem Bereich auferlegt worden ist.
Wenn der Wert von f in die Gleichung
Wirkungsgradverhältnis = X/(X - fY μ ^t)
eingesetzt wird, beschreibt die resultierende Gleichung eine Serie von Linien, die in Fig. 2 dargestellt werden. Alle unsere Daten passen zu diesen Linien.
In Fig. 1 wird der erste Bereich der vorstehend beschriebenen graphischen Darstellung in der folgenden Weise inter-Imperial Chemical Ind. Ltd. 709841/0944 -33-
B 8072
ΙΊ U/Ü8
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pretiert. Bei diesen sehr kurzen Zykluszeiten ist der Einfluß der verzögerten Anlaufzeit (response time) der Organismen derartig, daß f auf Null zustrebt und das Wirkungsgradverhältnis ein Maximum ist. In dem zweiten Bereich der graphischen Darstellung ist f angestiegen, da die Zykluszeit nun im wesentlichen die Anlaufzeit der Organismen überschreitet und somit nimmt das Wirkungsgradverhältnis ab. Wenn jedoch t weiter ansteigt, dann fällt der Einfluß von f auf die Gleichung und t wird mit dem Ergebnis der bestimmende Einfluß, daß das Wirkungsgradverhältnis ansteigt. In diesem Bereich weicht die typische Darstellung regelmäßiger Impulse von der unregelmäßiger Impulse (wie in Fig. 3) ab. Bei regulären Impulsen wird die Wiederannäherung an einen konstanten Wert nach kürzeren Zykluszeiten verschoben. Der Grund für diese letzte Beobachtung liegt wahrscheinlich darin, daß natürliche Schwankungen der regelmäßigen Frequenz unter Verwendung von Zellen zur Regulierung der Stoffwechselaktivitäten abgestimmt oder durch die korrekte konstante Frequenz des pulsierenden Substrats (d.h. regelmäßige Impulse) nachgezogen werden können. Wenn unregelmäßige Impulse angewendet werden, wird die natürliche konstante Frequenz der metabolischen Schwankungen zerstört und zufällige unwirksame Schwankungen in der Aktivität treten auf. Die Erfahrungen mit reinen Kulturen, die auf einer einzigen Energiequelle (Proteinorganismen) auf Methanol wachsen und mit gemischten Kulturen (Prokaryote und Eukaryote), die auf einer gemischten Energiequelle (häusliches Abwasser) wachsen, zeigen, daß die Theorie und Praxis zu dem hier entwickelten mathematischen Modell passen. Es wird daher angenommen, daß die Theorie bei den meisten Mikroorganismen anwendbar ist, die in energiebegrenzten kontinuierlichen Kulturen wachsen. Diese Theorie soll als "Reorganisation Energy Loss Theory" bezeichnet werden.
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Il U 7 08
- 34 -
Beispiel 1
Eine Kultur des Methylophilus methylotrophus wurde in einem kleinen cyclischen Druckgärbottich (wie er in der GB-PS 1 353 008 beschrieben wird) mit einem Flüssigkeitsarbeitsvolumen von 165 1 bei 400C und D = 0,25 h~ wachsen gelassen. Bei dem Medium handelte es sich um das, das als Medium I in der GB-PS 1 370 892 bezeichnet wird. Die Zirkulationsgeschwindigkeit innerhalb des Gärbottichs betrug 30 m h , was eine mittlere Zirkulationszeit von 20 Sekunden bedeutete. Das Zellentrockengewicht wurde auf die Methanolzufuhrgeschwindigkeit bezogen, so daß 14 g/l die beständige Zustandskonzentration der trockenen Zellen war. Fünf Methanolzugabepunkte wurden rund um den Gärbottich so verteilt, daß die Methanolströme zu dem Volumen der Flüssigkeit, die in diesem Teil des Gärbottichs enthalten waren, proportional sind, während die Methanolströme durch alle Punkte unterschiedlich waren.
Die physikalische Verteilung der Methanolzugabeöffnungen war derartig, daß die zirkulierenden Zellen in einem aufeinanderfolgenden Zyklus der Substratgegenwart und -abwesenheit alle 3 Sekunden oder einem ähnlichen Zyklus alle 20 Sekunden unterzogen wurden, wenn das gesamte Methanol, das dem Gärbottich zugeführt wurde, an einer Stelle eingegeben wurde. Die Ergebnisse werden in der Tabelle 1 gezeigt.
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27H708
- 35 Tabelle 1
ι 2 3 Methanolzugabezykluszeit C zu Zellen C zu CO C S/N
20 Sekunden 57,8 38,6 4,3
3 Sekunden 65,1 30,9 3,2
1. "C zu Zellen"stellt den Prozentsatz des Methanolkohlenstoffs dar, der zu zellularem Kohlenstoff umgewandelt wurde.
2. "C zu CO " stellt den Prozentsatz des Methanolkohlenstoffs dar, der zu CO„-Kohlenstoff umgesetzt wurde.
3. "C zu S/tf1 stellt den Prozentsatz des Methanolkohlenstoffs dar, der zu überschüssigem (supernatant) Kohlenstoff umgewandelt wurde.
Beispiel 2
Die Kultur des Methylophilus methylotrophus wurde in einem kontinuierlich geführten Labor-Gärbottich (Flüssigkeitsvolumen 1,5 1 und unveränderliches Zustandstrockengewicht 10 g/l) bei verschiedenen Verdünnungsgeschwindigkeiten mit konstanten Mediumströmen wachsen gelassen. Ein getrenntes Zugabesystem für Methanol wurde zur Anwendung gebracht, so daß ausreichend Methanol als Methanolimpuls - zugeführt in 0,3 Sekunden - eingebracht werden konnte, wobei z.B. 3 Sekunden für das Wachstum bei μ = 0,2 h~ erforderlich waren. Dieses Verhältnis der Zuführungszeit zur gesamten Zykluszeit wurde bei 1 bis 10 während der
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B 8072
27U708
- 36 -
Veränderungen der Zykluszeit aufrechterhalten. Die Mediumzusammensetzung und die Bedingungen des Wachsens waren mit denjenigen identisch, die im Beispiel 1 beschrieben wurden. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 2 gezeigt .
Tabelle
Verdünnungsgeschwindigkeit Zykluszeit (h ) (Sekunden)
*C Zellen (%)
0,07
0,20
0,4
2,75
5,5
11 ,0
22,0
1,0
2,0
2,5
3,0
4,0
8,0
11 ,0
20,0
33,0
2,75
5,5
56,2 49,3 47,5 42,3 64,4 62,4 61 ,0 59,5 54,5 53,0 47,1 46,2 48,8 62,1 61 ,5
* % (Gew./Gew.) des Methanolkohlenstoffs, der in zellularem Kohlenstoff einverleibt wurde. Der Kohlenstoffgehalt der Zellen blieb während des Versuches konstant.
Imperial Chemical Ind. Ltd.
709841/0944
Leerseite

Claims (18)

-R- PatentanSprüche
1. Verfahren zum Züchten von Zellen, dadurch gekennzeichnet , daß eine Zellenkultur entlang eines durch physikalische Beschränkungen definierten Weges strömen gelassen und die Kultur an einer oder mehreren Stellen mit einer Energiequelle versorgt wird, wodurch
einzelne Zellen in der Kultur während des Strömens entlang des Weges Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die entweder effektiv vernachläßigbar oder einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, so daß die Zykluszeit entweder Null ist oder unter den gewählten Umweltverhältnissen der Kultur in den ersten Bereich einer graphischen Darstellung der Zykluszeit gegen das Biomassenwirkungsgradverhältnis fällt oder in den Teil des zweiten Bereiches der graphischen Darstellung fällt, der dem
ersten Bereich unmittelbar folgt und derartig ist, daß
das Energiewirkungsgradverhältnis innerhalb 15 % des Wer-• tes in dem ersten Bereich liegt.
2. Verfahren zum Züchten von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Zellenkultur ent-
lang eines durch physikalische Beschränkungen definierten Weges strömen gelassen und die Kultur an einer oder mehreren Stellen mit einer Energiequelle versorgt wird, wodurch einzelne Zellen der Kultur während des Strömens entlang des Weges Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, die derartig ist, daß die Zykluszeit unter den gewählten Umweltverhältnissen der Kultur in den ersten Bereich
einer graphischen Darstellung der Zykluszeit gegen das
Biomassenwirkungsgradverhältnis oder in den Teil
eines zweiten Bereiches der graphischen Darstellung fällt,
7098 4 1 /09U
Imperial Chemical Ind. Ltd.
ORIGINAL INSPECTED
B 8072
2Ί I4/Ü8 - I -
•ι.
der dem ersten Bereich unmittelbar folgt und derartig ist, daß das Energiewirkungsgradverhältnis innerhalb 15 % des Wertes in dem ersten Bereich liegt.
3. Verfahren zum Züchten von Zellen, d a durch gekennzeichnet, daß eine Zellenkultur entlang eines durch physikalische Beschränkungen definierten Weges strömen gelassen und die Kultur an einer oder mehreren Stellen mit einer Energiequelle versorgt wird, wodurch einzelne Zellen in der Kultur während des Strömens entlang des Weges Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die entweder effektiv vernachläßigbar oder einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, so daß die Zyklusdauer entweder Null ist oder - bei einem gegebenen Wert von μ/μ - nicht größer als unten angegeben ist, wobei die maximalen Zykluszeiten für die Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten für das Paar stehen:
Zykluszeiten (Sekunden)
größer als 0,5 30
0,2 6
0,1 4
0,05 3
weniger als 0,02 2,5
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch
gekennzeichnet , daß die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert μ/μ nicht größer als die unten tabellarisch erfaßte ist, wobei die maximalen Zykluszeiten der Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen
Imperial Chemical Ind. Ltd. 709841/0944 -4-
7 14708
' 3.
Verhältnis zu den Zykluszeiten für das Paar stehen
als 0,5 Zykluszeiten
(Sekunden) größer 15 0,2 5 0,1 3,5 0,05 als 0,02 2,5 weniger 2
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Energiequelle Methanol und das Produkt ein Einzelzellenprotein ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet , daß die Zellen der Art Methylophilus methylotrophus (früher als Pseudomonas methylotropha bekannt) zuzuordnen sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet , daß die Zellen zu irgendeinem der Stämme NCIB Nr. 10508 bis 10515 und 10592 bis 10596 gehören.
8. Verfahren zur biologischen Behandlung einer
Flüssigkeit, die ein biologisch degenerierbares Material in Lösung und/oder Suspension enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Flüssigkeit kontinuierlich und/oder pulsierend einem Behandlungsbehälter an einer oder mehreren Stellen zugeführt wird, der eine Mikroorganismenkultur enthält, wobei einzelne Mikroorganismen in der Kultur einer pulsierenden Quelle biologisch degenerierbaren Materials oder einer solchen pulsierenden
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27 1 4/Ü8
Quelle äquivalenten Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die derartig ist, daß die Zykluszeit in den zweiten Bereich einer graphischen Darstellung der Zykluszeit gegen den Biomassenwirkungsgrad unter den für die Kultur gewählten Umweltverhältnissen fällt.
9. Verfahren zur biologischen Behandlung einer Flüssigkeit, die ein biologisch degenerierbares Material in Lösung und/oder Suspension enthält, dadurch gekennzeichnet , daß die Flüssigkeit kontinuierlich und/oder pulsierend einem Behandlungsbehälter zugeführt wird, der eine Mikroorganismenkultur an einer oder mehreren Stellen enthält, wobei einzelne Mikroorganismen in der Kultur einer pulsierenden Quelle biologisch degenerierbaren Materials oder einer solchen pulsierenden Quelle äquivalenten Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die derartig sind, daß die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert μ/μ innerhalb des für den Wert μ/μ unten tabellarisch erfaßten Bereiches liegt, wobei die Bereiche für die Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten für das Paar stehen:
μ/μπι Zykluszeiten
(Sekunden) größer als 0,2 8 bis 60 0,1 4,5 bis 120 0,05 3,5 bis 240 0,02 2,5 bis 600 kleiner als 0,01 2 bis 1200
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch
gekennzeichnet , daß die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert μ/μ innerhalb des für diesen Wert
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Il U 7 08 - i -
μ/μ unten tabellarisch erfaßten Bereiches liegt, wobei die Bereiche für die Werte von μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten für das Paar stehen:
μ/μΐη als 0,1 Zykluszeiten
(Sekunden) größer 8 bis 40 0,05 5 bis 80 0,02 3,5 bis 200 0,01 als 0,005 3 bis 400 kleiner 2,5 bis 900
11. Verfahren zur Fermentation einer Zellenkultur zur Herstellung eines organischen Lösungsmittels und/oder einfacher organischer Moleküle, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur an einer oder mehreren Stellen durch eine Energiequelle kontinuierlich und/oder pulsierend versorgt v/ird, wobei einzelne Zellen in der Kultur einer pulsierenden Energiequelle oder Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, die derartig ist, daß die Zykluszeit in den zweiten Bereich einer graphischen Darstellung der Zykluszeit gegen das Biomassenwirkungsgradverhältnis unter den für die Kultur gewählten Umweltverhältnissen fällt.
12. Verfahren zur Herstellung eines organischen Lösungsmittels und/oder einfacher organischer Moleküle durch Züchtung von Zellen, dadurch gekennzeichnet , daß die Kultur an einer oder mehreren Stellen durch eine Energiequelle kontinuierlich und/oder pulsierend versorgt wird, wobei einzelne Zellen in der
7098/» 1 /09<U
Imperial Chemical Ind. Ltd. - 7 -
B 8072
Kultur einer pulsierenden Energiequelle oder Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, die derartig ist, daß die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert von μ/μ in dem unten für den Wert μ/μ tabellarisch erfaßten Bereich liegt, wobei die Bereiche für die Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten dieses Paares stehen:
μ/μ Zykluszeiten
(Sekunden)
größer als 0,2 8 bis 60
0,1 4,5 bis 120
0,05 3,5 bis 240
0,02 2,5 bis 600
kleiner als 0,01 2 bis 1200
13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert μ/μ innerhalb des unten für diesen
Wert μ/μ tabellarisch erfaßten Bereiches liegt, wobei m
der Bereich für die Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fällt, die in einem linearen Verhältnis zu den Zykluszeiten dieses Paares stehen:
μ/μΐη als 0,1 Zykluszeiten
(Sekunden) größer 8 bis 40 0,05 5 bis 80 0,02 3,5 bis 200 0,01 als 0,005 3 bis 400 kleiner 2,5 bis 900
709841/09U
Imperial Chemical Ind. Ltd. - 8 -
•V
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13,
dadurch gekennzeichnet, daß das organische Lösungsmittel und/oder die einfachen organischen Moleküle Äthanol darstellen.
15. Verfahren nach Anspruch 8 oder 11, dadurch gekennzeichnet , daß die Zykluszeit derartig gewählt wird, daß sie in einen Teil des zweiten Bereiches der graphischen Darstellung fällt, wobei das Wirkungsgradverhältnis weniger als 85 % der Werte in dem ersten bzw. dritten Bereich ausmacht.
16. Verfahren zum Züchten von Zellen, dadurch gekennzeichnet , daß die Kultur an einer oder mehreren Stellen durch eine Energiequelle kontinuierlich und/oder pulsierend versorgt wird, wobei einzelne Zellen in der Kultur einer pulsierenden Energiequelle oder Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden, die einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, die derartig ist, daß die Zykluszeit in den dritten Bereich einer graphischen Darstellung der Zykluszeit gegen das Biomassenwirkungsgrad-0 verhältnis unter den für die Kultur ausgewählten Umweltverhältnissen fällt oder in den Teil eines zweiten Bereiches der graphischen Darstellung fällt, der unmittelbar dem dritten Bereich vorausgeht, und derartig ist, daß das Wirkungsgradverhältnis innerhalb von 15 % des Wertes in dem ersten Bereich liegt.
17. Verfahren zum Züchten von Zellen, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultur an einer oder mehreren Stellen durch eine Energiequelle kontinuierlich und/oder pulsierend versorgt wird, wobei einzelne Zellen in der Kultur einer pulsierenden Energiequelle oder Konzentrationsschwankungen ausgesetzt werden,
Imperial Chemical Ind. Ltd. 709841 /0944 - 9 -
die einer pulsierenden Energiequelle äquivalent sind, die derartig ist, daß die Zykluszeit bei einem gegebenen Wert von μ/μ in einem Bereich zwischen dem unten tabellarisch erfaßten Minimum und einem Maximumwert liegt, bei dem die Gesamtwirksamkeit der Kultur fällt und bei dem die in der Kultur vorhandenen Mikroorganismen in bestimmten Zahlen absterben, die Minima der Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fallen, die in einem linearen Verhältnis zur Zykluszeit des Paares stehen:
Zykluszeiten
(Sekunden) größer als 0,5 40 0,2 120 0,1 230 0,05 450 0,02 1000 kleiner als 0,01 2000
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet , daß die minimale Zykluszeit bei einem gegebenen Wert μ/μ den unten erfaßten Wert darstellt und die minimale Zeit der Werte μ/μ zwischen jedes aufeinanderfolgende Paar der tabellarisch erfaßten Werte fällt, die in einem linearen Verhältnis zu den minimalen Zeiten des Paares stehen:
μ/μ Zykluszeiten
(Sekunden)
größer als 0,5 65
0,2 170
0,1 350
0,05 700
Imperial Chemical Ind. Ltd. η nno t 4 ι nn ι ι - 10 -
/U3OH ι /ua4^
DE19772714708 1976-04-02 1977-04-01 Verfahren zum zuechten von zellen Granted DE2714708A1 (de)

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