JPS5934109B2 - 細胞の培養方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は細胞の培養方法に関し、さらに詳しくは微生物
例えば細菌、酵母および菌類の培養方法に関する。

しかし、この方法は微生物の培養に限定されるものでな
く、例えば組織培養にも応用しうる。

実用されている微生物学的方法において供給エネルギー
に対する産生バイオマスについての収率は、達成可能で
あると知られている最高収率よりもしばしば低く、我々
はこの原因が細胞への間欠的エネルギー利用可能性にあ
ると認定した。

本明細書において、「エネルギー源」とは関与培養物の
増殖速度への制限因子であるエネルギー源を意味するも
のとする。

従って、エネルギー源が炭素源であるときには、炭素制
限において増殖する培養物について述べるものである。

「間欠的エネルギー利用可能性」とは、基質中のエネル
ギー源の定常供給からのバラツキから生ずるところの、
増殖培養物中のエネルギー源濃度の変動を意味するもの
とする。

培養物中のエネルギー源濃度の変化は比増殖速度の変動
をもたらすことになり、あるいはその逆の関係も成立す
る。

微生物の総合的エネルギー効率に悪影響を与えるのは、
全体の培養物へのエネルギー供給の見掛は上の変動の効
果よりむしろ、実質上比増殖速度がゼロである期間の発
生である。

本発明では微生物培養物に対してエネルギー源を脈動的
に支給しうる機械装置を採用することにより、エネルギ
ー供給の変動を応用する。

エネルギー源を脈動的に培養物に対して供給する場合に
は、エネルギー源を所定の時間にわたって不連続量で供
給する。

各供給時間の後に、それにより供給されたエネルギーが
培養物によって利用可能な時間が続く。

供給された全てのエネルギーが用い尽されたときには、
培養物にエネルギーが供給されないか、または培養物に
よって利用しうるエネルギーがない時間が来る。

本明細書において、「脈動時間」とは、培養物に対して
エネルギーを供給している時間と、それに続く供給エネ
ルギーが培養物によって利用可能である時間とを合計し
た時間（長さ）を意味するものとする。

また「サイクル時間」とは、脈動時間と、それに続く培
養物によって利用可能な外部供給エネルギーが存在しな
い時間とを合計した時間を意味する（すなわち、あるエ
ネルギー供給時間の開始と次のエネルギー供給時間の開
始との間の合計時間長であり、この中には培養物が外部
供給エネルギーを利用しえない時間が必然的に含まれる
）。

ここにいくつかの実験を実施したが、実験では炭素源の
ようなエネルギー源を微生物の増殖培養物中で規則的お
よび不規則的な頻度の脈動状態で利用可能とした。

規則頻度の脈動とは、同一時間内で加えられる同一量の
エネルギー源例えば炭素源を含む脈動であって、しかも
その時間が別の同一時間で隔離されているものを意味す
る。

不規則頻度の脈動とは、上記の規則的脈動として定義さ
れた以外のいずれかの方式でエネルギー源を利用可能と
する時間、例えば頻度がランダムに変動する時間および
異なる頻度の時間（種々の頻度が繰り返しパターンを示
す）をも意味する。

これらの実験の結果から、添付図の第１図のグラフを作
った。

第１図のグラフにおいて、縦軸はバイオマス効率比（０
〜１．０で変動）であり、横軸はサイクル時間を対数目
盛で示したものである。

ここに「バイオマス効率比」とは、間欠的エネルギー利
用可能性のある環境中で得られる微生物系のエネルギー
変換効率測定値と、連続的エネルギー利用可能性のある
環境中での同じ微生物系のエネルギー変換効率と、の比
である。

横座標は、サイクルが不規則であるときには、算術平均
サイクル時間とする。

不規則サイクルが平均に関して広く分布していない場合
には、その測定効率比は第１図のグラフと実質上合致す
る。

しかし平均に関してサイクルの広い分布がある場合には
、測定効率比は第１図とグラフと合致しないが、個々の
サイクルに属する効率比の重量平均を考慮することによ
って得られる係数の計算によって合致するようになる。

第１図のグラフには下記の三領域が示されている： （イ）サイクル時間が短く（すなわち脈動速度すなわち
サイクル／単位時間が犬）、バイオマスへのエネルギー
変換効率比が実際上１でありかつ実質上一定である「第
１領域」。

従ってこの領域ではエネルギーの効率に有害な効果が見
られない。

（ｐ）サイクル時間が第１領域におけるよりも犬であり
（すなわち、脈動速度小）、バイオマスへのエネルギー
変換効率比がまず最小値にまで降下し、次いでサイクル
時間が増大するにつれて一定の高い値に再び近付く（す
なわちグラフが溝形になる）「第２領域」。

（ハ）サイクル時間が第２領域におけるよりも犬であり
（すなわち脈動速度小）、エネルギー変換効率比が実質
上一定である「第３領域」。

この第３領域は、培養物中に存在する微生物が顕著な数
量で死滅する程に培養物の総合的な効率を下げるまで脈
動速度が降下したときには、終了する。

上述のグラフは、エネルギー源の利用可能性に応答して
１サイクルの間に高速度で増殖する培養物によって消費
される時間が全サイクル時間よりも実質上率さい場合に
関するものである。

実用目的のためには、このような増殖によって消費され
る時間の割合は、概略、「設定総合比増殖速度」と［炭
素およびエネルギー源の利用可能性によって制限されな
いときの当該培養物によって達成されうる最大比増殖速
度（μｍａｘ）または（μｍ）Ｊとの比によって表わす
ことができる。

ここに、設定総合比増殖速度がμｍに接近するにつれて
、またはμｍの値がμに近付く程に低減されるにつれて
、培養物のエネルギーの効率に対する効率比の影響がい
ずれの一定脈動速度においても増大することを見出した
。

連続的に利用可能であるが制限的なエネルギー源での培
養物の比増殖速度の変化が、それ自体、培養物のエネル
ギーの効率の変化を引き起こすことは理解されよう。

前述の効率比は、もっばら、間欠的に利用可能なエネル
ギー源に起因する追加的効果に関連している。

逆にエネルギー源が間欠的に利用可能な場合の培養物に
おけるμ：μｍの比の減小は、エネルギー源が連続的に
利用可能な対応する培養物と比較して、いずれの一定脈
動速度においてもエネルギーの効率の減小をもたらす。

このような結果は第２図に示されている。

第２図（縦軸および横軸は第１図と同じ）には、任意の
１サイクルにおける迅速増殖で消費される時間の割合の
変化の効果を示すμ／μｍの種々の値についての一連の
曲線を表しである。

第３図は、エネルギー利用可能サイクルが厳格に規則的
である場合に得られる効果を示す。

エネルギーの間欠的利用可能性によって引き起こされる
効果の顕著な低減が認められる。

本明細書において、「エネルギー変換効率」とは、バイ
オマスを形成するために変換されるエネルギー源を、消
費した合計エネルギー源で除した比を意味し、例えば、
唯一のエネルギー源が炭素含有化合物であるときには、
産生バイオマス中に導入された炭素の質量を、消費した
合計炭素質量で除した比である。

培養物へ供給されるエネルギーの変動ないしは脈動は、
かかるエネルギー供給の変動ないし脈動が、微生物によ
り培養基中のエネルギー源保留分が枯渇されるに足る大
きさであるときには、前述の如き微生物へのエネルギー
の利用可能および利用不可能のサイクルを生じさせる。

培養物へのエネルギー供給の脈動（すなわち培養物への
継続的エネルギー供給の間に時間的間隔を置くこと）は
、二つの別異の方法またはこれら二つの別異の方法の組
合せによって実施されうる。

第１の方法においては、例えばタンク培養器中の、培養
物に対して時間的間隔を置いて脈動状態でエネルギーを
供給する。

かかる時間的間隔は調節制御しうる。別法として、第２
の方法では、物理的束縛によって限定された流路に沿っ
て流れている培養物に対して継続的エネルギー供給点間
に空間的間隔を置き、エネルギー源をそれら供給点で連
続的に供給する。

これら二つの方法は、第２の間隔を置いた供給点におい
て時間的間隔を置いた脈動でエネルギーを供給すること
により、組合せ使用することもできる。

第２の方法における効果は、限定流路に沿って培養物が
流れる際に培養物中の個々の細胞を、エネルギーの脈動
源に対応する濃度変化に付すことである。

第２の方法においては、継続的供給点間の距離および供
給点間の培養物の流速は、第１の方法におけるサイクル
時間に対応するものを決定する。

かかる対応サイクル時間も、本明細書ではサイクル時間
と称する。

第２の方法は英国特許第１．．３５３，００８号、第１
，４１７，４８６号および第１．４１７，４８７号明細
書記載の発酵槽、または特願昭５０−９９０５８号（英
国特許出願箱３５７５４／７４および２１２８８／７５
に対応）明細書記載の複数の栄養供給点をもつ発酵槽に
おいて採用しうる。

本発明の第１の方法の第１の態様では、細胞の培養物を
物理的束縛によって限定された流路に沿って流し、エネ
ルギー源を１またはそれ以上の位置で培養物に対して供
給することにより流路通過中の培養物中の個々の細胞を
、実質上無視しつるかまたは脈動状エネルギー源に相当
する濃度変化に曝し、かつサイクル時間は実質上ゼロで
あるか、または培養物に対して適用されうる環境条件下
でのサイクル時間対バイオマス効率比のグラフの第１領
域内にあるかもしくは該第１領域に直続する該グラフの
第２領域の部分にあり、そしてエネルギー効率比は第１
領域内における値の１５％以内の差にあるようにするこ
とを特徴とする細胞の培養方法を提供する。

本発明の第１の方法の第２態様では、細胞の培養物を物
理的束縛で限定された流路に沿って流し、エネルギー源
を１またはそれ以上の位置で培養物に対して供給するこ
とにより流路通過中の培養物中の個々の細胞を、脈動状
エネルギー源に相当する濃度変化に曝し、かつサイクル
時間は培養物に適用されうる環境条件下でのサイクル時
間対バイオマス効率比のグラフの第１領域内にあるかも
しくは該第１領域に直続する該グラフの第２領域の部分
にあり、そしてエネルギー効率比は第１領域内の値の１
５係以内の差にあるようにすることを特徴とする細胞の
培養方法を提供する。

本発明の第１の方法の第３態様では、細胞の培養物を物
理的束縛によって限定された流路に沿って流し、エネル
ギー源を１またはそれ以上の位置で培養物に対して供給
することにより、流路通過中の培養物中の個々の細胞を
、実質上無視しうるかまたは脈動状エネルギー源に相当
する濃度変化に曝し、かつサイクル時間は実質上ゼロで
あるかまたは所与のμ／μｍ値において下記表示時間を
越えず、そして下記表示の中間のμ／μｍ値に対する最
大サイクル時間は線型比例で求められるものであること
を特徴とする細胞の培養方法を提供する。

μ／μｍ サイクル時間（秒） ＞０．５ ３０ ０．２′６ ０．１４ ０．０５ ３ ＜０．０２ ２．５ 好ましくは、上記第１方法において、所与のμ／μｍ値
におけるサイクル時間は下記表示の時間を越えず、中間
値は比例関係で求める。

μ／μｍ サイクル時間（秒） ＞０．５ １５ ０．２５ ０、１ ３．５ ０．０５ ２．５ ＜０．０２ ２ 本発明の第１の方法は、細胞への高炭素変換効率が必要
とされる培養法、例えば、適当な炭素源（例：メタノー
ル）で微生物を培養することにより単細胞蛋白を製造す
る方法として好適である。

そのような単細胞蛋白製造方法は英国特許第１３７０８
９２号の明細書に記載されている。

本発明の上記第１の方法は、英国特許第１３５３００８
号、第１４１７４８６号、第１４１７４８７号明細書お
よび特願昭５０−９９０５８号（英国特許出願３５７５
４／７４および２１２８８／７５に対応）明細書に記載
される如き醗酵装置で実施するのが適当である。

物理的束縛によって限定された流路に沿って培養物を流
す装置で細胞への高炭素変換効率を必要とする方法を実
施する際に、炭素源を培養物に対して実質上連続的に供
給して、炭素源の即時かつ均質な分布を与えるのが好ま
しい。

業界で周知の実用上の理由のために、ある種の条件下、
例えば基質が高溶解性液体である場合および／または微
生物がエネルギー源に対して高親和性を有する場合には
、上記の如きエネルギー源の望ましい分布は達成し得な
い。

本発明の上記第１の方法の実施に当って、もし個々の方
法において拘束があるならば、出来る限り短いサイクル
時間で培養物に対してエネルギー源例えば炭素源を供給
するのが好ましい。

好ましくは、多数のエネルギー源供給点を設けるべきで
ある。

適切なサイクル時間を達成するために流路の周囲に連続
して設ける供給点間の距離は、流路に沿った培養物の流
速によって決定されることになる。

培養物に対して実質上連続的にエネルギー源を供給する
ことの困難性は、時には、やや溶解性の低い基質（例え
ばガスまたは蒸気として供給されるアルカン、長鎖アル
コールまたは炭化水素）の使用により、キャリヤー中に
同伴させることにより、または基質に対する微生物の親
和性を変性することにより、克服することができる。

前掲のサイクル時間は、メタノールから単細胞蛋白を製
造する方法、好ましくはメチロフィラス・メチロトロフ
ァス種の菌株を用いる方法に極めて好適である。

メチロフィラス・メチロトロファス種は、従前はシュウ
トモナス・メチロトロファ種として知られていたもので
あり、その特性は英国特許第１３７０８９２号明細書に
記載されている。

非常に適した上記種の菌株は、Ｎ ＣＩ Ｂ −１Ｆ５
゜１０５０８〜１０５１５およびＡ、 １０５９２〜１
０５９６菌株（ＮＲＲＬＡ、Ｂ ５３５２〜６４および
微工研寄託第１２１５〜２７号に対応）である。

流路に沿った培養物の流速を制御し、および／またはエ
ネルギー源例えば炭素源の添加量を供給点において制御
するのが好ましい。

本発明の第２の方法の第１態様では、生分解性物質を溶
液および／または懸濁物として含む液体を微生物学的に
処理するに際して、該液体を微生物培養物を入れた処理
容器に対して１またはそれ以上の位置で連続的および／
または脈動状で供給することにより、培養物中の個々の
微生物を生分解性物質の脈動源またはそのような脈動源
に相当する濃度変化に曝し、かつそのサイクル時間を、
培養物へ適用されうる環境下におけるサイクル時間対バ
イオマス効率のグラフの第２領域内にあるようにするこ
とを特徴とする方法を提供する。

本発明の第２の方法の第２態様では、生分解性物質を溶
液および／または懸濁物として含む液体を微生物学的に
処理するに際して、該液体を微生物培養物を含む処理容
器に対し１またはそれ以上の位置で連続的および／また
は脈動状に供給することにより、培養物中の個々の微生
物を、生分解性物質の脈動源またはそのような脈動源に
相当する濃度変化に曝し、かつ所与の８７μｍ値におけ
るサイクル時間を下記表示の範囲内にあるようにし、中
間値については比例で求めたサイクル時間とすることを
特徴とする方法を提供する。

μ／μｍ サイクル時間（秒） ＞ ０．２ ８〜６０ ０、１ ４．５〜１２０ ０．０５ ３．５〜２４０ ０．０２ ２．５〜６００ ＜０．０１ ２〜１２００ 好ましくは、上記第２方法における所与の８７μｍ値に
おけるサイクル時間は下記表示の範囲内にある（μ／μ
ｍの中間値に対するサイクル時間は比例計算によって求
める）。

μ／μｍ サイクル時間（秒） ＞０．１ 、 ８〜４００．０５
５〜８０ ０．０２ ３．５〜２００ ０．０１ ３〜４００ ＜０．００５ ２．５〜９００ 本発明の第２の方法は、廃水の微生物学的処理方法にお
ける一工程として最も適当である。

この種の方法の例は、特願昭４９−５３９３９号（英国
特許出願２３３２８／７３および５３９２１／７３に対
応）明細書に記載されている方法を挙げるさとができる
。

廃水の処理において、スラッジ生成量を最小限に低減さ
せること、および微生物学的処理に関与する微生物の炭
素転換効率が低くあるべきことは望ましい。

従って、エネルギー源（この場合には生分解性物質を含
む廃水供給物）が前述の方式で供給されるのが好ましい
。

しかし、さらには第３図のグラフから見られるように、
不規則脈動を使用することは、この応用例では、規則脈
動を用いるよりも有利である。

上記の本発明の第２の方法では、細胞への炭素変換効率
が低くあるべきことが望ましい。

従って、第２の方法における生分解性物質の供給は、そ
の方法がエネルギー効率比の最小値またはその付近で進
行するように脈動される。

好ましくは、かかる生分解性物質は、所望の効果を最大
化するために規則的な脈動状で供給される。

この第２の方法におけるサイクル時間は、好ましくは、
効率比がグラフの第１領域および第３領域におけるそれ
ぞれの値の８５％以下であるグラフの第２領域の部分に
ある。

本発明の第２の方法は、タンク反応器を備えた適宜な装
置で行なうことができ、その場合適当な装置は培養物が
、物理的束縛によって限定された流路に沿って流れるよ
うな装置である。

明かなように、使用装置がタンク反応器であるときには
液体またはエネルギー源は１またはそれ以上の位置で装
置内の培養物中に供給され、そして物理的束縛によって
限定された流路に沿って培養物を流動させる場合には液
体またはエネルギー源はその流路を流れている培養物に
対して１またはそれ以上の位置で連続的および／または
脈動状に供給される。

従って本発明方法は広範囲に応用することができ、そし
て微生物の連続的培養を行なうための方法に極めて有用
である。

本発明方法を採用する処理方法の種類目的に応じて、本
発明方法は消費エネルギーに関しての細胞産生効率を増
大するのにも、または低減するのにも使用することがで
きる。

単細胞蛋白または細胞代謝物質の産生のためには、かか
る効率は最大化されるべきである。

他方、前述のように、廃水処理および有機溶媒の産生に
おいては、その効率は最小化されるべきである。

エネルギー源は、好ましくは炭素源である。

しかし、エネルギー源は光合成反応における光源、また
はエネルギー源として水素を利用する培養物における水
素、また無機栄養性微生物における還元状態無機エネル
ギー源でありうる。

下記の如き基本的な四タイプの実験を行ない、その結果
から第１〜３図のグラフを作成した。

１、同一の醗酵槽を一対に結合してなる系内に微生物の
培養物を循環させた実験。

培養物に対して炭素源を下記（ａ）〜（ｃ）の方式で供
給した。

（ａ） 各種に対して等しい速度で供給。

（ｂ） 一方の槽にのみ供給。

（ｃ）各種に対して供給、しかしそれぞれの槽に対し別
異の速度で供給。

２、標準的な２ｅ実験用醗酵槽内の培養物に対して一連
の異なる方式で炭素源を脈動状に供給した実験。

３、容量５００００ｅの循環式醗酵槽中へ一連の位置で
連続的に炭素源を供給した実験。

４、容量２００００ｅの循環式の活性スラッジ処理系内
へ廃水を供給した実験。

エネルギー飢餓期間が生ずるように炭素および／または
エネルギー源を増殖微生物に供給する連続培養において
は、エネルギーがエネルギー飢餓期間後の細胞に供給さ
れるとき、供給エネルギーの一部分は、初期に、増殖状
態への適応期間にある細胞によって使用され、従って実
質上効果的な増殖のために利用され得ないと考えられる
。

どのことは、一層長期間にわたって、消費エネルギー源
に関してのバイオマス産生効率の総体的な降下を意味す
る。

炭素源のようなエネルギーの真に連続的な供給を受ける
細胞は真に定常的な速度で増殖し、その場合代謝物質が
蓄積し、酸素活性が効率的なバイオマス産生と均衡して
実質上一定水準にある。

このような培養は時間的間隔を置いて脈動方式でエネル
ギー源を供給することにより非効率化される。

これによって導入される効率比は、下記の簡潔な式によ
って広義に定義しうる。

Ｘ／（Ｘ＋ｆＹμｍ／μｔ） ここにＸは、μｍに等しい速度において定常状態の増殖
条件下にある有効な生合成に必要とされるエネルギーに
関係し、量Ｙは外部供給エネルギー利用不可能の長い時
間後の物質代謝機構の再組織に必要とするエネルギーに
関係し、ｔは前記定義のサイクル時間であり、ｆはＯ〜
１．０の範囲の係数であり、利用可能な外部供給エネル
ギーなしの状態で経過した時間の関数としての所要再組
織エネルギーの割合を示している。

項ｆＹμｍ／μが小であるときには、効率比は１に近く
なる。

これは次のようにして達成できる。すなわち、一定μｍ
においてμを増大させること、一定μにおいてμｍを減
小させること、またはサイクル時間とともに係数ｆの値
を変えることである。

係数ｆは、利用可能な外部供給エネルギーがない期間中
に分解される代謝物質蓄積物の割合を示す複雑な関数で
あり、それ自体では、蓄積代謝速度定数（ｋ）、エネル
ギー枯渇と代謝物質分解開始との間の応答時間（ｔｒ）
、合計サイクル時間（１）、および比例増殖係数μ／μ
ｍを含んでいる。

エネルギー供給の枯渇後に微生物が応答時間（ｔｒ）内
に影響を受けないままであり、その後に代謝蓄積物がそ
の残留濃度に比例した速度で消費されるものと仮定すれ
ば、それは下記式で示される。

ｆ ＝ １−ｅｘｐ （ｋｔｒ−ｋｔ （１−ｆｉ／ｌ
１ｍ ） 〕（ただし、ゼロより小の値が得られるとき
には１＝０とするものとする）。

これは、高々概算であるが、代謝物質の消費速度がゼロ
から極限値にまで即時に変化することが予示される場合
の応答時間の末端部分以外では、良好な値を示す。

これは我々の真の微生物系の理解に従わないので、この
領域における関係の多少の平滑化を行なった。

ｆの値を式に挿入した場合： 効率比−Ｘ／（Ｘ＋ｆＹμｍ／μｔ） 得られる式は第２図に示した如き一連の線を示す。

我々の実験データはこれらの線にすべて合致した。

第１図において、前述のグラフの第１領域は下記のよう
にして解釈される。

これらの極めて短いサイクル時間では、微生物の遅延応
答時間の影響は、ｆがゼロに近くなりそして効率比が最
大になる。

グラフの第２領域においては、サイクル時間が実質上微
生物の応答時間を越えているのでｆが増大し、かくして
効率比が減小する。

しかし、ｔが増大を続けているときには、式に対するｆ
の影響は減小し、そしてｔが支配的な影響を与えるよう
になり、その結果、効率比が増大する。

この領域において、規則的脈動についての典型的なグラ
フは、第３図におけるように、不規則的脈動のグラフか
ら放射状に別れている。

規則的脈動については、一定値への再接近は、より短い
サイクル時間の方向にづれる。

この最後の現象の理由は、実質上代謝活性の調節のため
に細胞が用いる自然の規則的周波数の振動が基質の脈動
の正確な一定周波数（すなイつち規則的脈動）と同調し
またはそれに引き込まれるのであろうと推定される。

不規則脈動を用いる場合には自然の代謝振動の一定周波
数が崩れ、活性におけるランダムな非効率的変動が生ず
る。

メタノールの単一エネルギー源で生育する純粋培養物（
蛋白微生物）、および混合エネルギー源（家庭排水）で
増殖する混合培養物（原核微生物および真核微生物）で
の経験によると、我々が誘導した数学的モデルに理論と
実際とが一致することが判明した。

この理論はエネルギー制限連続培養で増殖しているほと
んどの微生物に応用しうるものと考えられ、これを「再
組織化エネルギー損失理論（Ｒｅｏｒｇａｎｉｓａｔｉ
ｏｎ ＥｎｅｒｇｙＬｏｓｓ Ｔｈｅｏｒｙ ） 」と
称することにした。

実施例 １ 英国特許第１，３５３，００８号明細書に記載される如
き小型の圧力循環式醗酵槽（処理液容積１６５ｅ）中で
４０°ＣおよびＤ−０，２５ｈ−１で、メチロフィラス
・メチロトロファスの培養物を生育させた。

培養基は英国特許第１３７０８９２号明細書中の培養基
■と同じものであった。

醗酵槽内での循環速度は３０ｍ１／ｈであり、平均循環
時間は２０秒であった。

細胞乾燥重量はメタノールの添加速度に関係しており、
乾燥細胞の定常状態濃度は１４９／６であった。

醗酵槽に沿って５個所のメクノール添加位置を分布させ
、各位置でのメタノール流量を変えたが、そのメタノー
ル流量は醗酵槽の当該部分に含まれる液体の容積に比例
していた。

メタノール添加位置の物理的分布は、循環している細胞
を３秒毎の基質の存在および不存在の継続的サイクルに
付すか、または醗酵槽へ供給するメタノールのすべてを
１個所で供給するときには２０秒毎の同様なサイクルに
付すような分布とした。

結果を下記の表１に示す。

（注） （１）細胞への炭素とは、細胞の炭素へ変換したメタノ
ール炭素の百分率を表わす。

（２）ＣＯ２への炭素とは、Ｃ０２の炭素へ変換したメ
タノール炭素の百分率を表わす。

（３）Ｓ／Ｎへの炭素とは、細胞から炉別した液中の炭
素に変換したメタノール 炭素の百分率を表わす。

実施例 ２ 実験用連続式醗酵槽（液容１．５ｅ、定常状態細胞乾燥
重量１０ｇ／ｅ）中でメチロフィラス・メチロトロファ
スの培養物を一定の培養基流量で種種の稀釈速度で増殖
させた。

別個のメタノール添加装置を用いて、必要充分なメタノ
ール（例えばμｍ０．２ｈ−’における３秒の増殖に必
要充分）を、１回０．３秒間で供給するメタノールの脈
動として導入しうるようにした。

供給時間：全サイクル時間との比を、サイクル時間に変
動が生じても、１：１０に維持した。

培養基の組成および条件は実施例１と同一であった。

結果を表２に示す。※細胞の炭素へ組込まれたメタノー
ル炭 素の％（Ｗ／Ｗ）を表わす。

細胞の炭素含量は実験中一定のままであった。

【図面の簡単な説明】

第１図はバイオマス効率比（縦軸）とサイクル時間（横
軸）との関係を示すグラフである。 第２図は、種々の８７μｍ ａ ｘ、における第１図の
関係を示すグラフである。 第３図は規則的脈動（実線）および不規則的脈動供給の
場合についての第１図の関係を示すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 細胞の培養物を物理的束縛によって限定された流路
   に沿って流し、１またはそれ以上の位置で培養物に対し
   てエネルギー源を供給することにより、流路通過中の培
   養物中の個々の細胞をエネルギーの脈動源に相当するエ
   ネルギー源濃度変化に曝し、かつその脈動のサイクル時
   間を所与の８７μｍ値において下記一覧のサイクル時間
   二μ／μｍ サイクル時間（秒） ＞０．５ ３０ ０．２６ ０．１４ ０．０５ ３ ＜０．０２ ２．５ （ただし８７μｍ値が上記の中間値であるときには直線
   比例計算によって求められるサイクル時間）を越えない
   ようにすることを特徴とする細胞の培養方法。 ２ 所与の８７μｍ値におけるサイクル時間を下記一覧
   のサイクル時間： μ／μｍ サイクル時間（秒） ＞０．５ １５ ０．２５ ０、１ ３．５ ０．０５ ２．５ ＜０．０２ ２ （ただし８７μｍ値が上記の中間値であるときには直線
   比例計算によって求められるサイクル時間）を越えない
   ようにすることを特徴とする特許請求の範囲第１項に記
   載の方法。 ３ 適切な炭素源で微生物を培養することによって単細
   胞蛋白を産生させるための特許請求の範囲第１または２
   項に記載の方法。 ４ 炭素源がメタノールである特許請求の範囲第３項に
   記載の方法。 ５ 流路に沿った複数の位置でエネルギー源を培養物に
   供給する特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の
   方法。 ６ 細胞はメチロフィラス・メチロトコファス種に属す
   るものである特許請求の範囲第４項に記載の方法。 ７ 細胞は微工研菌寄第１２１５〜１２２７号の菌株の
   いずれかに属するものである特許請求の範囲第６項（こ
   記載の方法。 ８ 生分解性物質を溶液および／または懸濁物として含
   む液体を微生物学的に処理する方法であって、該液体を
   微生物培養物を含む処理容器に対し１またはそれ以上の
   位置で連続的におよび／または脈動状に供給することに
   より培養物中の個々の微生物を生分解性物質の脈動源ま
   たはそのような脈動源に相当する生分解性物質濃度変化
   に曝す工程を含み、かつ所与のμ／μｍ値における脈動
   サイクル時間を下記一覧： ８７μｍ サイクル時間（秒） ＞０．２ ８〜６０ ０、１ ４．５〜１２０ ０．０５ ３．５〜２４０ ０．０２ ２．５〜６００ ＜０．０１ ２〜１２００ （ただしμ／μｍ−７５Ｓ上記の中間値であるときは直
   線比例計算により求められるサイクル時間）の範囲内に
   あるようにすることを特徴とする上記微生物学的処理方
   法。 ９ 所与のμ／μｍ値におけるサイクル時間を下記一覧
   ： ８７μｍ サイクル時間（秒） ＞０．１ ８〜４０ ０．０５ ５〜８０ ０．０２ ３．５〜２００ ０．０１ ３〜４００ ＜０．００５ ２．５〜９００ （ただし８７μｍの値が上記の中間値であるときには直
   線比例計算によって求められるサイクル時間）の範囲内
   にあるようにすることを特徴とする特許請求の範囲第８
   項に記載の方法。 １０廃水の微生物学的処理における一工程である特許請
   求の範囲第８または９項に記載の方法。 １１ 培養物中の個々の微生物が曝される脈動源は不
   規則的なものである特許請求の範囲第８〜１０項のいず
   れかに記載の方法。