Verfahren und Vorrichtung rum Auswählen eines bestimmten prototropischen Mutanten aus einer grossen Mikroorganismenpopulation Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und eine Vorrichtung zum .Auswählen eines bestimmten pro- totropischen Mutanten aus einer grossen Mikroorganis- menpopulation.
Zwecks terminologischer Vereinfachung soll die er- findungsgemässe Vorrichtung nachfolgend als Mutek- tor bezeichnet werden, wobei dieses Wort eine Neuprä gung aus den Worten Mutanten und Detektor dar stellt.
Unter eecigneten Umgebungsbedingungen verlaufen sämtliche bioloLische Prozesse je nach Art und Menge der in den Einzelzellen vorhandenen Enzyme mit unter schiedlicher Geschwindiekeit und in verschiedenem Aus- mass ab. Daher liefern die bleichen Ausgangsstoffe, näm lich Kohlehydrate. Fettsäuren, Aminosäuren, Vitamine und Mineralien so verschiedenartige Formen wie eine Kuh, eine Hefezelle oder einen Apfelbaum.
Diese Differenzierung führte zur systematischen Aus wahl von Organismen durch den Menschen, die Kstimm- te wertvolle Enderzeugnisse selbst herzustellen oder bei deren Erzeugung besonders Nvirsam mitzuhelfen vermö gen.
Spezielle Tierzüchtungen und Pflanzenvarietäten wurden für die Zwecke der Landwirtschaft ausgwählt. In der industriellen Fermentation oder in der biulo@_i- schen Forschung sucht man ständig nach noch wirksame ren oder spezielleren Mikrobenstämmen; beispielsweise suchte man in jüngster Zeit unter den Mikroorganismen nach 1-Threoninerzeugern sowie solchen, die Fumarsäure in einer Konzentration von über 3.5 bis 4(j", im Umge bungsmedium zu erzeugen vermögen.
Diese speziellen Stämme sind sehr häufig das Ergeb nis von Mutationen, die innerhalb grosser Populationen stattfinden. Diese Mutationen ergeben sich aus dem Auftreten von Einzelwesen, die sich in der einen oder anderen Beziehung infolge eines Irrtums bei der Chromo- somen-Verdoppelung von ihren Eltern unterschieden. Diese Organismen, die eine Mutation erfahren haben, sowie ihre Nachkommen, kennt man als sogenannte Mutanten .
Die meisten Mutanten sind auxotroph, d.h. sie haben etwas und zwar manchmal soviel von den enzymatischen Eigenschaften ihrer Eltern verloren, dass sie in ihrer heimatlichen Umgebung nicht mehr weiterleben kön nen. Einige Mutanten jedoch sind in dem Sinne proto- troph, dass sie eine breitere oder wirkungsvollere Enzym ausrüstung als ihre Eltern haben. Solche prototypen Mutanten besitzen oftmals praktische Vorteile. So gestat tete beispielsweise die Auswahl und Verwendung von Mutanten aufsehcnerregende Leistungssteigerungen bei der Penicillin-Erzeugung.
Die in einer Population entstehende Mutantenart ist unkontrollierbar; dagegen kann man mit geeigneten physikalischen oder chemischen Mitteln die Häufigkeit des Auftretens von Mutationen anreizen.
Die Hauptaufgabe bei der Erzielung eines Mikroben mutanten mit 2ewünschcn Eigenschaften besteht häufig in der Erkennung des gewünschten Organismus in der ihn umocbenden, zahlreichen Population.
Diese Erkennung erzielte man bisher nach verschiede nen .Arbeitsweisen, die eine systematische, ermüdende Platticrung (nämlich das Aufimpfcn von Mikroorganis men auf in Flachschalen befindliche, halbfeste Kulturme dien) in sich schlossen und nur die Handhabung von auf Mutationsgrad bezogen - vergleichsweise kleinen Populationen gestatteten.
Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Schaffung eines Verfahrens, das den erforderlichen Zeit und Ar beitsaufwand für die Auswahl eines bestimmten Mutan ten verringert. Zudem soll es möglich sein, das Vorhan densein eines gewünschten Mutanten in einer sehr gros sen Population fortlaufend und selbsttätig festzustellen, der dann anschliessend nach Standardmethoden aus einer kleinen Population ausgesondert werden kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren zum Auswählen eines bestimmten prototropischen Mutanten aus einer grossen Mikroorganismenpopulation ist dadurch<B>gekenn-</B> zeichnet, dass man in einem Kultur;efäss mit flüssigem Kulturmedium A eine grosse Population bestimmter, der Mutation unterliegender Mikroorganismen ohne Rege lung der produzierten Mutantenarten wachsen lässt; während des Mikroorganismuswachstums in das Kultur- gefäss ständig frisches flüssiges Kulturmedium einbringt;
dem Kulturgefäss fortlaufend lebende Mikroorganismen enthaltendes, flüssiges Kulturmedium entnimmt, gleich zeitig aber im flüssigen Kulturmedium des Kulturgefässes ein derartiges Mikroorganismuswachstum zulässt, dass in der entstehenden Population beträchtliche Mutantenmen- gcn erhalten bleiben;
fortlaufend das gesamte cntnommcndc Kulturmedium portionswcise sammelt, wobei jede Portion ein solches Volumen aufweist, dass es aurciclcnd viel lebende Mikroorganismen enthält, damit sich unter theoretischer Betrachtung der Mutationsraten theoretisch mindestens ein prototropischer Mutant dar unter befindet;
jeder Portion ein Medium B zusetzt, das dem gewünschten prototropischen Mutanten eine erfass- bare Nachkommenschaft zu entwickeln gestattet und die Nicht-Mutanten verkümmern lässt, und das vom ge wünschten Mutanten, nicht aber von den Nicht-Mutanten veränderbare Eigenschaften besitzt, und periodisch die resultierenden Mischungen auf das Auftreten der Verän derung der Mediumscigenschaften hin beobachtet,
die das Wachstum eines gewünschten prototropischen Mu tanten in einem besonderen Mischungsexemplar anzeigt.
Die Erfindung schafft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens, die gekennzeichnet ist durch einen regulierbaren beweglichen Fraktionssammler mit einer Anzahl Kulturröhren, einem Kulturgefäss zur Aufnahme des flussigen Kulturmediums und der darin wachsenden Mikroorganismenpopulation; einen Vorratsbehälter zur Aufnahme des Mediums;
Mittel zum wiederholten Abziehen von Portionen des Kulturmediums und der Mikroorganismen aus dem Kul- turgefäss; Mittel zum wiederholten Abzielen von Portio nen des Mediums aus dem Vorratsbehälter; Mittel zum Überführen sowohl der Portionen des Kulturmediums und der Mikroorganismen als auch der Portionen des Mediums an jede der Kulturröhren; Mittel zum Regulie ren der Medienabflüsse in Abhängigkeit von der Ge schwindigkeit des Fraktionskollektors; und Mittel zum Zuführen von frischem Kulturmedium an das Kulturge- fäss.
Die Erfindung ist nachstehend anhand eines Ausfüh rungsbeispiels und der Zeichnung erläutert. In dieser zeigt: Fig. 1 eine schematische Darstellung der Hauptbe- standtcilc des Mutektors; Fig. 2 eine schematische Darstellung eines Mutektor- Rohrs nebst der Quelle für seine beiden Fraktionen und den Zuflusskontrolimittcln; Fig. 3 eine ähnliche Darstellung wie Fig. 2 mit abge wandelten Zuflusskontrollmitteln;
Fig. 4 wiederum eine Fig. 2 ähnelnde Darstellung mit noch anderen Bestandteilen; Fig. 5 eine Teilaufsicht auf den Fraktionssammler bei der Anordnung gemäss Fig. 4 und Fig. 6 eine der Fig. 3 ähnelnde Darstellung mit gewis sen Abwandlungen.
Der allgemein durch die Bezugsziffer 11 gekennzeich nete Mutektor umfasst ein Paar Dauerkultureinheiten 12 und 13 mit geeigneter, bekannter Ausrüstung, um sie nach dem chemostatischen oder turbidostatischen Prinzip arbeiten zu lassen. Die Ausläufe der beiden Kulturen werden<B>je</B> für sich in einen Aufnehmer, z.B. Trichter 14, eingegeben, der seinerseits mit einem drehba ren Fraktionssammler 15 üblicher Drehgestell-Bauart verbunden ist. Auf dem Drehgestell sind eine Mehrzahl Rohre, z.B. 300 Stück von 15 X 150 mm Grösse ange ordnet.
Ein in passender Weise an den Sammler 15 an- geschlossener Takt<U>g</U>eber 10 regelt dessen Drehgeschwin digkeit.
Ein Paar Behälter 17 und 18 dient zur Zuführung von verschiedenen auseewählten Nährmedien oder Substraten zu den Kultureinheiten 12 und 13. Der Behälter 18 ist ausserdem noch mittels Leitung 20 direkt an den Aufneh mer 14 angeschlossen und vermag daher nach Wunsch selcktivcs Mccliunt anzuliefern.
Geeignete Flicsskontroll- vorrichtungen, z.B. ein Paar Mariottische Röhren 21 und 22, sorgen für die Druckregelung in den Behältern 17 bzw. 18. 1n der Nähe der Kultureinheit 12 ist eine UV- Lichtquelle 23 angeordnet, die die Mutationsrate in dieser Einheit zu beschleunigen vermag.
Die ganze Einheit ist gedrängt gebaut, so dass sie notfalls zwecks aseptischen Arbeitens nach erfolgter Gas sterilisation in einen durchsichtigen Kunststoffkasten ein geschlossen werden kann.
Der Zweck der Dauerkultureinheit 12 besteht darin, sehr grosse Mikroorganismuspopulation mit beträchtlich vielen Mutanten zu entwickeln. Die Aufgabe der Rohre 16 im Fraktionssammler 15 andererseits besteht darin, eine vorgewählte Umgebung zu schaffen, in der der gewünschte Mutant eine erfassbare Nachkommenschaft zu entwickeln vermag, während die Nicht-Mutanten verkümmern.
Die Zahl der Rohre 16 im Fraktionssammlergestcll ist derart verhältnismässig gross, dass jedes Einzelrohr eine Inkubationsperiode erhält und dadurch Zeit geschaffen wird, damit die sich aus der Anwesenheit des gewünsch ten Mutanten ergebenden Wirkungen auftreten können. Diese Wirkungen fassen sich gewöhnlich durch Beobach tung mittels unbewaffneten Auges auf je nach den Eigenschaften des Mutanten verschiedene Art feststellen, wie dies in den späteren Beispielen näher beschrieben ist.
Um das Gerät und seine Arbeitsweise voll verstehen zu können, erscheint eine kurze Erörterung seiner Theo rie an dieser Stelle sinnvoll.
Von Wissenschaftlern wird allgemein anerkannt, dass die potentiellen Eigenschaften eines Individuums vererbt werden, während ihr Entwicklungsausmass von der Um gebung abhängt. Im Falle mikrobischer Mutanten kann sich eine neuerworbene Eigenschaft nur dann leicht kundtun, wenn sie eine wirksamere Anpassung des Individuums an seine Umgebung ergibt. Dann nämlich befindet sich der Mutant gegenüber der restlichen Popu lation im Vorteil, kann sich je nach Umgebung in beschleunigtem Ausmass vermehren und entwickelt eine Nachkommenschaft, die die neue Eigenschaft besitzt.
Wenn andererseits eine neue Eigenschaft des Mutan ten keine ausschliessliche oder verstärkte Vervielfälti gungsrate ergibt, bleibt der Mutant wahrscheinlich unent deckt. Im Falle des prototrophen Mutanten kann sich der Wettstreit mit normalen Zellen zumindest in einer nor malen Umgebung wahrscheinlich als zuviel Kampf erwei sen.
Unter diesen Umständen scheint eine allgemeine Regel für Mikroorganismen, nämlich das (iSpe7ialisie- rungs-Gcsetz , zu gelten, wonach die Wachstumsge schwindigkeit der Mannigfaltigkeit der Enzymausrüstung umgekehrt proportional ist. Ein Beispiel hierfür ist das viel schnellere Wachstum eines Virus mit enger Enzym ausrüstung im Gegensatz zur Wachstumsgeschwindig keit des durchschnittlichen, chemolithotrophischen Bak- teriums mit seinem breiten Enzymspektrum.
Das auf der vorstehenden Theorie beruhende Mutek- tor-Gerät schafft nicht nur Bedingungen, unter denen Mutanten in merklicher Anzahl auftreten, sondern auch einen schnellen Wechsel in der Umgebung kleiner, aber zahlreicher Ausschnitte aus der Population, so dass Mutanten mit den gewünschten Eigenschaften plötzlich besser als die Normalzellen angepasst werden. Dadurch erhalten die Mutanten eine Gelegenheit, Nachkommen schaft zu entwickeln und dadurch ihr Vorhandensein zu offenbaren.
Quantitative Einstellungen des Mutektors verlangen ein gewisses Verständnis für die Mutationsraten bei Mikroorganismen. Das Verhältnis für natürliche Muta tion liegt für Bakterien im Mittel bei 1 X 10-", d.h. unter je 1 Milliarde Zellen findet man im allgemeinen Durch schnitt einen Mutanten. Das Verhältnis für prototrophi- sche Mutation lässt sich zugegebenerweise nur schwer zahlenmässig bestimmen, da sämtliche möglichen proto- trophischen Eigenschaften nicht ohne weiteres erkannt werden können.
Man hat jedoch auf dem Gebiete der bakteriellen Genetik durch da, Verhältnis der Rückum wandlung zur Normaltype in einer Auxotrophenpopula- tion einen gewissen Einblick in diese Frage bekommen. Dieses Verhältnis ergab sich zu etwa 1 X 10- oder ein Prototroph auf eine Million Mutanten. Diese Verhältnis zahlen lassen sich aber beträchtlich erhöhen, indem man die Population mutagenen Mitteln, wie UV-Licht, Stick stoff-Senfgas oder radioaktiven Substanzen, aussetzt.
Der Abfluss aus dem Dauerkulturapparat muss also so eingestellt werden, dass jedem Rohr 16 des Fraktions sammlers 15 mindestens ein Prototroph mit einem Orga nismus von breiterer Enzymausrüstung als die Elternzel len zugeführt werden. Zusätzlich zu dieser Dauerkultur portion erhält das Rohr noch eine vergleichsweise grosse Menge eines Mediums, das die Umgebung schaffen soll, die zum Gedeihen des gewünschten Prototrophs erforder lich ist.
<I>Beispiel I</I> Erkennung <I>einer</I> prolutrophischen <I>Mutanten</I> Hierbei dient der Mutektor zur Gewinnung eines Organismus, der eine vergleichsweise stabile Verbindung, wie etwa ein Herbizid, Insektizid, lästieen Abfall oder ein komplexes Molekül unbekannter Struktur, zu zersetzen vermag, wobei im letzteren Falle die Erkennung in der Weise erfolgt, dass man das unbekannte komplexe Mole kül unter Anwendung der Theorie der Simultanadap tion>) mit bekannten Verbindungen in Bezug setzt.
Bei dieser Anwendungsform braucht man nur mit einer der Dauerkultureinheiten und dem Fraktionssamm ler 15 zu arbeiten.
Ein spezielles Erläuterungsbeispiel wäre die Suche nach einem Organismus, der die strukturell unbekannte Verbindung verwerten kann, die bei der Ammoniation von Pyrogallol entsteht.
Der erste Arbeitsschritt besteht in der Auswahl des geeigneten Dauerkultursystems. Da vorhandene Informa tion darauf hindeutet, dass sich die Kombination aus Ammoniakstickstoff und Pyrolgallol durch die ausserge- wöhnliche Mikrobenfestigkeit der Stickstoffeinheit im entstehenden Komplex auszeichnet, lässt man vorteilhaf- terweise die normale Mikrobenpopulation in einer stick stoffarmen Umgebung wachsen, so dass der Stickstoff wahrscheinlich zuerst dem Komplex entzogen wird.
Da her wird man das Dauerkulturgerät nach dem chemosta- tischen Prinzip arbeiten lassen. Die mutagene Population wird in einem Allzweckmedium mit Stickstoff als dem begrenzenden Faktor aufgezogen. Das Impfmaterial wird aus einer gewöhnlichen bodenvermischten oder bodenge züchteten (soil-run) Mikrobenpopulation bestehen. Das Medium wird die üblichen Mengen an Mineralsalz und Energiequelle mit auf Niedrigwart eingestelltem Stick stoffgehalt enthalten.
Ein Stickstoffgehalt von 0,18 mg/ml wird einer maximalen Populationsdichte von etwa 35 X 10" Mikrobenzellen im Milliliter entspre chen.
Der zweite Arbeitsschritt besteht in der Festlegung der Abflussmenge, die in die einzelnen Fraktionssamm- lerrohre einfliessen darf. Wenn jedes Testrohr 20 ml und das Dauerkulturgefäss 500 ml Fassungsvermögen besitzt, die Mutationsrate <B>1,81</B> X 10-' beträgt (also z.B. die von Phytomvnas stewartii ist,
die für normale Mutation etwas über des Mittelwert für UV-Licht angeregte Mutation jedoch ziemlich niedrig liegt und daher ziemlich typisch für eine übliche Mutationsrate ist) und der Aufteilungs- zykel etwa 20 Minuten erfordert, so gibt folgende Be rechnung einen ungefähren Anhalt für die je Rohr er forderliche Abflussmenge: 1. Die Mikrobenpopulation im DauerkulturgeNss be trägt etwa 35 X 10" je ml oder 1,75 X 10'9 für den Ge samtinhalt des Gefässes.
2. In dieser Population wären 1,81 X 10-s Mutanten, so dass während jedes Aufteilungszykels (1,75 X 10") X (1,8I X 10-,) = 3,17 X 105 Mutanten auftreten wür den.
3. Dann wäre die Zahl der Prototrophen in der Po pulation (3,17 X 10q) X (10- ) = 3,17 X 10" = 317 in 500 ml oder 0,6 Prototrophe je ml.
4. Daher würden unter diesen Bedingungen in 5 ml Dauerkulturabfluss, die man in Abständen von je 20 Mi nuten abzieht, etwa 3 Prototrophe enthalten sein.
Die Ablieferung dieser Menge an die einzelnen Test rohre lässt sich leicht durch passende Einstellung des Frischmediumzuflusses in das Dauerkulturgefäss und des Fraktionssammler Umlaufs an dem auf 20 Minuten Abstandsbetrieb eingestellten Taktgeber 10 erreichen.
Die neue Umgebung für den kleinen Populationsaus- schnitt in den einzelnen Rohren schafft man dadurch, dass man mit Hilfe eines geeigneten, mit dem Taktgeber 10 synchronisierten Ventils 26 aus dem Behälter 18 in jedes Rohr je 15 ml ammoniatierter Pyrogallolsuspension einbringt. Somit erhält jedes Rohr 5 ml aus dem Dauer- kulturgefäss 12 und 15 ml ammoniatierte Pyrogallolsus- pension aus dem Behälter 18.
Feineinstellungen im Volumen des abgegebenen ausgewählten Mediums kann man in geeigneter Weise, z.B. durch Änderung der Lichtweite der Enddüse 31 der Zuführungsleitung 20, vornehmen.
Wie besonders deutlich aus Fig.2 erkennbar ist, liefert der Behälter 17 ein geeignetes Nährmedium zur Erhaltung der Population in der Dauerkultureinheit 12, die deshalb auch als Mutantenquelle dient. Der Behälter 18 andererseits liefert das ausgewählte Medium, in diesem Fall ammoniatiertes Pyrogallol. Die Aufnehmer und Mischtrichter-Einheit 14 sammelt die beiden Abflüs se aus Gefäss 12 und Behälter 18 und leitet die Mischung in das jeweils richtige Testrohr 16 im Fraktionssammler 15.
Wenn die Einheit 12 nach dem chemostatischen Prinzip betrieben wird, dann tropft es aus der Mündung 33 der von der Kultureinheit kommenden Leitung 32 langsam und fortlaufend, während der Abfluss aus dem Behälter 18 durch die Leitung 20 nur kurzzeitig und ziemlich schnell vor sich geht. Das vorzugsweise relaisbe tätigte und mit dem Taktgeber 10 synchronisierte Ventil 26 regelt das Öffnen und Schliessen der Leitung 20 zum jeweils passenden Zeitpunkt.
Wie insbesondere aus der Darstellung des Rohrs 16 in Fig.2 erkennbar ist, befinden sich in seinem Bodenab schnitt die 5 ml Zcllsuspension mit etwa darin enthalte nen Mutanten, die durch mehrere Kreise und die Bezugs ziffer 41 angedeutet ist. Darüber befinden sich im Rohr die 15 ml ausgewähltes Medium, im vorliegenden Bei spiel also ammoniatiertes Pyrogallol, wie dies durch Kreuze und die Bezugsziffer 42 angedeutet ist.
Das aminoniaticrte Pyrogallol stellt für die in die einzelnen Rohre cingegebencn Organismen die einzige Stickstoffquelle dar, weil Stickstoff in der Dauerkultur cinlicit der begrenzende Faktor ist, während etwas Koh lenstoff nebst Mineralsalzen zusammen mit dem mutage- nen Populationsmuster eingebracht werden. Bei Dauerbe trieb wird jedem Rohr eine fünftägige Inkubationsperiodc zugebilligt, da das übliche Fraktionssammlergcstcll 300 Stück solcher Rohre hält und alle 20 Minuten ein Rohr gefüllt wird.
Jedes merkliche Wachstum in den Rohren ist mut- massliclier Nachweis dafür, dass eine gewisse Zersetzung des ammoniatierten Pyrogallols eingetreten ist. In der Praxis zeigte sich schon vor Ablauf des dritten Tages an der Oberfläche einiger Rohre ein beginnendes Wachs tum.
Weitere Zuchtwahl kann man dadurch erzielen, dass man den ganzen Vorgang in ähnlicher Form wiederholt, dabei aber den neuerkannten Mutant zum Beimpfen des Dauerkulturgefässes benutzt. <I>Beispiel 2</I> Erkennung <I>eines</I> giftfesten Mutanten In diesem Fall benötigt man eine Dauerkultureinheit und den Fraktionssammler und verwendet den Mutektor zur Gewinnung eines Organismus, der in einem Medium aktiv zu bleiben vermag, das ein gewünschtes Endpro dukt in einer für die normale Population giftigen Kon zentration enthält.
Als Beispiel hierfür dient die Suche nach einem Hefemutanten, der solange wirksam bleibt, bis der Ätlia- nolgehalt auf 16%, angestiegen ist. Üblichcrwcisc gedei hen Hefen nicht weiter, sobald der Äthanolgehalt im Medium 13 oder 14% erreicht hat.
Beim vorliegenden Beispiel wird eine grosse Hefepopulation im Dauerkul- turgerät gezüchtet, das, wie aus Fig.3 ersichtlich ist, diesmal nach dem turbidostatischen Prinzip arbeitet, wobei eine photoclcktrische Zelle 44 unter Betätigung eines relaisgesteuerten Ventils 45 den Zufluss von Frisch medium vom Behälter 17 her regelt. Durch reichlichen Luftumlauf in der mutagcnen Population sorgt man für maximale Zellvervielfachung und minimale Alkoholer zeugung.
Wenn die Kultur in der Einheit 12 etwa auf die Höhe von 70 bis 80 /', der maximalen Populationsdichte angelangt ist, die die Nahrstoffkonzentration im Medium zulässt, wird eine mit 46 bezeichnete 15-ml-Portion in ein Rohr 16 des Fraktionssammlers eingegeben, dem ausser- dem noch 3,1 ml 95@'iges Äthanol (mit 47 bezeichnet) aus dein Behälter 18 zugesetzt werden.
Dieser Alkoholge halt hemmt eine normale Hcfcpopulation, wodurch die Trübung im Rohr verschwindet, während sich ein von diesem Alkoholgehalt nicht angegriffener Mutant ver mehrt und zu fortgesetzter und verstärkter Trübung des Rohrinhalts sowie weiterer CO,-Entwicklung führt. <I>Beispiel 3</I> .Symbiose Hier wird der Mutektor dazu benutzt, einen Mutan ten zu erkennen, der mit anderen Organismen in Symbio se zu Icben vermag.
Ein Beispiel hierfür wäre der Versuch, einen Rhizo- bium-Mutanten zu erkennen, der symbiotisch unter An lagerung von Luftstickstoff an Gerstenwurzeln zu wach sen vermag und dadurch den Bedarf nach Stickstoffdün gung von mit Gerste bepflanzten Böden beseitigt.
Wie aus Fig.4 deutlich erkennbar ist, betreibt man die Dauerkultureinheit nach dem chemostatischen Prin zip mit Stickstoff als begrenzendem Faktor in einem Standard-Mannitbrühcmedium. Als Impfmaterial dient ein Gemisch aus vielen Rhizobiumstämmen. Den Abfluss stellt man auf etwa 5 ml je Rohr 16 im Fraktionssammler ein, dessen Eingabe mit 51 bezeichnet ist.
Fernerhin werden jedem Rohr vom Behälter 18 her 12 ml mit 52 bezeichneter, stickstofffreier Hoa@@lundliisiing zuQeführt. Ein in für Lösungskultur üblicher Weise gekeimter, zwei Ta.c alter Gerstensämling 53, der von einer erbsengros sen Hülle 54 aus Kunstschaumstoff umschlossen ist, wird auch noch in das Rohr eingesetzt (siehe Fig. 4). In das Rohr wird mittels Kapillarrohr 56 Luft eingeführt, um die Sämlingswurzeln zu belüften.
Einzelheiten hierüber sind aus den Fig.4 und 5 erkennbar, von denen die letztere ein Verteilerrohr 57 zur Belieferung mehrerer Kapillarrohre 56 zeigt.
Die Sämlinge 53 würden die üblichen .Anzeichen von Stickstoffvcrhungerung zeigen, falls ihnen nicht von irgendeinem Rhizobiummutanten Stickstoff zugeführt würde. Das Auftreten solcher Organismen könnte weiter hin auch durch das Auftreten von Knötchen am Wurzel system des Sämlings nachgewiesen werden. Die Inkuba tion kann 7 Tage lang auf dem Fraktionssamm)crgestel) durchgeführt und dann bis zu I Monat auf einem lagenfcsten Gestell fortgesetzt werden, bis die Sämlinge eindeutige Stickstoffverhungerungs-Symptome entwik- keln.
In dieser Beziehung scheint es von beträchtlichem Interesse zu sein, dass man unlängst in Australien einen stickstoffbindenden Mikroorganismus aufgefunden hat, der in Symbiose <B>mit</B> einer Graspflanze aufwächst, wäh rend bisher derartige Vorkommen allein bei Hülsenfrüch ten bekannt waren.
Beispiel <I>4</I> Atitibiuse In diesem Falle wählt der Mutektor aus einer mutage- nen Population einen Mutanten aus, der eine Substanz produziert, die auf hier als Testorganismen bezeichnete Bakterien schädigend einwirkt. Man kann den Mutanten aus einer Bakterien-, Hefe-, Pilz- oder Actinomycetes- Population heraussuchen. Haupterfordernis ist, dass er auf einfacheren Nährmedien als die Testorganismen zu wachsen vermag.
Man könnte <B>also</B> beispielsweise versu chen, einen Pilzmutanten zu isolieren, der Mycobacte- riumtuberculosis-Zcllen zu hemmen oder zu zerstören vermag. Man lässt die mutagene Pilzpopulation in einem Allzweckmedium mit Ammoniumsalzen oder einem an deren Mineralstickstoffsalz als einziger Stickstoffquelle in der Dauerkultureinheit 12 wachsen, die nach dem turbidostatischen Prinzip arbeitet (Fig.6)
und gibt bei 50% der Maximalpopulation jeweils eine mit 61 bezeich nete Teilmenge von 5 ml in die einzelnen Rohre des Fraktionssammlers ab. Jedes Rohr empfängt fernerhin eine mit 62 bezeichnete 15-ml-Teilmenge der Tuberkelor- eanismen. Diese lässt man in der nach dem chemostati- schen Prinzip arbeitenden Dauerkultureinheit 13 mit Dubos-Brühe (oder einem anderen flüssigen Medium,
das sich zur Bildung eines diffusen Wachstums von M. rrrber- crrlosi.s-Ze11en eignet) mit einem der komplexen Stickstoff nährstoffe, 7.B. Asparagin, als begrenzendem Faktor aufwachsen.
Im Rohr 16 befinden sich die Tuberkelorganismen in einem Hungerstadium und sterben allmählich aus oder lösen sich selbst auf, während die mutagene Population mehrere Stunden lang in dem nicht verbrauchten Anteil des gleichzeitig mit dem Populationsmuster in das Rohr eingegebenen Mediums weiter existieren kann.
Wenn kein Antibiotikum im Rohr erzeugt wird, hält sich die auf den diffusen A,1. Iubercolosis-Zellen beruhen de Trübung gradhell mehrere Tage lang, und es kann sich sogar oben auf dem Rohrinhalt ein Häutchen bilden, während sich die Pilzklumpen schnell am Rohrboden absetzen und solange wciterwachsen, bis die in ihrer 5-ml-Teilmenee enthaltenen Nährstoffe verbraucht sind. Wenn aber in dieser Teilmenge von der Pilzpopulation ein Antibiotikum angeliefert und im Rohre erzeugt wird, tritt ein plötzlicher Trübungsrückgang auf und die Häut- chenbildung bleibt aus, da die Tuberkelorganismen aus sterben oder gehemmt werden.
Aus den vorstehenden Beispielen ist somit ersichtlich, dass mit Hilfe des Mutektor-Geräts Mutanten verschie denster Art, darunter auch solche, die das Wachstum von freien Pflanzen- oder Tierzellen beeinflussen, schnell erkennbar gemacht werden.