CH488014A - Verfahren und Vorrichtung zum Auswählen eines bestimmten prototropischen Mutanten aus einer grossen Mikroorganismenpopulation - Google Patents

Description

  Verfahren und Vorrichtung     rum    Auswählen eines bestimmten prototropischen Mutanten  aus einer grossen     Mikroorganismenpopulation       Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und  eine Vorrichtung zum .Auswählen eines bestimmten     pro-          totropischen    Mutanten aus einer grossen     Mikroorganis-          menpopulation.     



  Zwecks terminologischer Vereinfachung soll die     er-          findungsgemässe    Vorrichtung nachfolgend als      Mutek-          tor     bezeichnet werden, wobei dieses Wort eine Neuprä  gung aus den Worten      Mutanten     und      Detektor     dar  stellt.  



  Unter     eecigneten        Umgebungsbedingungen    verlaufen  sämtliche     bioloLische    Prozesse je nach Art und Menge  der in den Einzelzellen vorhandenen Enzyme mit unter  schiedlicher     Geschwindiekeit    und in verschiedenem     Aus-          mass    ab. Daher liefern die bleichen     Ausgangsstoffe,    näm  lich Kohlehydrate. Fettsäuren,     Aminosäuren,    Vitamine  und Mineralien so verschiedenartige Formen wie eine  Kuh, eine Hefezelle oder einen Apfelbaum.  



  Diese Differenzierung führte zur systematischen Aus  wahl von Organismen durch den Menschen, die     Kstimm-          te    wertvolle Enderzeugnisse selbst herzustellen oder bei  deren Erzeugung besonders     Nvirsam        mitzuhelfen    vermö  gen.

   Spezielle Tierzüchtungen und Pflanzenvarietäten  wurden für die Zwecke der Landwirtschaft     ausgwählt.     In der industriellen Fermentation oder in der     biulo@_i-          schen    Forschung sucht man ständig nach noch wirksame  ren oder spezielleren     Mikrobenstämmen;    beispielsweise  suchte man in jüngster Zeit unter den Mikroorganismen  nach     1-Threoninerzeugern    sowie solchen, die     Fumarsäure     in einer Konzentration von über 3.5 bis     4(j",    im Umge  bungsmedium zu erzeugen vermögen.  



  Diese     speziellen    Stämme sind sehr häufig das Ergeb  nis von Mutationen, die innerhalb grosser Populationen  stattfinden. Diese Mutationen ergeben sich aus dem  Auftreten von Einzelwesen, die sich in der einen oder  anderen Beziehung infolge eines Irrtums bei der     Chromo-          somen-Verdoppelung    von ihren Eltern unterschieden.  Diese Organismen, die eine Mutation erfahren haben,  sowie ihre Nachkommen, kennt man als sogenannte        Mutanten .     



  Die meisten Mutanten sind     auxotroph,        d.h.    sie haben  etwas und zwar manchmal soviel von den enzymatischen    Eigenschaften ihrer Eltern verloren, dass sie in ihrer        heimatlichen     Umgebung nicht mehr weiterleben kön  nen. Einige Mutanten jedoch sind in dem Sinne     proto-          troph,    dass sie eine breitere oder wirkungsvollere Enzym  ausrüstung als ihre Eltern haben. Solche     prototypen     Mutanten besitzen oftmals praktische Vorteile. So gestat  tete beispielsweise die Auswahl und Verwendung von  Mutanten     aufsehcnerregende    Leistungssteigerungen bei  der     Penicillin-Erzeugung.     



  Die in einer Population     entstehende        Mutantenart    ist  unkontrollierbar; dagegen kann man mit geeigneten  physikalischen oder chemischen Mitteln die Häufigkeit  des Auftretens von Mutationen anreizen.  



  Die Hauptaufgabe bei der Erzielung eines Mikroben  mutanten mit     2ewünschcn        Eigenschaften        besteht        häufig     in der Erkennung des gewünschten     Organismus    in der  ihn     umocbenden,    zahlreichen     Population.     



  Diese Erkennung erzielte man bisher nach verschiede  nen .Arbeitsweisen, die eine systematische, ermüdende       Platticrung    (nämlich das     Aufimpfcn    von Mikroorganis  men auf in Flachschalen befindliche, halbfeste Kulturme  dien) in sich schlossen und nur die Handhabung von   auf     Mutationsgrad    bezogen - vergleichsweise kleinen  Populationen gestatteten.  



  Die Aufgabe der Erfindung besteht in der Schaffung  eines Verfahrens, das den erforderlichen Zeit und Ar  beitsaufwand für die Auswahl eines bestimmten Mutan  ten verringert. Zudem soll es möglich sein, das Vorhan  densein eines gewünschten Mutanten in einer sehr gros  sen Population fortlaufend und selbsttätig     festzustellen,     der dann anschliessend nach Standardmethoden aus einer  kleinen Population ausgesondert werden kann.  



  Das     erfindungsgemässe    Verfahren zum Auswählen       eines    bestimmten prototropischen Mutanten aus einer  grossen     Mikroorganismenpopulation    ist dadurch<B>gekenn-</B>  zeichnet, dass man in einem     Kultur;efäss    mit flüssigem  Kulturmedium A eine grosse Population bestimmter, der  Mutation unterliegender Mikroorganismen ohne Rege  lung der produzierten     Mutantenarten    wachsen     lässt;     während des     Mikroorganismuswachstums    in das     Kultur-          gefäss    ständig frisches flüssiges Kulturmedium einbringt;

        dem     Kulturgefäss    fortlaufend     lebende    Mikroorganismen       enthaltendes,        flüssiges        Kulturmedium    entnimmt, gleich  zeitig aber im flüssigen     Kulturmedium    des     Kulturgefässes     ein     derartiges        Mikroorganismuswachstum    zulässt, dass in  der     entstehenden    Population     beträchtliche        Mutantenmen-          gcn    erhalten bleiben;

   fortlaufend das gesamte       cntnommcndc    Kulturmedium     portionswcise    sammelt,  wobei     jede    Portion ein     solches    Volumen     aufweist,    dass es       aurciclcnd    viel     lebende        Mikroorganismen    enthält, damit  sich unter theoretischer Betrachtung der     Mutationsraten     theoretisch     mindestens    ein prototropischer Mutant dar  unter befindet;

   jeder Portion ein Medium B zusetzt, das  dem     gewünschten    prototropischen Mutanten eine     erfass-          bare    Nachkommenschaft zu entwickeln gestattet und die       Nicht-Mutanten        verkümmern    lässt, und das vom ge  wünschten Mutanten, nicht aber von den     Nicht-Mutanten          veränderbare    Eigenschaften besitzt, und periodisch die       resultierenden    Mischungen auf das Auftreten der Verän  derung der     Mediumscigenschaften    hin     beobachtet,

      die  das Wachstum eines gewünschten     prototropischen    Mu  tanten in einem     besonderen        Mischungsexemplar    anzeigt.  



  Die Erfindung schafft ferner eine Vorrichtung zur  Durchführung des     erfindungsgemässen    Verfahrens, die  gekennzeichnet ist durch einen regulierbaren beweglichen  Fraktionssammler mit     einer    Anzahl Kulturröhren, einem       Kulturgefäss    zur Aufnahme des     flussigen    Kulturmediums  und der darin     wachsenden        Mikroorganismenpopulation;     einen Vorratsbehälter zur Aufnahme des Mediums;

    Mittel zum wiederholten Abziehen von Portionen des  Kulturmediums und der Mikroorganismen aus dem     Kul-          turgefäss;    Mittel zum     wiederholten    Abzielen von Portio  nen des Mediums aus dem Vorratsbehälter; Mittel zum  Überführen sowohl der Portionen des Kulturmediums  und der Mikroorganismen als auch der Portionen des  Mediums an jede der Kulturröhren; Mittel zum Regulie  ren der Medienabflüsse in Abhängigkeit von der Ge  schwindigkeit des Fraktionskollektors; und Mittel zum  Zuführen von frischem     Kulturmedium    an das     Kulturge-          fäss.     



  Die Erfindung ist nachstehend anhand eines Ausfüh  rungsbeispiels und der     Zeichnung    erläutert. In dieser  zeigt:       Fig.    1 eine schematische Darstellung der     Hauptbe-          standtcilc    des     Mutektors;          Fig.    2 eine schematische Darstellung eines     Mutektor-          Rohrs    nebst der Quelle für seine beiden Fraktionen und  den     Zuflusskontrolimittcln;          Fig.    3 eine ähnliche Darstellung wie     Fig.    2 mit abge  wandelten     Zuflusskontrollmitteln;

            Fig.    4 wiederum eine     Fig.    2 ähnelnde Darstellung mit  noch anderen Bestandteilen;       Fig.    5 eine Teilaufsicht auf den Fraktionssammler bei  der Anordnung     gemäss        Fig.    4 und       Fig.    6 eine der     Fig.    3 ähnelnde Darstellung mit gewis  sen Abwandlungen.  



  Der allgemein durch die Bezugsziffer 11 gekennzeich  nete      Mutektor     umfasst ein Paar     Dauerkultureinheiten     12 und 13 mit geeigneter, bekannter Ausrüstung, um sie  nach dem      chemostatischen     oder      turbidostatischen      Prinzip arbeiten zu lassen. Die Ausläufe der beiden  Kulturen werden<B>je</B> für sich in einen Aufnehmer,     z.B.     Trichter 14, eingegeben, der seinerseits mit einem drehba  ren Fraktionssammler 15 üblicher     Drehgestell-Bauart     verbunden ist. Auf dem Drehgestell sind eine Mehrzahl  Rohre,     z.B.    300 Stück von 15 X 150 mm Grösse ange  ordnet.

   Ein in passender Weise an den Sammler 15 an-    geschlossener Takt<U>g</U>eber 10 regelt dessen Drehgeschwin  digkeit.  



  Ein Paar     Behälter    17 und 18 dient zur Zuführung von       verschiedenen        auseewählten    Nährmedien oder Substraten  zu den     Kultureinheiten    12 und 13. Der Behälter 18 ist       ausserdem    noch mittels Leitung 20 direkt an den Aufneh  mer 14 angeschlossen und vermag daher nach Wunsch       selcktivcs        Mccliunt    anzuliefern.

       Geeignete        Flicsskontroll-          vorrichtungen,        z.B.    ein Paar     Mariottische    Röhren 21 und       22,        sorgen    für die Druckregelung in den Behältern 17  bzw. 18. 1n der Nähe der Kultureinheit 12 ist     eine        UV-          Lichtquelle    23     angeordnet,    die die     Mutationsrate    in       dieser    Einheit zu beschleunigen vermag.  



  Die ganze Einheit ist gedrängt gebaut, so dass sie       notfalls    zwecks aseptischen Arbeitens nach erfolgter Gas  sterilisation in einen durchsichtigen Kunststoffkasten ein  geschlossen     werden    kann.  



  Der Zweck der     Dauerkultureinheit    12 besteht darin,  sehr grosse     Mikroorganismuspopulation    mit beträchtlich       vielen    Mutanten zu entwickeln. Die Aufgabe der Rohre  16 im Fraktionssammler 15 andererseits     besteht    darin,  eine vorgewählte Umgebung zu schaffen, in der der  gewünschte Mutant eine erfassbare Nachkommenschaft  zu entwickeln vermag, während die     Nicht-Mutanten          verkümmern.     



  Die Zahl der Rohre 16 im     Fraktionssammlergestcll    ist  derart     verhältnismässig    gross, dass jedes Einzelrohr eine       Inkubationsperiode    erhält und dadurch Zeit geschaffen  wird, damit die sich aus der Anwesenheit des gewünsch  ten Mutanten     ergebenden    Wirkungen auftreten können.  Diese     Wirkungen    fassen sich gewöhnlich durch Beobach  tung mittels unbewaffneten Auges auf je nach den       Eigenschaften    des     Mutanten        verschiedene    Art     feststellen,     wie dies in den späteren Beispielen näher     beschrieben     ist.  



  Um das Gerät und seine Arbeitsweise voll     verstehen     zu können, erscheint eine kurze Erörterung seiner Theo  rie an     dieser        Stelle    sinnvoll.  



  Von Wissenschaftlern wird allgemein anerkannt, dass  die potentiellen Eigenschaften eines Individuums vererbt  werden, während ihr Entwicklungsausmass von der Um  gebung abhängt. Im Falle     mikrobischer    Mutanten kann  sich eine neuerworbene Eigenschaft nur dann leicht  kundtun, wenn sie eine wirksamere Anpassung des  Individuums an seine Umgebung ergibt. Dann nämlich  befindet sich der Mutant     gegenüber    der restlichen Popu  lation im Vorteil, kann sich je nach Umgebung in       beschleunigtem        Ausmass    vermehren und entwickelt eine  Nachkommenschaft, die die     neue    Eigenschaft besitzt.  



  Wenn andererseits eine neue Eigenschaft des Mutan  ten keine ausschliessliche oder verstärkte Vervielfälti  gungsrate ergibt, bleibt der Mutant wahrscheinlich unent  deckt. Im Falle des     prototrophen    Mutanten kann sich der  Wettstreit mit normalen Zellen zumindest in einer nor  malen Umgebung wahrscheinlich als zuviel Kampf erwei  sen.  



  Unter diesen Umständen scheint eine allgemeine  Regel für Mikroorganismen, nämlich das     (iSpe7ialisie-          rungs-Gcsetz ,    zu gelten, wonach die Wachstumsge  schwindigkeit der Mannigfaltigkeit der Enzymausrüstung  umgekehrt proportional ist. Ein Beispiel hierfür ist das  viel schnellere Wachstum eines Virus mit enger Enzym  ausrüstung im Gegensatz zur Wachstumsgeschwindig  keit des durchschnittlichen,     chemolithotrophischen        Bak-          teriums    mit seinem breiten Enzymspektrum.  



  Das auf der vorstehenden Theorie beruhende     Mutek-          tor-Gerät    schafft nicht nur Bedingungen, unter denen      Mutanten in merklicher Anzahl auftreten, sondern auch  einen schnellen Wechsel in der Umgebung kleiner, aber  zahlreicher Ausschnitte aus der Population, so dass  Mutanten mit den gewünschten Eigenschaften plötzlich  besser als die Normalzellen     angepasst    werden. Dadurch  erhalten die Mutanten eine Gelegenheit, Nachkommen  schaft zu entwickeln und dadurch ihr Vorhandensein zu  offenbaren.  



  Quantitative Einstellungen des     Mutektors    verlangen  ein gewisses Verständnis für die     Mutationsraten    bei  Mikroorganismen. Das Verhältnis für natürliche Muta  tion liegt für Bakterien im Mittel bei 1 X     10-",        d.h.    unter  je 1 Milliarde Zellen findet man im allgemeinen Durch  schnitt einen Mutanten. Das Verhältnis für     prototrophi-          sche    Mutation lässt sich     zugegebenerweise    nur schwer  zahlenmässig bestimmen, da sämtliche möglichen     proto-          trophischen    Eigenschaften nicht ohne weiteres erkannt  werden können.

   Man hat jedoch auf dem Gebiete der  bakteriellen Genetik durch     da,    Verhältnis der Rückum  wandlung zur Normaltype in einer     Auxotrophenpopula-          tion    einen gewissen Einblick in diese Frage bekommen.  Dieses Verhältnis ergab sich zu etwa 1 X     10-     oder ein       Prototroph    auf eine Million Mutanten. Diese Verhältnis  zahlen lassen sich aber beträchtlich erhöhen, indem man  die Population     mutagenen    Mitteln, wie UV-Licht, Stick  stoff-Senfgas oder radioaktiven Substanzen, aussetzt.  



  Der Abfluss aus dem     Dauerkulturapparat    muss also  so eingestellt werden, dass jedem Rohr 16 des Fraktions  sammlers 15 mindestens ein     Prototroph    mit einem Orga  nismus von breiterer Enzymausrüstung als die Elternzel  len zugeführt werden. Zusätzlich zu dieser Dauerkultur  portion erhält das Rohr noch eine vergleichsweise grosse  Menge eines Mediums, das die Umgebung schaffen soll,  die zum Gedeihen des gewünschten     Prototrophs    erforder  lich ist.

      <I>Beispiel I</I>       Erkennung   <I>einer</I>     prolutrophischen   <I>Mutanten</I>    Hierbei dient der     Mutektor    zur Gewinnung eines  Organismus, der eine vergleichsweise stabile Verbindung,  wie etwa ein Herbizid, Insektizid,     lästieen        Abfall    oder ein  komplexes Molekül unbekannter Struktur, zu zersetzen  vermag, wobei im letzteren Falle die Erkennung in der  Weise erfolgt, dass man das unbekannte komplexe Mole  kül unter Anwendung der Theorie der  Simultanadap  tion>) mit bekannten Verbindungen in Bezug setzt.  



  Bei dieser Anwendungsform braucht man nur mit  einer der     Dauerkultureinheiten    und dem Fraktionssamm  ler 15 zu arbeiten.  



  Ein spezielles Erläuterungsbeispiel wäre die Suche  nach einem Organismus, der die strukturell unbekannte  Verbindung     verwerten    kann, die bei der     Ammoniation     von     Pyrogallol    entsteht.  



  Der erste Arbeitsschritt besteht in der Auswahl des  geeigneten     Dauerkultursystems.    Da vorhandene Informa  tion darauf hindeutet, dass sich die Kombination aus       Ammoniakstickstoff    und     Pyrolgallol    durch die     ausserge-          wöhnliche        Mikrobenfestigkeit    der Stickstoffeinheit im  entstehenden Komplex auszeichnet, lässt man     vorteilhaf-          terweise    die normale     Mikrobenpopulation    in einer stick  stoffarmen Umgebung wachsen, so     dass    der Stickstoff  wahrscheinlich zuerst dem Komplex entzogen wird.

   Da  her wird man das     Dauerkulturgerät    nach dem     chemosta-          tischen    Prinzip arbeiten lassen. Die     mutagene    Population  wird in einem Allzweckmedium mit Stickstoff als dem  begrenzenden Faktor aufgezogen. Das Impfmaterial wird    aus einer gewöhnlichen bodenvermischten oder bodenge  züchteten     (soil-run)        Mikrobenpopulation    bestehen. Das  Medium wird die üblichen Mengen an Mineralsalz und  Energiequelle mit auf     Niedrigwart    eingestelltem Stick  stoffgehalt enthalten.

   Ein Stickstoffgehalt von  0,18     mg/ml    wird einer maximalen     Populationsdichte    von  etwa 35 X 10"     Mikrobenzellen    im Milliliter entspre  chen.  



  Der zweite     Arbeitsschritt    besteht in der Festlegung  der     Abflussmenge,    die in die einzelnen     Fraktionssamm-          lerrohre    einfliessen darf. Wenn jedes Testrohr 20     ml    und  das     Dauerkulturgefäss    500 ml Fassungsvermögen besitzt,  die     Mutationsrate   <B>1,81</B> X     10-'    beträgt (also     z.B.    die von       Phytomvnas        stewartii    ist,

   die für normale Mutation etwas  über des Mittelwert für     UV-Licht    angeregte Mutation  jedoch ziemlich niedrig liegt und daher ziemlich typisch  für eine übliche     Mutationsrate    ist) und der     Aufteilungs-          zykel    etwa 20 Minuten erfordert, so gibt folgende Be  rechnung einen ungefähren Anhalt für die je Rohr er  forderliche Abflussmenge:  1. Die     Mikrobenpopulation    im     DauerkulturgeNss    be  trägt etwa 35 X 10" je ml oder 1,75 X     10'9    für den Ge  samtinhalt des Gefässes.  



  2. In dieser Population wären 1,81 X     10-s    Mutanten,  so dass während jedes     Aufteilungszykels    (1,75 X 10")  X (1,8I X     10-,)    = 3,17 X     105    Mutanten auftreten wür  den.  



  3. Dann wäre die Zahl der     Prototrophen    in der Po  pulation (3,17 X     10q)    X     (10- )    = 3,17 X 10" = 317 in  500 ml oder 0,6     Prototrophe    je ml.  



  4. Daher würden unter diesen Bedingungen in 5 ml       Dauerkulturabfluss,    die man in Abständen von je 20 Mi  nuten abzieht, etwa 3     Prototrophe    enthalten sein.  



  Die Ablieferung dieser Menge an die einzelnen Test  rohre lässt sich leicht durch passende Einstellung des       Frischmediumzuflusses    in das     Dauerkulturgefäss    und des  Fraktionssammler Umlaufs an dem auf 20 Minuten  Abstandsbetrieb eingestellten Taktgeber 10 erreichen.  



  Die neue Umgebung für den kleinen     Populationsaus-          schnitt    in den einzelnen Rohren schafft man dadurch,  dass man mit Hilfe eines geeigneten, mit dem Taktgeber  10 synchronisierten Ventils 26 aus dem Behälter 18 in  jedes Rohr je 15 ml     ammoniatierter        Pyrogallolsuspension     einbringt. Somit erhält jedes Rohr 5 ml aus dem     Dauer-          kulturgefäss    12 und 15 ml     ammoniatierte        Pyrogallolsus-          pension    aus dem Behälter 18.

   Feineinstellungen im  Volumen des abgegebenen ausgewählten Mediums kann  man in geeigneter Weise,     z.B.    durch Änderung der  Lichtweite der     Enddüse    31 der Zuführungsleitung 20,  vornehmen.  



  Wie besonders deutlich aus     Fig.2    erkennbar ist,  liefert der Behälter 17 ein geeignetes Nährmedium zur  Erhaltung der Population in der     Dauerkultureinheit    12,  die deshalb auch als     Mutantenquelle    dient. Der Behälter  18 andererseits liefert das ausgewählte Medium, in  diesem Fall     ammoniatiertes        Pyrogallol.    Die Aufnehmer  und     Mischtrichter-Einheit    14 sammelt die beiden Abflüs  se aus Gefäss 12 und Behälter 18 und leitet die Mischung  in das jeweils richtige Testrohr 16 im Fraktionssammler  15.

   Wenn die Einheit 12 nach dem     chemostatischen     Prinzip betrieben wird, dann tropft es aus der Mündung  33 der von der Kultureinheit kommenden Leitung 32  langsam und fortlaufend, während der Abfluss aus dem  Behälter 18 durch die Leitung 20 nur     kurzzeitig    und  ziemlich schnell vor sich geht. Das     vorzugsweise    relaisbe  tätigte und mit dem Taktgeber 10 synchronisierte Ventil      26 regelt das Öffnen und Schliessen der Leitung 20 zum  jeweils passenden Zeitpunkt.  



  Wie insbesondere aus der Darstellung des Rohrs 16 in       Fig.2    erkennbar ist, befinden sich in seinem Bodenab  schnitt die 5     ml        Zcllsuspension    mit etwa darin enthalte  nen Mutanten, die durch mehrere Kreise und die Bezugs  ziffer 41 angedeutet ist. Darüber befinden sich im Rohr  die 15     ml        ausgewähltes    Medium, im vorliegenden Bei  spiel also     ammoniatiertes        Pyrogallol,    wie dies durch  Kreuze und die Bezugsziffer 42 angedeutet ist.  



  Das     aminoniaticrte        Pyrogallol    stellt für die in die  einzelnen Rohre     cingegebencn    Organismen die einzige  Stickstoffquelle dar, weil Stickstoff in der Dauerkultur  cinlicit der     begrenzende    Faktor ist, während etwas Koh  lenstoff nebst Mineralsalzen zusammen mit dem     mutage-          nen        Populationsmuster    eingebracht werden. Bei Dauerbe  trieb wird jedem Rohr eine fünftägige     Inkubationsperiodc     zugebilligt, da das übliche     Fraktionssammlergcstcll    300  Stück solcher Rohre hält und alle 20 Minuten ein Rohr  gefüllt wird.  



  Jedes merkliche Wachstum in den Rohren ist     mut-          massliclier    Nachweis dafür, dass eine gewisse Zersetzung  des     ammoniatierten        Pyrogallols    eingetreten ist. In der  Praxis zeigte sich schon vor Ablauf des dritten Tages an  der     Oberfläche    einiger Rohre ein beginnendes Wachs  tum.  



  Weitere Zuchtwahl kann man dadurch erzielen, dass  man den ganzen Vorgang in ähnlicher Form wiederholt,  dabei aber den neuerkannten Mutant zum Beimpfen des       Dauerkulturgefässes    benutzt.    <I>Beispiel 2</I>       Erkennung   <I>eines</I>     giftfesten        Mutanten       In diesem Fall benötigt man eine     Dauerkultureinheit     und den Fraktionssammler und verwendet den     Mutektor     zur Gewinnung eines Organismus, der in einem Medium  aktiv zu bleiben vermag, das ein gewünschtes Endpro  dukt in einer für die normale Population giftigen Kon  zentration enthält.  



  Als Beispiel hierfür dient die Suche nach einem       Hefemutanten,    der solange wirksam bleibt, bis der     Ätlia-          nolgehalt    auf     16%,    angestiegen ist.     Üblichcrwcisc    gedei  hen Hefen nicht weiter, sobald der     Äthanolgehalt    im  Medium 13 oder     14%    erreicht hat.

   Beim vorliegenden  Beispiel wird eine grosse Hefepopulation im     Dauerkul-          turgerät    gezüchtet, das, wie aus     Fig.3    ersichtlich ist,  diesmal nach dem     turbidostatischen    Prinzip arbeitet,  wobei eine     photoclcktrische        Zelle    44 unter Betätigung  eines     relaisgesteuerten    Ventils 45 den Zufluss von Frisch  medium vom Behälter 17 her regelt. Durch reichlichen  Luftumlauf in der     mutagcnen    Population sorgt man für  maximale     Zellvervielfachung    und minimale Alkoholer  zeugung.

   Wenn die Kultur in der Einheit 12 etwa auf die  Höhe von 70 bis     80 /',    der maximalen     Populationsdichte     angelangt ist, die die     Nahrstoffkonzentration    im Medium  zulässt, wird eine mit 46 bezeichnete     15-ml-Portion    in ein  Rohr 16 des Fraktionssammlers eingegeben, dem     ausser-          dem    noch 3,1     ml        95@'iges        Äthanol    (mit 47 bezeichnet)  aus dein Behälter 18 zugesetzt werden.

   Dieser Alkoholge  halt hemmt eine normale     Hcfcpopulation,    wodurch die  Trübung im Rohr verschwindet, während sich ein von  diesem Alkoholgehalt nicht angegriffener Mutant ver  mehrt und zu fortgesetzter und verstärkter Trübung des  Rohrinhalts sowie weiterer     CO,-Entwicklung    führt.    <I>Beispiel 3</I>  .Symbiose  Hier wird der     Mutektor    dazu     benutzt,    einen Mutan  ten zu erkennen, der mit anderen Organismen in Symbio  se zu     Icben    vermag.  



  Ein Beispiel hierfür wäre der Versuch, einen     Rhizo-          bium-Mutanten    zu erkennen, der     symbiotisch    unter An  lagerung von Luftstickstoff an Gerstenwurzeln zu wach  sen vermag und dadurch den Bedarf nach Stickstoffdün  gung von mit Gerste bepflanzten Böden beseitigt.  



  Wie aus     Fig.4    deutlich erkennbar ist, betreibt man  die     Dauerkultureinheit    nach dem     chemostatischen    Prin  zip mit Stickstoff als begrenzendem Faktor in einem       Standard-Mannitbrühcmedium.    Als Impfmaterial dient  ein Gemisch aus vielen     Rhizobiumstämmen.    Den Abfluss  stellt man auf etwa 5     ml    je Rohr 16 im Fraktionssammler  ein, dessen Eingabe mit 51 bezeichnet ist.

   Fernerhin  werden jedem Rohr vom Behälter 18 her 12 ml mit 52  bezeichneter, stickstofffreier     Hoa@@lundliisiing        zuQeführt.     Ein in für     Lösungskultur    üblicher Weise gekeimter,     zwei          Ta.c    alter     Gerstensämling    53, der von einer erbsengros  sen Hülle 54 aus Kunstschaumstoff umschlossen ist, wird  auch noch in das Rohr eingesetzt (siehe     Fig.    4). In das  Rohr wird mittels     Kapillarrohr    56 Luft eingeführt, um  die     Sämlingswurzeln    zu belüften.

   Einzelheiten hierüber  sind aus den     Fig.4    und 5 erkennbar, von denen die  letztere ein Verteilerrohr 57 zur Belieferung mehrerer       Kapillarrohre    56 zeigt.  



  Die Sämlinge 53 würden die üblichen .Anzeichen von       Stickstoffvcrhungerung    zeigen, falls ihnen nicht von  irgendeinem     Rhizobiummutanten    Stickstoff zugeführt  würde. Das Auftreten solcher Organismen könnte weiter  hin auch durch das Auftreten von Knötchen am Wurzel  system des Sämlings nachgewiesen werden. Die Inkuba  tion kann 7 Tage lang auf dem     Fraktionssamm)crgestel)          durchgeführt    und dann bis zu I Monat auf einem       lagenfcsten    Gestell fortgesetzt werden, bis die Sämlinge  eindeutige     Stickstoffverhungerungs-Symptome        entwik-          keln.     



  In dieser Beziehung scheint es von beträchtlichem  Interesse zu sein, dass man unlängst in Australien einen       stickstoffbindenden    Mikroorganismus aufgefunden hat,  der in     Symbiose   <B>mit</B> einer Graspflanze aufwächst, wäh  rend bisher derartige Vorkommen allein bei Hülsenfrüch  ten bekannt waren.  



       Beispiel   <I>4</I>       Atitibiuse     In diesem Falle wählt der     Mutektor    aus einer     mutage-          nen    Population einen Mutanten aus, der eine Substanz  produziert, die auf hier als      Testorganismen     bezeichnete  Bakterien schädigend einwirkt. Man kann den Mutanten  aus einer Bakterien-, Hefe-, Pilz- oder     Actinomycetes-          Population    heraussuchen. Haupterfordernis ist, dass er  auf einfacheren Nährmedien als die Testorganismen zu  wachsen vermag.

   Man     könnte   <B>also</B> beispielsweise versu  chen, einen Pilzmutanten zu isolieren, der     Mycobacte-          riumtuberculosis-Zcllen    zu hemmen oder zu zerstören  vermag. Man lässt die     mutagene    Pilzpopulation in einem  Allzweckmedium mit     Ammoniumsalzen    oder einem an  deren     Mineralstickstoffsalz    als einziger Stickstoffquelle  in der     Dauerkultureinheit    12 wachsen, die nach dem       turbidostatischen    Prinzip arbeitet     (Fig.6)

      und gibt bei       50%    der Maximalpopulation jeweils eine mit 61 bezeich  nete Teilmenge von 5 ml in die einzelnen Rohre des  Fraktionssammlers ab. Jedes Rohr empfängt fernerhin      eine mit 62 bezeichnete     15-ml-Teilmenge    der     Tuberkelor-          eanismen.    Diese     lässt    man in der nach dem     chemostati-          schen    Prinzip arbeitenden     Dauerkultureinheit    13 mit       Dubos-Brühe    (oder einem anderen flüssigen Medium,

   das  sich zur Bildung eines diffusen Wachstums von     M.        rrrber-          crrlosi.s-Ze11en    eignet) mit einem der komplexen Stickstoff  nährstoffe,     7.B.    Asparagin, als begrenzendem Faktor  aufwachsen.  



  Im Rohr 16 befinden sich die     Tuberkelorganismen    in  einem Hungerstadium und sterben allmählich aus oder       lösen    sich selbst auf, während die     mutagene    Population  mehrere Stunden lang in dem nicht verbrauchten Anteil  des gleichzeitig mit dem     Populationsmuster    in das Rohr  eingegebenen Mediums weiter     existieren    kann.  



  Wenn kein Antibiotikum im Rohr erzeugt wird, hält  sich die auf den diffusen     A,1.        Iubercolosis-Zellen    beruhen  de Trübung gradhell mehrere Tage lang, und es kann  sich sogar oben auf dem Rohrinhalt ein Häutchen bilden,  während sich die Pilzklumpen schnell am Rohrboden  absetzen und solange     wciterwachsen,    bis die in ihrer       5-ml-Teilmenee    enthaltenen Nährstoffe verbraucht sind.  Wenn aber in dieser Teilmenge von der Pilzpopulation  ein Antibiotikum angeliefert und im Rohre erzeugt wird,  tritt ein plötzlicher Trübungsrückgang auf und die     Häut-          chenbildung    bleibt aus, da die     Tuberkelorganismen    aus  sterben oder gehemmt werden.

    



  Aus den vorstehenden Beispielen ist somit ersichtlich,       dass    mit Hilfe des     Mutektor-Geräts        Mutanten    verschie  denster Art, darunter auch solche, die das Wachstum von  freien Pflanzen- oder Tierzellen beeinflussen, schnell  erkennbar     gemacht    werden.

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH 1 Verfahren zum Auswählen eines bestimmten proto tropischen Mutanten aus einer grossen Mikroorganis- menpopulation, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem Kulturgefäss mit flüssigem Kulturmedium A eine grosse Population bestimmter. der Mutation unterliegen der Mikroorganismen ohne Regelung der produzierten Mutantenarten wachsen lässt;

   während des Mikroorga- nismuswachstums in das Kulturgefäss ständig frisches flüssiges Kulturmedium einbrin-t; dem Kulturgefäss fort laufend lebende Mikroorganismen enthaltendes, flüssiges Kulturmedium entnimmt, gleichzeitig aber im flüssigen Kulturmedium des Kulturgefässes ein derartiges Mi- kroorganismuswachstum zulässt, dass in der entstehen den Population beträchtliche Mutantenmengen erhalten bleiben;

   fortlaufend das gesamte entnommene Kulturme dium portionenweise sammelt, wobei jede Portion ein solches Volumen aufweist, dass es ausreichend viel leben de Mikroorganismen enthält, damit sich unter theoreti scher Betrachtung der Mutationsraten theoretisch minde stens ein prototropischer Mutant darunter befindet;

   jeder Portion ein Medium B zusetzt, das dem gewünschten prototropischen Mutanten eine erfassbare Nachkommen schaft zu entwickeln gestattet und die Nicht-Mutanten verkümmern lässt, und das vom gewünschten Mutanten, nicht aber von dün Nicht-Mutanten veränderbare Eigen- schaften besitzt, und periodisch die resultierenden Mi schungen auf das Auftreten der Veränderung der Me- diumseigenschaften hin beobachtet, die das Wachstum eines gewünschten prototropischen Mutanten in einem besonderen Mischungsexemplar anzeigt. UNTERANSPRÜCHE I.

   Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, dass man ein frisches flüssiges Kulturme dium mit Mikroorganismen impft, die Mutanteneigen- schaften zeigen, und das Verfahren wiederholt. 2. Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Mikroorganismus einen Bo denpilz und als Mittel B ammoniatiertes Pyrogallol verwendet. 3.

   Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, dass man als Mikroorganismus ein Ge misch aus vielen Rhizobium-Stämmen und als Medium B eine stickstoffreie Hoagland-Lösung verwendet, und das Anzeichen für ständiges Wachstum des gewünschten Mutanten dadurch erhält, dass man einen Sämling einer nichtleguminosen Pflanze b; obachtet, dessen Wurzeln im flüssigen Medium der einzelnen Portionen-Bchältcr versenkt und mit Luft umspült sind. 4.

   Verfahren nach Patentanspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, dass man die im flüssigen Kulturmedium des Kulturgefässes enthaltenen Mikroorganismen der Einwirkung mindestens eines die Mutationsraten be schleunigenden Mittels unterwirft.

   PATENTANSPRUCH 11 Vorrichtung zum Durchführen des Verfahrens nach Patentanspruch 1, gekennzeichnet durch einen regu lierbaren beweglichen Fraktionssammler mit einer An zahl Kulturröhren, einem Kulturgefäss zur Aufnahme des flüssigen Kulturmediums A und der darin wachsen den Mikroorganismenpopulation; einen Vorratsbehälter zur Aufnahme des Mediums B; Mittel zum wiederholten Abziehen von Portionen des Kulturmediums A und der Mikroorganismen aus dem Kulturgefäss; Mittel zum wiederholten .Abziehen von Portionen des Mediums B aus dem Vorratsbehälter; Mittel zum Überführen sowohl der Portionen des Kulturmediums A und der Mikroorga nismen als auch der Portionen des Mediums B an jede der Kulturröhren;

   Mittel zum Regulieren der Medicnab- flüssc in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit des Fraktionskollektors; und Mittel zum Zuführen von fri schem Kulturmedium A an das Kulturgefäss. UNTERANSPRUCH 5. Vorrichtung nach Patentanspruch 11, gekennzeich net durch Mittel zum Beschleunigen der Mutationsrate der Mikroorganismenpopul < < tion im Kulturgefäss.

   AitirTC@rktrrtg <I>des</I> Eidg. Annes für geistiges Eigentum: Sollten Teile der Beschreibung mit der im Patentan spruch gegebenen Definition der Erfindung nicht in Einklang stehen, so sei daran erinnert, dass gemäss Art.<B>51</B> des Patentgesetzes der Patentanspruch für den sachlichen Geltungsbereich des Patentes massgebend ist.