DE2708909C2 - - Google Patents

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung verwertbarer Stoffe durch aktiven Photometabolismus sowie eine zur Durchführung dieses Verfahrens geeignete Vorrichtung.
Bekanntlich haben bestimmte Mikroorganismen die Fähigkeit, unter Einwirkung von Lichtenergie und bestimmten Substraten verwertbare Stoffe zu erzeugen. So können beispielsweise die Blau- Grünalgen, wie Anacystis nidulans, NADPH (die reduzierte Form von NADP, Nikotinamid-adenin-dinumcleotidphosphat) erzeugen. Auch Bakterien, die Photosysteme und Hydrogenase und/oder Nitrogenase als Enzymsysteme enthalten, können durch Photometabolismus bestimmte Substrate umwandeln und/oder einen Kofaktor wie NADPH oder Verbindungen wie reduzierte Ferrodoxine oxidieren.
Da für einen kontinuierlichen Photometabolismus mehrere Umsetzungsteilnehmer anwesend sein müssen, können Enzymsysteme durch ganze Zellen aktiver Mikroben dargeboten werden.
Für die rationelle Herstellung verwertbarer Stoffe in größerem Umfang soll die Umwandlung auf kontinuierlicher Basis und vorzugsweise mit stabilisierten, länger als im Naturzustand aktiv bleibenden Organismen möglich sein. Ein solches Verfahren und eine zu seiner Durchführung geeignete Vorrichtung zu schaffen ist Aufgabe der Erfindung.
Überraschend wurde gefunden, daß eine kontinuierliche Erzeugung verwertbarer Stoffe durch den Photometabolismus stabilisierter Bakterien oder Algen der Art Rhodospirillum rubrum oder Anacystis nidulans möglich ist. Die Aufgabe wird durch das Verfahren der Erfindung in der Weise gelöst, daß ganze Zellen von einen aktiven Photometabolismus aufweisenden Bakterien oder Algen der Art Rhodospirillum rubrum oder Anacystis nidulans mit Agargel immobilisiert und stabilisiert, mit dem Medium in ein wenigstens teilweise lichtdurchlässiges Umsetzungsgefäß gebracht, in diesem sichtbaren Lichtstrahlen ausgesetzt werden und dabei eine durch den Photometabolismus der Zellen ein verwertbares Produkt ergebende Substanz kontinuierlich in das Umsetzungsgefäß eingeleitet wird.
Die zur Durchführung dieses Verfahrens geeignete Vorrichtung ist gekennzeichnet durch ein eine Kammer bildendes Hohlgefäß mit wenigstens einer lichtdurchlässigen Wand, in die die Ein- und Auslaßleitungen führend gestaltet sind, und in welcher im beleuchteten Bereich ein mit den Ein- und Auslaßleitungen verbundener Träger mit darauf mit Agargel immobilisierten ganzen Zellen von einen aktiven Photometabolismus aufweisenden Bakterien oder Algen der Art Rhodospirillum rubrum oder Anacystis nidulans angeordnet ist.
In den Zeichnungen zeigt die Fig. 1 ein Ausführungsbeispiel der zur Durchführung des Verfahrens geeigneten Vorrichtung mit einem Umsetzungsgefäß und einer angeschlossenen Gasfalle.
Die Fig. 2 zeigt einen Teil der Vorrichtung der Fig. 1, vergrößert in Seitenansicht und teilweise im Schnitt.
Das Schaubild der Fig. 3 zeigt die K m -Untersuchung für stabilisierte Bakterien der Art Rhodospirillum rubrum.
Die Fig. 4 zeigt als Beispiel ein Schaubild der H₂-Produktion als verwertbarer Stoff (Senkrechte: Aktivität, Waagerechte: Zeitdauer in Stunden).
Besteht das anfallende, verwertbare Produkt aus einer reduzierten Verbindung, z. B. NADPH (der reduzierten Form von NADP), so kann diese mit einem weiteren System, z. B. nach der folgenden Tabelle, kontinuierlich zu anderem verwertbarem Produkt umgesetzt werden.
Tabelle
Diese Systeme bedürfen zur Umsetzung keiner Lichteinwirkung.
Die Blau-Grünalgen Anacystis nidulans oxidieren Wasser und reduzieren NADP; die Bakterien Rhodospirillum rubrum oxidieren organische Stoffe, wie z. B. Malat und erzeugen H₂.
R. rubrum hat wandelbare Enzymsysteme (z. B. Hydrogenase/Nitrogenase), deren Produkt von den Umsetzungsverhältnissen abhängt. So erzeugt R. rubrum in Gegenwart von NH₃ oder Ammonionen kontinuierlich N₂, bei Vorliegen geeigneter organischer Stoffe, dagegen H₂.
Durch fachmännische Auswahl der entsprechenden Umsetzungsbedingungen kann so ein jeweils gewünschtes Produkt erhalten werden.
R. rubrum ist ein Purpurbakterium (kein Schwefelbakterium). Wie bekannt, ergeben sich maximale H₂-Ausbauten bei ruhenden Zellen, deren Mengen sich stark der auf Grundlage der vollständigen Umwandlung bestimmter organischer Stoffe in H₂ und CO₂ gemachten Voraussage annähern, vgl. z. B. R. H. Burris, Proc. Roy. Soc. (Großbrit.) 172, 339 (1969).
Für Malat gilt die Umsetzung
C₄H₆O₅+3 H₂O → 4 CO₂+6 H₂
Insgesamt betrachtet wird durch diesen Photometabolismus Kohlenstoff von der Dissimilation des anaeroben Zitronensäurekreislaufs in die Assimilation umgeleitet.
Beispiel I Herstellung von H₂ mit stabilisierten R. rubrum.
Zellen von R. rubrum wurden in einem Medium nach J. G. Omerod u. a., Arch. Biochem. Biophys. 94, 449 (1961) gezüchtet und in dem gebrauchten Medium bis zur Verwendung bei 4°C gelagert.
Zur Durchführung der Versuche wurden 5-ml-Kolben und ein mit Argon gefüllter Handschuhkasten verwendet. Die Kolben mit dem Präparat wurden verschlossen und auf einem mechanischen Rüttler unter konstanter Beleuchtung 60-95 Minuten inkubiert. Zur Beleuchtung dienten zwei Reihen gewöhnlicher 100-Watt-Glühbirnen. Im Falle der Schüttelkolben wurden die Lampen unter einem größeren durchsichtigen Block aus LUCIT angebracht und die Kolben in den Block gestellt. Abgemessene Mengen (meist 0,1-1 ml) des anfallenden Glases wurden aus dem Kolben entnommen und mit einem Gaschromatograph auf die Ausbeute an H₂, N₂ und O₂ geprüft.
Bestimmung von K m für R. rubrum, Malatlösung
Eine 600 mg Naßgewicht/ml enthaltende Suspension von R. rubrum in 0,05 TRIS, 0,001 M MgCl, pH 7,6, wurde in 1 ml Mengen getrennten 1 ml Mengen Malat-Lösungen von 0,1 M-0,001 M zugesetzt, und in 5-ml-Kolben unter ständiger Beleuchtung (Lampenabstand von ca. 25 cm) inkubiert.
Aktivitätsbestimmung von R. rubrum
Mehrere Proben von R. rubrum in 0,01 M Malat wurden bei Zellenkonzentration von 20-300 mg Naßgewicht/ml wie zuvor beschrieben geprüft, und die H₂-Ausbeute pro Zeiteinheit für jede Zellenkonzentration bestimmt.
Immobilisierung von R. rubrum
4 g Naßgewicht R. rubrum wurden 15 ml einer 5%igen Agarlösung (Edelagar) zugesetzt. Diese Lösung wurde gleichmäßig auf beide Seiten einer Kunststoffplatte gestrichen (s. die Beschreibung zur Fig. 1).
Die Platte wurde in das weiter unten beschriebene, luftdicht abgeschlossene Umsetzungsgefäß gelegt, und eine ständig mit Argon durchsetzte 0,01 M Malatlösung im Aufwärtsstrom mit einem Durchsatz von 8 ml/Std. hindurchgeleitet. Die ganze Vorrichtung wurde in ein auf 18-19° temperiertes Wasserbad eingetaucht. Das erzeugte Gas wurde in einem mit zwei Serumstopfen luftdicht verschlossenen doppelendigen Glasrohr gesammelt, wozu zunächst etwaige Fremdgase und Substrat durch Einziehen der Malatlösung in das Sammelrohr ausgetrieben, und die Lösung durch das sich ansammelnde Produktgas verdrängt wurde. Eine Probe wurde entnommen, sobald das Gas und das Malat im Gleichgewichtszustand waren, und sodann erneut ein konstanter Durchsatz hergestellt. Zur Beleuchtung diente je eine Reihe von gewöhnlichen 100-Watt-Glühbirnen zu beiden Seiten des Umsetzungsgefäßes. Die Birnen wurden dabei in einem Abstand von 5 cm von dem das Umsetzungsgefäß umschließenden Wasserbad senkrecht zu den darin befindlichen Platten und im Abstand von 10-12,7 cm von der dünnen Schicht immobilisierter Organismen angebracht.
Prüfung von immobilisiertem R. rubrum
Dem Sammelrohr wurden 0,75 ml Gas entnommen, und davon 0,5 ml in den vorstehend erwähnten Gaschromatographen injiziert. Die anfallende H₂-Menge wurde an Hand einer mit reinem H₂ erstellten Eichkurve gemessen, und der H₂-Prozentsatz errechnet. Die H₂-Menge wurde in µl H₂/Min. bei konstanten Durchsatz von 8 ml/Std. ausgedrückt.
Als Beispiel der zur Durchführung des Verfahrens geeigneten Vorrichtung zeigen die Fig. 1 und 2 ein Umsetzungssystem, das für die Stoffproduktion mit Hilfe von R. rubrum verwendet wurde.
Das hohle, durchsichtige Umsetzungsgefäß 1 ist mit den Ein- und Auslässen 3, 5 versehen, an die sich luftdicht Ein- und Auslaßrohre 6 anschließen. In der Umsetzungskammer 7 zwischen Ein- und Auslaß befindet sich eine Kunststoffplatte 9, die im gezeigten Beispiel oval und 10×20 cm groß und etwa 2 cm dick ist. Auf beiden Seiten der Platte wurde eine dünne, z. B. 1-2 mm dicke Schicht 17 der Agar-R.-rubrum-Mischung aufgetragen. Die den Lampen 15 zugewendeten Flächen 21 müssen durchsichtig oder durchscheinend sein, damit eine größtmögliche Lichtmenge für den Photometabolismus in die Umsetzungskammer 7 und auf die beschichteten Kunststoffflächen 9 gelangt. Im Beispielfall wurde hierfür LUCIT gewählt, aber anderes durchsichtiges oder durchscheinendes Material, z. B. Glas, ist ebenfalls geeignet. Auch die Flächengröße der Schicht 17 kann im Einzelfall kleiner sein oder vergrößert werden, z. B. durch Änderung der Flächenausbildung der Platte.
Im Ausführungsbeispiel wurde eine geeignete, durch Photometabolismus umsetzbare Substratlösung kontinuierlich über den Einlaß 3 eingeführt, und das Umsetzungssystem beleuchtet. Durch Einwirkung der Umsetzungsteilnehmer und Lichtstrahlen entsteht als Produkt H₂-Gas, das durch Auslaß 5 und Auslaßrohr 6 in das Sammelrohr 25 fließt. Durch den unteren Stopfen 29 des Sammelrohrs sind die Zu- und Ableitungen für den kontinuierlichen Zu- und Ablauf geführt, während der Stopfen gleichzeitig eine Substratmenge im Rohr hält. Im oberen Teil des Rohrs werden die Gase durch den oberen Verschluß 37 gehalten, und können in geeigneter Weise, z. B. durch eine durch den Verschluß 37 geführte Hohlnadel, abgezogen werden.
Die aus der Fig. 2 ersichtlichen Gasperlen 41 mit einem Durchmesser von 2-3 mm, und die Vorsprünge 43 halten die Kunststoffplatte 9 in einem Abstand von der Gefäßinnenwand, so daß das einfließende Substrat über die Schicht 17 strömen und intensiv auf sie einwirken kann.
Kinetic der Wasserstoffproduktion
Es wurde gefunden, daß R. rubrum annehmbare Mengen H₂ in Konzentrationen von mehr als 120 mg Naßgewicht/ml erzeugt. Weitere Versuche ergaben als wirksamste Kombinationen der variablen Größen und Standardprüfverfahren die folgenden aus den K m - Versuchen (vgl. Fig. 3) erhaltenen Bedingungen:
1 ml R. rubrum (300-500 mg Naßgewicht/ml),
1 ml 0,01 M Malatlösung und konstante Beleuchtung während 90 Minuten Ausbeute,
3,5-3,7 µl H₂ in einer aus einer 5-ml-Flasche entnommenen Probe von 0,5 ml.
Immobilisiertes R. rubrum
Die Fig. 4 enthält die Ergebnisse eines typischen Umsetzungsgefäßes, das bei einer Betriebsdauer von 150 Std. einen Höchstausstoß von 22,01 µl H₂/Min. erzielte. Dieses Umsetzungsgefäß enthielt eine größere Menge Bakterien und zeigte eine anfängliche Aktivitätssteigerung, bevor ein exponentieller Abfall beobachtet wurde.
Die Daten der Fig. 4 ergeben:
Neigung = -0,006
Standardabweichung = 0,232
Korrelation = -0,8136
Maximale H₂ -
Produktionsrate 22 µl/Min. (im Zeitpunkt 0)
95% ohne Zuverlässigkeitsgrenze (T 1/2) = 641,8 Std.
T 1/2 = 114,5 Std.
95% untere Zuverlässigkeitsgrenze (T 1/2) = 62,84 Std.
Im Falle von R. rubrum wurden aktive Präparate der stabilisierten Mikrobe nur unter anaeroben Bedingungen erhalten. Schwierig war auch die Bereitung identischer Präparate für das Umsetzungsgefäß, besonders was die Dicke der Agarschicht anlangt. Eine bevorzugte Schichtdicke betrug etwa 0,1-2 mm, aber Schwankungen der Dicke verursachten Schwankungen der Umsetzungsgeschwindigkeit infolge von Diffusion, sowie der Halbwertlebensdauer, die in einigen Fällen bis herunter auf 35 Std. gingen, was jedoch auf Verunreinigung mit O₂ zurückzuführen sein dürfte.
Jedenfalls zeigt dieses Beispiel klar die Möglichkeit der Immobilisierung ganzer Zellen von R. rubrum in aktiver und kontinuierlicher H₂ erzeugender Form.
Beispiel II (Stabilisierte Algen)
Blaugrüne Algen (Anacystis nidulans) wurden in analoger Weise zur Behandlung des R. rubrum stabilisiert. Unter Verwendung des oben beschriebenen Umsetzungsgefäßes wurde zur Beobachtung der Halbwertzeiten und der Biophotolyse dieser Algen die Reduktion von NADP (TPN) zu NADPH (TPNH) fortlaufend. Das NADPH stellt ein brauchbares Produkt dar, es kann z. B. als Energiequelle für andere enzymatische Umsetzungen und/oder als NADP Quelle (zur anderweitigen Verwendung, z. B. späteren Reduktion) verwendet werden.
Für die Stabilisierung der Algen wurde zunächst eine 5%ige Agarlösung in 0,5 M Tris als Puffer bereitet und nach Abkühlen bis fast zur Verfestigung in einer Menge von 20 ml mit 0,2 g Algen im gefriergetrockneten Zustand gemischt. Dabei wurde beobachtet, daß sich die Halbwertzeit der Algen durch Zusatz von Glucoseoxidase (ca. 15 000 Einheiten/g) in einer Konzentration von 0,1% in dem das Substrat enthaltenden Puffer erheblich steigern läßt. Außerdem wurde dem Puffer eine kleine Menge Catalase (im Gewichtsverhältnis Glucoseoxidase zu Catalase von 3 : 1) und 0,01% Dextrose zugesetzt.
Für die Bestimmung der Halbwertzeiten der stabilisierten Algen wurden in das Umsetzungsgefäß 20 ml der Agar-Algenmischung gegeben und mit Substrat mit einem Durchsatz von 12-15 ml/Std. bei 18° durchströmt. In diesem System wirken die Glucoseoxidase und Catalase als O₂-Aufnehmer. Änderungen des Dextrosezusatzes von 0,1-1% beeinflußten die Halbwertzeit nicht. Zur Kennzeichnung der Halbwertzeit wurden willkürliche Aktivitätseinheiten verwendet. Die nachfolgende Tabelle enthält die Ergebnisse von vier Versuchen, A-D, bei kontinuierlichem Betrieb. Das Substrat bestand aus einer Lösung von 419 mg NADP, 0,5 M TRIS, Dextrose (Glucose) in der gewünschten Konzentration und 1500 mg Glucoseoxidase-Catalasepräparat in insgesamt 500 ml wässerigem Volumen. Das Substrat wurde einmal durch die Kolonne mit der Gelmischung geleitet und das anfallende NADPH fluorimetrisch bei 460 nm (erregende Wellenlänge 340 nm) gemessen. Die Proben A, B und C enthielten Glucoseoxidase- Catalase als O₂-Aufnehmer und erbrachten höhere Halbwertzeiten. Die Glucosekonzentration entsprach 1 mg/ml (0,1%) bzw. 10 mg/ml (1%).
Die Tabelle verzeichnet die Halbwertzeiten in Stunden, die oberen und unteren Zuverlässigkeitsgrenzen, ebenfalls in Stunden (UCL - obere - LCL untere Grenze) und die über Regressionsverfahren ermittelte Korrelation.
Tabelle
(Halbwertzeitversuche)
Bei Erzeugung nicht-gasförmiger Produkte, wie NADPH, kann die Gasfalle der Fig. 1 wegbleiben und das anfallende Produkt in bekannter Weise isoliert und gesammelt werden.

Claims (6)

1. Verfahren zur kontinuierlichen Herstellung verwertbarer Stoffe durch Photometabolismus, dadurch gekennzeichnet, daß ganze Zellen von einen aktiven Photometabolismus aufweisenden Bakterien oder Algen der Art Rhodospirillum rubrum oder Anacystis nidulans mit Agargel immobilisiert und stabilisiert, mit dem Medium in ein wenigstens teilweise lichtdurchlässiges Umsetzungsgefäß gebracht, in diesem sichtbaren Lichtstrahlen ausgesetzt werden und dabei eine durch den Photometabolismus der Zellen ein verwertbares Produkt ergebende Substanz kontinuierlich in das Umsetzungsgefäß eingeleitet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Substanz wässerige Malatlösung eingeleitet wird.
3. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch ein eine Kammer (7) bildendes Hohlgefäß (1) mit wenigstens einer lichtdurchlässigen Wand (21), in die die Ein- und Auslaßleitungen (3, 5) führend gestaltet sind, und in welcher im beleuchteten Bereich ein mit den Ein- und Auslaßleitungen (3, 5) verbundener Träger (9) mit darauf mit Agargel immobilisierten ganzen Zellen von einen aktiven Photometabolismus aufweisenden Bakterien oder Algen der Art Rhodospirillum rubrum oder Anacystis nidulans angeordnet ist.
4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die im Agargel immobilisierten Zellen als dünne Schicht auf dem Träger aufgebracht sind.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Schichtdicke 0,1 bis 2 mm beträgt.
6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß an den aus der Kammer führenden Auslaß eine Gasfalle angeschlossen ist.
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