DE2708065A1

DE2708065A1 - Mittel fuer enzymatischen linsenabbau

Info

Publication number: DE2708065A1
Application number: DE19772708065
Authority: DE
Inventors: Jun Joseph Spina; Michael Kent Prof Weibel
Original assignee: Novo Laboratories Inc
Current assignee: Novo Laboratories Inc
Priority date: 1976-02-24
Filing date: 1977-02-24
Publication date: 1977-09-01
Also published as: ZA771075B; IL51484A0; NO139200C; AU517695B2; JPS5632297B2; NO139200B; ZA771076B; AU2258577A; FR2342072B1; DE2708002A1; AU504174B2; PT66214B; IT1075354B; GB1577524A; JPS5630020B2; BE851761A; DE2708002C3; IN144972B; AT361107B; CA1092002A

Description

Patentanwälte UInwebcr ä Z^

Rosenia! 7/!I. AJ.^f;j.

24. iebruer 1S77

NOVO LABORATORIES INC. 59 Danbury Road
V/ilton, Conn. 06897 V.St.A.

Mittel für enzymatisehen Linsenabbau

Die Erfindung bezieht sich auf die enzymatische Behandlung des Katarakts oder Stars.

Die Linse ist ein optisch klares, eingekapseltes, scheibenförmiges Element, das innerhalb des Auges hinter der Iris und gegenüber dem Glaskörper schwebt. Sie steuert einen Teil des optischen BrechungsVermögens des Auges bei. Die Linse wird vom Star befallen, wenn ihr Kern- und/oder Rand- und/ oder subcapsulärer Bereich trüb wird, was den Weg des Lichtes

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in das Auge blockiert, wodurch verminderte Sehkraft verursacht wird. Ein Katarakt oder grauer Star ist einfach eine trüb oder verschleiert gewordene Linse.

Es gibt allgemein gesprochen zwei Arten von Katarakten, angeborene und altersbedingte. Angeborene Katarakte, etwa 1 >i aller Fälle, treten bei Menschen unter 25 Jahren auf und sind charakteristischerweise verhältnismäßig v/eich. Altersbedingte Katarakte, etwa 99 A aller Fälle, treten beim älteren Menschen auf und sind charakteristischerweise verhältnismäßig hart.

Die intracapsuläre Technik der Staroperation, in den drei-. ßiger Jahren entwickelt, erfordert die Vornahme eines großen Einschnitts, 25 mm, etwa 180° uru die Hornhaut herum, um Zugang zur vorderen Augenkammer zu erhalten. Nach dem Durchtrennen der Aufhängebänder, die die Linse im Auge halten, wird die Linse mechanisch, z.B. mit einer Pinzette oder durch Saugen, entfernt. Das Entfernen der Linse kann durch die Verwendung von eZ-Chymotrypsin zwecks Auflösung der Ligamente, die die Linse am Strahlenkörper befestigen (Zonula), erleichtert werden. Diese Technik hat mehrere Nachteile. Der große Einschnitt in ein verhältnismäßig empfindliches Organ erfordert zum Verschließen viele Stiche. Die Entfernung jeder den Glaskörper an seiner Stelle haltenden Barriere macht die physische Aktivität für mehrere Tage nach der Operation unmöglich, da dann der Glaskörper verschoben werden kann. Die Empfindlichkeit der Augenst rule tür kann zu einer erheblichen Schädigung der Iris, der Retina usw. führen. Die intracapsuläre Technik ist jedoch die gebräuchlichste praktizierte Arbeitsweise, und man nimmt an, daß bisher weit bis über 360 000 solcher Vorgänge jedes Jahr in den Vereinigten Staaten vorgenommen worden sind.

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Eine andere, derzeit praktizierte Operation ist nur bei angeborenen Katarakten anwendbar. Ist der Katarakt extrem weich und flüssig, gelangt der Arzt in die vordere Augenkammer durch einen kleinen Einschnitt, durchbricht dann die Linsenkapsel und saugt deren Inhalt unter Verwendung einer dünnen Nadel und einer normalen Spritze heraus. Ist der Linseninhalt etwas zu hart, um auf diese V/eise abgesaugt zu werden, macht der Arzt mehrere Einschnitte in die vordere Kapsel und ermöglicht es der wässrigen Flüssigkeit der vorderen Augenkaramer, den Katarakt anzugreifen und zu hydrolysieren. Nach mehreren Tagen wird die Linse weich genug, um die zuvor erwähnte Absaugtechnik anwendbar werden zu lassen. Dieses Vorgehen arbeitet nur bei weichen angeborenen Katarakten und ist bei harten altersbedingten Katarakten unwirksam wegen der Härte des Linsenmaterials. Auch kann der Arzt einen altersbedingten Katarakt nicht aufschneiden und dann (lange) warten, bis die natürlichen Enzyme wirken, da das Auge bald aufgrund der Reaktion des Linsenmaterials mit den mit den Gefäßen versehenen Bereichen des Auges stark entzündet wird.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Mittel anzugeben, das viele, wenn nicht alle der Gefahren und Traumata oder Verletzungen beseitigt, die mit den zuvor beschriebenen und anderen bekannten Staroperationen verbunden sind; weiter soll sie ein Mittel angeben, das bestimmte aktive Proteinasen enthält und die vom Star befallene Linse in vivo abzubauen vermag.

Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur enzymatischen Behandlung des Stars, das wenigstens ein von außen zugeführtes, die Linse abbauendes, in einem flüssigen Träger gelöstes Enzym enthält.

Die Erfindung nutzt eine einzigartige physiologische Situation innerhalb der Linse selbst aus. Während der embryonalen

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Entwicklungsphase des Menschen isoliert sich das Linsenmaterial vom übrigen Körper und entwickelt sich unabhängig vom Organismus als Ganzem in solchem Umfang, daß jeder Mensch auf den Inhalt der eigenen Linse reagiert, als ob es ein fremdes Protein wäre. Beim Erwachsenen ist die Linse von der Linsenkapsel umgeben, die hauptsächlich aus Kollagen besteht,und diese Kapsel oder dieser Beutel isoliert tatsächlich die Linse vom Körper so stark, daß von außen zugeführte Enzyme in die Linse eingeführt werden können, ohne eine immunologische Fremdproteinreaktion auszulösen.

So wird jedes von außen zugeführte, in die Linse eingeführte Material physikalisch innerhalb der Linsensubstanz durch die Linsenkapsel eingekapselt, vorausgesetzt, das Material wirkt nicht auf die Linsenkapsel ein, zerstört sie nicht oder bricht sie nicht auf. Wird die für das Einführen des Materials gemachte öffnung verschlossen, kann ein solches Material für längere Zeit in der Linsenkapsel verbleiben. Für die Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels bedeutend ist, daß die Linsenkapsel eine biochemische Zusammensetzung aufweist, die wesentlich verschieden ist von der des Rindenbereichs und des Kerns der Hauptlinsensubstanz· Von außen zugeführte Enzyme, die das Gewebe des Kerns und des Randbereichs selektiv abzubauen oder aufzulösen vermögen, die jedoch die Linsenkapsel intakt lassen, gibt es. Es kann bemerkt werden, daß der makromolekulare Charakter von Enzymen sie daran hindert, rasch, wenn überhaupt, die Netzstruktur der Kapselmembran zu durchdringen. Folglich werden in die Rinde und den Kern eingeführte selektive Enzyme darin eingeschlossen und sind über längere Zeit in der Lage, die Substanz der Alterslinse enzymatisch abzubauen·

Das Gewebe des Kerns und der Rinde, die die Linsenkapsel vollständig füllen, weist Schichten (ähnlich einer Zwiebel) auf,

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so daß jede enzymhaltige Flüssigkeit, die in die Linsensubstanz gedrückt wird, die ganze Linse entlang den Schichtlinien durchdringt. So bringt die Schichtstruktur tatsächlich alle Zellen im Kern und in der Rinde in sofortige Berührung mit den Enzymen in der Flüssigkeit. Ein normaler Alterskatarakt nimmt bis zu 20 ul Flüssigkeit ohne Anstieg des Linseninnendrucks auf einen Wert, bei dem ein Kapselbruch eintritt, auf. Daher führt die Einführung einer konzentrierten Lösung von außen zugeführter Enzyme direkt in die Linse zu einer enzymatischen Einwirkung ausschließlich auf Rinden-, Kern- und subcapsuläres, vom Star befallenes Material in vivo.

Technische Fortschritte haben dem Arzt oder Chirurgen sowohl operative Ausstattung als auch Techniken zum Operieren an der Linse selbst an die Hand gegeben. Herkömmliche Operationsausstattung, einschließlich beispielsweise das Operationsmikroskop, das in den letzten 15 Jahren weite Verbreitung gefunden hat, ermöglicht es dem Chirurgen, Einzelheiten zu erkennen, die für die visuelle Beobachtung bisher zu klein waren. Zudem erlaubt es die Verfügbarkeit von Hikrokanülen dem Chirurgen, in eine Struktur einzudringen, die so klein ist wie die menschliche Augenlinse (etwa 9 mm Durchmesser), ohne ihr größeren Schaden zuzufügen. Insgesamt stehen die für die Operation an der Linse erforderlichen Operationstechniken und die chirurgische Ausstattung auf dem Fachgebiet zur Verfügung.

Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Mittels kann die enzymhaltige Lösung in die Linse von Hand oder mit einem pneumatisch betätigten Spritzensystem in einer Flüssigkeitsmenge injiziert werden, die von einer durchschnittlichen menschlichen Augenlinse aufgenommen werden kann, d.h. nicht mehr als etwa 20 jlL. Bas Verteilungsmuster der injizierten Flüs-

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sigkeit kann durch Einbringen eines löslichen, inerten Farbstoffs, wie ζ·Β· Dichlorindophenol, oder eines Fluoreszenzfarbstoffs, wie z.B. Fluoreszein, in die Injektionsflüssigkeit beobachtet werden.

Bei einer bevorzugten Weise der Enzymeinführung folgt der Injektion der Lösung in den Hittelteil der Linse eine Injektion einer winzigen Luftblase in die Bahn der Kanüle, wenn diese aus der Linse und aus dem Auge herausgezogen wird. Diese winzige Luftblase dient zum Verschließen der kleinen Punkturstelle in der Linsenkapsel und so zum Unterbinden des Austretens der Enzymlösung aus der Linse (bevor der normale Linseninnendruck wieder hergestellt ist).

Die Zusammensetzung des abbauenden Gemische und die Inkubationszeit in der Linse wird so eingestellt, daß ein hohes Maß an Verflüssigung oder Erweichung des Linsenkernteils und des Rindenteils erzielt wird. Eine Beendigung des Vorgangs der Linsenverflüssigung und der Schutz anderer Innenaugenstrukturen für den Fall des Austritts des enzymatisch abbauenden Mittels aus der Linsenkapsel kann durch Einführen spezieller Enzyminhibitoren in die vordere Augenkammer bewirkt werden.

Die Enzymhemmstoffe können in die vordere Augenkammer für den Fall des Austritts von Enzym in diese oder selbst als Vorsichtsmaßnahme gegen ein solches Austreten eingeführt werden. Hochmolekulare (oder makromolekulare) Inhibitoren durchdringen die Linsenkapsel nicht und stören deshalb den enzymatischen Abbau der Linsenrinde und des Kerns nicht. Niedermolekulare Inhibitoren können durch die Linsenkapsel diffundieren und können verwendet werden, um den enzymatischen Abbau zu beenden, sowohl außen als auch im Inneren der Linse selbst.

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Die von außen zugeführten Enzyme, die sich als am wirksamsten beim Abbau des vom Star befallenen Linsengewebes erwiesen haben, sind im allgemeinen nicht immunologisch kompatibel mit dem menschlichen System. Deshalb sind diese (Enzym-)Proteine leicht stark antigenerzeugend. Glücklicherweise ist die Linse nicht von Blutgefäßen durchzogen und steht mit dem ixmranologische Reaktionen auslösenden System bei Säugetieren nicht in Verbindung. Menschliche Linsenproteine sind selbst antigenerzeugend, was ein Hinweis auf ihre frühe immunochemieehe Isolierung während der Zelldifferenzierung ist. Daher löst die Einführung von Fremdproteinen in die Linse, abbauende Enzyme eingeschlossen, keine schädlichen immunologischen Reaktionen aus.

Da die biochemische Zusammensetzung eines großen Teils des Kern-, Rand- und subcapsulären Kataraktmaterials Proteincharakter hat, wurde eine erhebliche Zahl proteolytischer Enzyme, die aus mikrobiellen, Pflanzen- und tierischen Quellen erhalten wurden, auf ihre Fähigkeit zum Abbau harter, altersbedingter menschlicher Katarakte hin ausgesucht. Mikrobielle Proteinasen, bevorzugt ein Gemisch verschiedener Proteinasen oder eine einzelne selektive Proteinase, haben sich als am meisten befriedigend erwiesen.

Die anderen biochemischen Hauptkomponenten, die in vom Star befallenem Gewebe gefunden werden, sind Membranbestandteile, die zusätzlich zu ihren Proteinanteilen erhebliche Mengen an Lipiden, Triglyceriden und Fettsäureestern enthalten. Aue diesem Grunde enthält im Falle der Verwendung eines Gemische das in die Linse eingeführte abbauende Enzymgemisch bevorzugt auch eine Phospholipase und eine Lipase.

Das in die Linse eingeführte Enzym oder Enzymgemisch ist bevorzugt eine 0,1 - 10 gew./gew.-prozentige wässrige Lö-

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sung von Enzym, vorzugsweise in auf einen pH-Wert von 7,4 gepufferter Salzlösung, wenngleich pyrogenfreies destilliertes Wasser verwendet werden kann. Kristalline hochgereinigte Enzyme sind natürlich bevorzugt, in der Praxis aber können etwas weniger reine Enzyme verfügbar sein. Wird ein Gemisch von Enzymen verwendet, sollte das Gemisch bevorzugt wenigstens zwei verschiedene Proteinasen und eine Lipase und eine Phospholipase enthalten. Für optimale Ergebnisse kann ein Gehalt noch anderer Enzyme wünschenswert sein.

Nachdem die konzentrierte 0,1 - 10 gew./gew.-prozentige Enzymlösung in die Linsenrinde eingeführt worden ist, kann eine geeignete Abbauperiode verstreichen. Eine solche Periode kann, z.B. 3 Tage dauern und hängt von der Enzymkonzentration, der Härte der vom Star befallenen Linse und auch von der Vorliebe des Chirurgen ab. Erwünschtermaßen wird die Linse bis zu dem Punkt verflüssigt, bei dem der abgebaute Rückstand durch die ursprüngliche Kanülenbahn in die Linse ausgespült und abgesaugt werden kann· Eine teilweise Verflüssigung jedoch, z.B. zur Verkleinerung und/oder Erweichung, kann dem Chirurgen genügen, indem es möglich wird, den altersbedingten Kataraktrückstand durch eine kleine (weniger als 180°) Einschnittöffnung mechanisch zu entfernen oder ihn zu fragmentieren und dann durch eine kleine Einschnittöffnung ausströmen zu lassen. Alles in allem können die Enzymkonzentration, die Gesamtmenge an in die Linse eingeführter flüssigkeit und die Abbauzeit variiert werden, um die Erfordernisse für den Chirurgen und die Bedürfnisse des einzelnen Patienten zu erfüllen.

Ein Abbau des Katarakts in situ, wie er hier betrachtet wird, erfordert hohe Enzymaktivitätswerte und Selektivität. Zum Glück sind hoch selektive Enzyme auf dem Fachgebiet bekannt.

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/ο

Tatsächlich sind mehrere Klassen von außen wirksamer En» zyrae bekannt, die selektiv Gewebekomponenten ähnlich denen, wie sie in menschlichen Linsen anzutreffen sind, abbauen. ICs sind Lipasen, Proteasen und glykolytische Enzyme, die jeweils verschiedene Arten von Lipiden, Proteinen und Polysacchariden abbauen. Mit Enzymen in hochreiner Form, wie z.B. kristallinen Enzymen, können konzentrierte (wässrige) Lösungen gemischter Enzyme zusammengestellt werden, z.B. 10 gew./gew.-prozentige Lösungen. Polglich erlaubt die vorgeschriebene 20 μΙ-Grenze die Einführung von bis zu 2 mg reinen Enzyms in die Linsensubstanz. Da eine normale Linse etwa 200 mg wiegt, stellt das leicht erreichbare Enzym/Substrat-Verhältnis von etwa 1 : 100 ein hohes Enzym/ Substrat-Verhältnis dar, insbesondere da die Schichtenstruktur der Linse tatsächlich alle Linsenzellen in praktisch direkten Kontakt mit der Enzymlösung bringt. Besonders bevorzugt werden konzentrierte Lösungen eingesetzt. Ist die Enzymkonzentration nicht hoch, erfordert der Abbau der Linsensubstanz mehr Zeit, und eine mechanische Entfernung des Linsenrückstands (Rinde) kann erforderlich sein. Andererseits bauen konzentriertere Enzymlösungen die Linsensubstanz rascher und weitgehender ab. Hohe Enzymkonzentrationen lösen keine nachteiligen Folgen aus. Im Verlauf der Abbauperiode für die Linsensubstanz baut sich die Protease selbst ab und baut die anderen Enzyme ebenso ab. Die von außen zugeführten Enzyme werden innerhalb weniger Tage desaktiviert, und dann ist die (erweichte oder verflüssigte) vom Star befallene Linse reif zur Entfernung.

Untersuchungen von Einzelenzymen haben ergeben, daß viele einzelne Proteinasen menschliche Augenlinsen in vitro verflüssigen. Beispielsweise wurden frisch entfernte menschliche Augenlinsen in vitro in einer ausgewogenen Salzlösung mit pH 7,4 abgebaut durch Enzymkonzentrationen von etwa 330 Einheiten (E) /ml

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mit Papain, Subtilisin Carlsberg, "Pronase-P", "Savarase", "Alcalase", "Neutrase", "Esperase". (1 Einheit ist definiert als die Enzymmenge, die 1 uMol TCA-lösliches Tyrosin pro Minute (gemessen nach der Standard-Folin-Ciocalteau-Methode) unter Verwendung von Casein als Substrat hervorbringt. Die Versuchsbedingungen sind 0,6 Gew./Vol.-Prozent Casein in 0,05 m K₂HPO₄ZKH₂PO₄ bei pH 7,5 und 37⁰C). Im Falle jedes Enzyms wurden die Linsen in erheblichem Umfang abgebaut, was durch erhebliche Verkleinerung der Linse in Erscheinung trat.

Die vielen verschiedenen, im Handel erhältlichen Proteinasen, die menschliche Augenlinsen abbauten, zeigen, daß die Auswahl einer bevorzugten Protease auf der Grundlage der Enzymeigenschaften insgesamt erfolgen kann, d.h. Aktivität gegenüber Linsengewebe, Selektivität gegenüber Linsengewebe und Leichtigkeit der Inhibierung. Daher sind die zur Verwendung in den erfindungegemäßen Mitteln bevorzugten Enzyme hoch gereinigt, erwünschtermaßen homogen oder sogar Einzelkomponenten, Fraktionen der Proteinasen von S. griseus, Fraktionen, die die Linse angreifen, nicht aber die Linsenkapsel, und die auf die im vorderen Augenabschnitt vorhandenen Substanzen und Strukturen nicht traumatisch einwirken. Inertverhalten gegenüber der Linsenkapsel ist wünschenswert, da dann das gesamte in die Linse eingeführte Enzym vom hinteren Abschnitt und von den vor der Linsenkapsel liegenden Augenstrukturen abgekapselt wird, wobei der hintere Abschnitt derjenige ist, wo ein Schaden durch enzymatische Einwirkung am ehesten eintritt.

Hoch gereinigte (nahezu homogene) Proteinasen vernünftiger Selektivität können durch Fraktionieren der handelsreinen S. griseus-Proteinase ("Pronase-P") nach auf dem Fachgebiet bekannten Arbeitsweisen erhalten werden.

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Ein im Handel erhältliches Präparat τοη S. griseus-Proteinasen, nämlich "Pronase-P¹¹ (TM),wurde durch Gelpermationschromatographie in wenigstens sechs verschiedene Molekulargewichtsgruppen aufgelöst, wobei die Auflösung in der Figur durch das Elutionsprofil dargestellt ist, die eine die Fraktionierung der Proteinasen aus S. griseus zeigende graphische Darstellung ist. Sine einzelne Proteinase scheint die Proteinpopulation in jeder der Molekulargewichtgruppen stark zu beherrschen, nach isoelektrischen Scheibengelfokussiermethoden zu urteilen· Obgleich diese gereinigten Proteine der Fraktionen 1 bis V selbst zufriedenstellende Proteinasen für den Linsenabbau in viro sind, kann eine weitere Reinigung zur Homogenität leicht durch Anwendung hoch auflösender Proteinfraktionierungsmethoden erzielt werden, wie z.B. Ionenaustausch oder Affinitätschromatographie auf der Grundlage biologischer Spezifität. Die Trennung ist nachfolgend in beispielhafter Ausführlichkeit beschrieben·

Gering auflösende Fr»V"fcion^ervn/y von S« grlseuB erhaltenen Proteinasen

Das Ausgangsprodukt war ein im Handel erhältliches Proteasepulver, Pronase-P (der Kaken Chemical Co·, Tokio, Japan). Das Material enthielt etwa 3-5 Aktivitätseinheiten (AE)/mg auf der Grundlage des Auftretens τοη Tyrosin bei der enzymatisch katalysierten Hydrolyse τοη Casein· Die chromatographische Fraktionierung und alle nachfolgenden Schritte wurden bei 4⁰C durchgeführt.

Das für die Fraktionierung des Rohenzyms verwendete Material für die Gelperartion ist "G-75 Superfine Sephedex*, 2 g in einer Säule τοη 5 χ 90 cm· Der Blutionepuffer ist 25 mMol MES (2-(H-Morpholino)äthan-8Ulfonsäure), pH 6,0, mit 5 mMol

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CaCIp# Sechs gut aufgelöste Molekulargewichtsgruppen von Proteinen wurden aus der Säule erhalten, wie durch das Frotein-Elutionsprofil der Figur gezeigt. Dieses Fraktionierverfahren stimmt praktisch überein mit dem von Bauer und I^fqvist (Acta Chem. Scand. 2χ, 3H7 /1973/) berichteten, mit der Ausnahme, daß sie offenbar eine teilweise Auflösung der Fraktion III in eine zusätzliche Molekulargewichtsfraktion erhielten, die als Schulter des Hauptpeaks erscheint. Fraktion VI zeigte extrem geringe proteolytische Aktivität und wird weiter nicht mehr erörtert. Isoelektrische Breitbereichfokussierung (pH 3 - 10) an Polyacrylamidgelen zeigte, daß jede der Fraktionen einen Proteinhauptpeak und etwas mit Minder- und Spurenkomponenten, wie nachfolgend zusammengestellt, verbundene Heterogen!tat aufwies.

Fraktion I __T

pl_±

Hauptkomponente 6,0 Nebenkomponente 5,1 6 Spurenkomponenten

Fraktion II __r

————— P*_A

Hauptkomponente 5,5 Nebenkomponente 5,1 6 Spurenkomponenten

Hauptkomponente 5,8 Hebenkomponente 5,5

Fraktion IY

Hauptkomponente 7,8 6 Spurenkomponenten

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- -Uf -	pK_±
/Hf	7,5
Fraktion V	6,8

Hauptkomponente
Nebenkomponente

4 Spurenkomponenten

Mittelschnitte jeder Molekulargewichtsfraktion wurden zusammengefaßt, wie angegeben, und dann der Dialyse gegen 50 1 Hank's Gleichgewichtssalzlösung bei 4⁰C 24 h unterworfen. Die dialysierten Fraktionen wurden dann einer etwa 6-fachen Konzentration unter Verwendung von "Ficoll" ausgesetzt. Die konzentrierten Proben wurden in 2 m.i-Mengen unterteilt und für nachfolgende Verwendung eingefroren.

Hoch auflösende Fraktionierung you S. griseus—

Fraktion V

Sin Anteil der Fraktion V des aus der Gelpermeationschromatographie erhaltenen Enzyms wurde gegen 10 ml TriB-HCl-Puffer (Tris-hydroxymethylaminomethanhydrochlorid), pH über Nacht dialysiert. Die Enzymprobe wurde auf eine DEAE-Cellulose-(Diäthylaminoäthylcellulose-)Säule gebracht, die mit demselben Puffer ins Gleichgewicht gebracht war und ausgiebig mit dem 10-fachen Leervolumen der Säule mit dem beladenen Puffer gewaschen· Bin linearer Salzgradient zwischen O und 0,1 m KCl in 10 mMol Tris-HCl, pH 7t7, wurde zum Eluieren des Enzyms angewandt. Das Gradientenvolumen war das 10-fache Leervolummm der Säule. Der unter dem Gradienten früh eluierte Hauptpeak wurde durch isoelektrische Breitbandf okUBsierung an Polyacrylamidgel auf Heterogenität geprüft und erwies sieh als homogen. Densitometrische Analyse des Gele nach Proteinanfärbung ergab eine einzige scharfe Bande mit einem isoelektrischen Punkt von 7,35· Es gab tatsächlich kein Anzeichen von Heterogen!tat

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durch. Autolyse nach erneuter Prüfung nach 6 Tagen Lagerung bei O⁰C.

Die Hauptkomponente der Fraktion V entwickelt chymotrypsinartige Spezifität, indem sie ungewöhnlich spezielle hohe Aktivität hinsichtlich des synthetischen Substrats ATEE (N-Acetyltyrosinäthylester) zeigt.

Hoch auflösende Reinigung der Fraktion IY bis zur Homogenität

Ionenaustauschchromatographieauflösung wurde an Cellulosephosphat durchgeführt (feinteilig, gemäß den Herstellerangaben mit einer Kapazität von 1 mÄq/g₉ Sigma Chemical Co., und nach den Verkäuferanweisungen vorkonditioniert). Die verwendete Säule war 1 χ 10 cm. Das Säulenmaterial wurde mit 10 mMol Calciumacetat, pH 5,2, ine Gleichgewicht gebracht. Die aufgetragene Probe war 250 mg "Pronase-P" in 10 ml, über Hacht gegen den Säulenpuffer dialysiert. Die große Mehrzahl der Proteine wurden in das Leervolumen der Säule eluiert. Ein (etwa 2 Leervolumina) späterer Peak mit hoher BAEE-(H-Benzoylarginin-äthylester-)Aktivltät wurde beim weiteren Waschen der Säule beobachtet. Dieser Peak wurde von einer Schulter am Durchbruchpeak vollständig aufgelöst, der nur ATEB-Aktivitätseigenschaften der Fraktion V zeigte. Die Gesazttausbeute an Proteinasen der Fraktion IY, bezogen auf die BAEE-Aktivität des Ausgangsmaterials betrug 50 %. Bachfolgende Isoelektrische Fekussierung des BAEE-P#aks zeigte, daß er homogen war, wobei der isoelektrische Punkt identisch war mit dem, der für die Hauptproteinkomponente der Fraktion IY beobachtet wurde.

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Einzelne Eigenschaften der S. griseus-Protease-

fraktionen

Sie aus der Gelpermeationschromatographietrennung des rohen S. griseus-Präparats erhaltenen Hauptkomponenten sind Proteinasen niederen Molekulargewichts (8.000 -20.000 Daltons). Die verschiedenen Fraktionen, eineein oder zusammengemischt, zeigen ziemlich geringe Autolyseraten, wenn die Calciumionenkonzentrationen größer als millimolar sind. Die in den Traktionen I, II und III gefundenen Hauptproteinasekomponenten zeigen ein zwangsweises Bedürfnis nach zweiwertigem Metall und werden leicht durch ÄDTA inhibiert. Für praktische Zwecke kann angenommen werden, daß diese drei Enzyme durch ÄDTA-Konzentrationen über 10 uMol ohne überflüssige Calciumionen quantitativ inhibiert werden. Die Hauptproteinasekomponenten in den Fraktionen 17 und V scheinen typische Serinproteinasen zu sein und werden quantitativ und irreversibel durch Phenylsulfonylfluorid oder Diisopropylfluorphosphat Inhibiert. Von den fünf Fraktionen scheinen drei für den Linsenabbau geeignet zu sein. Dies sind die Fraktionen II, IT und V. Fraktion I zeigt Aktivität auf die Linsenkapsel· Fraktion III initiiert Thromogenese und nachfolgende Fibrinbildung in der plasminartigen wässrigen Flüssigkeit des Kaninchenauges. Die Fraktionen II bis IY können mit bekannten Inhibitoren in vivo inaktiviert werden. Aller Wahrscheinlichkeit nach existiert ein geeigneter Inhibitor für Fraktion V. Es kann festgestellt werden, daß die Fraktionen IY und V rasch und irreversibel durch Diisopropylfluorphosphat inaktiviert werden.

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pH-Stabilität von S. griaeus-Praktionen I Us V

Die pH-Stabilität von S. griseue-Praktionen im pH-Bereich von 2-11 wurde untersucht. Fünf verschiedene Puffer wurden eingesetzt, die sich in benachbarten pH-Bereichen überlappten, um spezielle Ioneneffekte auf die Stabilität zu korrigieren. pH-Stat-Methoden wurden angewandt, um die Restaktivität für Fraktion IY aufzuzeichnen, und die Standardazocaseinprobe wurde für die anderen Fraktionen angewandt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind nachfolgend zusammengestellt. Die Inkubationen erfolgten in Gegenwart von 10 mMol Calciumchlorid bei Raumtemperatur.

Fraktion II. Die Proteinaseaktivität ist bei pH-Werten unter 3 sehr instabil. Die mäherungsweise Halbwertszeit ist 10 h bei pH 4· Sie ist relativ stabil im pH-Bereich von 5-9, vorausgesetzt, die Proteinkonzentration ist kleiner als 10 pg/ml. Ihre Halbwertszeit beträgt etwa 28 h bei pH 10 und 10 h bei pH 10,5.

Fraktion IY. Das Enzym ist sehr instabil bei pH-Werten unter 2. Es verliert etwa 25 % seiner Aktivität in 24 h bei pH 3 und ist sehr stabil im pH-Bereich von 4-9 bei Proteinkonzentrationen unter 10 ug/ml· Es ist verhältnismäßig instabil bei hohen pH-Werten mit einer Halbwertszeit von etwa 5 h bei pH 10 und einer Halbwertszeit von weniger als 2 h bei 10,5·

Fraktion Y. Dieses Enzym ist das stabilste aller Fraktionen. Es ist recht stabil im breiten pH-Bereich von 2 - 10,5 bei Proteinkonzentrationen unter 100 ug/ml.

Alle Proteinasefraktionen I - V können ohne nachweisbaren Verlust proteolytischer Aktivität eingefroren/aufgetaut werden. Bei 4⁰C in Hank's Gleichgewichtssalzlösung von pH 6,0

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können die Enzyme Über 2 Wochen lang mit nur 5 - 10 96 Verlust proteolytiecher Aktivität aufbewahrt werden, gemessen nach der Standard-Azocaselnprobe·

pH-Aktivitätsprofile der Fraktionen II. IV und V

Fraktion II wurde mit Hilfe einer Azocaseinprobe geprüft. Sie Fraktionen IV und V wurden unter Anwendung von pH-Stat-Verfahren mit BAEE bzw. ATEE als Substraten geprüft. Der untersuchte pH-Bereich war 3-10, und 4 verschiedene Puffersysteme wurden überlappend eingesetzt, um die speziellen Ioneneffekte auf einem Minimum zu halten.

Die Ergebnisse sind nachfolgend zusammengestellt.

Fraktion II. Ein beträchtlicher Aktivitätaverlust ergibt sich bei niederen pH-Werten. Bas pH-Profil zeigt ein Plateau bei pH 6 und bleibt etwa gleich bis zu pH 10· Citrat scheint leicht inhibierend zu sein.

Fraktion IV. Keine Aktivität bei pH-Werten unter 4. Die Aktivität steigt rasch von pH 5 - 7 und steigt langsam zu einem Plateau beim pH-Wert von 11.

Fraktion V. Keine Aktivität bei pH-Werten unter 4. Die Aktivität steigt rasch im Bereich von pH 5 - 8 und ein Plateau wird bei pH-Werten von 8 - 9 erreicht. Die Aktivität fällt rasch im pH-Bereich von 10 -11.

Als Schlußfolgerung scheint es, daß jede der Fraktionen II, IV und V verhältnismäßig hohe Aktivität im physiologischen pH-Bereich besitzt und zur Anwendung in vivo geeignet ist.

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Inhibitoren und auf aktive Stellen gerichtete Inaktlvatoren für Proteinase-Fraktionen

II. IV und Y

Fraktion II zeigt ein starkes Bedürfnis nach zweiwertigen Metallionen und wird durch ÄDTA irreversibel inaktiviert, fraktion II ist sehr empfindlich gegenüber XDTA und wird bei Konzentrationen unter 10 μ§/ΐη1 quantitativ durch 10 uMol ÄDTA inhibiert. Es war nicht möglich, eine Reaktivierung des Apoenzyms durch Zugabe überschüssiger Calciumionen zu reaktivieren.

Die Ergebnisse sind nachfolgend zusammengestellt.

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) aktivierte die Peakfraktion V sirtt chiometrisch, bis etwa 70 % Inaktivierung eintreten. An diesem Punkt beginnt die Hydrolysegeschwindigkeit des PMSF mit der der Reaktion mit dem Enzym zu konkurrieren. Auf der Grundlage einer Analyse des Inaktivierungsprofils und der Aktivität des Enzyms mit BAEE als Substrat beträgt die geschätzte Wechselzahl dieses Enzyms 3/sec, was recht typisch ist für eine Proteinase.

Wieder unter Verwendung von PMSF ist die Inaktivierung des Peaks IV stö'chiometrisch bis zu etwa 60 % Umsetzung. Unter Anwendung der Methoden ähnlich denen, wie sie für die Fraktion V angewandt wurden, wurde eine minimale Wechselzahl von 5/sec errechnet. Beide Fraktionen V und IV werden sofort und irreversibel durch Misopropylfluorphosphat inaktiviert, auf der Grundlage der pH-Stat-aufgezeichneten Aktivitätsanalyse .

Behandlung und Gewinnung der Enzyme für chirurgische Anwendung Gefrorene Mengen der verschiedenen, für die Verflüssigung

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von Linsenmaterial eingesetzten Enzymfraktionen wurden unmittelbar vor ihrer Verwendung aufgetaut. Ein ausreichendes Volumen einer 2 gew./vol.-prozentigen Lösung von Fluorescein in Gleichgewichtssalzlösung (BSS) wurde der Enzymlösung zugesetzt, um das erhaltene Gemisch 0,2 gew./vol.-prozentig an Fluorescein zu machen· Die Lösung wurde dann kaltsterilisiert unter Milliporenfiltration durch ein 0,45 pm-Forenfilter in ein steriles, pyrogenfreies Testrohr mit einem sterilen Stopfen. Dabei wurde in allen Stufen der Reinigung und nachfolgenden Handhabung des Enzyms dafür Sorge getragen, daß sichergestellt wurde, daß alle Behälter und Apparaturen, die mit dem Enzym oder den Flüssigkeiten und Substanzen, die den Enzymlösungen zugesetzt werden, in Berührung kommen, pyrogenfrei, also frei von fiebererregenden Stoffen waren. Nach Kaltsterillsierung des Enzyms wurden strikt aseptische Techniken bei der weiteren Handhabung und Übertragung des Enzyms eingehalten. Vor dem Beschicken der Injektionsvorrichtung mit dem Enzym wurde die gesamte Leitung, Hähne, Mikroliterspritze und Kanüle durch BLndurchpumpen von "Cidex" durch die ganze Einheit chemisch sterilisiert. Die Sterilisierlösung wurde durch kontinuierliches Hindurchpumpen sterilen BSS durch die Einheit über 15 min entfernt. Das Enzym wird dann unter Anwendung von Steriltechniken in die Vorrichtung gebracht und die Kanüle über die ganze Anwendung hinweg in steriler Umgebung gehalten. Hach dem Einsatz wurde jede Enzymlösung auf Sterilität geprüft, indem 50 μΐ der Lösung direkt von der Instrumenteneinheit auf ein Agar-Nährmedium in einer Fetrischaie gespritzt wurden· Die Schalen wurden dann für 10 lage daraufhin überwacht, ob sich Anzeichen für mikrobielle Verunreinigung der Apparatur oder der Enzymlösung zeigten. Jede Enzymlösung wurde routinemäßig innerhalb einer halben Stunde nach ihrer Verwendung geprüft. Die Anwesenheit von Fluoreszein hat keinen Einfluß auf die Aktivität irgendeines der Enzyme, die bei dieser Untersuchung eingesetzt wur-

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den» und wurde,wo angebracht, in die Blindprobe beim Analysen-verfahren eingebracht,

Chirurffisches Vorgehen

Die Injektionsmethode ist grundlegend eine atraumatische Technik. Die Tiere werden unter Generalanästhesie gesetzt, wozu Nembutal (30 mg/kg) und "Ketamine" (40 mg/kg) intramuskulär gespritzt werden. Bei einem normalen Kaninchen dauert es etwa 15 min, bis das Tier in tiefe Anästhesie gelangt ist; die angewandte Dosierung erlaubt ein durchschnittliches Operationsfenster von etwa 20 min. Wenn nötig, können periodisch Ergänzungsmengen von etwa 20 % der Anfangsdosis in Intervallen von 10 min verabreicht werden. Die Pupillen werden durch örtliche Anwendung von 1 % "Mydriacyl¹¹ und einer 10 folgen ophthalnisehen Lösung von Neosynephrin erweitert. Jeweils ein Tropfen wird alle 5 min bei insgesamt drei Anwendungen auf das Auge gebracht. Das Tier wird dann auf den Operationstisch gebracht. Strikt steriles Vorgehen wird von diesem Zeitpunkt an beim Operieren eingehalten. Das Tier wird abgedeckt und das Auge mit dem örtlich wirkenden ophthalmischen Anästbetikum "Alcain" gespült. Beim Kaninohen wird eine einfache federbewehrte Einrichtung zum Zurückziehen des Augenlids verwendet, um die Nickhautmembran von der Vorderseite des Auges wegzuziehen. Im Rand wird ein kleiner Einschnitt mit einem Zeigler-Messer gemacht. Die Punktur erfolgt tangential zum Krümmungsradius der Hornhaut und ist gerade so klein, daß es nur mit dem Operationsmikroskop zu beobachten ist. Diese Art des Einschnitts ist selbstdichtend und vermeidet einen Kollaps der vorderen Augenkammer· Sodann wird eine Mikrokanüle durch den Einschnitt mit Hilfe des Operationsmikroskops hindurchgeschoben· Die vordere Linsenkapsel wird dann durchdrungen und die Kanüle in den Linsenkern einge-

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bettet. Sine vorbestimmte Menge der Enzymlösung wird dann durch die Kanüle mit Hilfe einer Präzisiona-Mikroliter-Spritzantriebseinrichtung zugemessen. Für die Kaninchenlinse optimal werden 3 - 10 ul abgegeben. Nach dem hier beschriebenen Torgehen kann eine 5 ul-Menge einer Enzymlösung von 200 E/ml als erfindungsgemäß beispielhafte Ausführungsform angesehen werden. Direkte Sichtbarmachung der Verteilung der eingespritzten Lösung erfolgt durch Einbringen eines Fluoreszenzfarbstoffs, Fluoreszein, in die Enzymlösung. Nach dem Einspritzen der Flüssigkeit wird eine kleine Gasblase, z.B. Luft, eingeführt, um den Raum zu dichten, der durch Einführen der Flüssigkeit in die Linse entstanden ist. Die Kanülenspitze wird dann halb aus.der Linse herausgezogen und die Nadelbahn mit mehr Gas abgedichtet, worauf die Kanüle weiter herausgezogen wird. Der ganze Vorgang dauert etwa 5 min. Die postoperative Medikation besteht in der örtlichen Anwendung von "Neopolycin"-Augensalbe auf das Auge und intramuskuläre Injektion eines Breitbandantibiotifcns(z.B. 600.000 Einheiten "Bicillin").

Typische Inkubationszeiten in der Linse für die Einwirkung des abbauenden Enzyms waren 3 oder 4 Tage. Dann wurden die Linsen ausgesaugt. Vor dem Aussaugen der Linsen zeichnete sich das Auge Im allgemeinen wie folgt aus: Ein "reifes" Auge zeigte eine schwachgelbe und diffuse Trübung im Pupillenbereich, eine Folge der Denaturierung der Linsenproteine innerhalb der Kapsel und Verteilung des Farbstoffs über das gesamte Innenlinsenvolumen. Normalerweise zeigt das Kaninchenauge leicht erhöhten Linsenlnnendruck 24 h nach der Behandlung mit Enzym. Bei etwa der Hälfte der Kaninchen bildete sich ein kleiner Fibrinfleck oder -Strang in der vorderen Augenkammer· In Anbetracht der Leichtigkeit, mit der das Kaninchenauge von einem Trauma getroffen wird, waren die Augen "ruhig" und sprachen nach dem Eingriff auf die Enzyminjektion nur sehr gering an.

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Zum Absaugen der Linse wurden die Tiere wieder unter allgemeine Narkose gesetzt, wobei anfangs die oben beschriebene Standardmenge an Narkosemitteln eingesetzt wurde, nach 10 min jedoch ergänzt durch zusätzliche 50 % eines jeden Narkosemittels. Die Pupillen werden wieder durch Anwendung von Mydriacyl und Neosynephrin erweitert. Das Tier wurde auf den Operationstisch gebracht und abgedeckt, wobei sodann strikt unter sterilen Bedingungen gearbeitet wurde. Mit einem Zeigler-Hesser wird ein Einschnitt von 2 - 3 mm in den Rand (Limbus) gemacht. Die vordere Kapsel wird dann mit Hilfe einer scharfen Nadel durchbrochen, um die verflüssigte linse zugänglich zu machen. Kleine Mengen Fibrinfasern, die sich gelegentlich in der Vorderkammer des Kaninchenauges bilden, werden mit einer Mikropinzette entfernt, dann wird die Linse ausgesaugt. Die verwendete Absaug/Spülvorrichtung ist eine im Handel erhältliche Vorrichtung. Die verwendete Spülflüssigkeit war mit Lactat versetzte Ringer-Lösung (der Abbott Laboratories). Das Aussaugen erreichten Linsenmaterials erfolgt optimal unter Verwendung des Operationsmikroskops als Betrachtungshilfe. Nach dem Absaugen wird der Einschnitt im Limbus mit drei Nähten geschlossen und die vordere Augenkammer wieder hergestellt. Die postoperative Medikation besteht in subkonjunktiv verabreichten 0,25 ml "Celestone"-Augenpräparats, örtlich verabreichter Neopolycin-Salbe und einem intramuskulär verabreichten Breitbandantibiotikum ("Bicillin¹*, 600.000 E). Den Tieren wurden täglich erweiternde Tropfen verabreicht, die aus einer ophthalmischen Lösung von Atroplnsulfat, Neosynephrin und "Maxitrol" bestanden, um Synechiebildung auf einem Minimum zu halten. Die tatsächliche Operationszeit vom Öffnen bis zum Schließen des Auges beträgt etwa 15 - 20 min.

Beste Ergebnisse wurden mit Enzymdosierungen für das Kaninchenauge von 3 - 10 ul einer Enzymlösung erhalten, die 50 -500 E/ml Aktivität (bezogen auf eine Azocaselnanalyse) ent-

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hielt. Auf der Grundlage der Erfahrung mit etwa 70 Albinokaninchen mit dem vorstehenden Dosierungsbereich scheint es, daß eine zweitägige Inkubationszeit die Linse zum Entfernen durch Absaugen ausreichend erweicht. In etlichen Fällen war die Operation so erfolgreich, daß sowohl die vordere als auch die hintere Kapsel vollständig intakt waren, mit der Ausnahme des Einschnitts in der vorderen Kapsel für den Eintritt der Absaugnadel. Bei etlichen Kaninchen war das Auge mit der abgesaugten Linse praktisch nicht vom Kontrollauge zu unterscheiden.

Eine ähnliche Testreihe wurde an pigmentierten Kaninchen und an Katzen durchgeführt. Insgesamt waren die Ergebnisse der Operation für pigmentierte Kaninchen identisch mit den Beobachtungen und Erfahrungen an den Albinokaninchen· Im Falle der Katzen waren die Ergebnisse qualitativ ähnlich denen der Kaninchen, in den Einzelheiten aber verschieden aufgrund der Tatsache, daß der Linsenkern der Katze eine extrem harte, dichte Matrix und sehr charakteristisch dafür ist, was im harten brueszenten menschlichen Katarakt anzutreffen ist. Wurden Enzymdosierungen ähnlich denen, wie sie bei den Kaninchen eingesetzt wurden, für Katzen eingesetzt, wurde eine vollständige Erweichung des Kerne nicht erreicht. Wegen der extremen Dichte des Linsenkerns der Katze wurde das injizierte Enzym anfangs in dem weicheren Randbereich verteilt, und ein Abbau des Kernbereichs trat zuerst am Rand und dann zur Mitte hin ein. Beim Absaugen der Katzenlinse wurde ein kleines dichtes Polster verbliebenen Kernmaterials in der Linsenmitte beobachtet, das etwa 1/3 des Durchmessers des normalen kompakten Katzenaugenkerns hatte. Obgleich dieses Kernmaterial nicht abgesaugt werden konnte, war es klein genug, um durch den Einschnitt im Limbus leicht entfernt werden zu können· Daher werden im Falle extrem großer und dichter Kernbereiche, wie sie bei-

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spielsweise im Katzenauge anzutreffen sind, höhere Enzymdosierungen und längere Innenlinsen-Inkubationszeiten im Vergleich zum Modellsystem des Kaninchenauges erforderlich.

Ein weiterer Punkt sollte im Hinblick auf die Bildung von fibrin in der vorderen Augenkammer sowohl für Katze als auch für Kaninchen gemacht werden. Bei beiden Tieren ist die Bildung von Fibrin ein charakteristisches Phänomen, das eintritt, wenn die wässrige Flüssigkeit den Linsenproteinen ausgesetzt ist. Dieses Phänomen mag beim Menschen nicht auftreten, da die wässrige Flüssigkeit keine wesentlichen Mengen an verklumpenden Proteinen enthält, wie dies sowohl bei Kaninchen als auch bei Katzen der Fall ist. Bei Kaninchen trat die Bildung von Fibrin postoperativ sporadisch auf, und in einer Reihe von Fällen gingen die Febrinklumpen spontan wieder in Lösung.

Traumastudien - Vorderabschnitt

Es wurde eine Studie durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Enzyme einen großen pathologischen Einflufi auf Strukturen des Vorderaugenabschnitts oder damit zusammenhängende physiologische Funktionen ausüben· Bei einer solchen Studie wurde das zufällige Zusammentreffen des vorderen Abschnitts mit dem die Linse verflüssigenden Enzym oder der Austritt des Enzyms nach dem Einbringen in die Linse in den vorderen Augenabschnitt untersucht.

Die für diese Studie ausgewählten Enzyme waren die Fraktionen II, IV und V, isoliert aus dem S. griseus-Präparat "Pronase". Das dafür eingesetzte Tier waren Neuseeland-Albinokaninchen mit einem Gewicht von etwa 3 kg. Diese Versuche wurden in der gleichen Weise durchgeführt, wie sie zum Einbringen des Enzyms in die Linse beschrieben wurden, mit der Ausnahme, daß

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das Enzym in die Mitte der Vorderkammer gegeben und die Linsenkapsel nicht durchdrungen wurde· Da die Enzymlösung eine erheblich höhere Dichte hat als die wässrige Flüssigkeit, sinkt sie anfangs auf den Boden der Kammer und bildet einen kreisförmigen Ring um die vorderen Außenbereiche der Linse. In dieser Lage berührt die injizierte Lösung direkt die nahebei liegenden Strukturelemente des Vorderabschnitts, wie z.B. den vorderen Strahlenkörper und die Zonula, vordere und hintere Flächen der Iris und die Trabeculars truktur der Vorderkammer. Innerhalb einiger Minuten scheint sich die Lösung mit dem Rest der wässrigen Flüssigkeit zu mischen und durch den Vorderabschnitt homogen verteilt zu werden, was visuell durch die Verteilung des Fluoreszeinfarbstoffs in Erscheinung tritt. Nach dem Eingriff wurden die Tiere dann mit routinemäßigen Augenuntersuchungen bis zu 2 Monaten überwacht. Diese Beobachtungen wurden durch Sezieren ausgewählter Augen und detaillierte pathologische Überprüfung ergänzt.

Vier getrennte Versuchsreihen wurden bei etwa wöchentlichen Zeitabständen durchgeführt, wobei eine Gruppe aus wenigstens 3 Kaninchen bestand, von denen jedes eine Injektion einer der drei S. griseus-Fraktionen in den Vorderabschnitt erhielt. Drei verschiedene Enzympräparate wurden für diese Untersuchung eingesetzt, von denen eines für eine Doppelversuchsreihe verwendet wurde. Die Herstellung und Handhabung der Enzymlösungen ist identisch zu der für die Versuche mit der Linseninjektion. Die insgesamt eingesetzten Dosiswerte lagen innerhalb des Bereichs der Werte, die zuvor für die Verflüssigungs/Absaugversuche angewandt wurden, und die eingeführten Volumina lagen zwischen 2 und 7 ul.

In allen Fällen ausnahmslos waren die Augen über die ganze postoperative Beobachtungszeit hinweg vollständig normal, wie

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durch routlnemäSige Augenuntersuchungen festgestellt wurde. Z.B. war die Hornhaut klar, die Linsenkapsel blieb transparent, die Pupille sprach auf Licht normal an, die Iris zeigte keine Blutungen,und keine Bildung von Fibrinklumpen konnte im Vorderabschnitt beobachtet werden. Der Innenaugendruck schien in den Fällen, in denen er von außen durch ein Tonometer gemessen wurde, normal zu sein. Anatomisches Sezieren zeigte keine visuell auszumachenden Unterschiede in irgendeiner der Gewebestrukturen des Vorderabschnitts. Ausführliche Pathologie zeigte ein normales Auge an.

Auf der Grundlage dieser Beobachtungen kann der Schluß gezogen werden, daß sich keine erheblichen Komplikationen ergeben, wenn der Vorderabschnitt den die Linse verflüssigenden Enzymen in Dosismengen ausgesetzt wird, die direkt mit jenen vergleichbar sind, welche für einen typ!sehen Operationsvorgang angewandt werden. Während dieser Schluß nicht direkt auf Primaten übertragen werden kann, sollte erwähnt werden, daß das Albinokaninchen ein ausgezeichnetes Versuchsobjekt anstelle der direkten Verwendung von Primaten darstellt. Das Auge des Albinokaninchens ist vielleicht unter allen üblichen Versuchstieren am leichtesten zu traumatisieren und spricht leicht auf eine Vielzahl chemischer und physikalischer Störungen an.

Traumastudien - Hinterabschnitt

Sinn dieser Studie war es, Gewißheit darüber zu erlangen, welchen Einfluß, wenn Überhaupt, die die Linsen verflüssigenden Enzyme auf die Augenstrukturen des hinteren Abschnitts ausüben. Diese Studie sollte ein mögliches Trauma feststellen, das von einem zufälligen Einbringen oder Austritt des Enzyms aus der Linsenkapsel in den hinteren Abschnitt resultieren könnte. 50 Augen wurden für diese Studie herangesogen·

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Zwei Methoden zum Einführen des verflüssigenden Enzyms In den Glaskörper wurden angewandt. Zur ersten Methode gehörte eine Technik, die der ähnlich war» wie sie zum Einbringen des Enzyms in die Linse angewandt wurde, und dazu wurde die Spenderkanüle direkt durch die Linsenmitte, durch die hintere Kapsel und in den Glaskörper geführt. Das Einbringen der Kanülenspitze im hinteren Abschnitt kann unter Verwendung der Schlitzlampenbefestigung am Zeiss-Operationsmikroskop präzise bestimmt werden. Die zweite Methode des Einbringens umfaßt direktes Injizieren In den hinteren Abschnitt durch den pars planer. In diesem Falle tritt die Kanüle von der Seite des Auges ein. Der Reineffekt dieser Art des Einbringens des verflüssigenden Enzyms in den hinteren Abschnitt besteht darin, daß Sekundärkomplikationen, die sich aus der Wechselwirkung weichen Linsenmaterials wie der Rindensubstanz mit dem Glaskörper vermieden wird. Typischerweise wurden die Dosen variiert, indem das Volumen der in den Glaskörper gegebenen Menge geändert wurde. Injektionsvolumina lagen zwischen 2 und 7 ul mit Gesamtenzymwirkungen ähnlich denen, die zum Abbau der Linse angewandt wurden. Ein typisches Injektionsmuster, wie es durch Beobachtung des Fluoreszeinfarbstoffs sichtbar gemacht wurde, besteht in einer Regenschirmform, die radial von der Kanülenspitze ausstrahlt und der Grenzfläche der hinteren Linsenkapsel und dem anliegenden Glaskörper folgt. Zusätzlich zu den Enzymzufuhren wurde eine Reihe von Kontrollexperimenten durchgeführt, bei denen die Gleichgewichtsealzlösung und Fluoreszein Injiziert wurden. Die Masse der Untersuchungen wurde an Neuseeland-Albinokaninchen und vier Versuche an schwarzen Holländern, einem pigmentierten Kaninchen, durchgeführt. Neun Versuchsgruppen von Untersuchungen am hinteren Abschnitt wurden unter Verwendung fünf verschiedener Enzympräparate durchgeführt. Bei einer Gruppe wurden zweigleisige Hemmversuche für S. griseus-Fraktionen IV und II unter Ver-

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wendung von Aprotinin bzw. ÄDTA durchgeführt. Nach dem Eingriff wurden die Tiere täglich durch Routineaugenuntersuchungen überwacht, und etwa 50 % der Augen wurden anatomisch seziert.

Die frühen Studien an Injektionen des hinteren Abschnitts stimmten darin überein, daß die Ergebnisse statistisch verteilt erschienen und alle drei aus dem S. griseus-Präparat isolierten Fraktionen sowohl positive als auch negative Ergebnisse ergaben. Das negative Ergebnis wird am besten durch die folgenden Beobachtungen gekennzeichnet. Innerhalb 24 h entwickelt das Auge eine verhältnismäßig tiefe Vorderkammer, verursacht durch eine Verlagerung (1-3 nun) der Linse nach hinten gegen den Glaskörper. Nach etwa 2 Tagen entwickeln sich im hinteren Augenabschnitt Trübungen. Nach 2 Tagen blieben die Augen ruhig, und es wurde keine weitere Entwicklung beobachtet. Beim Sezieren zeigte das Glaskörpergel verschiedene Grade der Abweichung und hatte in den extremsten Fällen seine gelartige Konsistenz vollständig verloren. Die Befestigung oder Aufhängung der Linse durch die Zonula, obgleich in den meisten Fällen verlängert oder gedehnt, schien intakt zu sein, wenngleich gelegentlich eine teilweise Subluxation erkennbar war. Die äußersten Reaktionen auf das oder die Enzym(e) waren stets von erheblicher Auflösung des Linsenmaterials innerhalb der Kapsel begleitet, und in den Fällen, in denen teilweise Erweichung des Linsenmaterials beobachtet wurde, hatte sich die Linsenform von einer ellipsoiden zu einer halbkugeligen Form verändert. Die Retina schien normal zu sein, selbst bei den am schwersten traumatisierten Augen. Bei den Fällen, in denen sich das Linsenmaterial erheblich verflüssigt hatte, wurde gelegentlich Fibrinbildung im hinteren Abschnitt beobachtet, eine Reaktion, die für eine längere Wechselwirkung zwischen Glaskörper und abgebautem Linsenmaterial charakteristisch ist. Weitere Ver-

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to

suchsreihen zeigten die Dosisabhängigkeit des Ausmaßes des Trauma, da niedrige Dosierungen von etwa 1/3 - 1/5 der normalerweise zur Verflüssigung der Linse verwendeten Dosierung keines der charakteristischen Traumasymptome hervorriefen, wie sie für normale bis hohe Enzymdosierungen beobachtet werden. Bei den Versuchen, bei denen eine pars pianer-Einführung des Enzyms in den hinteren Abschnitt erfolgte und bei denen anschließendes Sezieren zeigte, daß die hintere Linsenkapsel nicht angekerbt oder durchdrungen war, wurde das Auftreten einer tiefen Vorderkammer routinemäßig beobachtet. In den Fällen der pars pianer-Einführung entwickelten sich keine Trübungen des hinteren Abschnitts, und die Augen waren nach 2 Tagen ungewöhnlich ruhig und stabilisiert.

Folgende Hypothese wird angeboten: Der Glaskörper enthält ein tragendes Netzwerk biochemisch verschiedener Fasern. Wenigstens zwei Fasertypen sind unterschieden worden, basierend auf ihrer unterschiedlichen Empfänglichkeit gegenüber Abbau durch prοteolytische Enzyme. Hochmolekulare Hyaluronsäure-Protein-Komplexe sind aus der Glasflüssigkeit isoliert worden und scheinen eng mit den gelartig viskoelastischen Eigenschaften des Glaskörpers verknüpft zu sein. Im allgemeinen würde die Vielzahl der proteinartigen Komponenten, die im Glaskörper anzutreffen sind, fast garantieren, daß eine oder mehrere Komponenten für proteolytischen Abbau empfänglich ist oder sind, unabhängig von der Substratspezifität der gewählten Froteinase. Die Einflüsse des strukturmäßigen Abbaus und der nachfolgenden Verflüssigung der Glaskörpersubstanz scheinen ein beträchtliches Druckdifferential zwischen dem hinteren und dem vorderen Abschnitt zu erzeugen. Die am Ziliarepithel gebildete wässrige Flüssigkeit in den meisten vorderen Bereichen des hinteren Abschnitts würde abgebaute und teil-

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weise abgebaute Elemente des Glaskörpers durch das Zonulanetzwerk in die vordere Kammer führen. Das Druckdifferential könnte entweder mit osmotischen Unterschieden, teilweisem Verlust des fest tragenden Glaskörpers, Volumenänderungen des hinteren Abschnitts in Verbindung mit Strukturveränderungen im Glaskörper oder einer Kombination dieser Faktoren zusammenhängen. Die Linse, die die beiden Kammern trennt, würde sich nach hinten bewegen und damit auf das Druckdifferential zwischen dem vorderen und dem hinteren Augenabschnitt ansprechen. Die Folge dieser Bewegung der Linse wäre erhöhte Beanspruchung der Zonulaaufhängung und ihre damit verbundene Dehnung, begleitet durch eine Verformung der Linse. Sekundärreaktionen, die die erweich-· ten Linsenrand- und -kernregionen durch Auslaufen des Enzyms durch die Punktursteile in der hinteren Kapsel beeinflussen, sind eine Folge einer gut bekannten Wechselwirkung von Glaskörper- und Linsenproteinen. Die typischen Trübungen des hinteren Abschnitts, die durch Untersuchung des Auges von vorn beobachtet werden, sind tatsächlich trübe Bereiche der hinteren Linsenkapsel, die sich als Folge der Beanspruchung bilden, die über die Zonulaaufhängung übertragen wird, und sind mit der Rückwärtsbewegung der Linse verbunden. Charakteristische Merkmale der Entwicklung trüber Bereiche in der hinteren Linsenkapsel sind das Auftreten symmetrischer Bruch- und Spannungslinien in der Kapsel, die von der Punktursteile ausstrahlen. Dieses Phänomen wird nur in der hinteren Linsenkapsel und nicht in der vorderen Linsenkapsel beobachtet, die klar und intakt bleibt.

Eine direkte Injektion des verflüssigenden Enzyms in den hinteren Abschnitt des Auges sollte in der Praxis kein Problem sein, und ein Durchbruch des injizierten Enzyms durch die hintere Linsenkapsel wird leicht vermieden, indem das Enzym vor den Kern der Linse gebracht wird. Nichtsdestowe-

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niger sollte eine absolut sichere Methode zur Verhinderung der Polgen einer Berührung des hinteren Abschnitts mit dem bzw. den iSnzym(en) für den Chirurgen zur Verfügung stehen. Daher wurden Injektionen der 8. griseus-Fraktionen II und IV in Gegenwart eines selektiven Inhibitors für jedes Enzym in den hinteren Abschnitt durchgeführt. Der für die Fraktion II gewählte Inhibitor war ÄDTA. Das Enzym in einer Gleichgewichtssalzlösung mit 50 iaMol ÄDTA wurde direkt durch die Linse in den hinteren Abschnitt injiziert. Mn Kontrollversuch wurde durchgeführt, bei dem das Enzym aus der Gleichgewichtssalzlösung, die ÄDTA enthielt, weggelassen wurde. Doppelansätze für jeden Versuch zeigten kein postoperatives Augentrauina. Die charakteristische Entwicklung einer tiefen Vorderkammer und begleitende Trübungen im hinteren Abschnitt fehlten völlig, und die Augen waren von normalen Kontrollaugen nicht zu unterscheiden, die genadelt worden waren. Der für die Fraktion IV gewählte Inhibitor war Aprotinin, ein Proteinaseinhibitor mit einem Molekulargewicht von etwa 6000, isoliert aus Pancreas (geliefert von Novo Industri A/S). Das Enzym in einer Gleichgewichtssalzlösung mit 2,5 mg/ml Aprotinin wurde direkt durch die Linse in den hinteren Abschnitt injiziert. Die Ergebnisse für die Fraktion IV, wenn auch nicht so spektakulär, wie die mit Fraktion II erhaltenen, zeigten eine beträchtliche Herabsetzung der Traumacharakteristik, die zuvor durch dieses Enzym bei normalen Dosierungswerten beobachtet wurden. Die Augen stabilisierten sich nach etwa 36 h bei nur mäßiger Vertiefung der Vorderkammer. Eine sehr geringe Trübung konnte an der hinteren Linsenkapsel an der Punkturstelle beobachtet werden. Fibrinbildung wurde beim Sezieren des Auges nicht entdeckt. Ferner war der Glaskörper mäßig fest, und es war nur begrenzte Erweichung des hinteren Rindenbereichs der Linse eingetreten. Dieses Ergebnis zeigt, daß bei dieser Aprotininkonzentration unter den angewandten Versuchsbedingungen

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vollständige Inhibierung der Fraktion IV nicht erreicht worden war.

Das Mittel bzw. die Maßnahme, die für den Fall vorgeschlagen wird, daß zufällig andere Augenteile als die Linse dem oder den Enzym(en) ausgesetzt wird, ist eine Folgeinjektion eines für das Enzym spezifischen Inhibitors. Der Inhibitor kann bequemerweise in das Auge in der gleichen Weise, wie sie zum anfänglichen Einbringen des Enzyms angewandt wird, eingeführt und an Ort und Stelle gebracht werden.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht :

Beispiel 1

Enzymatisehe Verflüssigung harter, altersbedingter, vom Star befallener menschlicher Augenlinsen.

Frische, menschliche, vom Star befallene ganze Linsen, die am Versuchstag herausoperiert worden waren, wurden in Größe, Farbe und Härte zueinander passend ausgesucht. Die Linsenkapseln wurden entfernt, und jede Linse wurde in ein 2 ml-Volumen eines enzymhaltigen Inkubationspuffers gebracht. Der Puffer war eine sterile Gleichgewichtssalzlösung, pH 7,4 (0,01 m Kaliumphosphat, 0,49 % NaCl, 0,075 9ί KCl, 0,048 Si CaCl₂* 2H₂O, 0,030 % MgCl₂). Die verwendete Kontrollösung war einfach der Gleichgewichtssalzpuffer· Die Abbaulösungen enthielten die folgenden Mengen an 3 Proteasen, 1 Lipase und 1 Phospholipase, ausgedrückt als internationale Einheiten (IE) katalytischer Aktivität pro ml Inkubationspuffer; Subtilisin BPN' Protease - 250 IE/ml, S. griseus-Protease - 75 I3/ml, Elastase - 120 ΙΕ/ml, Pancreatinlipase - 20.000 ΙΕ/ml und

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Phospholipase von V. russelli venum - 75 ΓΕ/ml.

Substilisin BPN* mid S. griseus-Proteasen:

1 Einheit ist definiert als die Henge des Enzyms, die 1 uKol TCA-lösliches Tyrosin pro min (gemessen nach der Standard-Polin-Ciocalteau-Methode) unter Verwendung τοη Casein als Substrat erzeugt. Die experimentellen Bedingungen waren 0,6 Gew./ Vol.-Prozent Casein in 0,05 m KgHPO^/KHgPO^, pH 7,5 bei 37⁰C

Elastase;

1 Einheit ist definiert als die Menge des Enzyms, die 1 mg Elastin in 20 min (spektrophotometrisch gemessen) unter Verwendung von Elastin-Orcein als Substrat löst. Die experimentellen Bedingungen sind 12 mg/ml Elastin-Orcein in 0,2 m Tris/ SO₄, pH 8,8 bei 37°C

Lipase (Schweinepancreas):

1 Einheit ist definiert als die Menge des Enzyms, die ein pJSquiv. Fettsäure pro Stunde aus einem Triglycerid (gemessen nach der pH-Stat-Methode) unter Verwendung einer Olivenölemulsion als Substrat hydrolysiert. Die experimetellen Bedingungen sind 50 vol./vol.-prozentige Suspension Olivenöl in 3 m HaCl mit 15 mg/ml Taurocholat und 0,075 m CaCl₂, pH 8,0 bei 37⁰C

Phospholipase A (V. russelli);

1 Einheit ist definiert als die Menge des Enzyms, die 1 uMol L-c6-Phosphatidylchelin zu L-Z-Lysophos-

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phatidylcholin und einer Fettsäure pro min (spektrophotoraetrische Messung der Fe/Hydroxylamin-Farbreaktion mit den I^rodukten) unter Verwendung von Lecithin als Substrat hydrolysiert. Die experimentellen Bedingungen sind 2 mg/ml Lecithin in 0,05 m 2,4,6-Collidin mit 0,005 m CaCl₂, pH 6,5 bei 37⁰C

Die durch Inkubation der ganzen Linsen in diesem Abbaumedium erhaltenen Ergebnisse waren wie folgt: 24 h Inkubation verringerte den Durchmesser der Linsen, in einem abbauenden Gemisch inkubiert, um etwa die Hälfte (1/2). Nach 48 h betrug der Durchmesser der Linsen etwa 1/3 bis 1/4 der Größe der Kontroilinsen. Hach 72 h war der Durchmesser der Linsen in dem abbauenden Gemisch etwa 1/5 der Größe der Kontrollinsen. Die Kontrollinsen, im Grundsalzmedium inkubiert, zeigten keine Verringerung der Größe oder Veränderung im Aussehen. Eine Prüfung der Proteaseaktivität, die in der überstehenden Flüssigkeit des abbauenden Gemische nach 72 h verblieb, zeigte, daß die Proteaseaktivität durch Autolyse beträchtlich gesunken war und ohne weitere Aktivität hinsichtlich des Abbaus des Linsenmaterials war. Ähnliche bei 37⁰C durchgeführte Versuche zeigten in wesentlichen die gleiche Abbaukinetik, wenngleich die Selbstinaktivierung der Enzymaktivität, die mit der Autolyse verbunden ist, geringfügig schneller zu sein schien.

Beispiel 2

Verteilung von in intakte Linsen lebender Tiere und von Augen aus der menschlichen Augenbank injizierter Flüssigkeit.

3 lebende Kaninchen (6 Augen) und 4 frische menschliche Augen von der Augenbank wurden mit einem inerten Farbstoff

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(Dichlorindophenol) unter Verwendung einer Mikrokanüle und einer μΙ-Spritzeinrichtung unter optischer Beobachtung mit Hilfe eines Operationsmikroskops gespritzt. Der Injektion des Farbstoffs in den Mittelteil der Linse folgte eine Injektion einer winzigen Luftblase in die Bahn oder Öffnung, die von der Kanüle zurückgelassen wurde, als diese aus der Linse und aus dem Auge herausgezogen wurde. Diese winzige Luftblase diente als Dichtung der kleinen Punktursteile in der Linsenkapsel und zum Verhindern des Austretens des Farbstoffs aus der Linse. Direkte Beobachtung durch das Operationsmikroskop bei diesem Vorgang bestätigte, daß bis zu 20 ul Flüssigkeit im Linseninneren vollständig aufgenommen v/erden konnten ohne Austritt in die vordere oder die Glaskörperkammer und doch über die Kern-, Rand- und subcapsulären Bereiche der Linse gut verteilt wurden. Die Kaninchenaugen wurden dann nach dem Schlachten der Tiere entfernt. Die Kaninchenaugen und die Augen der menschlichen Augenbank wurden dann fixiert, seziert und histologisch zur Bestätigung der Ergebnisse untersucht. Ähnliche Injektionsversuche wurden unter Verwendung intakter Kataraktlinsen durchgeführt, die am Tage des Versuchs herausoperiert worden waren. Die Ergebnisse bei Verwendung dieser intakten Kataraktlinsen waren im wesentlichen identisch, sowohl bei visueller Untersuchung unter Vervrendung des Operationsmikroskops als auch bei histologischer Untersuchung.

Beispiel 3

Verflüssigung von Kataraktmaterial unter Verwendung intakter menschlicher Kataraktlinsen, abbauenden Enzymgemischs und eines Injektionssystems mit MkrokanÜle und μΙ-SOritze.

In intakte menschliche, am Versuchstag herausoperierte Kataraktlinsen wurde das abbauende Enzymgemisch des Beispiels 1

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(20 ul) injiziert. Das abbauende Enzymgemisch wurde in der Linse eingeschlossen und verteilte sich über den Kataraktteil der Linse in jedem Falle. Kontrollinsen wurden mit der Gleichgewichtssalzlösung ohne abbauende Enzyme gespritzt, Nach 72 h hatten die Kontrollinsen keinen Abbau erfahren; die mit dem abbauenden Enzymgemisch gespritzten Linsen jedoch zeigten beträchtlichen Abbau des Kern- und Randbereichs.

Beispiel 4

Untersuchungen in vivo.

Um das Ausmaß an Trauma, Entzündung und anderer nachteiliger Reaktionen, die sich aus der Einführung der Enzyme durch die vorstehend beschriebene Technik oder zufälliges Entv/eichen der Enzyme in die vordere Kammer ergeben könnten, zu bestimmen, erhielten 3 lebende Katzen (6 Augen) Injektionen des Enzymgemischs in die Linse mit absichtlichem Auslaufen des Enzymgemischs in die vordere Kammer. Ein Auge jeder Katze wurde mit 20 ul des Enzymgemischs und das andere mit 20 ul inerten Farbstoffs behandelt. Es wurde nicht steril gearbeitet; jedes Tier erhielt jedoch eine einzige große Dosis intramuskulär verabreichten Ampicillins unmittelbar nach dem Eingriff. Die Augen wurden eine Woche lang täglich untersucht. Eines der 6 Augen entwickelte rasch eitrige Endophtalmitis als Folge der unterlassenen sterilen Arbeitsweise. Es gab kein klinisches Anzeichen einer Entzündung oder Zerstörung von Strukturen außerhalb der Linse aufgrund der Anwesenheit der Enzyme bei allen übrigen 5 Augen. Nach dem Eingriff lag normaler Innenaugendruck vor.

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Claims

270806b Patentansprüche

1. Mittel zur enzymatischen Behandlung des Katarakts, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein in einem flüssigen Träger gelöstes, von außen zugeführtes, die linse abbauendes Enzym enthält.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Proteinase aus Streptomyces griseus enthält.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Enzym aus der Gruppe der Fraktionen II, IV und V einer Proteinase aus Streptomyces griseus enthält.

4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Proteinase, eine Lipase und eine Phospholipase enthält.

5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es mehrere Proteinasen enthält.

6. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 5» dadurch gekennzeichnet, daß es eine 0,1 - 10 gew./gev/.-prozentige wässrige Enzymlösung ist.

7. Mittel nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß es eine auf etwa pH 7,4 gepufferte Salzlösung ist.

8. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es außerdem einen Farbstoff enthält.

9. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung in lyophilisierter Form vorliegt.

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