DE2704767A1 - Protease- und elastase-toxoid aus pseudomonas aeruginosa, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur herstellung von antiserum und toxoid-impfstoffen gegen pseudomonas aeruginosa-infektionen - Google Patents

Protease- und elastase-toxoid aus pseudomonas aeruginosa, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur herstellung von antiserum und toxoid-impfstoffen gegen pseudomonas aeruginosa-infektionen

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DE2704767A1 DE19772704767 DE2704767A DE2704767A1 DE 2704767 A1 DE2704767 A1 DE 2704767A1 DE 19772704767 DE19772704767 DE 19772704767 DE 2704767 A DE2704767 A DE 2704767A DE 2704767 A1 DE2704767 A1 DE 2704767A1
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Description

u.Z.: M 055 Case: F 2843
SHIONOGI & CO., LTD. Osaka, Japan
" Protease- und Elastase-Toxoid aus Pseudomonas aeruginosa, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur Herstellung von Antiserum und Toxoid-Impfstoffen gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen "
Sowohl in der Humanmedizin als auch in der Veterinärmedizin ist Pseudomonas aeruginosa ein fakultativer Problemkeim Pseudomonas aeruginosa ist nur dann pathogen, wenn die Keime an Orte gelangen, an denen die normalen Abwehrmechanismen
20 nicht intakt sind oder die Immunität herabgesetzt ist, beispielsweise bei Neugeborenen, bei Patienten, die wegen Leukämie oder Lyphommen antineoplastische Stoffe oder Bestrahlung erhielten, ferner nach schweren Verbrennungen oder Behandlung mit Immunosuppressiva. In der Veterinärmedizin verursacht Pseudo-
monas aeruginosa in Form der hämorrahgisehen Pneumonie bei Nerzen und der Rindermastitis starke Schaden.
709833/0925
^ Seit kurzem wurden einige Antibiotika gegen Pseudomonas aeruginosa entwickelt, doch haben sie eine unzureichende Wirkung .
Es wurde festgestellt, daß Protease und Elastase, die von einigen Stämmen von Pseudomonas aeruginosa gebildet werden, die Toxine von Pseudomonas aeruginosa darstellen; vgl. K. Kawaharajo u. Mitarb., Japan. J. Exp. Med., Bd. 45, (1975), S. 79 bis 88, S. 89 bis 100 und S. 515 sowie Bd. 44 (1974), S. 435 bis 442.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Toxoide au3 Protease und Elastase von Pseudomonas aeruginosa zu schaffen, die sich zur Herstellung von Antiserum und Toxoid-Impfstoffen gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen eignen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Die Toxoide der Erfindung können allein oder in Kombination zur wirksamen Vorbeugung oder Therapie von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen verwendet werden. Ihre Wirkung ist besonders ausgeprägt, wenn sie zusammen mit dem Original-Endotoxin-Protein (OEP) verwendet werden, einem Antigen, das von J.Y. Homma u. Mitarb., Japan. J. Exp. Med., Bd. 45 (1975), S. 355 bis 360, Bd. 42 (1972), S. 23 bis 34, J.Y. Homma, Microbial Drug Resistance, Tokyo University Press, Tokyo (1975), S. 267 bis 279 und J. Y. Homma, The Fourth Inter-
L -»
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national Congre« of Animal, Plant and Microbial Toxins, Plenum Press, London, 1975, isoliert und beschrieben wurde. Die Toxoide können auch zur Herstellung von Antiseren und Antikörpern verwendet werden, die zur passiven Schutzimpfung und zur Therapie eingesetzt werden können.
Das Protease-Toxoid aus Pseudomonas aeruginosa hat folgende physikochemische Eigenschaften:
(1) Molekulargewicht, bestimmt durch Gelfiltration, 53 000; 10
(2) UV-Absorptionsspektrum: Maximum bei 280 ψ (E^ 9,27; 0,1 M KCl), Minimum bei 250 mu;
(3) isoelektrischer Punkt: pH 5,2 (Forcalelektrophorese);
(4) Aminosäurezusammensetzung (g/100 g Protein): Asparaginsäure 15,6; Glutaminsäure 9,5; Leucin 8,7;
15 Alanin 8,5; Glykokoll 7,7; Serin 7,6; Tyrosin 6,9;
Phenylalanin 5,9; Threonin 5,0; Valin 5,0; Lysin 4,1; Isoleucin 3,9; Arginin 2,3; Tryptophan 2,3; Prolin 2,1; Histidin 1,9; Ammoniak 1,4; Gesamtmenge 98,4 g;
(5) Aussehen: farbloses Pulver;
(6) Antigenaktivität: positiv;
(7) Proteaseaktivität: negativ.
Das Elastase-Toxoid aus Pseudomonas aeruginosa hat folgende physikochemische Eigenschaften:
(1) Molekulargewicht, bestimmt durch Gelfiltration, 47 000;
(2) UV-Absorptionsspektrum; Maximum bei 278 mu (E^ c, 21,2, 0,1 M KCl), Minimum bei 252 mu;
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(3) isoelektrischer Punkt: 6,5 (Elektrophorese mit Celluloseace tatmembran).
(4) Aminosäurezusammensetzung (g/100 g Protein):
Asparaginsäure 14,2; Tyrosin 9,9» Phenylalanin 7,0; Glutaminsäure 6,5; Arginin 6,5; Alanin 5,8; Glykokoll 5,6; Serin 5,6; Threonin 5,0; Valin 4,9; Leucin 4,3; Lysin 3,9; Methionin 2,9; Prolin 2,9; Isoleucin 2,7; Histidin 2,6; Tryptophan 2,3; Cystin/2 1,2; Ammoniak 0,9; Gesamtmenge 94,7 g.
(5) Aussehen: farbloses Pulver;
(6) Antigenaktivität: positiv;
(7) Elastaseaktivität: negativ.
Die neuen Toxoide werden in üblicher Weise hergestellt.
Protease oder Elastase aus Pseudomonas aeruginosa wird in einem Puffer bei einem pH-Wert von. 6 bis 10 gelöst, beispielsweise einem Borat-, Acetat-, Phosphat-, Glykokoll- oder Tris-Puffer. Vorzugsweise wird ein Puffer mit einem pH-Wert von 9 verwendet. Sodann wird die Lösung des Enzyms in dem Puffer mit Formaldehyd oder Oxymethansulfinsäure behandelt, bis das Enzym inaktiviert ist. Zur Inaktivierung der Protease wird 35 - 38prozentige wäßrige Formaldehydlö-
(Formalin)
sung/in einer Konzentration von 4 bis 10 Volumprozent und Oxymethansulfinsäure in einer Konzentration von 0,4 bis 3 M in Gegenwart von Lysin verwendet. Anstelle von Lysin können beispielsweise auch Arginin, Leucin, Tyrosin oder Glutaminsäure verwendet werden. Lysin ist besonders bevorzugt. Zur Inaktivierung der Elastase wird Formaldehyd bzw. wäßrige
L -J
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27ΠΑ767
^ Formaldehydlösung in einer Konzentration von 1 bis 6 Volumprozent und Oxymethansulfinsäure in einer Konzentration von 0,25 bis 5 M verwendet. Die Inaktivierung kann bei Temperaturen von 10 bis 400C, vorzugsweise bei Raumtemperatur, durch geführt werden. Die Behandlungszeit hängt u. a. von den Reaktionsbedingungen ab. Im allgemeinen beträgt sie 1 bis 7 Tage, vorzugsweise mindestens 3 Tage.
Die eingesetzte Protease und Elastase aus Pseudomonas aeruginosa wird in an sich bekannter V/eise hergestellt; vgl. JA-AS 27 315/1965. Die Eigenschaften der Protease und Elastase sind ebenfalls in dieser Druckschrift beschrieben.
Die Wirksamkeit der Toxoide der Erfindung, nachstehend kurz als Protease-Toxoid und Elastase-Toxoid bezeichnet, wird durch Immuntests an Kaninchen, Mäusen und Nerzen nachgewiesen.
Versuch 1
Antigenitätstest an Kaninchen
(1) Versuchsmethodik
(a) Protease-Toxoid:
Jeweils 1 mg Protease-Toxoid wird subcutan drei weißen Kaninchen (New Zealand) zusammen mit Freund'sehen unvoll-
ständigem Adjuvans subcutan injiziert. Nach 1 Woche wird
nochmals 1 mg Protease-Toxoid subcutan injiziert. Sodann wird in Abständen von zv^i Vbchen, zwei Wochen, drei Wochen und einer Woche 1 mg Protease-Toxoid intramuskulär injiziert. L -
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^ In bestimmten Zeitabständen wird Blut aus der Ohrvene entnommen. Das daraus erhaltene Serum wird auf 560C erwärmt und der passive Hämagglutinationstiter (PHA-Titer) nach der in Japan. J. Exp. Med., Bd. 45 (1975), S. 361 bis 365 beschriebenen Methode bestimmt. Es wird also die passive Hämagglutinationsreaktion mit Protease als Antigen durchgeführt .
(b) Elastase-Toxoid:
Auf die gleiche Weise wie in (a) beschrieben, werden weiße Kaninchen (New Zealand) mit Elastase-Toxoid geimpft. Die Impfung wird viermal in Abständen von 2 Wochen durchgeführt. Sodann wird mit Elastase als Antigen der passive Hämagglutinationstiter (PHA-Titer) mittels des passiven Hämagglutinationstesis bestimmt.
(2) Versuchsergebnisse (a) Protease-Toxoid:
Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt. 20
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Impfung Nr. Nr. 1 1. Tabelle I 3. — 4. 10 - T
Protease-Toxold Nr. 2 1 mg 2. 1 mg 1 mg 5. 1024
Verabreichung Nr. 3 S.C. 1 mg* i.m. i.m. 1 mg 256
Zeitraum "i- 2 Wochen S.C. ^2 Wochen Χ 3 Wochen i.m. 4096
PHA-Titer T Ί2 Wochen T T
Kaninchen O T 1024 1024
Anm.: *) Impfung mit O 512 256 256
O O 128 512 512
CD
OO 		128 J, 1 Woche
CO T
(O 1024
O Freund1schem Adjuvans. 256
CD
IS) 		unvollständigen 512
CJl
1 (b) Elastase-Toxoid:
Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
1 Tabelle • mg* II 3. 4. T
Impfung Nr. 1 .C. 2. 1 mg 1 mg 4096
Elastase-Toxoid S
I		 2 Wochen 1 mg* i.m. i.m. 2048
Verabreichung i S.C. ^2 Wochen 512
Zeitraum T Ψ2 V/och en T
PHA-Titer 0 T 512
Kaninchen Nr.1 0 64 0
Nr. 2 0 0 128 ^2 Wochen
Nr. 3 8 r
512
64
128
Anm.: *) Impfung mit Freund'schem unvollständigem Adjuvans.
Versuch 2
15 Antigenitätstest an Nerzen
(a) Protease-Toxoid
13 Nerzen werden intramuskulär jeweils 1000 y Protease-Toxoid mit Adjuvans (Kaliumalaun) intramuskulär injiziert. Die zweite Impfung wird etwa 2 Wochen später mit 500 y des Toxoids durchgeführt. Der PHA-Titer gegen Protease nahm von 1 : 64 auf 1 : 512 zu, vor der Impfung konnte ein PHA-Titer nicht gemessen v/erden.
(b) Elastase-Toxoid
20 Nerzen v/erden jeweils 500 y Elastase-Toxoid mit Kaliumalaun als Adjuvans intramuskulär injiziert. Etwa 2 Wochen, später werden 500 y des Toxoids mit Adjuvans injiziert. Nach 3 Wochen v/erden 1000 y des Toxoids mit Adjuvans inji-
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ziert. 18 Tage nach der letzten Impfung wird aus den Nerzen Blut entnommen. Der PHA-Titer gegen Elastase nimmt von 1:16 auf 1 : 60 zu. Vor der Impfung konnte ein PHA-Titer
nicht gemessen werden.
5
Versuch 3
Enzymneutralisationsaktivität von Serum aus Kaninchen, die mit den Toxoiden geimpft wurden.
(1) Versuchsmethodik
(a) Die Protease-Neutralisationsaktivität wird durch Bestimmung der Proteaseaktivität gemessen. Serum aus einem KaninT chen, das mit Protease-Toxoid geimpft wurde, sowie Kaninchen- Normal serum werden untersucht. Der PHA-Titer des Serums der geimpften Tiere beträgt 1 : 7860. Der PHA-Titer des Normal-
15 serums ist negativ gegen Protease, Elastase und OEP. Die
Seren werden 30 Minuten auf 560C erwärmt. Eine "bestimmte Menge an Protease wird in 1/15 M Phosphatpuffer vom pH 7,4 gelöst. 0,2 ml der erhaltenen Pro tea se lösung v/erden zu 0,2 ml des zu untersuchenden Serums gegeben. Sodann wird mit
20 physiologischer Kochsalzlösung auf 3,0 ml aufgefüllt. Das Gemisch wird 60 Minuten auf 370C erwärmt. Die restliche
Proteaseaktivität v/ird folgendermaßen bestimmt:
Die vorstehend erhaltene Lösung wird in gewünschter Konzentration mit 1 ml einer 2volumprozentigen Caseinlösung
versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 4O0C inkubiert.
Sodann wird die Reaktion durch Zusatz von 2 ml einer Lösung
abgebrochen, die 0,1 M an Trichloressigsäure, 0,2 M an Essig-L -J
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säure und 0,2 M an Natriumacetat ist. Das Gemisch wird 2 Stunden auf 400C erwärmt, um nicht umgesetztes Casein vollständig auszufällen, und sodann filtriert. Im Filtrat wird Tyrosin nach der Methode von Folin bestimmt. Zu diesem
^ Zweck werden 1 ml des Filtrats mit 5 ml einer 0,4 M Lösung von Natriumcarbonat und einer 20volumproζentigen Lösung einer Phenolreagenslösung einer Säurekonzentration von 1,8 η versetzt. Nach 15 bis 20 Minuten wird die Absorption des Gemisches bei 670 τψ. bestimmt. Die Menge des freien Tyrosins wird durch Vergleich mit dem Wert berechnet, der aus dem nicht-inkubierten Toxoid-Casein-Gemisch erhalten wird.
(b) Die Elastase-Neutralisationsaktivität wird durch Bestimmung der Elastaseaktivität gemessen. Es werden zwei Seren von Kaninchen, die mit Elastase-Toxoid geimpft wurden, sowie ein Kaninchen-Normalseru.il untersucht. Die PHA-Titer der Seren der geimpften Tiere betragen 2048 und 256. Der PHA-Titer des Normalserums ist gegen Protease, Elastase und OEP negativ. Die zu untersuchenden Seren werden 30 Minuten auf 560C erwärmt. 0,2 ml des Serums v/erden mit 0,2 ml Elastaselösung versetzt. Sodann wird die Lösung mit physiologischer Kochsalzlösung auf 2 ml aufgefüllt. Anschließend wird die Lösung 60 Minuten bei 370C stehengelassen. Die restliche Elastaseaktivität wird nach der vorstehend in (a) beschriebe-
2^ nen Methode gemessen.
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(2) Versuchsergebnisse
(a) Protease-Neutralisationsaktivität von Serum von Kaninchen, die mit Protease-Toxoid geimpft wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.
Tabelle III
Protease, Restliche Proteaseaktivität (Neutralisations- Normalserum ohne Serum
y/0,2 ml aktivitä t) (optische Dichte bei 670 m.i) 0,07 0,045
vacciniertes Serum *) 0,15 0,105
0 0,058 (7860) 0,21 0,17
10 0,062 (1920) 0,38 0,30
20 0,060 ( 240) 0,55 0,46
40 0,25 (O20) 0,70 0,76
80 0,46 (<120)
160 0,75 (<120)
Anm.: *) Die Zahlen in Klammern geben den PHA-Titer wieder.
(b) Elastase-Neutralisationsaktivität von Serum von Kaninchen, die mit Elastase-Toxoid geimpft wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.
Tabelle IV
Elastase,
γ/ο}2 mi
9,2-
36,8 73,6
147,2
Restliche Elastaseaktivitäf (Neutralisationsaktivltat) (optische Dichte bei 670 ΐημ)
vacciniertes Serum *) Ansatz 1 Ansatz 2
O105. (1920) oTo6 (24o) 0t05 ( 96Ο) 0,06 «120) O1Oo ( 480)
0r06 0,21
120)
0,08
lrl6
Normalserum
0f10 0,26 Or39 0,62 1 j Ok
1
1T48
,33
ohne Serum
Oyl6
0,32
0,50 0,87 1,24 lf45
Anra.: *) Die Zahlen in Klammern bedeuten den PHA-Titer.
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Versuch 4
Schutzwirkung eines OEP, Protease-Toxoid und Elastase-Toxoid enthaltenden Impfstoffes gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektion
(1) Versuchsmethodik
Die Schutzwirkung wird an Nerzen untersucht, die entweder durch einenlediglich OEP-enthaltenden Impfstoff oder einen OEP, Protease-Toxoid und Elastase-Toxoid enthaltenden Dreikomponenten-Impfstoff immunisiert worden sind. Als Versuchstiere dienen 5 bis 6 Monate alte weibliche Nerze (Sapphire). Der Impfstoff wird subcutan oder intramuskulär injiziert.
Belastungstest
Es wird der Stamm Nr. 5 von Pseudomonas aeruginosa verwendet, der sowohl Protease als auch Elastase erzeugt. 0,5 ml einer Bakteriensuspension wird den Tieren unter Äthernarkose intranasal gegeben.
Herstellung der Impfstoffe:
(a) Herstellung der Protease-Toxoid-Kaliumalaun-Lösung. 100 mg Protease-Toxoid v/erden in 24,8 ml einer phosphatgepufferten wäßrigen Kochsalzlösung (M/15, pH 7,4; PBS) gelöst. Die Lösung wird mit 2,5 ml einer lOprozentigen Kalium-
alaunlösung versetzt. Sodann wird die erhaltene Lösung mit
2,5 ml einer 20prozentigen Ma2HPO^.12H2O.-Lösung versetzt. Der pH-7/ert wird auf 6,5 eingestellt, um eine vollständige Ausfällung sicherzustellen. Schließlich werden 0,3 ml einer L -
709833/0925
Γ "·
1 Iprozentigen Lösung von Natriura-äthylmercurithiosalicylat als Antiseptikum zugegeben. Die Lösung enthält 1 mg Protease-Toxoid pro 0,3 ml.
(b) Herstellung der Elastase-Toxoid-Kaliumalaunlösung.
Die Herstellung erfolgt gemäß (a), jedoch unter Verwendung von Elastase-Toxoid.
(c) Herstellung der OEP-Kaliumalaunlösung.
Ό 100 mg OEP werden in 5 ml einer 0,01 η Natronlauge gelöst und mit 28 ml PBS versetzt. Die erhaltene Lösung wird sodann mit 3,3 ml einer lOprozentigen Kaliumalaunlösung, hierauf mit 3.3 ml einer 20prozentigen Na2HPO^-Losung und schließlich mit 0,4 ml einer Iprozentigen Lösung von Natriumäthylmercurithiosalicylat versetzt. Die Lösung enthält 1 mg OEP/0,4 ml.
(d) Herstellung des Dreikomponenten-Impfstoffes. Unmittelbar vor der Verwendung werden die erhaltenen Lösun-
!0 gen miteinander vermischt. In 0,5 ml des Impfstoffes sind 500 y Protease-Toxoid, 500 y Elastase-Toxoid und 500 y OEP enthalten.
Infektion (Belastung und Immunisierung):
Der Zeitpunkt der Immunisierung, die Dosis, der Zeitpunkt der Infektion und der Autopsie sind in Tabelle V angegeben.
709833/0925
IO
Tabelle V
O CD K>
Tier Antigen *) ZeitDunkt der Immunisierung 8/30 9/18 Zeitpunkt der
Belastung
10/7		 Zeitpunkt
der Autopsie
10/20
Gruppe A OEP 8/18 500 y 1000 y 19. Tag nach
der letzten
Immunisierung		 13. Tag nach
der Belastung
Gruppe B OEP +
Protease-
Toxoid
+
Elastase-
Toxoid		 500 y 500 y
500 y
500 y		 1000 y
1000 y
1000 y		 19. Tag nach
der letzten
Immuni s i erung		 13. Tag nach
der Belastung
500 y
1000 y
1000 y
Anm.: *) Die Impfstoffe für die Gruppe A und Gruppe B enthalten 1 % Kaliumalaun als Adjuvans.
Γ - 18 -
1 (2) Versuchsergebnisse
In Tabelle VI sind die Ergebnisse zusammengefaßt.
Tabelle VI
5 • Zahl der
Bakterien
zur" In
fektion		 Zahl 1 1 • • 1 tag
1		 der Nerze 1 2. 3 . Gruppe
tung
12 3		 B-
Über-
' leben		 9
2 χ 1O5 unbehandelt
Todes
12 4 7		 Gruppe A
nach der Belas
2 ο Uber-
. leben		 ,6 χ 10
6 x 1O5 1 2 3 2
10 2 x IO
6 χ 10 1 1 5
2 x 1O7 2
6 x 1O7 1 1. 10? h 1 5
15 2 χ 1O8
6 x 1O8 1 3 2 1 2
2 χ IC9 6*-
6 χ 1O9 2 k X 3 2
1^5O >i,9 χ ίο
3,
20 Anm.: *) A-B P<O,O1.
Aus den Versuchsergebnissen ist ersichtlich, daß die Schutzimpfung mit den Toxoiden der Erfindung zur Ausbildung eines
PHA-Titers und von neutralisierenden Antikörpern führt. Diese sind wirksam gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen,
insbesondere in Kombination mit OEP.
70983 3/0 925
Γ
Die Toxizität des Protease- und Elastase-Toxoids ist sehr gering. Nach intraperitonealer Injektion einer Dosis von 1 mg/Maus zeigen sich keine akuten Vergiftungserscheinungen. Die Dosis letalis minima von Protease-Toxoid beträgt 0,2 mg/ Maus (i.p.) und von Elastase-Toxoid 0,125 mg/Maus (i.p.).
Die Toxoide der Erfindung können Menschen und Tieren zur vorbeugenden Behandlung und zur Therapie von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen
allein oder in Kombination oder zusammen mit OEP gegeben werden. Die Impfung kann subcutan, intramuskulär oder intracutan und gegebenenfalls zusammen mit einem Adjuvans erfolgen. Die Toxoide können ferner zur Produktion von Antiserum gegen Protease oder Elastase von Pseudomonas aeruginosa verwendet werden. Die Antikörper werden aus dem Antiserum gewonnen. Das Antiserum oder die Antikörper können ebenfalls zur vorbeugenden Behandlung oder Therapie von Pseudomonas aeruginosa-Infektionen verwendet werden.
Toxoid-Impfstoffe für die Human- und Veterinärmedizin können in üblicher Weise aus den Toxoiden hergestellt werden. Zu diesem Zweck werden die Toxoide in einem Lösungsmittel und gegebenenfalls zusammen mit einem Adjuvans gelöst. Erforderlichenfalls können auch Antiseptika zugesetzt werden.
Beispiele für verwendbare Lösungsmittel sind destilliertes
Wasser, physiologische Kochsalzlösung und phosphatgepufferte v/äßrige Kochsalzlösung. Als Adjuvans können beispielsweise Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, Calciumphosphat, L -J
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1 Alaun oder Freund1sches unvollständiges Adjuvans verwendet werden. Die Menge des Adjuvans hängt unter anderem vom Ausmaß der Immunitätserhöhung ab. Beispiele für verwendbare Antiseptika sind Natrium-äthylmercurithiosalicylat,
Phenol, Benzoesäure und Formaldehyd.
Bei zv/ei- bis dreimaliger Schutzimpfung pro Woche ohne Adjuvans werden Menschen 1 bis 50 y/kg Protease-Toxoid, vorzugsweise zusammen mit 0,1 bis 10 y/kg OEP und 1 bis
10 50 y/kg Elastase-Toxoid gegeben. Entsprechend dem Imraunitätsgrad können die Mengen erhöht werden. Zur Schutzimpfung von Nerzen werden 10 bis 2000 y Elastase vorzugsweise zusammen mit 10 bis 2000 y OEP und 10 bis 2000 y Protease-Toxoid/Tier und einem Adjuvans gegeben. Zur Therapie von
Nerzen werden 10 bis 2000 y Protease-Toxoid zusammen mit 10 bis 2000 y Elastase-Toxoid und 0,1 bis 100 y OEP/Tier gegebenenfalls zusammen mit einem Adjuvans verabfolgt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung. 20
Beispiel 1
100 mg kristalline Protease aus Pseudomonas aeruginosa werden in 100 bis 200 ml einer 0,05 molaren Lösung von Natriumhydrogenphosphat (pH 8,5) gelöst, die 0,05 bis 0,2 M
25 an Lysin ist. Sodann wird die Lösung mit 35-38prozentiger wäßriger Formaldehydlösung (Formalin) versetzt, bis deren Konzentration etwa 1 bis 8 Volumprozent beträgt. Nach dreitägigem Stehen bei Raumtemperatur wird das Gemisch gegen Wasser dialysiert und sodann gefriergetrocknet.
L _l
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Es hinterbleibt das Protease-Toxoid. Die Ausbeute beträgt 98 bis 100 % d. Th..
Die restliche Proteaseaktivität wird nach der Methode (a) von Versuch 2 nach dreitägiger Dialyse bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII und VIII zusammengefaßt.
Tabelle VII
Formalin- restliche Proteaseaktivität,
konzentration, %
8 21
4 42
1 93
0 100
Anm.: Die Konzentration des Toxoids und Lysin beträgt 1 mg/ml bzw. 0,05 M.
Tabelle VIII
Lysin-
konzentration,
Molar		 restliche Proteaseaktivität,
0 88
0,05 21
0,1 9
0,2 <5
Vergleich * 100
Anm.: Die Konzentration des Toxoids und des Formalins
beträgt 1 mg/ml bzw. 8 Vol.-Ji. *) kein Zusatz von Formalin.
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r "I
1 Beispiel 2
Das Toxoid wird gemäß Beispiel 1 unter Verwendung von 0,5 M Oxymethansulfinsäure und in Gegenwart von 0,05 M Lysin hergestellt. Die restliche Proteaseaktivität beträgt
5 15 %.
Beispiel 3
Das Toxoid wird gemäß Beispiel 1 mit 2,5 M Oxymethansulfinsäure in Gegenwart von 0,05 M Lysin hergestellt. Die erhaltene Aktivität ist vollständig verschwunden.
Beispiel 4
Eine Lösung von stark gereinigter Elastase mit 10 bis 15 mg Enzymprotein/ml (50 mPE*/i mg Enzymprotein), 5 M Natriumchlorid, 10 mMol Natriumacetat, 2 mMol Calciumchlorid, 10 mMol Natriumacetat, 2 mMol Calciumchlorid und 0,1 InI4IoI Zinkchlorid wird mit Boratpuffer (pH 9,0) oder 0,2 M Natriumacetatlösung (pH 9|0) verdünnt, bis die Konzentration des
Enzymproteins 2 bis 5 mg/ml beträgt. Die Endkonzentration
35-38prozentiger 20 an Borat beträgt etwa 0,2 M. Die Lösung wird miV'wäßriger
(Formalin)
Formaldehydlösung/versetzt, bis die Endkonzentration einen Wert von 0,5 bis 4 Volumprozent hat. Sodann wird das Gemisch 3 bis 6 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach 24 Stunden ist die Elastaseaktivität nahezu vollständig verschwunden. Die inaktivierte Elastaselösung wird gegen V/asser dialysiert und sodann gefriergetrocknet. Es hinterbleibt das Elastase-Toxoid. Die Ausbeute beträgt etwa 60 bis 100 S» d.Th.
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Die restliche Elastaseaktivität wird gemäß Beispiel 1 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengefaßt.
Anm.: *) mPE = Milliproteaseeinheiten; 1 PE bedeutet, daß 1 mg Tyrosin innerhalb 1 Stunde durch Protease gebildet wird. 1 mPE ist 1/1000 von 1 PE.
Tabelle IX
Formalin
konzentration,
Vol.-55		 restliche Elastaseaktivität, % Natriumacetat
4
2
1
0,5		 Boratpuffer 21
45
£5
<5
S5
9
Anm.: Die Konzentration des Enzymproteins beträgt 2 mg/ml. Das Gemisch wird nach Zugabe der wäßrigen Fonnaldehydlösung 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen.
Beispiel 5 Elastase-Toxoid wird gemäß Beispiel 4 mit einer 0,2 M Natriumacetatlösung (pH 9,0) und mit Oxymethansulfinsäure anstelle von wäßriger Formaldehydlösung hergestellt. Die EIastaselösung wird nach der Zugabe der Oxymethansulfinsäure 3 bzw. 6 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird die restliche Elastaseaktivität gemäß Beispiel 4 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengefaßt.
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Tabelle X
Konzentration der
Oxymethansulfinsäure,
VoI. -Si		 restliche Eli
na<
3 TaKen		 ästaseaktivität
Dh
6 Tagen
3 10 <5
2 8 ^5
1 17 ^5
0,5 38 — 5
0,25 47 <5
0 100 100
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Claims (4)

  1. " Protease- und Elastase-Toxoid aus Pseudomonas aeruginosa, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur Herstellung von Antiserum und Toxoid-Impfstoffen gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen "
    Patentansprüche
    :i) Protease-Toxoid aus Pseudomonas aeruginosa, hergestellt durch Inaktivierung der Protease, und mit folgenden physiko~ chemischen Eigenschaften:
    (1) Molekulargewicht, bestimmt durch Gelfiltration, 63 000;
    28Ω
    (2) UV-Absorp ti ons spektrum: Maximum bei 280 mu (E1^ 9,27,
    0,1 M KCl), Minimum bei 250 mu;
    (3) isoelektrischer Punkt: pH 5,2 (Forcalelektrophorese);
    (4) Arainosäurezusaminensetzung (g/100 g Protein): Asparaginsäure 15,6; Glutaminsäure 9,5; Leucin 8,7; Alanin 8,5; GlykokolL 7,7; Serin 7,6.; Tyrosin 6,9; Phenylalanin 5,9; Threonin 5,0; Valin 5,0; Lysin 4,1;
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    ORIGINAL INSPECTED
    270A767
    Isoleucin 3,9; Arginin 2,3; Tryptophan 2,3; Prolin 2,1;. Histidin 1,9; Ammoniak 1,4; Gesamtmenge 98,4 g;
    (5) Aussehen: farbloses Pulver;
    (6) Antigenaktivität: positiv; 5 (7) Proteaseaktivität: negativ.
  2. 2. Elastase-Toxoid aus Pseudomonas aeruginosa, hergestellt durch Inaktivierung der Elastase, und mit folgenden physikochemischen Eigenschaften:
    (1) Molekulargewicht, bestimmt durch Gelfiltration, 47 000; (2) UV-Absorptionsspektrum: Maximum bei 278 mp (E^0 8J 21,2, 0,1 M KCl), Minimum bei 252 mu;
    (3) isoelektrischer Punkt: 6,5 (Elektrophorese mit Cellulose-
    acetatmembran);
    (4) Aminosäurenzusammensetzung (g/100 g Protein):
    15 Asparaginsäure 14,2; Tyrosin 9,9; Phenylalanin 7,0;
    Glutaminsäure 6,5; Arginin 6,5; Alanin 5,8; GlykokoIL 5,6; Serin 5,6; Threonin 5,0; Valin 4,9; Leucin 4,3; Lysin 3,9; Methionin 2,9; Prolin 2,9; Isoleucin 2,7; Histidin 2,6;
    Tryptophan 2,3; Cystin/2 1,2; Ammoniak 0,9; 20 Gesamtmenge 94,7 g.
    (5) Aussehen: farbloses Pulver;
    (6) Antigenaktivität: positiv;
    (7) Elastaseaktivität: negativ.
  3. 3. Verfahren zur Herstellung des Protease-Toxoids gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man aus Pseudomonas aeruginosa gewonnene Protease in gepufferter Lösung und in Gegenwart von Lysin mit Formaldehyd oder Oxymethansulfinsäure
    behandelt. j
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    - 3- 270A76?"1
  4. 4. Verfahren zur Herstellung des Elastase-Toxoids gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Elastase aus Pseudomonas aeruginosa in Pufferlösung mit Formaldehyd oder Oxymethansulfinsäure behandelt.
    5· Verwendung des Toxoids gemäß Anspruch 1 oder 2 zur Herstellung von Antiserum und Toxoid-Impfstoff gegen Pseudomonas aeruginosa-Infektionen.
    7098 3 3/0 925
DE19772704767 1976-02-05 1977-02-04 Protease- und elastase-toxoid aus pseudomonas aeruginosa, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur herstellung von antiserum und toxoid-impfstoffen gegen pseudomonas aeruginosa-infektionen Granted DE2704767A1 (de)

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