DE2704316A1 - Verfahren zur herstellung von 4-desacetoxy-vinblastin und dieses enthaltende pharmazeutische zubereitung - Google Patents

Description

Verfahren zur Herstellung von 4-Desycetoxy-vinblastin und dieses enthaltende pharmazeutische Zubereitung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von einem therapeutisch wirksamen Diindolalkaloid und seinen Saureadditionssalzen, sowie von diese Verbindungen als Wirkstoff enthaltenden Arzneimittelpräparaten. Das erwähnte Diindolalkaloid ist ein Nebenalkaloid der Pflanze Vinca rosea L., das 4-Desacetoxy-vinblastin; der Gegenstand der Erfindung ist also ein Verfahren zur Herstellung von 4-Desacetoxy-vinblastin und seinen Säureadditionssalzen,

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sowie von diese Verbindungen enthaltenden Arzneimittel-Präparaten.

Es ist bekannt, daß die .Nebenalkaloide wertvolle zitostatische Eigenschaften zeigen (vgl. US-PS 5 097 137 und 3 205 220; ungarische PS I53 200, 154 und 160 967). Diese wertvollen Nebenalkaloide bilden einen ziemlich, untergeordneten Teil des Gesamtalkaloidgehalts der Pflanze: das als wertvollste Bestandteil betrachtete Vincrdatin bildet nur einige hundertstel Prozente, die weniger wirksamen Vinblastin und Vinleurosin je etwa 1-2 % des Gesamtalkaloidgehalts.

Die Bedeutung der beiden letzterwähnten Nebenalkaloide, des Vinblastins und Vinleurosins ist in der letzten Zeit gestiegen, seit es bekannt wurde, daß das Vinblastin auf halbsynthetischen Weg in das wertvollere Vincristin (vgl. ungarische PS 165 599) und das Vinleurosin in das N-Formylderivat (ungarische PS 165 986) übergeführt werden kann, welches auch gegen solche Tumoren hemmend wirkt, welche mit den bisher bekannten zitostatischen Mitteln nicht beeinflußt werden konnten.

Die neueren Forschungen wurden einerseits auf die Herstellung von weiteren wirksamen halbsynthetischen Derivaten, z.B. von Carboxamid- und Desacetylderivaten (DOS 1 795 763 und 2 415 890) und andererseits auf die Isolierung von weiteren N_ebenalkaloiden, z.B. von Vincadiolin und Leurocolombin (US-PS 3 887 565 und 3 890 325) bzw. von 4-Desacetoxy-vinblastin (N. Neuss, A.J. Barnes und L.L. Huckstep: Experientia .3Vl, 18-19 /1975/) gerichtet.

Die Isolierung von weiteren Nebenalkaloiden wurde durch die neuere Entwicklung der chromatographischen Methoden, besonders durch die Anwendung der Hochdruck-

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Chromatographie ermöglicht. Diese Methode ermöglicht auch die Trennung von solchen Verbindungen mit sehr ähnlichen physikalischen Konstanten und chemischer Struktur.

Zur Zeit kann aber die Hochdruckchromatographie nur unter Laboratoriumsbedindungen ohne besonderen Schwierigkeiten angewendet werden, ihre betriebliche Anwendung ist noch außerordentlich schwierig.

N. Neuss und Mitarbeiter (Eperientia, 3i/i, 18-19 /1975/) haben bei der Reinigung von Vinblastin nach zweimaliger Chromatographie und zweimaligem Umkristallisieren ein bisher unbekanntes Begleitalkaloid des Vinblastins, das 4—Desacetoxy-vinblastin isoliert. Die ultravioletten und infraroten Spektra von Vinblastin und 4-Desacetoxy-vinblastin sind einander außerordentlich ähnlich und auch die Retentionsfaktoren der beiden Verbindungen sind nahezu gleich: die Differenz beträgt nur 0,03. In der zitierten. Mitteilung sind auch die Methode der Trennung der beiden Alkaloiden und auch die Schwierigkeiten der Strukturermittlung beschrieben; über die pharmakologischen und sonstigen Wirkungen des neuen Begleitalkaloids wird aber nichts mitgeteilt.

Es wurde nun gefunden, daß dieses 4-Desacetoxyvinblastin nicht nur eine dem Vinblastin etwa gleichkommende tumorhemmende Aktivität besitzt, sondern in überraschender Weise auch wesentliche pharmakologische Vorteile gegenüber Vinblastin und anderen bekannten tumorhemmend wirkenden Diindolalkaloiden zeigt, daß seine Toxizität wesentlich niedriger ist. Auf Grund dieser Eigenschaften können das in der Therapie bisher nicht verwendete 4-Desacetoxy-vinblastin und seine Säureadditionssalze sehr vorteilhaft als Wirkstoff von in der Therapie von malignanten Tumoren verwendbaren Arzneimittelpräparaten eingesetzt

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werden.

Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist also ein Arzneimittelpraparat tumorhemmender Wirkung, welches 4—Desacetoxy-vinblastin oder Säureadditionssalze davon als Wirkstoff enthält.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein neues, der bisher bekannten Methode überlegenes Verfahren zur Herstellung von 4—Desacetoxy-vinblastin, seinen Säureadditionssalzen, sowie von diese Verbindungen als Wirkstoffe enthaltenden Arzneiinittelpraparaten.

Die Forschungsarbeit, welche zu der vorliegenden Erfindung führte, hatte ursprünglich die Aufgabe, das 4—Desacetoxy-vinblastin durch eine auch unter betrieblichen Umständen einfach ausführbaren Methode, ohne Hochdruckchromatographie, unmittelbar aus dem Drog zu isolieren und auch die pharmakologischen Wirkungen dieser Verbindung aufzuklären. Als Ausgangsstoff wurde dabei ein angereichertes Gemisch der Sulfatsalze der Diindol-Nebenalkaloide verwendet, welches nach der in der ungarischen Patentschrift 160 967 beschriebenen Methode aus den Pflanzenteilen von Vinca rosea L. gewonnen wurde.

Zu der Aufarbeitung dieses Gemisches von Sulfatsalzen der Nebenalkaloide wurde eine in den letzten Jahren ausgearbeitete neuere Methode verwendet, nach welcher das erwähnte Gemisch der Alkaloidsalze zur Freisetzung der Alkaloidbasen mit einer organischen Base behandelt wird, wobei die Vinleurosin-Base aus dem Reaktionsgemisch gefällt und dann durch Filtrieren getrennt wird. Das FiItrat wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in einem organischen Lösungsmittel gelöst, wobei das Sulfat der zum Freisetzen der Alkaloidbasen zum Ausgangsgemisch zugesetzten or-

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Ganischen Base sich ausscheidet. Dieses Salz wird durch Filtrieren entfernt und das Filtrat mit einer wäßrigen Phosphat-Pufferlösung von pH 3,7 bis 4,3 extrahiert. Der saure wäßrige Extrakt wird mit Phosphorsäure auf pH 3»7 bis 4,1 eingestellt und dann mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff extrahiert; Aus der abgetrennten organischen Phase kann die Hauptmenge von Vinblastin gewonnen werden, während sich in der in obiger Weise extrahierten sauren wäßrigen Phase die verschiedenen Begleitalkaloide des Vinblastins anhäufen.

Es wurde nun gefunden, daß unter diesen so isolierten Begleitalkaloiden neben den schon bekannten Vincristin, N-Desmethyl-vinblastin und einer kleinen Menge von zurückgebliebenem Vinblastin auch das vierte Diindolalkaloid, das 4-Desacetoxy-vinblastin anwesend ist.

Es wurde ferner gefunden, daß die bisherigen Schwierigkeiten, welche mit der Trennung des 4-Desacetylvinblastins von dem sehr ähnliche Eigenschaften zeigenden Vinblastin verbunden waren, beseitigt werden können, wenn man das Alkaloidgemisch formyliert und so das schwer trennbare N-Desmethyl-vinblastin in Vincristin überführt; dann kann das nunmehr nur drei Komponenten enthaltende Alka-' loidgemisch mit einfachen Extraktionsmethoden, unter Anwendung der üblichen Säulechromatographie in die drei Komponenten zerlegt werden.

Bei der Untersuchung der pharmakologischen Eigenschaften von 4-Desacetoxy-vinblastin wurde festgestellt, daß die tumorhemmende Aktivität dieser Verbindung etwa ebenso groß wie diejenige des Vinblastins, aber ihre Toxizität wesentlich niedriger ist. Ein weiterer Vorteil des 4—Desacetoxy-vinblastins ist, daß die bei den Diindolalkaloiden ähnlicher Struktur, wie bei dem Vi_n-

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cristin und Vinblastin auftretende schädliche Nebenwirkung, die Lähmungserscheinungen verursachende Neurotoxizität bei dem 4-Desacetoxy-vinblastin überhaupt nicht auftritt.

Die pharmakologischen Eigenschaften von 4-Desacetoxy-vinblastin wurden an verschiedenen transplantierbaren Tumoren, an Mäusen und Ratten untersucht. So wurde die Wirkung dieser Verbindung gegen Vinca-sensitive und Vinca-refraktive L 1210 lymphoide Leukämie (L 1210/VS bzw. L 1210/Ref) an ¹¹BDF^" Mäusen, gegen Ehrlich¹ sches Ascites-Carcinom und S 37 Ascites-Sarcom an "Swiss" Mäusen und gegen Novikoffsches Hepatom an "Wistar" Ratten geprüft. Die erhaltenen ergebnisse sind in der nachstehen den Tabelle 1 zusammengefaßt.

Das 4-Desacetoxy-vinblastinsuifat wurde in physiologischer Salzlösung gelöst und diese Lösung intraperitoneal in den angegebenen Dosen den Tieren verabreicht. Es wurden die durchschnittliche Verlängerung der Lebensdauer und die tumorhemmende Wirkung ermittelt, im Vergleich mit den unbehandelten Kontroll-Tieren.

Die in der Tabelle angegebenen "Τ/c" Werte entsprechen dem Quotient durchschnittliche Lebensdauer der behandelten Tiere durchschnittliche Lebensdauer der Kontroll-Tiere

der in den letzten Spalten der Tabelle angegebene "Limit-Tag", an welchem die Zahl der noch überlebenden bzw. tumorfreien Tiere ermittelt wurde, entspricht im allgemeinen der vierfachen Lebensdauer der Kontroll-Tiere nach der Transplantierung des Tumors.

I I

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Tabelle 1 Wirkung von 4-Desacetoxy-vinblastinsulfat an mit Tumoren infizierten Mäusen bzw. Ratten

Tumor

Tägliche Dose i.p, mgAg

Verabreichung

Dauer Durchschnittliche der Be- Lebensdauer, handlung Tage nach der (Tage) Transplantation

behandelt kontroll

Am Limit-Tag

T/c.100

lebend

tumorfrei

L 120AS

0,9 1,8 2,0 4,0

- 4,0 4,0

5,0 6,0

täglich einmal

ti ti

zweitäglich

7
7

16
16
22
16
16
16

11,3
24,5
27,7
27,5
17,7
20,8
24,2

8,8

8,8

10,3

10,3

10,3

8,3

8,3

8,3

128
128
238
269
267
213
251
291

0/6 0/6 0/6 ^w/6 0/6 0/6 0/6 0/6

0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6

i-

L 120/Ref

2,0 4,0 4,0

täglich einmal

Il

zweitäglich

14

9,5
11,5
11,7

8,0 8,0 8,0

119

144
146

0/6 0/6 0/6

0/6 0/6 0/6

Erhlich'-s ehe s
Ascitescarcinom

täglich einmal

30

17,4

10/10

6/10

ro •»j ο

Tumor

Tägliche

Dose i.p

mg./kg.

Verabreichung

Dauer Durchschnittliche
der Be- Lebensdauer,
handlung Tage nach der
(Tage) Transplantation

behandelt kontroll

T/c.100

Am Limit-Tag

lebend

tumorfrei

S 37	2,	8	täglich einmal	8	68,	5	13,	2	376	6/8 ·	6/8
Ascites- -Sarcom	7	ti	8	67,	9	18,	2	373	7/10	7/10

to	Novikoff	o,	5	täglich	einmal	8	10,	3	. 8,2	126	0/6	0/6
OO CO	Hepatom	1,	O	Il		8	27,	7	8,2	338	1/6	1/6
CO		1,	5	Il		8	24,	7	7,8	317	2/6	0/6
O
967	NK/Ly ascites lymphom	2,	O	täglich	einmal	8	48,	1	14,4	334	0/10	0/10
		4,	O	Il		8	55,	O	14,4	382	6/10	0/10
		6,	O	Il		8	^7,	2	14,4	328	0/10	. 0/10

- of-

Aus den Daten der Tabelle 1 ist es'ersichtlich, daß die mit anderen Vincaalkaloiden nicht beeinflußbare L 1210/Ref Leukämie auch mit 4-Desacetoxy-vinblastin kaum beeinflußt werden kann. Demgegenüber kann bei den übrigen transplantierten Tumoren eine bedeutsame, von der Größe der Dosen abhängige Hemmwirkung festgestellt werden; die Hemmwirkung tritt bei dem iiovikoff'sehen Hepatom am stärksten hervor. Bei intraperitoneal verabreichten täglichen Dosen von 1 bis 10 mg/kg, vorteilhaft . 1 bis 6 mg/kg wurden bei Mäusen und Ratten SO bis 2SO %-ige Verlängerungen der Lebensdauer beobachtet.

Zu der Behandlung von Menschen kann besonders intravenöse Verabreichung oder Infusion, in täglichen Dosen von 0,1 bis O,S mg/kg anempfohlen werden.

Die Toxizitäts-Daten von 4—Desacetoxy-vinblastin sind im Vergleich mit ähnlich wirkenden verwandten Diindolalkaloiden .verhältnismäßig günstig, wie das aus den in der nachstehenden Tabelle 2 angegebenen LD,-Q-Werten (an Mäusen, i.p.) hervorgeht:

Tabelle 2

Verbindung ^LD50 ^mS^-S

4-Desacetoxy-vinblastin 23 Vinblastin 7,S

Vincristin 4,2

N-Formyl-leurosin 29,0

Der Gegenstand der Erfindung ist also ein neues Verfahren zur Herstellung von 4-Desacetoxy-vinblastin bzw. _m von seinen Säureadditionssalzen, sowie von diese Verbin-

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' 'indungen als Wirkstoffe enthaltenden Arzneimittelpräparaten, aus den angereicherten Gemischen von Säureadditionssalzen der Diindolalkaloiden von Vinca rosea, durch Freisetzen der Diindolalkaloid-Basen aus dem erwähnten Gemisch von ßäureadditionssalzen, Abtrennen des sich aus dem Gemisch der freigesetzten Diindolalkaloid-Basen ausscheidenden Leurosins, Eindampfen der bei der Abtrennung erhaltenen Mutterlauge, Lösen des Verdampfungsrückstandes in organischen LösungSÄitteln, Extrahieren der Lösung mit einem wäßrigen Phosphat-Pufferlösung von pH 3,7 bis 4,3, Extrahieren des abgetrennten wäßrig-sauren Extraktes mit chlorierten Kohlenwiisserstoffen und Abtrennen der die Hauptmenge von Vinblastin enthaltenden organischen Phase von der die übrigen Diindolalkaloiden enthaltenden wäßrigsauren Phase, dadurch gekennzeichnet, daß man die in obiger Weise erhaltene wäßrig-saure Phase auf einen pH-Wert von 7»5 bis ^t vorteilhaft etwa 9»O einstellt, die so erhaltene wäßrig-alkalische Lösung mit chlorierten Kohlenwasserstoffen extrahiert, die neben N-Desmethyl-vinblastin, Vincristin und wenig Vinblastin das gewünschte 4-DeS-acetoxy-vinblastin enthaltende organische Phase eindampft, den Verdampfungsrückstand in an sich bekannter Weise for-'myliert, den pH-Wert des formulierten Gemisches mit einer Base auf 7,5 bis 10, vorteilhaft 8,5 bis 9,0 einstellt!, die alkalisch-wäßrige Lösung mit eii em Kohlenwasserstoff der Benzolreihe oder einem chlorierten Kohlenwasserstoff extrahiert, den Extrakt eindampft und den das 4-Desacetoxyvinblastin neben Vinblastin und Vincristin enthaltender! Verdampfungsrückstand an partiell desaktiviertem Aluminiumoxyd chromatographiert und das isolierte 4-Desacetoxy- < vinglastin gewünschtenfalls in ein Säureadditionssalz Y überführt, und das erhaltene 4—Desacetoxy-vinblastin oder

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ein Säureadditionssalz davon mit pharmazeutischen Trägerstoffen und/oder Hilfstoffen vermischt und zu Injektionslösungen, Tabletten oder anderen therapeutisch anwendbaren Präparaten verarbeitet.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird zweckmäßig so ausgeführt, daß man das als Ausgangsstoff einzusetzende Gemisch der Saureadditionssalze vorteilhaft Sulfatsalze Diindolalkaloiden in einem organischen Lösungsmittel, vorteilhaft in Aceton oder in einem aliphatischen Alkohol mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen, besonders in Methanol löst; das Lösen wird bei Temperaturen zwischen 0 C und 50 C, zweckmäßig bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Lösung wird dann zum Freisetzen der Diindolalkaloid-Basen mit einer Base, z.B. mit Monoäthylamin, Diethylamin oder Pyridin versetzt, Die freigesetzte Leurosin-Base scheidet sich bei 0 C bis 25 C aus der Lösung aus. Die Ausscheidung von keurosin kann durch Kühlen des Gemisches um 0 ⁰C vervollständigt werden. Das ausgeschiedene Leurosin wird abilftriert, mit dem selben Lösungsmittel gewaschen, welches auch zum Lösen der Alkaloidsalze eingesetzt wurde und dann getrocknet. Das auf diese Weise isolierte rohe Leurosin kann gewünschtenfalls in an sich bekannter Weise, z.B. durch Umkristallisieren gereinigt und/oder in ein Säureadditionssalz, zweckmäßig in das Sulfatsalz übergeführt werden.

Die nach dem Abtrennen der Leurosin-Base erhaltene Mutterlauge wird dann unter vermindertem Druck einge_ dampft. Der Verdampfungsrückstand wird in einem organischen Lösungsmittel, zweckmäßig in einem Kohlenwasserstoff der Benzolreihe, z.B. in Benzol, Toluol oder Xylol, vorteilhaft in Benzol gelöst, wobei das Sulfat der zum Freisetzen der Diindolalkaloid-Basen eingesetzten organischen Base (Monoäthylam:n, Diethylamin oder Pyridin) aus

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der Lösung gefällt wird. Dieses Salz wird durch Filtrieren entfernt und das Filtrat mit einer wäßrigen Phosphat-Pufferlösung von pH = 3,7 - 4,3, vorteilhaft 4,0 _+0,1 extrahiert. Die vereinigten wäßrig-sauren Extrakte werden vereinigt und der pH-Wert des Extraktes mit einer Säure, vorteilhaft mit Phosphorsäure auf 3,5 - 4,1, vorteilhaft 4,0 jf 0,1 eingestellt. Die so erhaltene wäßrig-saure Lösung wird mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff, vorteilhaft mit Dichlormethan extrahiert, die vereinigten organischen Phasen werden über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Als Verdampfungsrückstand wird Vinblastin erhalten, welches gewünschtenfalls in ein Säureadditionssalz, zweckmäßig in das SuIfatsalz übergeführt werden kann.

Die nach dem Extrahieren mit dem chlorierten Kohlenwasserstoff zurückgebliebene wäßrige Phase wird mit einer Base, zweckmäßig mit Ammoniumchlorid auf pH = 7,5 - 10, vorteilhaft 8,5-9 eingestellt. Die so alkalisch gemachte Lösung wird dann mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, vorteilhaft mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff, z.B. mit Dichlormethan oder Chloroform extrahiert und dann werden die vereinigten organischen Phasen eingedampft. Der Verdampfungsruckstand, welcher Vincristin, N-Desmethyl-vinblastin, wenig Vinblastin und 4-Desacetoxy-vinblastin enthalt, wird dann einer Forinyli^rung unterworfen; als Formylierungsmittel wird zweckmäßig ein Gemisch von Ameisensäure und Essigsäureanhydrid verwendet. ^üo wird das im Gemisch anwesende N-Desmethyl-vinblastin quantitativ in Vincristin übergeführt. Nach der Beeindigung der Formylierungsreaktion wird das Reaktionsgemisch mit einer 5-15-fachen, zweckmäßig 10-fachen Menge von Wasser ver-

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dünnt und der pH-Wert der verdünnten Lösung auf 7,5 - 10» vorteilhaft 8,5-9 eingestellt.

Die alkalische Lösung wird mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, zweckmäßig mit einem Kohlenwasserstoff der Benzolreihe oder mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff, z.B. mit Benzol, Toluol, Xylol, bzw. mit Dichlormethan oder Chloroform, besonders aber mit Benzol extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden under vermindertem Druck eingedampft. Der Vincristin, Vinblastin und 4—Desacetoxy-vinblastin enthaltende Rückstand wird dann in einem organischen Lösungsmittel oder Lösungsmittelgemisch, zweckmäßig in einem Gemisch von einem Kohlenwasserstoff der Benzolreihe und einem chlorierten Kohlenwasserstoff, vorteilhaft in einem Gemisch von Benzol und Chloroform gelöst und die in der Lösung anwesenden Diindolalkaloid durch Chromatographie an Aluminiumoxyd, zweckmäßig an partiell desaktiviertem Aluminiumoxyd getrennt. Es wird zweckmäßig ein organisches Lösungsmittelgemisch, vorteilhaft Gemische von Benzol und Chloroform in stufenweise geändertem Mengenverhältnis als Eluent verwendet. Die erhaltenen Fraktionen können zweckmäßig durch Dünnschichtchromatographie identifiziert werden. Die dieselbe Alkaloid-Komponente enthaltenden Fraktionen werden vereinigt. Das Aufarbeiten der Vincristin und Vinblastin enthaltenden Fraktionen wird in bekannter Weise durchgeführt; die 4-Desacetoxy-vinblastin enthaltenden Fraktionen werden nach dem Vereinigen unter vermindertem Druck eingedampft und das als Rückstand erhaltene rohe 4-Desacetoxyvinblastin gewünschtenfalls durch Umkristallisieren gereinigt oder in ein Säureadditionssalz übergeführt.

Das erfindungsgemäß hergestellte 4-Desacetoxy-

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vinblastin bzw. seine Säureadditionssalze können in der Therapie oral oder zweckmäßiger parenteral, am vorteilhaftesten durch intravenöse Injektion verabreicht werden.

Zur parenteralen Verabreichung wird das 4-DeG-acetoxy-vinblastin in destilliertem Wasser oder in physiologischer Salzlösung und/oder gegebenenfalls in verschiedenen zur Herstellung von Injektionslösungen geeigneten organischen Lösungsmitteln, z.B. in niederen aliphati-

tl

sehen Alkoholen oder in Glykoläthern, z.B. in Athylenglykol-monomethylä-ther gelöst. Der Injektionslösung können gegebenenfalls auch Lösungsvermittler, z.B. Polyoxyäthylen- -sorbitan-derivate, wie Tween 20, Tween 60 oder Tween 80, ferner verschiedene Hilfsstoffe, wie Konservierungsmittel, z.B. Benzylalkohol, p-Hydroxy-benzoesäureester, usw., Antioxydanten, z.B. Ascorbinsäure, Natriumpyrosulfit, Tocopherol usw., .komplexbildende Stoffe, z.B. Athylendiamin-tetraacetate, Puffer, gegebenenfalls auch localanästhetische Mittel, z.B. Lidocain, sowie verschiedene Trägerstoffe, z.B. Milchzucker zugesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die nachstehenden Beispiele näher veranschaulicht; die Erfindung ist aber in keiner Weise auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel Λ

herstellung von rohem 4-Desacetoxy-vinblastin !?0 g rohes Diindolalkaloidsulfat-Gemisch werden in 3OO ml Methanol bei Raumtemperatur gelöst,· dann unter Rühren mit 13 ml Diäthylamin versetzt. Die erhaltene Lösung wird auf 0 ⁰C abgekühlt und eine Stunde bei dieser Temperatur gehalten, wobei das rohe Leurosin-Base sich kristallin abscheidet. Die Kristalle werden abfiltriert,

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mit wenig Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es werden auf diese weise 6,4- g rohe Leurosin-Base erhalten; dieses Produkt enthält etwa 90 bis 95 % des gesamten Leurosingehalts des als Ausgangsstoff eingesetzten Diindolalkaloidsulfat-Gemisches. Die so erhaltene rohe Leurosin-Base kann durch Umkristallisieren gereinigt und gewünschtenfalls in bekannter Weise in das Sulfat-Additionssalz übergeführt werden.

Das bei dem Abtrennen der rohen Leurosin-Base erhaltene Filtrat wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft und der Rückstand in 2500 ml Benzol gelöst. Während des Lösens scheidet sich das Sulfat des Diathylamins kristallin, ab. Die Kristalle werden abfiltriert, mit wenig Benzol gewaschen und zur Rückgewinnung des Diathylamins beiseite gelegt.

Das benzolische Filtrat wird dann dreimal mit je 25OO ml einer wäßrigen Phosphat-Pufferlösung von pH = 4-,O_-+ o,1 extrahiert. (Zur Herstellung dieser Phosphat-Pufferlösung wird aus wasserfreiem Natrium-dihydrogenphosphat eine 10 %-ige wäßrige Lösung hergestellt und der pH-Wert dieser Lösung wird mit N/1 Phosphorsäurelösung auf den obigen Wert eingestellt.) Die bei der Extraktion gewonnenen wäßrigen Phasen werden vereinigt, der pH-Wert der vereinigten wäßrigen Phase wird mit weiterer N/1 Phosphorsäurelösung wieder auf 4,0 +0,1 gestellt und dann wird diese wäßrige Lösung viermal mit je 2500 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Es werden auf diese Weise 25 g Yinblastin erhalten; dieses Produkt kann ohne weitere Reinigung, direkt zur halbsynthetischen Herstellung von

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Vincristin eingesetzt werden.

Die erhaltenen 25 g Viriblastin werden in 80 ml Methanol gelöst:und der pH-Wert dieser Lösung wird mit einer äthanolischer 0,3 Vol.%-iger Schwefelsäurelösung auf 5 gestellt. Während des Stehens kristallisiert das Vinblastinsulfat aus der Lösung.

Die in obiger Weise mit Dichlormethan extrahierte saure wäßrige Phase wird mit konzentriertem Ammoniak auf pH = 8,5 bis 9,0 eingestellt, dann viermal mit je 800 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformextrakte werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert. Das FiItrat wird bei vermindertem Druck eingedampft und das als Rückstand erhaltene amorphe Alkaloidgemisch (8 g) wird im Gemisch von 45 ml Ameisensäure und 11 ml Essigsäureanhydrid gelöst. Die Lösung wird bis 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann mit zehnfacher Menge von auf 5 C abgekühltem destilliertem Wasser verdünnt. Der pH-Wert der verdünnten Lösung wird mit konzentriertem Ammoniak auf 8,5 bis 9,0 gestellt und die so alkalisch gemachte Lösung wird viermal mit je 800 ml Benzol extrahiert, ^ie Benzolextrakte werden vereinigt und das als Rückstand erhaltene amorphe Alkaloidengemisch (6,9 g) wird in 42 ml 1:1 Benzol-Chloroform-Gemisch gelöst. Die in der Lösung anwesenden Alkaloide werden mittels Säulechromatographie von einander getrennt. Als Adsorbent wird Aluminiumoxyd (Aktivität IV-V, 345 g) in einem 9:1 Gemisch von Benzol und Chloroform suspendiert eingesetzt; diese Suspension wird in eine Säule mit 4 cm Durchmesser eingefüllt und die Lösung wird auf die Säule aufgetragen.

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Die an der Säule adsorbierten Alkaloide werden in der folgenden Weise elüiert: zuerst wird ein 9:1 Gemisch von Benzol und Chloroform eingesetzt und Fraktionen von je 100 ml werden gesammelt. Die einzelnen Fraktionen werden mittels DünnschichtChromatographie untersucht. (Adsorbent: Aluminiumoxydschicht auf Aluminiumfolie; Laufmittel: das Gemisch von 1OÖ ml Benzol, 50 ml Chloroform und 7_t5 ml Diethylamin. Die 4-Desacetoxy-vinblastin enthaltenden Fraktionen 5 bis 10 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Es wird auf diese Weise 1,7 g rohes 4-Desacetoxy-vinblastin erhalten.

Die Fraktionen 11 bis 36 werden mit einem 4:1 Gemisch von Benzol und Chloroform eluiert und die einzelnen Fraktionen nach der obigen dünnschichtchromatographischen Methode identifiziert.

Die Fraktionen 11 bis 19 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Es wird als Rückstand 0,6 g eines 1:1 Gemisches von Vinblastin und 4-Desacetoxy-vinblastin erhalten. Dieses Gemisch kann wieder durch Säulenchromatographie in seine Komponenten zerlegt werden: man löst den Rückstand in einem 9:1 Gemisch von Benzol und Chloroform und trägt die Lösung auf eine mit der oben beschriebenen Suspension von Aluminiumoxyd (Aktivität: IV-V) gefüllte Säule. In der oben beschriebenen Weise werden 0,18 g Vinblastin und 0,20 g 4-Desacetoxy-vinblastin erhalten.

Die Fraktionen 20 bis 24 werden ebenfalls vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rück-

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- 18 -

stand enthält 0,9 g Vinblastin.

Die Fraktionen 25 bis 36 enthalten eine geringe Menge (0,3 g) 4-Desacetoxy-vinblastin.

Des weiteren Fraktionen 36 bis 45 werden mit einem 1:1 Gemisch von Benzol und Chloroform eluiert. Durch eindampfen des vereinigten Eluats unter vermindertem Druck erhält man 1,7 S Vincristin.

Beis-piel 2

Die Reinigung von 4-Desacetox^-vinblastin

1,7 S rohes 4-Desacetox^-vinblastin (hergestellt nach Beispiel 1) werden in einem 3:2 Gemisch von Äthanol und Wasser (25 ml) gelöst. Die Lösung wird auf 5 °C abgekühlt und bei dieser Temperatur 16 Stunden stehen gelassen. Die alisgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit 3 bis 4 ml des obigen, ebenfalls auf 5 C abgekühlten Methanol-Wasser-Gemisches gewaschen und getrocknet. Es werden auf diese Weise 1,3 g Desacetoxy-vinblast.in erhalten: F. 190-193 °0; /öf7p° = +107 ° (c = 1, in Chloroform).

Analyse für 0_;;Η^Χ,Οη:

berechnet: C 70,19 H 7,50 N 7,44 0 14,87 %; gefunden: C 69,85 H 7,52 N 7,23 0 14,97 %.

Massenspektrum: das Massenspektrum von 4-Desacetoxy- -vinblastin wurde im Vergleich mit Vinblastin untersucht. Der Molekularionen-Spitzenwert ist bei der Desacetoxy- -Verbindung bei einer um 53 Masseneinheiten niedrigeren Massenzahl meßbar (m/e = 752), als bei Vinblastin (_m/e = 810). Die Differenz entspricht der Masse der Acetoxygruppe.

Beide Diindolalkaloide bestehen aus einem Velbamin-Teil und einem Vindolin-Teil. Da die für den Velbamin-Teil und für den Basen-Spitzenwert des Velbamin-Teils charakteristischen Massenzahlen auch im Massenspektrum von

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-M.

Desacetoxy-vinblastin auftreten (m/e = 355 bzw. m/e = 154), ist es anzunehmen, daß die erwähnte Acetoxygruppe von dem Vindolin-Teil fehlt. Auf (Jrund der Spaltungswege (m/e = 122, 135» 224) kann es angenehmen werden, daß diese Acetoxygruppe von dem 4-Kohlenstoffatom von Vinblastin fehlt.

Protonmagnetisches Kernresonanzspektrum: das Protonmagnet isehes Kernresonanzspektrum (PMKR) von 4-Desacetoxy-vinblastin wurde ebenfalls im Vergleich mit Vinblastin untersucht und es wurde gefunden, daß der bei Vinblastin bei /«= 2,09 ppm meßbare und für die 4-Acetoxygruppe charakteristische Spitzenwert bei 4-Desacetoxy-vinblastin nicht vorhanden ist.

Die im PMKR-Spektrum von 4-Desacetoxy-vinblastin meßbaren charakteristischen Spitzenwerte:

O = 2,73 ppm N-Methyl-protonen ^ - 3,60 ppm Carbomethoxy-protonen </ = 3,81 ppm aromatische -OCH, Protonen O= 3,85 ppm Carbonethoxy-protonen

Beispiel 3

4-Desacetoxy-vinblastin-sulfat

1,1 g rohes, nach Beispiel 1 hergestelltes 4-Desacetoxy-vinblastin werden bis pH » 4,5 mit äthanolischer 1,25 %-iger Schwefelsäurelösung versetzt und das Gemisch wird 2 Stunden bei 5 C stehen gelassen. Dann

werden die erhaltenen Kristalle abfiltriert und mit

ο "

2 bis 3 ml auf 5 O abgekühlten Äthanol gewaschen. Es werden in diese Weise 0,95 g rohes 4-Desacetoxy-vinblastiii sulfat erhalten. Dieses Produkt kann gewünschtenfalls in der folgenden Weise umkristallisiert werden.

0,95 g rohes 4-Desacetoxy-vinblastin-sulfat werden in 25 ml Methanol gelöst und die Lösung wird mit

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125 ml Aceton versetzt. Das Gemisch wird 2 Stunden bei 5 ⁰C stehen gelassen, dann werden die erhaltenen Kristalle abfiltriert, mit 2 bis 3 ml abgekühltem Aceton bei 5 C

gewaschen und getrocknet. Es werden 0,88 g gereinigtes

20 ο .^--Desacetoxy-vinblastin-sulfat erhalten; /*^7τ) = ^f29,O (c = 1, in Methanol).

Beispiel 4

Herstellung von Arzneimittelpräparaten

Es wird ein au« einer den Wirkstoff enthaltenden

Trockenampulle und einer Lösungsmittelampulle bestehendes

Injektionspräparat hergestellt.

a) In 500 ml physiologische Kochsalzlösung werden 5 g Benzylalkohol und 5 g Lactose gelöst, die Lösung wird durch Steril-Filtration sterilisiert und in Portionen von je 5 ml in Ampullen gefüllt.

b) Je 1 mg, 5 mg oder 7 mg 4-Desacetox;y-vinblastinsulfat werden in der Form von steriler Lösung unter sterilen Bedingungen in Ampullen abgefüllt und lyophilisi'srt.

Der Inhalt der lyophilisierten Trockenampulle wird von der Verabreichung in dem Inhalt der Lösungsmittelampulle gelöst.

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Claims (1)

1. PATENTANSPRÜCHE

   Verfahren zur Herstellung von 4-Desacetoxy- -vinblastin und von Säureadditionssalzen davon, sowie von diese . Verbindungen als Wirkstoffe enthaltenden Arzneimittelpräparaten, aus angereicherten Gemischen der S^ureadditionssalze der Diindol-^iNlebenalkaloide von Vinca rosea L., durch Freisetzen der Diindolalkaloid-Basen aus dem erwähnten Gemisch der Diindolalkaloid-Säureadditionssalze, Abtrennen des.sich aus der Lösung des Gemisches der freien Alkaloid-Basen abscheidenden Vinleurosins, Lösen des Verdampfungsrückstandes der bei dem Abtrennen des Vinleurosins erhaltenen Mutterlaugen in einem organischen Lösungsmittel, Extrahieren der erhaltenen organischen Lösung mit einer wäßrigen Phosphat-Pufferlösung von pH = 3,7 bis 4,3, Extrahieren des abgetrennten sauren wäßrigen Extrakts mit einem chlorierten Kohlenwasserstoff und Abtrennen der die Hauptmengen von Vinblastin enthaltenden organischen Phase von der die übrigen Diindolalkaloide enthaltenden wäßrigsauren Phase, dadurch gekennzeichnet , daß man die in obigetf Weise erhaltene wäßrig-saure Phase auf einen pH-Wert von 7,5 bis 10, vorteilhaft etwa 9 einstellt, die so erhaltene wäßrig-alkalische Lösung mit chlorierten Kohlenwasserstoffen extrahiert, die neben N-Desmethyl- -vinblastin, Vincristin und wenig Vinblastin das gewünschte 4—Desacetoxy-vinblastin enthaltende organische Phase eindampft, den Verdampf ungsriickstand in an sich bekannter Weise formyliert, den pH-Wert des formylierten Gemisches mit einer Base auf 7,5 bis 10, vorteilhaft 8,5 bis 9,0 einstellt, die alkalisch-wäßrige Lösung mit einem Kohlenwasserstoff der Benzolreihe oder einem chlorierten Kohlenwasserstoff extrahiert, den Extrakt eindampft und den das 4—Desacetoxy-vinblastin neben Vinblastin, Vincristin und

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   gegebenenfalls andere Bebenalkaloide enthaltenden VerdaapfungsrUekstand en partiell deealrtiriertcm Alunininnvoacyd chronetogrephiert» das isolierte 4-Deeacetoxy-Yin· blastin gewttnachtenfall β in ein Sgureaddltloneealz überfahrt» und das erhaltene ^-Desacetoxy-vinblaßtin oder ein SUureadditienesalz davon mit pharxnazeutiechen Trägeretof- c fen und/oder Hl If stoff en verinischt und zu Injektlonslö· eungen« Tabletten oder anderen therapeutisch anwendbaren Prfiparaten verarbeitet·

   2· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet ₉ daß man vor der Chromatographiechen Trennung des hauptsächlich ^-Desaceto^-vinblactin» Yiribl-stin und Vincrietin enthaltenden Verdampfungsrticlffltendee diesen BUcIostand itit einem FonsylierzüLtiel behandelt, und ao das im Gemisch ebenfalls anwesende Deßmethylvinblastin in Vincrietin überfahrt.

   3· Ein Arsneirdttelpränarat, dadurch gekenneeichnet, daß es 4-Desaceto:zy-vinblaetin oder ein physiologiBCh verträgliches Säureadditionssals davon als Wirkstoff» «usamaen mit nicht toxischen, pharmaceutieh anwendbaren Diluent en oder Trägeretoff en und/oder anderen phsrnaseutischen Hilfetoffen enthält*

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   ORIGINAL INSPECTED