DE2642395C2 - Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren, stabilen Lösung von Immunoglobulinen und organischem Eisen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren, stabilen Lösung von Immunoglobulinen und organischem Eisen zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Eisenmangelanämie und zur Erhöhung der Widerstandskraft gegen Infektionskrankheiten junger Säugetiere.

Bestimmte junge Säugetiere, insbesondere neugeborene Ferkel, die in einem geschlossenen Milieu leben, sind normalerweise durch zwei Hauptgefahren bedroht, nämlich die Eisenmangelanämie und die Infektionskrankheiten. Während der ersten Gefahr jetzt zufriedenstellend und systematisch durch vorzugsweise injizierbare Gaben

von Eisen vorgebeugt wird, ist dies bei der zweiten Gefahr nicht in demselben Maße der Fall, insbesondere bei J|'

der Colibacillose des jungen Ferkels. Der Grund hierfür sind die Schwierigkeiten der Chemoprophylaxe durch die mehr und mehr auftretende Resistenz der E. coli gegenüber Antibiotika und die im allgemeinen unzureichende Passage von Antiinfektionsmitteln in der Muttermilch, was wiederholte Einzelbehandlungen des Jungtieres v/ährend der ganzen gefährlichen Periode erfordert, wie die Immunoprophylaxe mit der Heterogenität der empfohlenen Verfahren. Die Injektion von Immunoglobulinen (Ig) bewirkt normalerweise eine Erhöhung der plasmatischen Gammaglobuline und damit eine Erhöhung der Widerstandsfähigkeit des Jungtieres während ungefähr drei Wochen. |

Im Falle des Ferkels begnügte man sich bis heute damit, Eisen zuzuführen, und behielt sich zusätzliche Behandlungen durch parenterale oder orale Anwendung geeigneter Produkte vor, und zwar bei Infektionsge-

fahren als vorbeugende Maßnahme und bei Auftreten einer Infektionskrankheit als therapeutische Behandlung. «

Die systematische Injektion bei einsm Jungtier statt der einzigen Injektion von Eisen, und zwar eines Präpara- i

tes, welches gleichzeitig eine Vorbeugung gegen Anämie und eine Erhöhung der Widerstandskraft gegen Infektionskrankheiten gewährleistet, würde daher eine Verbreiterung und Vereinfachung der Basisprophylaxe darstellen.

Zweck der Erfindung ist daher die Schaffung eines Herstellungsverfahrens für eine injizierbare, stabile Lösung, die eine organische Eisenverbindung in leicht resorbierbarer Form zusammen mit Immunoglobulinen enthält. Die Lösung muß stabil sein und ihre Bestandteile in einem geeigneten Verhältnis enthalten, so daß auf diese Weise die notwendige Dosierung in einer der Tierart angepaßten Menge vorhanden ist.

Es ist andererseits festgestellt worden, daß eine Kombination, welche Eisenextran und Immunoglobuline vereinigt, eine verzögerte Depotwirkung von 15 bis 20 Tagen aufweist Diese Eigenschaft gestaltet die Überbrückung der kritischen Zeitdauer der jungen Tiere mit einer einzigen Injektion. Die Herstellung einer derartigen stabilen Lösung erschien jedoch bis heute nicht möglich, "'eil bekanntlich die konzentrierten Lösungen von Schwermetallen die Immunoglobuline ausfällen und bzw. oder denaturiere:;. Bestimmte Salze von Schwermetaller] «jerden im übrigen auch verwendet zur Ausfällung und Abtrennung der Immunoglobuline und ihrer Fraktio- f

nen. §

Es wurde nun gefunden, daß man diesen Nachteil vermeidet, wenn man nach der Erfindung gemäß kennzeichnenden Teil von Patentanspruch 1 von einer Lösung mit 5 — 16% Säugetier-Immunoglobuünen ausgeht, in welche man langsam und unter Rühren eine Lösung mit einem Gehalt von 4—12% Eisen in Form von Eisendextran eingießt, worauf die beiden Ausgangslösungen auf einen pH-Wert von 6 gebracht werden.

Die durch diese Verfahrensweise erhaltene Lösung ist eine stabile Kombination eines Schwermetalies in Form von organischem Eisen und eine biologische Substanz in Form von Immunoglobulinen, die bis heute in den geforderten Konzentrationen nicht realisierbar erschien.

Um die Haltbarkeit der Lösung zu gewährleisten, ist es zweckmäßig, jeder der beiden Ausgangslösungen ein Konservierungsmittel zuzusetzen, wie 2,8—6%o Phenol oder 2—5%o Formol oder 0,1 — O,2°/oo Thimerosal. I

Wie praktische Versuche gezeigt haben, bewirkt die Verwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Lösung einen Hämoglobingehalt des Blutes, welcher wenigstens hinsichtlich des Eisengehaltes genauso hoch ist wie bei der Injektion eines Eisenpräparates allein, und der darüber hinaus länger wirksam zu sein scheint. Außerdem ist der Gehalt an kreisenden Immunoglobulinen einwandfrei erhöht.

• Die praktische Anwendung der Lösung erweist sich als sehr einfach, weil sie sowohl intramuskulär in den Schenkel als auch subkutan hinter dem Ohr des Jungtieres injiziert werden kann, ohne daß irgendwelche feststellbare Unterschiede in ihrer Resorption und über Verträglichkeit bestehen, die gut ist

Zur Prophylaxe oder Behandlung von anderen Mangelerscheinungen, denen die jungen Säugetiere ausgesetzt sind, kann es vorteilhaft sein, während der Herstellung der erfindungsgemäßen Lösung Vitamine der B-Gruppe zuzusetzen, indem beispielsweise der Eisendextran-Ausgangslösung ungefähr 7500 Gamma an Vitamin B12 auf 100 mi zugemischt werden.

In dem Eisendextran-Komplex ist das Eisen verhältnismäßig schwach gebunden, während seine Bindung mit dem Transfer™ und dem Lactoferrin, die eine größere Affinität für das Eisen besitzen, stärker ist Bei cbr Anwendung von Eisen allein Obernehmen diese letztgenannten Substanzen den Transport des Eisens im Organismus. Bei der Anwendung der erfindungsgemäß erhaltenen Lösung kann der Transport des Eisens im Organismus noch beschleunigt und intensiviert werden, wenn man in der Ausgangslösung der Immunoglobuline eine bestimmte Menge Lactoferrin und bzw. oder Transf errin darin gelassen oder zugesetzt hat

Eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer injizierbaren, stabilen Lösung von Immunoglobulinen und organischem Eisen zur Behandlung junger Ferkel ist folgende:

Man bereitet sich eine Immunoglobulin-Ausgangslösung mit 10 Gew.-°/o Gehalt von heterologen Rinder-Immunoglobulinen, bestehend aus den drei Klassen IgG, IgM und IgA und die die spezifischen Gammaglobulinantikörper für Serotypen von Escherichia coli pathog. des Ferkels enthalten, und zwar

O 149 K 91 (B) 88 (L); O 8 K 87 (B) 88 (L); O 147 K 89 (B) 88 (L); O (ZH 8325 K (ZH 832) (B) 88 (L); O 141 K 85 ab (B); O 141 K 85 ab (B) 88 (L);
O 141 K 85 ac (B): O 139 K 82 (B); O 138 K 81 (B).

Diese Immunoglobuline kommen aus einer Kombination von serischen Immunoglobulinen, gewonnen an Rindern, die mit den Antigenen der Serotypen von dem ausgewählten E. coli hyperimmunisiert sind, sowie von colostralen Immunoglobulinen von Rindern, die während der Tragzeit mit den gleichen Antigenen immunisiert sind.

Neben diesen Immunoglobulinen kann diese Lösung noch Transferrin und bzw. oder Lactoferrin enthalten.

Man bereitet ferner die zweite Ausgangslösung aus einer sterilen Lösung von Eisendextran, wie sie im Handel unter den Bezeichnungen FERRAN 100, FERROFAX, IMFERON und FERVATOL bekannt sind. Zu der ausgewählten Eisendextranlösung, die man auf ungefähr 10 Gew.-% an Eisen eingestellt hat, fügt man noch 7500 Gamma Vitamin tin pro 100 ml zu. Es ist vorteilhaft, hydrogeniertes Eisendextran anstelle von gewöhnlichem Eisendextran zu verwenden.

Man bringt hierauf diese Leiden Lösungen auf die normale Umgebungstemperatur von ungefähr 20°C und setzt noch ein Konservierungsmittel 'iinzu, beispielsweise O,4%o Phenol, sowie einen Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan- oder Phosphatpuffer oder andere pH-Modifikatoren, wie Salzsäure und Natronlauge.

Man mißt hierauf zwei Volumen der Immunogiobulinlösung ab und gießt unter sterilen Bedingungen langsam und unter leichtem Rühren und Überwachung des pH-Wertes ein Volumen der Eisendextran-Lösung ein. Es ist wichtig, das Eisen zu den Immunoglobulinen zu geben und nicht umgekehrt Erforderlichenfalls stellt man den pH-Wert in der Weise ein, daß dieser innerhalb eines Bereiches von 6—6,25 bleibt, was ebenfalls für den pH-Endwert der Lösung gilt

Die Endlösung, die man auf diese erfindungsgemäße V/eise erhält, enthält 6% Immunoglobuline und ungefähr 3,3% Eisen als Dextran, 2500 Gamma Vitamin Bi₂ pro 100 ml und letztlich 4%o Phenol.

Die Verfahren zur Dosierung der Immunoglobuline sowie des Eisens sind bekannt. Man wendet beispielsweise für die Immunoglobuline das quantitative Verfahren der radialen Immuno-Fällung nach der Technik von FAHY an und das Agglutinationsschnellverfahren für besondere Gehalte.

Die Bindung des Eisens an den Lactoferrinen und den Transferrinen kann durch Elektrophorese kontrolliert werden, durch die Braunfärbung des Eisens in der Gamma-Zone an der Grenze der Beta-Globuline.

Die praktische Anwendung der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Lösung besteht beispielsweise in der systematischen Injektion von 3 ml der Lösung .subkutan hinter dem Ohr oder intramuskulär in den Schenkel der Ferkel. Diese einzige Injektion findet in den ersten sieben Lebenstagen, vorzugsweise am vierten oder fünften Tag, statt.

In der nachfolgenden Tabelle sind die hierbei erzielten Wirkungen hinsichtlich der erhaltenen Hämoglobin(Hb)- und Hämatokrit(Hct)-Mittelwerte bei geimpften und nicht geimpften Ferkeln von verschiedenen Muttertieren während der ersten 20 Lebenstagen gegenübergestellt Dabei wurden etwa 30 Tiere in vier Gruppen A, B, C, D aufgeteilt, wovon die Gruppen A und B nochmals in zwei Halbgruppen Al, A2 und Bl, B2 geteilt wurden, wovon die Tiere der Halbgruppen Al und Bl mit der vorstehend beschriebenen Lösung geimpft wurden, während die Tiere der Halbgruppen A2 und B2 unbehandelt blieben. Die Tiere der Gruppen C und D erhielten zum Vergleich nur eine Injektion von 1 ml Eisendextran-Lösung mit 100 mg/ml Fe (FERAN 100).

Die Blutproben zur Bestimmung der Hb- und Hct-Mittelwerte wurden nach den jeweils angegebenen Tagen entnommen, wobei die Werte bei 5 Tagen vor der Injektion erhalfen ,wurden.

	26	42 395	8,46 6,4 5,14	Gruppe C 100 rag Fe	Gruppe D 100 mg Fe
Tabelle				8,89 12,78	8,89 12,17
Alter der Ferkel ϊπ Tagen	Hämoglobin (Hb) Gruppe A Al A2		31,66 20,75 17,83
5 Tage 12 Tage 13 Tage 20 Tage	12,20 12,92 e,73	Gruppe B Bl B2
	Hämatokrit(Hct)	8,46 11,18 12,43
5 Tage 12 Tage 20 Tage	37,4 23,66 36,33
31,66 33,50 34,75

Es zeigt sich hierbei iiichtnur, daß der Gehalt des Blutes an den betreffenden Blutbestandteilen erwartungsgemäß weit auseinander liegt, sondern daß die Werte in den Spalten Al und Bl der geimpften Tiere einen nahezu konstanten Gehalt der beiden Blutbestandteile nach 12 und 20 Tagen angeben, wie er etwa einer alleinigen 20 Eisen-Injektion nach 2 bis 3 Wochen entspricht, was die verzögerte Depotwirkung der erfindungsgemäß hergestellten Lösungen erkennen läßt.

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer injizierbaren, stabilen Lösung von Immunoglobulinen und organischem Eisen zur Vorbeugung gegen und Behandlung von Eisenmangelanämie und zur Erhöhung der Widerstandskraft gegen Infektionskrankheiten junger Säugetiere, dadurch gekennzeichnet, daß man von einer Lösung mit 5—16% Säugetier-Immunoglobulinen ausgeht, in welche man langsam und unter Rühren eine Lösung mit einem Gehalt, von 4—12% Eisen in Form von Eisendextran eingießt, worauf die beiden Ausgangslösungen auf einen pH-Wert von 6 gebracht werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes einen Tris-{hydroxymetLyl)—aminomethan-Puffer oder einen Phosphatpuffer zusetzt

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man jeder der beiden Lösungen als Konservierungsmittel 2,8—6%o Phenol oder 2—5%o Formal oder Thimerosal in einer Konzentration von 0,1— 0,2%o zusetzt

4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Immunogiobulinlösung verwendet, die Lactoferrinfraktionen lactischer oder kolostraler Herkunft und bzw. oder Transferrin serischer Herkunft enthält

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Herstellung eine Lösung von Vitaminen der B-Gruppe und bzw. oder Spuren von Zink, Kupfer und bzw. oder anderen Oligop-ilementen zusetzt