DE2626823C3

DE2626823C3 - Verfahren zur Herstellung einer vorgefertigten Wegwerf-Adsorptionssäule und ihre Verwendung für Radioimmunoassays

Info

Publication number: DE2626823C3
Application number: DE2626823A
Authority: DE
Inventors: Arlene Joan New York N.Y. Gimovsky (V.St.A.)
Original assignee: Union Carbide Corp
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 1975-06-16
Filing date: 1976-06-15
Publication date: 1979-10-11
Also published as: IN144963B; US4151254A; DK268576A; AU499185B2; NO762066L; SE7606787L; BE842983A; BR7603833A; GB1524454A; AU1386176A; AR230345A1; FR2314756B1; CH609459A5; IT1079182B; DE2626823A1; NZ181160A; SE420651B; NL7606464A; DE2626823B2; JPS5672269U

Description

Derzeit besteht eine wachsende Nachfrage nach automatisch und rasch arbeitenden Analysiergeräten, " welche beispielsweise für mikroanalytische Untersuchungen in der biochemischen Forschung, für klinische Routineteste, für enzymatisch^ Untersuchungen und Radioimmunoassays Verwendung finden können. Für cm rasches Arbeiten werden Analysengeräte mit ^b" mehreren Meßstellen bevorzugt, welche ein Zentrifug;ilfckl für die Mikroanalyse einer Vielzahl von Flüssigkeiten verwenden, beispielsweise von KörperfÜissigkciten, wie Blut und Serum.

In einigen solcher Meßvorrichtungen können Ad- ^h> sorptioiissäulcn verwendet werden, um die zu analysierc'id'.'ii Komponenten voneinander zu trennen, wobei irt'och beim Arbeiten mit einem Zcntrifugalfeld insofern Probleme auftreten, als die bettartige Füllung zur Rißbildung neigt oder infolge eines Verlustes von in den inneren Poren gebundenen Wassers in unerwünschter Weise komprimiert wird. Auch hat sich gezeigt, daß an die mechanische Stabilität der das Sorptionsmittel stützenden Rückhalteglieder besondere Anforderungen gestellt werden.

Da zahlreiche Analysenvorgänge gleichzeitig durchgeführt werden müssen, sollen derartige Adsorptionssäulen billig, gleichförmig in ihrem Verhalten und einfach in der Benutzung sein, so daß in der Praxis vorgefertigte Wegwerf-Adsorptionssäulen bevorzugt werden.

Der Erfindung liegt daher die technische Aufgabe zugrunde, derartige Wegwerf-Adsorptionssäulen herzustellen, welche sich insbesondere für die Durchführung von Radioimmunoassays eignen, in Analysiergeräten verwendbar sind, die mit Zentrifugalkräften arbeiten, bis zum endgültigen Gebrauch sicher gelagert werden können und ein gleichförmiges Gelsorptionsmittel enthalten, das sich im Gebrauch nicht verschlechtert.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die vorangestellten Patentansprüche gekennzeichnet.

Aus der DE-OS 21 32 686 ist eine Chromatographiesäule bekannt, welche sich wegen ihrer Länge von 80 cm aber offensichtlich nicht als vorgefertigte Wegwerfsäule eignet. Diese bekannte Säule weist einen zylindrischen Mittelteil auf, der an beiden Enden konisch verjüngt, wobei die konischen Teile jeweils in zylindrische Endstücke von geringerem Durchmesser übergehen. An beiden Enden befindet sich am Übergang vom konischen Teil zum zylindrischen Teil ein poröses Rückhalteglied für das in der Säule befindliche Sorptionsmittel. Da solche Chromatographiersäulen jedoch nicht in Zentrifugalfedern eingesetzt werden, braucht beim Herstellen der Säulen auch keine Rücksicht auf die vorstehend erwähnten Probleme der Rißbildung in der bettartigen Füllung bzw. der mechanischen Stabilität der Rückhaiteglieder genommen zu werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend anhand der Zeichnung näher erläutert, welche die zu füllende Adsorptionssäule im Längsschnitt zeigt.

Die Säule 10 kann aus irgendeinem beliebigen, sich inert verhaltenden Material hergestellt sein, beispielsweise aus Glas oder einem Kunststoff. Vorzugsweise wird hierfür Polystyrol verwendet, welches durchscheinend ist, ein leichtes Material darstellt und nicht leicht zu Bruch geht. Die Säule 10 hat eine Länge von etwa 10,16 cm und der Säulenkörper hat einen äußeren Durchmesser von etwa 10,186 mm. Diese Säule kann etwa 2,5 ml einer Flüssigkeit aufnehmen. Die Spitze 12 weist einen inneren Durchmesser von etwa 1,019 mm auf und der Kopfteil 14 hat einen äußeren Durchmesser von etwa 20,372 mm. Die beiden Enden der Säule 10 werden durch den Stopfen 16 für die Spitze 12 und den Stopfen 18 am Kopfteil 14 verschlossen. Die beiden scheibenförmigen Rückhalteglieder 20 und 22 bestehen aus Polyäthylen. Das Sorptionsmittel in Gelform 24 befindet sieh zwischen den beiden Rüekhaltegliedern 20, 22 im Mittelteil der Säule 10. Derartige nicht gefüllte Adsorptionssäulen sind im Handel erhältlich.

Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Wegwerf-Adsorptionssäulen sind mehrere Faktoren von ausschlaggebender Bedeutung, damit brauchbare Ergebnisse erhalten werden. Insbesondere wenn solche Adsorptionskolonnen in Analysiervorrichtungen verwendet werden sollen, die sich eines Zentrifugalfeldes

bedienen, ist es von Bedeutung, daß der Strömungswiderstand nur von dem Sorptionsmittel ausgeübt wird. Daher müssen die Rückhalteglieder am Kopf und am Boden der Säule die Flüssigkeit schneller hindurchlassen als dieses Sorptionsmittel. Die Porengröße des Rückhaitegliedes am Boden muß jedoch kleiner sein als die Teilchengröße des eingefüllten Sorptionsmittels. Die Teilchen des Sorptionsmittels dürfen unter der Einwirkung eines Zemrifugalfeldes nicht durch dieses Rückhalteglied hindurchgepreßt werden. Entsprechend muß die Porengröße des Rückhaltegliedes am Kopf der Säule klein genug sein, damit das Sorptionsmittel auch während der Lagerung oder während des Transportes zurückgehalten wird, selbst wenn dabei die Säule auf den Kopf gestellt wird.

Auch muß das für die Rückhalteglicder verwendete Material Zentrifugalkräften standhalten, welche etwa der 5fachen Erdbeschleunigung entsprechen, ohne daß eine Rißbildung auftritt oder daß sich diese Rückhalteglieder verbiegen. Für die Rückhalteglieder wird daher ein hochdichtes poröses Polyäthylen besonders bevorzugt. Damit das Polyäthylen einen Durchfluß gestattet, der größer ist als der Durchfluß durch das Sorptionsmittel, ist es erforderlich, daß es vor Verwendung in den erfindungsgemäßen Wegwerf-Adsorptionssäulen hydrophil gemacht wird.

Bevorzugt werden die Rückhalteglieder aus hochdichtem porösem Polyäthylen in einer Dicke von etwa 1,587 mm und mit einer Porosität bis zu 30 Mikron hergestellt, wobei das betreffende Material eine Durometer-Zugfestigkeit von etwa 80 bis 100 haben soll.

Im nachstehenden Beispiel 1 wird die Herstellung solcher Rückhalteglieder oder Rückhaltescheiben näher erläutert. Die Hydrophilierungsbehandlung kann vor oder nach dem Ausschneiden der Scheiben aus einer Polyäthylenfolie oder -platte durchgeführt werden. Als Oxidationsmittel wird Chromsäure bevorzugt, es können aber auch andere Oxidationsmittel verwendet werden, beispielsweise Salpetersäure, Perchlorsäure, Kaliumpermanganat oder Ozon. Auch kann eine thermische Oxidationsbehandlung durchgeführt werden, falls das für ein spezielles Material erwünscht ist. Vorzugsweise werden die Rückhalteglieder vor dem Kontaktieren mit dem Oxidationsmittel unter Vakuum zuerst mit Aceton und dann mit Wasf "S gewaschen.

Auch der Teilchengrößenbereich des Sorptionsmittels ist von entscheidender Bedeutung, damit ein schneller Durchfluß durch die Adsorptionssäule sichergestellt wird. Falls im Vergleich zur mittleren Teilchengröße sin Überschuß an Feinteilen in der Säule vorhanden ist, wird dis Durchflußgeschwindigkeit wesentlich herabgesetzt. Andererseits verlieren Säulen, die einen Überschuß an relativ zur mittleren Teilchengröße großen Teihhen aufweisen, infolge der dadurch verringerten Kapillarität sehr rasch das in den Poren vorhandene Wasser. Hierdurch wird die Rissebildung in der gepackten Säule begünstigt, wenn diese nicht vollständig in Wasser eingetaucht ist, d. h. während der Umdrehungsbewegung im Zentrifugalfeld. Daher soll der Teilchengrößenbereich klein genug sein, um die Ausbildung von gleichförmigen Adsorptionsbetten in den Säulen sicherzustellen. Ein zu breiter Teilchengrößenbereich führt häufig zu einer ungleichmäßigen Verteilung in der Säule und beeinträchtigt damit den Auftrenneffekt.

In der Praxis hat sich eezeigt, daß die Gelteilchen aus vernetzter<x-l,6-Polyglukose eine mittlere Teilchengröße von etwa 20 bis 80 Mikron aufweisen sollen, wobei nicht mehr als 10 Prozent der Teilchen außerhalb dieses Bereiches liegen sollen.

Es ist darauf zu achten, daß die wäßrige Gelaufschlämmung unter solchen Bedingungen hergestellt wird, daß dabei keine Unterteilung der Gelteilchen stattfindet. Ausführliche Versuche haben erwiesen, daß aus diesem Grunde die Verwendung eines Magnetrührers unzweckmäßig ist Es hat sich jedoch gezeigt, daß ein über Kopf angebrachter Rührer vorzuziehen ist und

to Gelsuspensionen von gleichförmiger Teilchengröße herzustellen gestattet.

Schließlich ist im Rahmen der Erfindung auch noch das Verhältnis von Sorptionsmittel zu Wasser von Bedeutung. Insbesondere spielt dieses Verhältnis eine Rolle zur Herstellung eines gleichförmigen Aufschlämmungsvolumens in jeder einzelnen Säule, wodurch dann eine gleichmäßige Trennwirkung derselben sichergestellt wird. In der Praxis werden befriedigende Ergebnisse mit einem Verhältnis von Wasser zu Gel im Bereich von etwa 1 : 1,5 bis 1,5 : I er: :'.-lt.

Die erfindungsgemäß herstellbaren Wegwerf-Ädsorptionssäulen eignen sich sehr gut zur Verwendung für Radioimmunoassays, insbesondere in Analysiervorrichtungen, welche die Zentrifugalkraft für das Verrnisehen, ^en Transport und das Trennen der Reaktionskomponenten und/oder der Reaktionsprodukte ausnutzen.

Die erfindungsgemäß hergestellten Adsorptionssäulen eignen sich vor allem zur Anwendung in einem

JO Analysator des Typs, wie er in der DE-OS 25 20 714 beschrieben ist. Es handelt sich dabei um ein Analysiergerät mit mehreren Meßs teilen, bei dem ein Zentrifugalfeld für das Vermischen, den Transport und die Trennung der Reaktionskomponenten und/oder der

Ji Reaktionsprodukte Verwendung findet. Dieser Analysator ermöglicht die Kontrolle der Teilvennischung von Komponenten, der Inkubationszeit sowie der gleichzeitigen Trennung und Konzentrationsmessung von Komponenten. Beispielsweise kann eine erfindungsge-

■"> maß hergestellte Wegwerf-Adsorptionssäule in einem solchen Analysator sehr bequem dazu dienen, um Radioimmunoassays an einer Vielzahl von Zusammensetzungen durchzuführen, beispielsweise an Körperflüssigkeiten, wie Blutserum. Beispielsweise können die in

^ den Beispielen 1 bis 3 der Erfindung näher eriäu;erten Adsorptionssäulen für eine Mikroanalyse von Digoxin. Trijodothyronon (T-3), Tretrajodothyronin (T-4), der Aufnahme der Substanz T-3, von Cortison und dergleichen, verwendet werden.

Vi Die Erfindung wird durch das nachstehende Beispiel näher erläutert.

Beispiel
a) Herstellung der Rückhalteglieder (ScrnibenforiTi)

Blattförmiges Polyäthylen mit einer Dicke von etwa 1,587 mm und einer Porosität von 25 ± 3 Mikron wird in Scheiben mit einem Außendurchmesser von etwa 7,615 bis 8,011 mm zerschnitten. Anschließend werden

wi die Scheiben unter Vakuum in einem Acelonbad behandelt und dadurch Fettspuren entfernt. Unmittelbar danach werden die Scheiben im Vakuum unter Verwendung von etwa 1 Liter Wasser je 500 Scheiben sorgfältig gespült. Die Scheiben werden dann in einem

^h5 Chromsäurebad hydrophil gemacht. Hierfür wira eine Chromsäurelösung verwendet, die aus 8 bis 10 g Kaliumdichromat, 35 bis 50 ml destilliertem oder entionisiertem Wasser und I Liter konzentrierter

Schwefelsätife erhalten worden ist. Man läßt die Scheiben so lange in dem Chromsäurebad, bis sie sich grün färben, d. h. etwa 5 bis 10 Minuten. Anschließend werden die Scheiben mit destilliertem Wasser abgewaschen, bis sie weit! oder cremefarbig geworden sind. el. h. etwa 5 bis 10 Minuten. Anschließend werden die Scheiben so lange gespült oder gewässert, bis der pll-Wert des Spülwassers und des zugeführten Frischwassers identisch ist. Der Lrfolg der Hydrophilierungsbehandlung der Scheiben läßt sich dadurch feststellen, daß man eine trockene Scheibe in eine leere Kunststoffsäulc einsetzt und dann die Säule mit Wasser füllt. Die Säule muß sofort zu tropfen beginnen, was anzeigt, daß die Rückhaltescheibe völlig hydrophil geworden ist. Die Scheiben werden anschließend in destilliertem oder entionisiertem Wasser aufbewahrt.

b) Herstellung der Gelaufschlämmung

aa) F.ine abgemessene Menge eines im Handel erhältlichen Gels aus vernetzter r\-l,6-Polyglukosc. üblicherweise etwa 40 bis 50 g, mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 Mikron wird in ein dickwandiges graduiertes Becherglas aus Pyrex-Glas eingefüllt. Anschließend setzt man destilliertes oder entionisiertes Wasser entsprechend der 6- bis Bfachen Gewichtsmenge des Ciels zu. Hierauf rührt man die Mischung, bis sich eine gleichförmige Aufschlämmung gebildet hat. Diese Mischung stellt man im Becherglas mindestens eine Stunde lang in ein Bad mit siedendem Wasser. Dann läßt man die Aufschlämmung abkühlen und regelt das Vokimenverhältnis von Flüssigkeitsspiegel zu Gelbett so ein. daß ein Endwert von etwa 1 : 0,8 erhalten wird. Schließlich setzt man je 1000 ml der Aufschlämmung noch 0.1 g eines bakteriostatischen Mittels hinzu, beispielsweise das Natriumsalz der 2-(Äthylmercurithio)benzoesäure.

bb) 40 bis 50 g des in Abschnitt aa) beschriebenen vernetzten Gels werden in ein dickwandiges graduiertes Becherglas aus Pyrex eingefüllt. Dann setzt man destilliertes oder entionisiertes Wasser entsprechend der 6- bis Sfachen Gewichtsmenge des Gels hinzu und rührt diese Mischung so lange, bis eine gleichförmige Aufschlämmung entstanden ist. Man läßt diese Mischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen. Anschließend regelt man das Volumenverhältnis von flüssigem Überstand zu Gelbett auf einen Kndwert von etwa I : 0,8 ein. Schließlich setzt man je 100 Volumenteile der Aufschlämmung 0,1 g des vorstehend erwähnten bakteriostatischen Mittels hinzu. Vor dem Gebrauch "> wiiil rlie Aufschlämmung entgast, um alle Luftblasen daraus zu entfernen.

c) Herstellung der Adsorptionssäulc

Säulen aus Polystyrol mit einem Außendurchmesser

in des zylindrischen Mittelteils von etwa 9,023 mm und einer Länge von etwa 10,274 cm, welche im Handel erhältlich sind, werden in eine Haltevorrichtung in einem Untersatz aufrecht angeordnet. |edc Säule wird zunächst mit destilliertem oder entionisiertem Wasser

ι '< sorgfältig gespült. Dann werden die gemäß Abschnitt a) hergestellten hydrophil gemachten Polyäthylenscheiben in ilen untersten Abschnitt des I !auptkörpers der Säule mit einem entsprechenden Werkzeug eingesetzt und mit destilliertem Wasser benetzt. Die gemäß Abschnitt

.«ι b), Ausführungsform aa) oder bb) hergestellten Gelaufschlämmungen werden mittels eines über Kopf angeordneten Rührers bei mäßiger Geschwindigkeit von 500 bis 750 Umdrehungen pro Minute gemischt, um so eine vollständig homogene Mischung /ti erhalten.

¹. leweils 5.0 ml der Aufschlämmung werden dann in jede der vorr-spülten Säulen eingefüllt. Man läßt die Gclteilehen absitzen, so daß das Gelbett noch etwa 1.587 mm über den Mittelteil der Säule hinausragt. Mindestens 1 bis 2 ml Wasser sollen sich oberhalb des

si Gclbcttes befinden, bevor die obere Rückhaltescheibe eingesetzt wird. Anschließend wird eine /weite, gemäß Abschnitt a) hergestellte Scheibe in den oberen Abschnitt des Hauptkörpers der Säule mittels eines entsprechenden Werkzeuges eingesetzt, wonach der

ι > Säulenteil oberhalb dieser oberen Scheibe sorgfältig mit Wasser gewaschen wird, um überschüssiges Gel zu entfernen. Anschließend setzt man 3.0 bis 4,0 ml eines Quellmittels für das Gel zu jeder Säule hinzu und läßt dieses Reagenz durch die Säule hindurchtropfen, bis auf

in der oberen Scheibe keine Flüssigkeit mehr zurückbleibt. Die Kolonnen werden dann in destilliertem Wasser gelagert, welches 0.01 Volumenprozent eines bakteriostatischen Mittels enthält, und zum Transport an die Verbrauchsstelle mit Verschlußgliedern versehen.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung einer vorgefertigten Wegwerf-Adsorptionssäule unter Verwendung einer an beiden Enden offenen zylindrischen Säule, deren Mittelteil einen praktisch gleichförmigen Durchmesser aufweist, deren Bodenteil sich zu einem Teil mit geringerem Durchmesser als der Mittelteil verjüngt und deren Kopfteil einen größeren Durchmesser als der Mittelteil aufweist, '° wobei ein erstes poröses hydrophiles Rückhaltegüed am Übergang des Mittelteils in den Bodenteil mit geringerem Durchmesser eingesetzt ist und ein entsprechendes zweites Rückhalteglied nach dem Füllen der Säule mit dem Sorptionsmittel dicht auf >⁵ dieses aufgelegt wird, dadurch gekennzeichnet, daß poröse Rückhalteglieder aus Polyäthylen verwendet werden, die durch Behandlung mit einem Oxidationsmittel hydrophil gemacht worden sind, und daß eine wäßrige Gelaufschlämmung von vernetzten! a-l,6-Polyglukose, deren Gelteilchen eine mittlere Teilchengröße von 20 bis 80 Mikron aufweisen, bei einem Verhältnis von Wasser zu Gel im Bereich von 1 : 1,5 bis 1,5 : 1 in den Mittelteil der Säule eingefüllt wird, worauf in die Säule das zweite poröse hydrophile Rückhalteglied oberhalb des Sorptionsmittels am Übergang vom Mittelteil in den Kopfteil mit größerem Durchmesser eingesetzt. Wasser am Säulenkopf eingefüllt wird und beide offenen Enden der Säule mit abnehmba- ^J(l ren Verschlußgliedern versehen werden.

2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückhalte.ijlieder aus Polyäthylen mit einer Porosität bis zu etwa 30 -Jikron bestehen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch ^J) gekennzeichnet, daß die Rückhalteglieder eine mit dem Durometer gemessene Zugfestigkeit von 80 bis 100 aufweisen.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mit Chromsäure hydrophilierte ⁴" Rückhalteglieder verwendet werden.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückhalteglieder vor dem Kontaktieren mit einem Oxidationsmittel unter Vakuum zuerst mit Aceton und dann mit Wasser ⁴"' gewaschen worden sind.

6. Verwendung der nach Anspruch 1 bis 5 hergestellten Säule für die Durchführung von Radioimmunoassays.