DE2626823B2 - Verfahren zur Herstellung einer vorgefertigten Wegwerf-Adsorptionssäule und ihre Verwendung für Radioimmunoassays - Google Patents
Verfahren zur Herstellung einer vorgefertigten Wegwerf-Adsorptionssäule und ihre Verwendung für RadioimmunoassaysInfo
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Description
Derzeit besteht eine wachsende Nachfrage nach automatisch und rasch arbeitenden Analysiergeräten,
welche beispielsweise für mikroanalytische Untersuchungen in der biochemischen Forschung, für klinische
.. utineteste, für enzymatische Untersuchungen und Radioimmunoassays Verwendung finden können. Für
ein rasches Arbeiten werden Analysengeräte mit b0
mehreren Meßstellen bevorzugt, welche ein Zentrifugalfeld für die Mikroanalyse einer Vielzahl von
Flüssigkeiten verwenden, beispielsweise von Körperflüssigkeiten, wie Blut und Serum.
In einigen solcher Meßvorrichtungen können Ad- b5
sorptionssäulen verwendet werden, um die zu analysierenden Komponenten voneinander zu trennen, wobei
jedoch beim Arbeiten mit einem Zentrifugalfeld insofern Probleme auftreten, als die bettartige Füllung
zur Rißbildung neigt oder infolge eines Verlustes von in den inneren Poren gebundenen Wassers in unerwünschter
Weise komprimiert wird. Auch hat sich gezeigt, daß an die mechanische Stabilität der das Sorptionsmittel
stützenden Rückhalteglieder besondere Anforderungen gestellt werden.
Da zahlreiche Analysenvorgänge gleichzeitig durchgeführt werden müssen, sollen derartige Adsorptionssäulen billig, gleichförmig in ihrem Verhalten und
einfach in der Benutzung sein, so daß in der Praxis vorgefertigte Wegwerf-Adsorptionssäulen bevorzugt
werden.
Der Erfindung liegt daher die technische Aufgabe zugrunde, derartige Wegwerf-Adsorptionssäulen herzustellen,
welche sich insbesondere für die Durchführung von Radioimmunoassays eignen, in Analysiergeräten
verwendbar sind, die mit Zentrifugalkräften arbeiten, bis zum endgültigen Gebrauch sicher gelagert werden
können und ein gleichförmiges Gelsorptionsmittel enthalten, das sich im Gebrauch nicht verschlechtert.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch die vorangestellten Patentansprüche gekennzeichnet.
Aus der DE-OS 21 32 686 ist eine Chromatographiesäule bekannt, welche sich wegen ihrer Länge von 80 cm
aber offensichtlich nicht als vorgefertigte Wegwerfsäule eignet Diese bekannte Säule weist einen zylindrischen
Mittelteil auf, der an beiden Enden konisch verjüngt, wobei die konischen Teile jeweils in zylindrische
Endstücke von geringerem Durchmesser übergehen. An beiden Enden befindet sich am Übergang vom
konischen Teil zum zylindrischen Teil ein poröses Rückhalteglied für das in der Säule befindliche
Sorptionsmittel. Da solche Chromatographiersäulen jedoch nicht in Zentrifugalfedern eingesetzt werden,
braucht beim Herstellen der Säulen auch keine Rücksicht auf die vorstehend erwähnten Probleme der
Rißbildung in der bettartigen Füllung bzw. der mechanischen Stabilität der Rückhalteglieder genommen
zu werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend anhand der Zeichnung näher erläutert, welche die zu
füllende Adsorptionssäule im Längsschnitt zeigt.
Die Säule 10 kann aus irgendeinem beliebigen, sich inert verhaltenden Material hergestellt sein, beispielsweise
aus Glas oder einem Kunststoff. Vorzugsweise wird hierfür Polystyrol verwendet, welches durchscheinend
ist, ein leichtes Material darstellt und nicht leicht zu Bruch geht. Die Säule 10 hat eine Länge von etwa
10,16 cm und der Säulenkörper hat einen äußeren Durchmesser von etwa 10,186 mm. Diese Säule kann
etwa 2,5 ml einer Flüssigkeit aufnehmen. Die Spitze 12 weist einen inneren Durchmesser von etwa 1,019 mm
auf und der Kopfteil 14 hat einen äußeren Durchmesser von etwa 20,372 mm. Die beiden Enden der Säule 10
werden durch den Stopfen 16 für die Spitze 12 und den Stopfen 18 am Kopfteil 14 verschlossen. Die beiden
scheibenförmigen Rückhalteglieder 20 und 22 bestehen aus Polyäthylen. Das Sorptionsmittel in Gelform 24
befindet sich zwischen den beiden Rückhaltegliedern 20, 22 im Mittelteil der Säule 10. Derartige nicht gefüllte
Adsorptionssäulen sind im Handel erhältlich.
Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Wegwerf-Adsorptionssäulen
sind mehrere Faktoren von ausschlaggebender Bedeutung, damit brauchbare Ergebnisse
erhalten werden. Insbesondere wenn solche Adsorptionskolonnen in Analysiervorrichtungen verwendet
werden sollen, die sich eines ZentrifuEalfeldes
bedienen, ist es von Bedeutung, daß der Strömungswiderstand nur von dem Sorptionsmittel ausgeübt wird.
Daher müssen die Rückhalteglieder am Kopf und am Boden der Säule die Flüssigkeit schneller hindurchlassen
als dieses Sorptionsmittel. Die PorengräBe des Rückhaitegliedes
am Boden muß jedoch kleiner sein als die Teilchengröße des eingefüllten Sorptionsmittels. Die
Teilchen des Sorptionsmittels dürfen unter der Einwirkung eines Zentrifugalfeldes nicht durch dieses Rückhalteglied
hindurchgepreßt werden. Entsprechend muß die Porengröße des Rückhaltegliedes am Kopf der Säule
klein genug sein, damit das Sorptionsmittel auch während der Lagerung oder während des Transportes
zurückgehalten wird, selbst wenn dabei die Säule auf den Kopf gestellt wird.
Auch muß das für die Rückhalteglieder verwendete Material Zentrifugalkräften standhalten, welche etwa
der 5fachen Erdbeschleunigung entsprechen, ohne daß eine Rißbildung auftritt oder daß sich diese Rückhalteglieder
verbiegen. Für die Rückhalteglieder wird daher ein hochdichtes poröses Polyäthylen besonders bevorzugt.
Damit das Polyäthylen einen Durchfluß gestattet, der größer ist als der Durchfluß durch das Sorptionsmittel,
ist es erforderlich, daß es vor Verwendung in den erfindungsgemäßen Wegwerf-Adsorptionssäulen hydrophil
gemacht wird.
Bevorzugt werden die Rückhalteglieder aus hochdichtem porösem Polyäthylen in einer Dicke von etwa
1,587 mm und mit einer Porosität bis zu 30 Mikron hergestellt, wobei das betreffende Material e:ne
Durometer-Zugfestigkeit von etwa 80 bis 100 haben soll.
Im nachstehenden Beispiel 1 wird die Herstellung solcher Rückhalteglieder oder Rückhaltescheiben näher
erläutert. Die Hydrophilierungsbehandlung kann vor oder nach dem Ausschneiden der Scheiben aus einer
Polyäthylenfolie oder -platte durchgeführt werden. Als Oxidationsmittel wird Chromsäure bevorzugt, es können
aber auch andere Oxidationsmittel verwendet werden, beispielsweise Salpetersäure, Perchlorsäure,
Kaliumpermanganat oder Ozon. Auch kann eine *o thermische Oxidationsbehandlung durchgeführt werden,
falls das für ein spezielles Material erwünscht ist. Vorzugsweise werden die Rückhalteglieder vor dem
Kontaktieren mit dem Oxidationsmittel unter Vakuum zuerst mit Aceton und dann mit Wasser gewaschen.
Auch der Teilchengrößenbereich des Sorptionsmittels ist von entscheidender Bedeutung, damit ein
schneller Durchfluß durch die Adsorptionssäule sichergestellt wird. Falls im Vergleich zur mittleren Teilchengröße
ein Überschuß an Feinteilen in der Säule vorhanden ist, wird die Durchflußgeschwindigkeit
wesentlich herabgesetzt. Andererseits verlieren Säulen, die einen Überschuß an relativ zur mittleren Teilchengröße
großen Teilchen aufweisen, infolge der dadurch verringerten Kapillarität sehr rasch das in den Poren
vorhandene Wasser. Hierdurch wird die Rissebildung in der gepackten Säule begünstigt, wenn diese nicht
vollständig in Wasser eingetaucht ist, d. h. während der Umdrehungsbewegung im Zentrifugalfeld. Daher soll
der Teilchengrößenbereich klein genug sein, um die w Ausbildung von gleichförmigen Adsorptionsbetten in
den Säulen sicherzustellen. Ein zu breiter Teilchengrößenbereich führt häufig zu einer ungleichmäßigen
Verteilung in der Säule und beeinträchtigt damit den Auftrenneffekt. b5
In der Praxis hat sich gezeigt, daß die Gelteilchen aus vernetzter *-l,6-Polyglukose eine mittlere Teilchengröße
von etwa 20 bis 80 Mikron aufweisen sollen, wobei nicht mehr als 10 Prozent der Teilchen außerhalb dieses
Bereiches liegen sollen.
Es ist darauf zu achten, daß die wäßrige Gelaufschlämroung
unter solchen Bedingungen hergestellt wird, daß dabei keine Unterteilung der Gelteilchen
stattfindet. Ausführliche Versuche haben erwiesen, daß aus diesem Grunde die Verwendung eines Magnetrührers
unzweckmäßig ist Es hat sich jedoch gezeigt, daß ein über Kopf angebrachter Rührer vorzuziehen ist und
Gelsuspensionen von gleichförmiger Teilchengröße herzustellen gestattet
Schließlich ist im Rahmen der Erfindung auch noch das Verhältnis von Sorptionsmittel zu Wasser von
Bedeutung. Insbesondere spielt dieses Verhältnis eine RoUe zur Herstellung eines gleichförmigen Aufschlämmungsvolumens
in jeder einzelnen Säule, wodurch dann eine gleichmäßige Trennwirkung derselben sichergestellt
wird. In der Praxis werden befriedigende Ergebnisse mit einem Verhältnis von Wasser zu Gel im
Bereich von etwa 1 : 1,5 bis 1,5 :1 erzielt.
Die erfindungsgemäß herstellbaren Wegwerf-Adsorptionssäulen eignen sich sehr gut zur Verwendung
für Radioimmunoassays, insbesondere in Analysiervorrichtungen, welche die Zentrifugalkraft für das Vermischen,
den Transport und das Trennen der Reaktionskomponenten und/oder der Reaktionsprodukte ausnutzen.
Die erfindungsgemäß hergestellten Adsorptionssäulen eignen sich vor allem zur Anwendung in einem
Analysator des Typs, wie er in der DE-OS 25 20 714 beschrieben ist. Es handelt sich dabei um ein
Analysiergerät mit mehreren Meßstellen, bei dem ein Zentrifugalfeld für das Vermischen, den Transport und
die Trennung der Reaktionskomponenten und/oder der Reaktionsprodukte Verwendung findet. Dieser Analysator
ermöglicht die Kontrolle der Teilvermischung von Komponenten, der Inkubationszeit sowie der gleichzeitigen
Trennung und Konzentrationsmessung von Komponenten. Beispielsweise kann eine erfindungsgemäß
hergestellte Wegwerf-Adsorptionssäule in einem solchen Analysator sehr bequem dazu dienen, um
Radioimmunoassays an einer Vielzahl von Zusammensetzungen duichzuführen, beispielsweise an Körperflüssigkeiten,
wie Blutserum. Beispielsweise können die in den Beispielen 1 bis 3 der Erfindung näher erläuterten
Adsorptionssäulen für eine Mikroanalyse von Digoxin. Trijodothyronon (T-3), Tretrajodothyronin (T-4), der
Aufnahme der Substanz T-3, von Cortison und dergleichen, verwendet werden.
Die Erfindung wird durch das nachstehende Beispiel näher erläutert.
Beispiel
a) Herstellung der Rückhalteglieder (Scheibenform)
a) Herstellung der Rückhalteglieder (Scheibenform)
Blattförmiges Polyäthylen mit einer Dicke von etwa 1,587 mm und einer Porosität von 25 ± 3 Mikron wird
in Scheiben mit einem Außendurchmesser von etwa 7,615 bis 8,011 mm zerschnitten. Anschließend werden
die Scheiben unter Vakuum in einem Acetonbad behandelt und dadurch Fettspuren entfernt. Unmittelbar
danach werden die Scheiben im Vakuum unter Verwendung von etwa 1 Liter Wasser je 500 Scheiben
sorgfältig gespült. Die Scheiben werden dann in einem Chromsäurebad hydrophil gemacht. Hierfür wird eine
Chromsäurelösung verwendet, die aus 8 bis 10 g Kaliumdichromat, 35 bis 50 ml destilliertem oder
entionisiertem Wasser und 1 Liter konzentrierter
Schwefelsäufe erhalten worden ist. Man läßt die Scheiben so lange in dem Chromsäurebad, bis sie sich
grün färben, d. h. etwa 5 bis 10 Minuten. Anschließend werden die Scheiben mit destilliertem Wasser abgewaschen,
bis sie weiß oder cremefarbig geworden sind, d. h. etwa 5 bis 10 Minuten. Anschließend werden die
Scheiben so lange gespült oder gewässert, bis der pH-Wert des Spülwassers und des zugeführten Frischwassers
identisch ist. Der Erfolg der Hydrophilierungsbehandlung der Scheiben läßt sich dadurch feststellen,
daß man eine trockene Scheibe in eine leere Kunststoffsäule einsetzt und dann die Säule mit Wasser
füllt. Die Säule muß sofort zu tropfen beginnen, was anzeigt, daß die Rückhaltescheibe völlig hydrophil
geworden ist. Die Scheiben werden anschließend in destilliertem oder entionisiertem Wasser aufbewahrt.
b) Herstellung der Gclaufschiämmung
aa) Eine abgemessene Menge eines im Handel erhältlichen Gels aus vernetzter a-l,6-Polyglukose,
üblicherweise etwa 40 bis 50 g, mit einer Teilchengröße von 20 bis 80 Mikron wird in ein dickwandiges
graduiertes Becherglas aus Pyrex-GIas eingefüllt. Anschließend setzt man destilliertes oder entionisiertes
Wasser entsprechend der 6- bis 8fachen Gewichtsmenge des Gels zu. Hierauf rührt man die Mischung, bis sich
eine gleichförmige Aufschlämmung gebildet hat. Diese Mischung stellt man im Becherglas mindestens eine
Stunde lang in ein Bad mit siedendem Wasser. Dann läßt man die Aufschlämmung abkühlen und regelt das
Volumenverhältnis von Flüssigkeitsspiegel zu Gelbett so ein, daß ein Endwert von etwa 1 :0,8 erhalten wird.
Schließlich setzt man je 1000 ml der Aufschlämmung noch 0,1 g eines bakteriostatischen Mittels hinzu,
beispielsweise das Natriumsalz der 2-(Äthylmercurithio)benzoesäure.
bb) 40 bis 50 g des in Abschnitt aa) beschriebenen vernetzten Gels werden in ein dickwandiges graduiertes
Becherglas aus Pyrex eingefüllt. Dann setzt man destilliertes oder entionisiertes Wasser entsprechend
der 6- bis 8fachen Gewichtsmenge des Gels hinzu und rührt diese Mischung so lange, bis eine gleichförmige
Aufschlämmung entstanden ist. Man läßt diese Mischung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen.
Anschließend regelt man das Volumenverhältnis von flüssigem Überstand zu Gelbett auf einen Endwert von
etwa 1 : 0,8 ein. Schließlich setzt man je 100 Volumenteile
der Aufschlämmung 0,1 g des vorstehend erwähnten bakteriostatischen Mittels hinzu. Vor dem Gebrauch
wird die Aufschlämmung entgast, um alle Luftblasen daraus zu entfernen.
c) Herstellung der Adsorptionssäule
Säulen aus Polystyrol mit einem Außendurchmesser
ίο des zylindrischen Mittelteils von etwa 9,023 mm und
einer Länge von etwa 10,274 cm, welche im Handel erhältlich sind, werden in eine Haltevorrichtung in
einem Untersatz aufrecht angeordnet. Jede Säule wird zunächst mit destilliertem oder entionisiertem Wasser
sorgfältig gespült. Dann werden die gemäß Abschnitt a) hergestellten hydrophil gemachten Polyäthylenscheiben
in den untersten Abschnitt des Hauptkörpers der Säule mit einem entsprechenden Werkzeug eingesetzt und
mit destilliertem Wasser benetzt. Die gemäß Abschnitt b), Ausführungsform aa) oder bb) hergestellten Gelaufschlämmungen
werden mittels eines über Kopf angeordneten Rührers bei mäßiger Geschwindigkeit von 500 bis 750 Umdrehungen pro Minute gemischt, um
so eine vollständig homogene Mischung zu erhalten.
2) Jeweils 5,0 ml der Aufschlämmung werden dann in jede
der vorgespülten Säulen eingefüllt. Man läßt die Gelteilchen absitzen, so daß das Gelbett noch etwa
1,587 mm über den Mittelteil der Säule hinausragt. Mindestens 1 bis 2 ml Wasser sollen sich oberhalb des
jo Gelbettes befinden, bevor die obere Rückhaltescheibe eingesetzt wird. Anschließend wird eine zweite, gemäß
Abschnitt a) hergestellte Scheibe in den oberen Abschnitt des Hauptkörpers der Säule mittels eines
entsprechenden Werkzeuges eingesetzt, wonach der
j5 Säulenteil oberhalb dieser oberen Scheibe sorgfältig mit
Wasser gewaschen wird, um überschüssiges Gel zu entfernen. Anschließend setzt man 3,0 bis 4,0 ml eines
Quellmittels für das Gel zu jeder Säule hinzu und läßt dieses Reagenz durch die Säule hindurchtropfen, bis auf
der oberen Scheibe keine Flüssigkeit mehr zurückbleibt. Die Kolonnen werden dann in destilliertem Wasser
gelagert, welches 0,01 Volumenprozent eines bakteriostatischen Mittels enthält, und zum Transport an die
Verbrauchsstelle mit Verschlußgliedern versehen.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen
Claims (6)
1. Verfahren zur Herstellung einer vorgefertigten Wegwerf-Adsorptionssäule unter Verwendung
einer an beiden Enden offenen zylindrischen Säule, deren Mittelteil einen praktisch gleichförmigen
Durchmesser aufweist, deren Bodenteil sich zu einem Teil mit geringerem Durchmesser als der
Mittelteil verjüngt und deren Kopfteil einen größeren Durchmesser als der Mittelteil aufweist, Ό
wobei ein erstes poröses hydrophiles Rückhalteglied am Übergang des Mittelteils in den Bodenteil mit
geringerem Durchmesser eingesetzt ist und ein entsprechendes zweites Rückhalteglied nach dem
Füllen der Säule mit dem Sorptionsmittel dicht auf dieses aufgelegt wird, dadurch gekennzeichnet,
daß poröse Rückhalteglieder aus Bolyäthylen verwendet werden, die durch Behandlung
mit einem Oxidationsmittel hydrophil gemacht worden sind, und daß eine wäßrige Gelaufschlämmung
von vernetztem «-1,6-Polyglukose, deren
Gelteilchen eine mittlere Teilchengröße von 20 bis 80 Mikron aufweisen, bei einem Verhältnis von
Wasser zu Gel im Bereich von 1 :1,5 bis 1,5 :1 in den
Mittelteil der Säule eingefüllt wird, worauf in die Säule das zweite poröse hydrophile Rückhalteglied
oberhalb des Sorptionsmittels am Übergang vom Mittelteil in den Kopfteil mit größerem Durchmesser
eingesetzt. Wasser am Säulenkopf eingefüllt wird und beide offenen Enden der Säule mit abnehmbaren
Verschlußgliedern versehen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Rückhalteglieder aus Polyäthylen
mit einer Porosität bis zu etwa 30 Mikron bestehen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch y>
gekennzeichnet, daß die Rückhalteglieder eine mit dem Durometer gemessene Zugfestigkeit von 80 bis
100 aufweisen.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß mit Chromsäure hydrophilierte
Rückhalteglieder verwendet werden.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gel'.ennzeichnet, daß die Rückhalteglieder vor dem
Kontaktieren mit einem Oxidationsmittel unter Vakuum zuerst mit Aceton und dann mit Wasser
gewaschen worden sind.
6. Verwendung der nach Anspruch 1 bis 5 hergestellten Säule für die Durchführung von
Radioimmunoassays.
50
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