DE3851725T2

DE3851725T2 - Diagnostisches System mit Anwendung eines einheitlichen Substrates für die Immobilisierung von Mikrosphären.

Info

Publication number: DE3851725T2
Application number: DE3851725T
Authority: DE
Inventors: Robert S Pierce; Michael W Smith
Original assignee: Porex Technologies Corp
Current assignee: Porex Technologies Corp
Priority date: 1987-07-17
Filing date: 1988-07-01
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2008-07-02
Also published as: EP0299299A3; DE3851725D1; JPH01112160A; CA1309343C; EP0299299B1; EP0299299A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein verbessertes diagnostisches Prüfsystem derjenigen Art, bei dem Mikrosphären oder andere kleine Partikel an oder in der Nähe der Oberfläche immobilisiert werden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Einige Immuntest-Systeme wurden durch immunologische Technologie entwickelt. In diesen Systemen wird die Anwesenheit eines Antigens in einer Testprobe dadurch festgestellt, daß das Antigen veranlaßt wird, sich an Antikörpern in einem ausgewählten Testmedium zu binden, und sodann wird die Anwesenheit des Antigens im Testmedium festgestellt. In einem kürzlich entwickelten System wurden der Testprozeß und die Zeit zur Durchführung des Testverfahrens wesentlich reduziert, so daß der Immuntest bequem in einer Arztpraxis oder von einem Patienten zu Hause durchgeführt werden kann.
Dieses System der bisherigen Technik, wie in Fig. 1 gezeigt und in der Beschreibung von z. B. WO-A-85/05451 dargestellt, weist einen Behälter 11 auf, der einen absorbierenden Zylinder 13 enthält, der als Reservoir dient. Oben an dem Reservoir liegt eine poröse Kunststoffscheibe 15, an der sich eine poröse Membran 17 befindet, die normalerweise durch ein poröses Kontaktpolster 19 von der porösen Membran 17 getrennt ist. Im Immuntest werden spezifische Antikörper für das zu detektierende Antigen an der Membran 17 abgelagert, indem zuerst die Antikörper gebunden werden oder die Antikörper an Mikrokügelchen aus einem synthetischen Harz, z. B. Polystyrol oder Latex, adsorbiert werden, und dann diese Mikrokügelchen in oder an der Membran abgelagert werden, indem Flüssigkeit, in der die Mikrokügelchen suspendiert sind, durch die Membran hindurchgeführt wird. Eine Testprobe, die auf die Anwesenheit des vermuteten Antigens getestet werden soll, wird auf die Membran 17 gegossen und durch Kapillarwirkung des Reservoirs 13 in Verbindung mit der porösen Kunststoffscheibe 15 und dem Kontaktpolster 19 relativ schnell durch die Membran 17 gezogen. Wenn sich das vermutete Antigen in der Testprobe befindet, bindet es sich an die Antikörper, die an oder in der Membran abgelagert sind. Nach diesem Schritt wird Flüssigkeit, die markierte Antikörper enthält, die spezifisch für das vermutete Antigen sind, auf die Membran gegossen und durch Kapillarwirkung durch die Membran hindurch in den Behälter 13 gezogen. Wenn das Antigen der Testprobe entzogen und in oder an der Membran zurückgehalten worden ist, werden die markierten Antikörper sich an das Antigen binden und bleiben dadurch in oder an der Membran 19. Dem Auftragen des markierten Antikörpers auf die Membran folgt normalerweise ein Spülschritt, um ungebundene markierte Antikörper zu entfernen. Diesem Spülvorgang folgt dann ein Vorgang, der die markierten Antikörper veranlaßt, in Erscheinung zu treten. Im Fall einer Enzymmarkierung wird dieser letzte Schritt durch Zugabe einer Lösung eines farbbildenden Wirkstoffs durchgeführt, der mit dem Enzym reagiert, wenn die Lösung es durchströmt. Da alle Flüssigkeiten durch die Membran hindurchgehen, werden sie vom Reservoir aufgenommen, und das Reservoir muß groß genug sein, um das gesamte Volumen der Testprobe, der markierten Antikörperlösung, der Spüllösung und der farbbildenden Lösung auf zunehmen.
Um eine genaue Anzeige der Anwesenheit oder Abwesenheit des Antigens zu erhalten, muß das System einen gleichmäßigen beständigen Fluß der verschiedenen Flüssigkeiten sicherstellen, die durch die Membran hindurchgehen. Um diesen gleichmäßigen Fluß zu erhalten, muß der Kontakt zwischen den verschiedenen Komponenten des Systems bestehen bleiben. Irgendwelche Lücken oder Zwischenräume zwischen zwei beliebigen Komponenten erzeugen Pools aus stagnierender Flüssigkeit und interferieren mit der Kapillarwirkung, die die Flüssigkeit in das Reservoir zieht. Diese Interferenz führt zu fehlerhaften oder ungenauen Testergebnissen. Daher muß beim Zusammenbau der Komponenten des Systems sehr sorgfältig vorgegangen werden, damit zwischen den Komponenten keine Partikel eingeschlossen werden, die dort Zwischenräume erzeugen würden. Das Material der Membran ist nur in Form von relativ großen flachen Blättern erhältlich, und diese müssen für den Einsatz im System in Scheiben geschnitten werden. Der Zusammenbau der Komponenten ist schwierig, da sowohl die Membran als auch das Kontaktpolster dünn ist, und normalerweise ist der manuelle Zusammenbau erforderlich.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Das System der vorliegenden Erfindung ist so gestaltet, daß es die oben beschriebenen Probleme in dem System gemäß der bisherigen Technik überwindet. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung ist ein einstückiges poröses Substrat im Behälter vorgesehen und dient der Extraktion des Zielsubstrats in oder an seiner oberen Schicht, wobei der Rest der Porenstruktur des Substrats als Reservoir dient. Die Poren in der Oberfläche des porösen Substrat s sind mikroskopisch zum Einschließen makroskopischer Partikel, z. B. Mikrosphären. Die Poren in allen Schichten außer der dünnen oberen Schicht des Substrats haben eine viel größere Porengröße. Dieser Teil des Substrats mit den größeren Poren dient als Reservoir für die Flüssigkeiten, die durch die oberste Schicht laufen sollen.
Da das Reservoir und die Schicht, in oder an der die Mikrosphären eingeschlossen werden, aus einem Stück bestehen, werden die Probleme beim Zusammenbau und die möglichen Lücken oder Zwischenräume zwischen den Komponenten des Systems der bisherigen Technik vermieden.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

Fig. 1 ist eine Schnittansicht, die das Immuntestgerät der bisherigen Technik darstellt;
Fig. 2 ist eine Schnittansicht, die das Diagnosegerät gemäß der vorliegenden Erfindung darstellt;
Fig. 3 und 4 sind Schnittansichten einer Form, die aufeinander folgende Schritte in einer Methode der Herstellung eines porösen Substrats darstellen, das in dem Gerät der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll;
Fig. 5 stellt ein poröses Form- oder Paßteil dar, das nach den in Fig. 3 und 4 dargestellten Methoden hergestellt wird;
Fig. 6 bis 8 sind Schnittansichten durch eine Form, die die Schritte in einer alternativen Methode der Herstellung eines porösen Substrats darstellen, das im Gerät gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll.

BESCHREIBUNG EINER BESTIMMTEN AUSFÜHRUNG

Wie in Fig. 2 dargestellt, weist die Testvorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung ein poröses aus einem Stück bestehendes Substrat 31 auf, das in einem Kunststoffbehälter 33 enthalten ist und diesen ausfüllt. Der Behälter kann aus zwei Teilen bestehen, um die Einführung des Substrats in den Behälter zu erleichtern. Das Substrat 31 hat eine zylindrische Form und am Boden einen vergrößerten Bereich 34. Die Poren des Substrats sind miteinander zu gewundenen kapillaren Durchgängen verbunden, so daß das Substrat saugfähig ist. Das Substrat ist mit einer oberen Schicht 36 versehen, die eine glatte flache Oberfläche 38 hat. Die Poren, die zur Porosität auf der oberen Schicht und Oberfläche führen, sind viel kleiner als im unteren Teil 37 des Substrats, der als Reservoir für das Substrat dient und den Hauptteil des Substrats umfaßt.
Das Reservoir 37 kann als makroporös beschrieben werden, was bedeutet, daß die Poren des Reservoirs ohne Hilfe eines Mikroskops sichtbar sind. Die Porengröße im Reservoir 37 reicht von 20 bis 100 um, und das Porenvolumen liegt zwischen 35% und 65%. Normalerweise wird ein Porenvolumen von 50% oder größer bevorzugt; bei manchen Immuntestanwendungen ist es sogar erforderlich. Die Poren in der oberen Fläche sind vorzugsweise so groß, daß die obere Fläche als mikroporös beschrieben werden kann, was bedeutet, daß die Poren in der oberen Fläche so klein sind, daß sie nur mit Hilfe eines Mikroskops sichtbar sind.
Um die beschriebene Vorrichtung so anzupassen, daß sie in einem Testverfahren verwendet werden kann, müssen mikroskopische Partikel, z. B. Mikrosphären, auf oder in der Oberfläche der Schicht 36 abgelagert werden. Die Partikel können auch in der obersten Schicht eingeschlossen werden, indem sie den Weg durch die oberste Schicht teilweise durchlaufen, bevor sie eingeschlossen werden. Für die deutlichsten Anzeigen der Testergebnisse werden die Partikel jedoch vorzugsweise an der Oberfläche eingeschlossen. Die Partikel können in der Größe zwischen 0,1 um und mehreren um im Durchmesser liegen. Partikel, die größer als 5 um sind, können verwendet werden, kleinere Partikel im Bereich von 0,1 bis 5 um werden jedoch bevorzugt, da kleinere Partikel eine größere Konzentration des Oberflächenbereichs für die Bindung einer Zielsubstanz bieten. Extrem kleine Partikel werden nicht verwendet, da sie entsprechend feine Poren in der Oberfläche des Substrats erfordern würden; und je kleiner die Porengröße in der Oberfläche ist, desto länger dauert es, bis die Flüssigkeiten im Immuntestverfahren durch die oberste Schicht in das Reservoir laufen. Als Kompromiß zwischen den gegensätzlichen Anforderungen des Erreichens eines hochkonzentrierten Oberflächenbereichs und eines schnellen Durchlaufs der Flüssigkeiten durch die Oberfläche in das Reservoir werden meistens Mikrosphären von ca. 1 um Größe gewählt. In einigen Anwendungen jedoch, z. B. wenn die zu testende Probe nur geringe Konzentrationen eines Zielantigens enthält, ist eine niedrigere Fließgeschwindigkeit wünschenswert, um dem Antigen in der Probe eine längere Zeit zu geben, um mit den Antikörpern an den Mikrosphären zu reagieren.
Um Mikrosphären an der Oberfläche des Substrats abzulagern, werden die Mikrosphären in einer wäßrigen Lösung oder einer Flüssigkeit suspendiert, die leicht in das Substrat sickert. Ein Tropfen der Lösung, die die Mikrosphären enthält, wird auf die Oberfläche des Substrats aufgebracht, und die Flüssigkeit der Lösung sickert hinunter in das Substrat, wobei die Mikrosphären in die Oberfläche des Substrats eingeschlossen oder eingebettet werden. Die Porengröße der obersten Schicht sollte klein genug sein, um die Mikrosphären an der Oberfläche einzuschließen, entweder nur durch Filterung oder in Kombination mit einer Neigung der Mikrosphären, zu agglutinieren und an dem Material des Substrats zu haften. Normalerweise sollte die Porengröße in der Oberfläche so groß wie möglich, aber immer noch wirksam sein, um die Mikrosphären an oder in der Oberfläche einzuschließen, wenn keine längere Inkubationszeit erforderlich ist. In diesem Fall wird die Porengröße so gewählt, daß sie zur gewünschten Inkubationszeit führt. Auf jeden Fall sollte die Porengröße der Oberfläche viel kleiner sein als die Porengröße des Reservoirs, wie im System der früheren Technik mit Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben, was dahingehend wirkt, daß Flüssigkeiten während des Immuntestverfahrens durch Kapillarwirkung durch die oberste Schicht hindurchgezogen werden. Nachdem die Flüssigkeit der Suspension nach unten hin in das Substrat hineingesickert ist, wobei die Mikrosphären an der Oberfläche 34 zurückgehalten wurden, kann die Flüssigkeit der Suspension verdunsten, wobei die getrockneten Mikrosphären zurückbleiben, die an der Substratoberfläche zurückbehalten wurden. Vorzugsweise werden die Mikrosphären an der Substratoberfläche immobilisiert. Diese bevorzugte Immobilisierung wird durch die Agglutination der Mikrosphären und/oder die Haftung der Mikrosphären am Material des Substrats unterstützt.
In dieser Form mit den auf der Oberfläche des Substrats abgelagerten Mikrosphären wird die Vorrichtung dem Benutzer gegeben, der einen Testvorgang durchführt, um auf Anwesenheit einer Zielsubstanz zu testen. Dieser Testvorgang kann im wesentlichen genauso ausgeführt werden wie oben unter Bezugnahme auf Fig. 1 beschrieben und auch wie im U.S.-Patent Nr. 4.632.901 von Valkiers et al., erteilt am 30. Dezember 1986, beschrieben. Im einzelnen haben sich die an der Oberfläche des Substrats abgelagerten Mikrosphären an ihren Oberflächenantikörpern gebunden oder abgelagert, die so ausgewählt werden, daß sie für das Zielantigen spezifisch sind. Eine Testprobe, die auf die Anwesenheit des vermuteten Antigens getestet werden soll, wird auf die oberste Schicht 36 gegossen. Die Testprobe wird relativ schnell durch die Kapillarwirkung des Reservoirs 37 durch die oberste Schicht 36 gezogen. Falls sich das vermutete Antigen in der Testprobe befindet, wird es sich an die Antikörper auf den Mikrosphären binden, die auf der Oberfläche des Substrats abgelagert sind. Nach Auftragen der Testprobe auf das Substrat wird eine Flüssigkeit, die markierte Antikörper enthält, die spezifisch für das vermutete Antigen sind, auf die oberste Schicht gegossen und durch Kapillarwirkung durch die oberste Schicht in das Reservoir 37 gezogen. Falls das Antigen der Testprobe entzogen wurde und auf der Oberfläche des Substrats verblieben ist, binden sich die markierten Antikörper an das Antigen und verbleiben dadurch an der Oberfläche. Wie beim bekannten Verfahren folgt dem Auftragen des markierten Antikörpers auf die oberste Schicht normalerweise ein Spülvorgang, um ungebundene markierte Antikörper aus der obersten Schicht zu entfernen. Diesem Spülschritt folgt dann ein Schritt, der den markierten Antikörper veranlaßt, sein Vorhandensein zu zeigen. Im Fall einer Enzymmarkierung besteht dieser letzte Schritt in der Zugabe einer weiteren Lösung eines farbbildenden Wirkstoffs, der mit dem Enzym reagiert, während die Lösung durch die oberste Schicht 36 hindurchgeht.
Da jede Flüssigkeit durch die oberste Schicht hindurchläuft, wird sie in dem Reservoir 37 aufgenommen. Entsprechend muß das Reservoir groß genug sein, das ganze Volumen der Testprobe, der markierten Antikörperlösung, der Spüllösung und der farbbildenden Lösung aufzunehmen.
Das erfindungsgemäße Gerät kann auch in einem Immuntest verwendet werden, der auf Anwesenheit von Ziel- Antikörpern in einer Testprobe testet. In einem solchen Vorgang wird ein für die Ziel-Antikörper spezifisches Antigen an die Oberflächen der Mikrosphären oder anderer kleiner Partikel gebunden oder angebracht, und die Ziel- Antikörper binden sich an das Antigen, während die Testprobe durch die Oberfläche des Substrats sickert. Das erfindungsgemäße Gerät kann auch in anderen diagnostischen Tests zum Nachweis von Zielsubstanzen in anderen Testproben als Immuntests verwendet werden. Um das Vorhandensein einer Zielsubstanz zu überprüfen, wird ein Material, das an der Zielsubstanz haftet, an die Oberfläche von kleinen Partikeln gebunden oder angebracht, oder alternativ wird das Material der kleinen Partikel selbst so gewählt, daß die Zielsubstanz am Material der kleinen Partikel haftet. Wenn dann die Testprobe durch die Oberfläche der obersten Schicht des Substrats sikkert, wird der Zielstoff in oder an der Oberfläche des Substrats extrahiert, wo seine Anwesenheit nachgewiesen wird.
Das aus einem Stück bestehende poröse Substrat mit der Oberfläche 38, die feine Poren hat, um die kleinen Partikel an der Oberfläche einzuschließen, kann auf mehrere Arten hergestellt werden. In Übereinstimmung mit einer Ausführung weist das poröse Substrat gesinterte Partikel aus Kunstharz mit einer obersten Schicht 36 auf, die aus gesinterten Partikeln gebildet ist, die kleiner sind als die Partikel, die zum Reservoir zusammengesintert sind. Geeignete Kunstharze für das Substrat sind Polyethylen mit ultrahohem Molekulargewicht, Polyethylen mit hoher Dichte oder Polyvinylidenfluorid, das unter dem Namen Kynar verkauft wird. Um die Bildung des porösen Substrats durch die hierin beschriebenen Methoden zu erleichtern, sollte das Kunstharz thermoplastisch sein, es kann jedoch auch jedes Kunstharz verwendet werden, das zu einem offenzelligen makroporösen Substrat geformt werden kann. Das Material des Harzes sollte natürlicherweise hydrophil sein oder, z. B. durch ein Netzmittel, hydrophil gemacht werden können.
Die kleineren Partikel, die die oberste Schicht 36 bilden, führen zu einer wesentlich kleineren Porengröße als der des Reservoirs, aber die Poren wären nicht klein genug, um Mikrosphären im Bereich von 5 um Durchmesser oder kleiner auf ihrer Oberfläche einzuschließen. Um die gewünschte feine Porengröße in Übereinstimmung mit einer Ausführung zu erreichen, wird eine mikroporöse Matrix in den Poren zwischen den gesinterten Partikeln der obersten Schichten 36 durch Eingießen gebildet.
Die mikroporöse Matrix wird aus einer Lösung gebildet, mit der die Poren zwischen den gesinterten Partikeln der Schicht 36 getränkt werden, ähnlich der Art, in der eine mikroporöse Membran aus einer Lösung gegossen wird, die mikroporöse Membranen bildet. Das Material der mikroporösen Matrix sollte hydrophil sein oder hydrophil gemacht werden können. Die mikroporöse Matrix kann also aus jedem Material bestehen, das aus einer Lösung innerhalb der Poren an der Oberfläche des Substrats gegossen werden kann und deren Material hydrophil ist oder gemacht werden kann. Das Material der mikroporösen Matrix kann beispielsweise Zellulose, Polyvinylchlorid, Polyvinylidenfluorid, Polykarbonat, Nylon oder Polysulfon sein.
Ein Beispiel für eine Art der Herstellung des Substrats gemäß der Erfindung ist in Fig. 3 und Fig. 4 dargestellt. Eine Schicht aus feinem thermoplastischen Kunstharzpulver 41, z. B. Polyethylen mit ultrahohem Molekulargewicht, wird auf dem Boden eines zylindrischen Hohlraums 43 einer Form 45 aufgebracht. Die Partikel des Pulvers sind so groß, daß 60% der Partikel oder mehr durch ein Gitter mit Siebfeinheit 150 passen. Vor dem Aufbringen der Schicht feinen Pulvers 41 auf den Boden des Formhohlraums wird ein pulveriges Netzmittel zu einem Gewichtsanteil von 0,3% unter das Pulver gemischt. Ein Beispiel für ein Netzmittel, das verwendet werden kann, ist Natrium-N-Methyl-N-Oleoyl-Taurat. Die Menge feinen Pulvers, das die Schicht 41 bildet, ist nicht entscheidend, muß aber ausreichend sein, um den Boden des Formhohlraums vollständig zu bedecken. Nach dem Aufbringen des feinen Pulvers auf den Boden des Formhohlraums wird die Form geschüttelt, um das Pulver gleichmäßig auf der Bodenfläche zu verteilen und sicherzustellen, daß es den Boden des Formhohlraums vollständig bedeckt. Der Rest des Hohlraums wird dann mit thermoplastischem Kunstharzpulver 47 von einer größeren Partikelgröße, z. B. Pulver von Siebfeinheit 100, gefüllt. Die Form dieser Partikel ist vorzugsweise stark unregelmäßig. Das Pulver 47 kann dasselbe Harz wie das der Schicht 41 oder ein anderes Harz sein, das mit dem Harz der Schicht 41 versintert. Die Verwendung von unregelmäßig geformten Partikeln im Pulver 47 verhindert, daß die Partikel sich eng miteinander verbinden und führt am Ende zu einem hohen Porenvolumen in der sich ergebenden porösen Struktur, beispielsweise 50% oder größer. Das Pulver 47 enthält auch ein pulveriges Netzmittel in einem Gewichtsanteil von 0,3%, das darunter gemischt wird, bevor das Pulver in die Form gebracht wird. Das Netzmittel kann dasselbe sein wie das unter das feine Pulver gemischte. Das Pulver 47 mit den größeren Partikeln füllt den Hohlraum 43 der Form einschließlich eines oberen Abschnitts 49 des Hohlraums mit vergrößertem Durchmesser. Die Form wird erneut in Schwingung gesetzt, um sicherzustellen, daß sich Zwischenräume mit relativ gleichförmiger Größe zwischen den Partikeln des Pulvers 47 bilden. Die Form wird dann erhitzt, um die Partikel zusammenzusintern. Nach der Sinterung wird die Form abgekühlt und das Formstück, das die gesinterten Partikel aufweist, wird aus der Form genommen. Das gesinterte Formstück, wie es in Fig. 5 dargestellt ist, hat eine obere Schicht 51, die aus den feinen gesinterten Partikeln gebildet worden ist und eine glatte Oberfläche 53 hat, die aus dem Boden der Form mit einer durchschnittlichen Porengröße zwischen 5 und 10 um in der oberen Schicht und der Oberfläche gebildet worden ist. Die durchschnittliche Porengröße, die aus den größeren Partikeln gebildet wird, die letztendlich das Reservoir 37 des Substrats bilden, liegt zwischen 20 und 30 um.
Das in der Form gesinterte Formstück könnte unmittelbar nach dem Formen verwendet werden, um große Mikrosphären gemäß der Erfindung einzuschließen. Die durchschnittliche Porengröße in der oberen Schicht 53 liegt zwischen 5 und 10 um und schließt Mikrosphären von ca. der doppelten durchschnittlichen Porengröße oder größer an der Oberfläche und ca. der Hälfte der durchschnittlichen Porengröße in der oberen Schicht ein. Wie oben erklärt wird jedoch bevorzugt, Mikrosphären von 5 um Durchmesser oder weniger zu verwenden und diese Mikrosphären an der Oberfläche des Substrats einzuschließen. Nach dem Zusammensintern des Formstücks wie oben beschrieben wird eine mikroporöse Matrix in den Poren des Substrats in der Nähe der oberen Fläche ausgebildet, während die Poren des Reservoirs leer bleiben. Allgemein wird die Formgebungsstufe durchgeführt, indem eine Lösung zubereitet wird, aus der die mikroporöse Matrix gebildet wird, und indem die Poren in der Nähe der glatten Oberfläche der Formstücks mit der Lösung getränkt werden. Eine Phaseninversion wird in der Lösung veranlaßt und der Feststoff, der zur mikroporösen Matrix wird, tritt in den Poren des Formstücks in der Nähe der oberen Fläche des Formstücks aus der Lösung aus. Auf diese Weise entsteht eine glatte mikroporöse Oberfläche, die die kleinen Mikrosphären einschließt.
Beispiele für Lösungen zur Bildung der mikroporösen Matrix und Methoden zur Formgebung der mikroporösen Matrix in den Poren werden im folgenden beschrieben:
400 g n-Butyl-Alkohol (Butanol) werden in das Mischgefäß 3 eines handelsüblichen Mischers mit 4,5 l Inhalt gegeben, der eine Umdrehungsgeschwindigkeit von 2500 U/min hat. Während der Mixer mit niedriger Geschwindigkeit (1000 U/min) läuft, werden 16 g Zelluloseazetat langsam dem Butanol hinzugefügt. Nachdem die Zellulose hinzugegeben worden ist, wird der Mischer eine Minute lang bei 2500 U/min betätigt, woraufhin das Zelluloseazetat aufgelöst sein sollte.
132,8 g Nitrozellulose, die 30% Gew.-30% Isopropylalkohol enthält und eine Viskosität zwischen 70 und 80 Sekunden hat (ASTM D: 1343-56), werden in das Mischgefäß gegeben. Der Mischer wird zwei Minuten lang bei 2500 U/min betätigt, um die Nitrozellulose aufzulösen.
1079 g Azeton werden in das Mischgefäß gegossen und der Mischer wird bei hoher Geschwindigkeit 15 min lang betätigt. Am Ende dieses Mischvorgangs sind alle Feststoffe in der Mischung gelöst.
732 g Butanol werden dann in den Mischer gegossen und der Mischer wird zwei Minuten lang bei hoher Geschwindigkeit betätigt.
Dann werden 100 g gefiltertes reines Wasser langsam in die Lösung getropft, während der Mischer mit 1000 U/min läuft.
Während der Mischer immer noch mit einer Geschwindigkeit von 1000 U/min läuft, werden 24 g färbende Titandioxid (TiO&sub2;) in die Lösung gemischt, wonach der Mischer 15 min lang bei 3200 U/min betätigt wird, so daß das Titanoxid gründlich gemischt wird und sich in Suspension in der Lösungsflüssigkeit befindet.
Die Mischung wird dann in einen geschlossenen Behälter gegossen, der wenig Raum über der Lösung läßt. Die Mischung wird aufgrund des Mischvorgangs Luftblasen enthalten. Die Lösung wird einige Stunden stehengelassen; während dieser Zeit steigen die Blasen in der Lösung an die Oberfläche und entweichen. Während der Entfernung der Bläschen wird die Temperatur der Lösung auf über 26,7ºC (80ºF) gehalten. Die fertige Mischung sollte nach der Entfernung der Luftblasen bei 32,2ºC (90ºF) eine Viskosität von 400 bis 800 mPa·s (Centipoise, cps) haben und kann die feinen Poren in der Nähe der glatten oberen Oberfläche des porösen Kunststofformstücks tränken. Im Gießverfahren dieses Beispiels wird eine Phaseninversion durch die Verdunstung der Lösemittel hervorgerufen, die die mikroporöse Matrix als verbleibender Rest in den Poren des Substrats hinterläßt. Um beständige, wiederholbare Ergebnisse der Porosität der mikroporösen Matrix zu erreichen, sollte der Formgebungsvorgang in einer kontrollierten Umgebung durchgeführt werden. Die relative Feuchtigkeit sollte vorzugsweise zwischen 70 und 80% und die Umgebungstemperatur zwischen 25,6 und 27,8ºC (78 und 82ºF) gehalten werden.
Während des Formgebungsvorgangs wird die Lösung auf eine Temperatur zwischen 43,3 und 46,1ºC (110 und 115ºF) erhitzt, wodurch die Viskosität der Lösung unter 500 mPa·s fällt. Eine Mehrzahl der wie oben beschrieben gebildeten Formstücke wird in einem Gestell so ausgerichtet, daß die glatte Oberfläche des Formstücks über den Boden des Gestells hinaus vorsteht. Die erhitzte Gießlösung wird in eine hohle Wanne gegossen und das Gestell wird über die Wanne gestellt, so daß die glatte Oberfläche der Formstücke ca. 3,2 mm (1/8 inch) tief in die Lösung eintaucht, wobei dann die Mischung in der Wanne die Poren an der oberen Oberfläche imprägniert. Die Enden der Formstücke verbleiben ca. 1 Sekunde in der Lösung, woraufhin das Gestell gerade nach oben angehoben und dann langsam genug gedreht wird, so daß die überschüssige Flüssigkeit ablaufen kann. Das Gestell wird mit den glatten oberen Oberflächen nach oben zeigend, wobei die feinen Poren in der Nähe der Oberfläche nun mit Lösung getränkt sind, unter eine Abzugshaube gestellt, die mit einem Abzugsventilator ausgestattet ist, der betrieben wird, um Luft über die getränkten Formstücke zu ziehen. Bei einer Haube mit einem unteren Einlaßende von 660 · 965 mm (26 · 38 inches), wird die Luft aus der Haube mit einer Geschwindigkeit von 2,1 m³ pro Minute ausgestoßen, so daß eine gewünschte Luftströmung über die imprägnierten Formstücke erreicht wird. Diese Schritte werden alle durchgeführt, während die geregelte Feuchtigkeit und Temperatur wie oben beschrieben aufrechterhalten werden. Die getränkten Formstücke bleiben eine ausreichende Zeit lang unter der Abzugshaube, wobei Luft über die Formstücke gezogen wird, damit die Lösemittel verdunsten und die mikroporöse Matrix sich im Formstück bildet und aushärtet. Diese Zeit dauert mindestens 1,5 Stunden. Die Teile werden dann aus der kontrollierten Umgebung herausgenommen und ca. 0,5 ml einer dünnflüssigen Netzmittellösung werden auf die glatte obere Oberfläche jedes Substrats aufgebracht. Die Lösung kann beispielsweise 1 Gew.-% VarionTM, 10 Gew.-% Isopropylalkohol und 89 Gew.-% gefiltertes Wasser enthalten. Varion ist ein oberflächenaktives Mittel, das bei Fa. Sherex Corporation erhältlich ist. Nach dem Aufbringen der Netzmittellösung werden die Teile in einen Luftstrom gestellt, um sie zu trocknen, woraufhin die Herstellung der Substrate abgeschlossen ist.
Das obige Beispiel führt zu einem Substrat, das an der Oberfläche 38 mikroporös und im Reservoir 37 makroporös ist, und zwar mit einem großen Porenvolumen von über 50%, wobei die Reservoirporen mit den Mikroporen an der glatten Oberfläche des Substrats in kapillarer Wechselwirkung stehen. Die entsprechend diesem Beispiel hergestellten Substrate schließen beständig Polystyrol- Mikrosphären an der oberen Oberfläche ein, die nur einen Durchmesser von 1,0 um haben.
Durch Änderung der Parameter der Lösung, aus der die mikroporöse Matrix gegossen wird, kann die Porosität der mikroporösen Matrix variiert werden, so daß Mikrosphären mit anderen Größen eingeschlossen werden. Falls der prozentuale Anteil der Feststoffe, die der Lösung hinzugefügt werden, erhöht wird, wird die Porengröße der mikroporösen Matrix verringert. Falls das Molekulargewicht der Nitrozellulose erhöht wird, wird die Porengröße verringert. Das Molekulargewicht von Nitrozellulose wird normalerweise vom Lieferanten als Viskositätszahl gemäß ASTM D 1343-56 bestimmt.
In einem abgewandelten speziellen Beispiel werden die anfänglichen Mengen der in der Lösung verwendeten Flüssigkeiten Butanol, Azeton und Wasser im Vergleich zu den der oben beschriebenen speziellen Beispiele um 40% reduziert, und die Nitrozellulose aus den obigen Beispielen wird durch 132,8 g Nitrozellulose mit einer Viskositätszahl zwischen 140 und 180 Sekunden ersetzt. Die entstehende Lösung hat eine Viskosität von 3500-5500 mPa·s (cps) Die Lösung wird auf eine Temperatur zwischen 51,7 und 57,2ºC (125 und 135ºF) erhitzt, wodurch die Viskosität unter 3000 mPa·s (cps) sinkt, und die Lösung wird in die obere Oberfläche der Formstücke imprägniert, indem sie wie oben beschrieben eingetaucht werden. Mit diesen Abänderungen und ansonsten dem speziellen Beispiel wie oben beschrieben folgend, wird die Porengröße der entstehenden mikroporösen Matrix reduziert, so daß die Oberfläche Mikrosphären bis herunter zu 0,3 um einschließt.
Statt die Formstücke in die Lösung zu tauchen, die die mikroporöse Matrix bildet, kann die Lösung mit einer Spritzpistole auf die glatte obere Oberfläche der Formstücke aufgetragen werden. Wie der Eintauchvorgang sollte der ganze Vorgang des Auftragens der Lösung auf die obere Oberfläche der Formstücke in einer kontrollierten Umgebung erfolgen. Die relative Feuchtigkeit der Umgebung sollte zwischen 70 und 80% und die Temperatur zwischen 25,6 und 27,8ºC (78 und 82ºF) gehalten werden. Die Membranlösung aus dem ersten beschriebenen Beispiel wird auf eine Temperatur zwischen 43,3 und 46,1ºC (110 und 115ºF) erhitzt, um die Viskosität der Lösung unter 500 mPa·s (cps) zu senken. Die erhitzte Lösung wird in eine Heißspritzpistole gefüllt, und mit dieser Pistole wird eine abgemessene Menge auf die obere Oberfläche jedes Formstücks gegeben. Die Menge der abgegebenen Lösung wird so gewählt, daß sie etwas mehr als ausreichend ist, um die Oberfläche zu bedecken. Die mikroporöse Matrix kann sich dann aus der Lösung heraus in den Poren der Oberfläche unter einer Abzugshaube wie zuvor beschrieben ausbilden. Nach dem Aushärten der mikroporösen Matrix wird die dünnflüssige Netzmittellösung wie zuvor beschrieben aufgebracht. Die entstehenden Strukturen schließen beständig an ihren oberen Oberflächen Polystyrol-Mikrosphären von 1,0 um ein.
Eine andere Art, eine mikroporöse Matrix zu erhalten, die Mikrosphären von 0,3 um einschließt, ist das Ausgeben einer zweiten abgemessenen Menge der Lösung in die obere Oberfläche jedes Formstücks aus der Spritzpistole. Die zweite abgemessene Menge wird vorzugsweise mindestens einige Minuten nach dem Auftragen der ersten abgemessenen Menge auf die Oberfläche aufgetragen, so daß die mikroporöse Matrix aus der ersten abgemessenen Menge bereits angefangen hat, sich zu bilden. Die Teile werden dann unter der Trockenhaube genau wie oben beschrieben wieder 1,5 Stunden lang getrocknet. Dieses wiederholte Auftragen von Lösung, die die mikroporöse Matrix bildet, verringert die Porengröße in der Matrix in einer oberen Oberfläche so, daß die Oberfläche Mikrosphären von 0,3 um einschließt.
Die oben beschriebenen Beispiele schließen Mikrosphären von der beschriebenen Größe ein, ohne daß Proteine an der Oberfläche der Mikrosphären gebunden werden, und schließen Mikrosphären mit Antikörpern an den Mikrosphären von derselben Größe ein, falls keine chemische Anziehung zwischen den Antikörpern und dem Material der mikroporösen Matrix vorhanden ist. Falls jedoch eine chemische Anziehung zwischen den Antikörpern an der Oberfläche der Mikrosphäre und dem Material der mikroporösen Matrix besteht, schließt die Struktur noch kleinere Mikrosphären ein. In dem Beispiel, das Mikrosphären von 1 um einschließt, können z. B. Mikrosphären bis herunter zu 0,5 um an der oberen Oberfläche der Struktur eingeschlossen werden, falls eine chemische Anziehungswirkung zwischen den Antikörpern und dem Zellulosematerial der mikroporösen Matrix besteht.
In einer abgewandelten Ausführungsform wird das Substrat ohne Verwendung einer mikroporösen Matrix hergestellt, die in die Poren der obersten Schicht gegossen wird. In dieser Ausführung wird ein sehr feines thermoplastisches Kunstharzpulver, z. B. Polyethylenpulver mit ultrahohem Molekulargewicht, für die Bildung der obersten Schicht des Formstücks verwendet, speziell einer Schicht, von der mindestens 90% der Partikel klein genug sind, so daß sie durch ein Sieb mit der Siebfeinheit 200 hindurchgehen. Ein Pulver, dessen Partikel durch ein Sieb mit der Siebfeinheit 200 hindurchgehen, wird als "Pulver mit Siebfeinheit unter 200" bezeichnet. Das verwendete Pulver hat also zu 90% eine Siebfeinheit unter 200. Dieses feine Pulver wird hergestellt, indem im Handel erhältliches Kunstharzpulver durch ein Sieb mit Siebfeinheit 200 geschüttelt wird. Die Partikel, die durch das Sieb fallen, werden aufgefangen und als oberste Schicht 35 des Substrats verwendet.
Das feine Pulver, das wie oben beschrieben hergestellt wird, wird mit einem Netzmittel, z. B. Natrium-N-Methyl-N-Oleoyl-Taurat, zu einem Gewichtsanteil von 0,3% gemischt. Die Mischung aus Pulver und Netzmittel wird in den Hohlraum 43 der Form 45 wie in Fig. 6 gezeigt gegeben. Die Form wird geschüttelt, um das feine Pulver gleichmäßig auf dem Boden des Hohlraums 43 zu einer Schicht 61 zu verteilen. Die Menge des in den Hohlraum gegebenen Pulver s ist nicht entscheidend, es sollte aber genug sein, um den Boden des Hohlraums vollständig zu bedecken. Nachdem das Pulver gleichmäßig auf dem Boden der Form verteilt wurde, wird ein zylindrischer Zapfen oder Bolzen 63 mit einem Durchmesser, der etwas kleiner ist als der Durchmesser des unteren Teils des Hohlraums 43 in den Hohlraum eingeführt und gegen die Schicht 61 aus feinem Pulver mit einem Druck von 34474 bis 103422 kPa (5.000 bis 15.000 Pbs/sq.inch) angedrückt, um das Pulver wie in Fig. 7 dargestellt zu komprimieren. Durch diese Kompression wird die Größe der Zwischenräume zwischen den Partikeln des feinen Pulvers reduziert und entsprechend auch die Porengröße in der oberen Schicht 35 des hergestellten Substrats. Je größer die Kompressionskraft ist, die auf die Schicht 61 ausgeübt wird, um so kleiner wird die Porengröße in der oberen Schicht 35 des entstehenden Substrats. Eine Kraft von 75843 kPa (11.000 Pbs/sq.inch) führt zu einem durchschnittlichen Porendurchmesser von ca. 3 um in der oberen Schicht 35 des entstehenden Substrats. Nachdem die Schicht 61 komprimiert wurde, wird der Rest des Hohlraums 63 mit Kunstharzpulver 67 mit größeren Partikeln gefüllt, z. B. Polyethylenpulver von ultrahohem Molekulargewicht mit Siebfeinheit 150, wie in Fig. 8 dargestellt. Dem Pulver 67 ist auch ein Netzmittel zu einem Gewichtsanteil von 0,3% beigemischt. Das Netzmittel kann dasselbe sein wie in dem feinen Pulver aus Schicht 61. Die Form wird dann wieder ca. 20 Sekunden lang geschüttelt, um gleichmäßigere Abstände zwischen den Partikeln 67 zu erreichen. Dieses Schütteln beeinflußt die komprimierte Schicht 61 nicht wesentlich. Die Form wird dann erhitzt, um die Partikel der Schicht 61 mit den Partikeln des Pulvers 67 und die beiden Schichten an ihrer Berührungsfläche zusammenzusintern. Die Form wird dann abgekühlt und das fertige Substrat aus der Form genommen. Das entstehende Substrat hat eine obere Schicht 35, die mikroporös ist, und ein Reservoir 37, das makroporös ist und sich in kapillarer Verbindung mit der mikroporösen Schicht befindet. Die obere mikroporöse Schicht schließt Mikrosphären von ca. 5 um an der oberen Oberfläche ein, wenn keine chemische Bindung zwischen den Antikörpern in den Mikrosphären und dem Material der obersten Schicht 35 besteht. Falls eine chemische Bindung eintritt, schließen die obere Oberfläche und die obere Schicht kleinere Mikrosphären ein. Die obere Schicht schließt auch Mikrosphären bis hinunter zu 1 um Durchmesser ein, die in der oberen Schicht verteilt sind.
In dem oben beschriebenen Immuntestgerät schließt ein aus einem Stück bestehendes poröses Substrat Mikrosphären an der Oberfläche des Substrats oder in der obersten Schicht ein, während es gleichzeitig als Reservoir dient, um die Flüssigkeiten aufzufangen, die bei dem Immuntest durch die Oberfläche des Substrats hindurchlaufen. Dadurch werden die Probleme beim Zusammensetzen der Komponenten des Substrats und die Probleme des Zwischenraums zwischen den Komponenten des Substrats vollständig vermieden.

Claims

1. Diagnosevorrichtung, aufweisend ein offenzelliges, poröses Substrat mit einer obersten Schicht (36) und einem unteren Reservoirteil (37), wobei die oberste Schicht mikroporös ist und dahingehend wirkt, wäßrige Flüssigkeit von der Oberfläche (38) der obersten Schicht durch Kapillarwirkung in den Reservoirteil zu übertragen, wobei der Reservoirteil makroporös ist und in kapillarer Verbindung mit den Mikroporen der Oberfläche steht, wobei das Substrat Mikropartikel aufweist, die auf der Oberfläche abgelagert sind, wobei die Mikropartikel Antigene oder Antikörper aufweisen, die gebunden oder an deren Oberfläche absorbiert sind, dadurch gekennzeichnet, daß die oberste Schicht und der untere Reservoirteil in einem Stück ausgebildet sind.

2. Diagnosevorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat in einem Behälter (33) enthalten ist, wobei der Behälter eine obere Öffnung aufweist, die die Oberfläche freilegt.

3. Diagnosevorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikropartikel Mikrosphären sind.

4. Diagnosevorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat aus gesinterten Partikeln aus Kunstharz besteht und eine mikroporöse Matrix aufweist, die in die Poren eingegossen ist, die durch die gesinterten Partikel des Substrats an der Oberfläche gebildet sind.

5. Diagnosevorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die gesinterten Partikel eine Schicht aus Partikeln aufweisen, die in der Nähe der Oberfläche angeordnet sind, welche kleiner als der verbleibende Teil der Partikel sind.

6. Diagnosevorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die oberste Schicht Mikroporen einer Größe hat, um die Mikrosphären in oder auf der obersten Schicht einzuschließen, wenn auf diese obersten Schicht eine Flüssigsuspension mit der Flüssigkeit aufgebracht wird, die durch die oberste Schicht hindurch in den Reservoirteil läuft.

7. Diagnosevorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat gesinterte Partikel aus Kunstharz aufweist und daß die oberste Schicht gesinterte Partikel aufweist, die kleiner als die gesinterten Partikel in dem Reservoir sind.

8. Diagnosevorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine mikroporöse Matrix in die Poren eingegossen ist, die durch die gesinterten Partikel der obersten Schicht in der Nähe der Oberfläche gebildet sind.

9. Diagnosevorrichtung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die oberste Schicht der gesinterten Partikel durch Verteilen der kleineren Partikel in eine Schicht und durch Anlegen einer Druckkraft an die Schicht gebildet ist, um die Größe der Zwischenräume zwischen den Partikeln zu verringern und sodann die Partikel zusammenzusintern.