DE2305812A1 - Verfahren und geraet fuer die gelchromatographie - Google Patents

Description

• Verfahren und Gerät für die Gelchromatographie Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren und ein Gerät für die Gelchromatographie, bei welchem in einem Chromatographierohr über ein Trenngel die zu trennende Substanz aufgeschichtet wird.
• Die Gaschromatographie ist eine in der Chemie, Biologie, Industrie und Medizin weitverbreitete Routinetechnik. Die Trenneigenschaften stützen sich dabei vor allem auf die Unterschiede im Molekulargewicht der zu trennenden Substanzen, wobei aufgrund von Diffussionsgleichgewichten zwischen den Gelkörnern des als 'tSelmatrix"in das Chromatographierohr eingegossenen Trenngel e 5 und dem verwendeten Elutionspuffer die kleinsten Moleküle der zu trennenden Substanz schneller am Auslaßende des Rohres arkommen, als die größeren Moleküle.
• Dieser Wirkungsmechanismus läßt erkennen, daß nur dann eine befriedigende Substanztrennung erreichbar ist, wenn die zu trennende Substanz in einer dünnen Schicht auf das Trenngel aufgebracht wird, wenn die Mlolekulargewich-te der Substanzbestandteile ausreichend unterschiedlich sind, ein genügend langes Trennrohr benutzt wird und die Zeit für eine Trennung nicht zu knapp bemessen ist. Diese Bedingungen sind aber in der Praxis meist nicht gleichzeitig gegeben; insbesondere liegen Substanzproben häufig nur in verhältnismäßig unkonzentrierter Form vor, so daß eine relativ große Menge dem Trenngel liberschichtet werden muß, um nach der Trennung noch ausreichend große (nachweisbare) Qaantitäten der getrennten Substanzteile zu erhalten. Die Trennschärfe ist dann meist unbefriedigend, es werden große Mengen des teueren Trenngeles benötigt (wenn überhaupt ausreichend lange Rohre zur Verfügung stehen) und der erforderliche Zeitaufwand erhöht sich.
• Die Konzentration der Substanzen vor einer Gelchromatographie ist meist mit hohen Substanzverlusten, technischem und finanziellem Aufwand sowie beachtlichem Zeitbedarf verbunden und läßt sich deshalb häufig nicht durchführen.
• Ausgehend davon ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren und ein Gerät der eingangs genannten Art anzugeben, mit welchem ohne die genannten Nachteile auch relativ schwach konzentrierte Substanzen chromatographisch filtriert werden können.
• Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß die für eine brauchbare Chromatographie erforderliche dünne sub stan zauf -schichtung über dem Trenngel (dünne "Startzonet') bei Vorhandensein nur senwach konzentrierter Proben dann erreichbar ist, wenn diese Probe vor Beginn des chromatographischen Trennvorganges in einem ersten Teil des Geles elektrophoretisch zu einer dünnen Startzone konzentriert wird.
• Das Gerät nach der. Erfindung bzw. zur Durchführung des Verfahrens, mit einem Chromatographierohr, mit einem oberen Ende zum Einfüllen des Trenngeles und der Zuführung einer Elutionspufferflüssigkeit und einem unteren Ende, das vorzugsweise verjüngt und verschließbar is-t, zur Abführung der Fraktionen, z.B. zu einem Braktionssammler, ist demnach gekennzeichnet durch ein im oberen Bereich des Ohromatographierohres vorgesehenes bzw. vorzusehendes Gelelektrophoresesystem. Dabei ist es freigestellt, ob ein übliches Chromatographierohr durch das Elektrophoresesystem nach oben verlangert wird oder ob der obere Bereich des Rohres für das Elektrophoresesystem benutzt wird.
• Weitere Vorteile und zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Erläuterung eines Ausführungsbeispieles der Erfindung anhand einer Figur und den Ansprüchen.
• In der Figur ist mit 1 ein im Querschnitt kreisförmiges Chromatographierohr bezeichnet, dessen unteres Ende 2 sich konisch verjüngt und mit dem Kükenhahn 3 abschließbar ist. Im Bereich des unteren Endes 2 enthält das Rohr eine poröse Siebplatte 4, auf welcher das in das Rohr einzufüllende Trenngel (Gelmatrix) 5 ruht. Das Rohr ist bei 6 in axialer Richtung zweigeteilt und die beiden Teile (oberes Rohrteil 7, unteres Rohrteil 8) sind unter Einfügung eines Dichtungsringes 9 miteinander verschraubbar und weisen dazu die zueinanderpassenden Gewindeteile 10, 11 auf.
• Im zusammengebauten Zustand gehen die Innenwandungen der Rohrteile praktisch fugenlos ohne Änderung des Rohrdurchmessers ineinander über. Das obere Rohr teil 7 ist konzentrisch von einem weiteren Rohr 12 mit größerem Durchmesser umgeben, wobei der Boden 13 dieses weiteren Rohres 12 bei 14 mit dem unteren Ende der äußeren Begrenzung des oberen Rohrteiles 7 dicht verbunden ist. Bei Verwendung von Glas oder durchsichtigem Kunststoff ist die dichte Verbindung durch einen Schmelz- oder Schweißvorgang gewährleistet. Das Rohr 12 erstreckt sich bis in die Höhe des oberen Endes des oberen Rohrteiles 7, so daß beide Rohre bis zum selben Niveau gefüllt werden können (hydrostatischer Druckausgleich). Der schlauchförmige Zwischenraum 15 zwischen dem oberen Rohrteil 7 und dem Rohr 12 dient als Pufferflüssigkeitsbehälter; seinem Boden benachbart ist eine ringförmige erste Elektrode 16 angeordnet, die den unteren Bereich des oberen Rohrteiles 7 konzentrisch umgibt. Ein Durchführungsanschluß zu dieser Elektrode kann in die Wand des Rohres 12 eingeschmolzen sein (der Übersichtlichkeit wegen nicht dargestellt). Die an der Elektrode 16 beim Betrieb entstehenden Gasblasen können lungchindert nach oben entweichen. Der genannte untere Bereich des oberen Rölirteiles 7 ist ersetzt durch einen porösen Ring 17. (in einer anderen Au3führtingsform ist statt des Ringes 17 ein Lochlranz im Rohrteil 7 vorgesehen). Im oberen Bereich des oberen Rohrteiles ist die zweite Elektrode 18 - ebenfalls in Ringform und mit einem nicht dargestellten Durchführungsanschluß versehen - angeordnet.
• Das obere Ende des oberen Rohrteiles 7 ist unter Einlage des Dichtungsringes 19 mit dem Deckel 20 verschließbar. Der Deckel besitzt eine mit dem Kükenhahn 21 verschliußbare Öffnung 22 für den Austritt von an der zweiten Elektrode 18 beim Betrieb des Gerätes entstehenlem Gas. Eine weitere mit einem gleichartigen Hahn 23 verschließbare Öffnung 24 im Deckel 20 dient zur Zuführung einer Elutionspufferflüssigkeit, die über die leitung 25 aus dem Elutionspufferbehälter 26 zugeführt werden kann.
• Der Deckel kann auch als Träger für eine in das obere Rohrteil eintauchende zweite Elektrode benutzt werden. Die untere Randbegrenzung der Deckelöffnung 24 ist mittels eines Teflon-Schläuchchens 27 nach unten verlangert.
• Die beiden Elektroden 16, 18, das obere Rohrteil 7 mit dem porösen Ring 17 und das weitere Rohr 12 bilden zusammen ein Elektrophoresesystem, wobei das obere Rohrteil eine Trennkammer und der Zwischenraum 15 einen Pufferflüssigkeitsbehälter bilden.
• Funktionsweise Bei geschlossenem Hahn 3 wird das Rohr 1 bis über den porösen Ring mit dem gewüulschten (perlen- oder körnchenförmigen) Gel (Gelmatrix) gefüllt. Der über dem porösen Ring sich befindende Gelteil ist mit als "erster Teil des Geles" bezeichnet und in der Fig. mit dem Bezugszeichen 30 versehen. (Bei Versuchen wurden Dextran Gele, z.B. "Sephådex" der Firma Phalmacia oder Polyacrylamidgel, z.B. "Biogel" der Firma Biocal verwendet). Das Gel wird zuvor mit einem Puffer äquilibriert, der eine bestimmte Zusammensetzung besitzt, die sich nach dem erstrebten Konzentrier verfahren für die Substanz richtet.
• Auf das Gel wird eine Pufferschicht (Elutionspuffer) auf gefüllt (aus dem Elutionspufferbehälter 26 über den Hahn 23, Schlauch 27). Anschließend wird die - noch schwach konzentrierte - zu trennende Substanzprobe (die 5 % bis 10 % Glyzerin enthalten soll) beispielsweise mit einem dünnen Teflon schlauch durch 21 und 22 hindurch auf das Gel aufgebracht, wobei die Probe aufgrund der durch das Glyzerin gegebenen höheren spezifischen Dichte sich dem zunächst über dem Gel stehenden Elutionspuffer unterschichtet. Dieser Zustand ist in der Figur gezeigt, wobei über dem Trenngel 5 die Substanzprobe 28 liegt und im Bereich der zweiten Elektrode 18 sich die Elutionsflüssigkeit 29 befindet, wobei darauf zu achten ist,daß der Schlauch 27 in die Flüssigkeit 29 eintaucht, die aber nicht so hoch stehen darf, daß sie die Öffnung 22 verschließt. Nun wird der Behälter 15 zwischen 7 und 12 mit Pufferflüssigkeit gefüllt, der Hahn 23 geschlossen, Hahn 21 geöffnet und eine Gleichspannungsquelle an die Elektroden 16, 18 angeschlossen. Die Polung wird so gewählt, daß zur Konzentrierung saurer Stoffe (DissoziXerung von Säuregruppierungen) die erste Elektrode 16 als Anode geschaltet ist. Nach Ausschalten der Gleichspannung entsteht zwischen den Elektroden ein elektrisches Feld, wobei der Strompfad von der ersten Elektrode 16 über die in den Behälter 15 eingefüllte Pufferflüssigkeit und die durch sie benetzte poröse Scheibe 17 über das Trenngel 5, die Substanz 28 und den Elutionspuffer 29 zur zweiten Elektrode 18 führt. Zur Konzentrierung basischer Stoffe (Protonisierung von Aminogruppen) wird umgepolt. Aufgrund der jeweils gewählten elektrophoretischen Konzentrierungstechnik wird die Substanz 28 zu einer außerordentlich scharfen Startzone konzentriert, wobei ein Konzentrierungseffekt bis zu 500 : 1 erzielt werden kann. Dadurch läßt sich dann - je nach Substanzmenge und je nach den Abmessungen des Gerätes - die Dicke der Startzone auf etwa 1,5 bis 0,1 mm reduzieren. So dünne Schich-ten gewrahrleisten aber große Trennschärfen auch bei wenig unterschiedlichen Molekulargewichten, sie erlauben kurze Trennrohre und bieten damit den Vorteil geringen Gelverbrauches und kleinen Zeitaufwandes; außerdem können Fraktionen in ausreichenden (nachweisbaren) Mengen und Konzentrationen gewonnen werden (Verbesserung des Zeit-Kosten-Ausbeute-und Qualitätsfaktors).
• Nach dem Ende der Konzentrierungsphase wird die Gleichspannung von den Elektroden abgeschaltet und es folgt die übliche "Chromatographie". Die scharf konzentrierte Startzone wandert in der durch das Gel von oben nach unten strömenden Elutianspufferflüssigkeit in das Gel ein. Nach Öffnen des Hahnes 3 können dann die Fraktionen einem Fraktionssammler zugeführt werden.
• Für die elektrophoretische Konzentrierung werden im Rahmen der Erfindung zwei unterschiedliche Techniken vorgeschlagen.
• 1. Die zu trennende Substanz enthält einen sog. "Substanzprobenpuffer", der das gleiche Anion (bzw. Kation) enthält wie der Gelpuffer. Dieses Anion (bzw. Kation) soll bei der Elektrophorese die höchste elektrische Beweglichkeit in Richtung zur ersten Elektrode 16 haben, wobei die Elektrode als Anode zur Trennung saurer Substanzen (bzw. als Kathode zur Trennung basischer Substanzen) geschaltet ist Die Elutionspufferflüssigkeit 29 über der Substanzprobe 28 soll ein Anion (bzw.
• Kation) enthalten, das die kleinste elektrische Beweglichkeit besitzt. Die unterschiedlichen Moleküle in der Substanz sollen intermediäre Beweglichkeiten besitzen (Konzentrierungseffekt nach KOHLRAUSCH-Funktion ; Ann.Physik-und Chemie 1962, 209 (1897).
• 2. Alle Puffersysteme, also Elutionspuffer, Puffer in der Substsnzzone und Gelpuffer besitzen die gleiche chemische Zusammensetzung, also auch das gleiche Anion (bzw. Kation).
• Jedoch be-trägt die Konzentration der Pufferflüssigkeit in der Substsnzzone -nur etwa 1/5 bis 1/10 von der des Elutions- und Gelpuffers. Der Konzentrierungseffek-t ergibt sich aufgrund unterschiedlicher Leitfähigkeiten, wobei die elektrische Feldstärke dem Quotienten aus elektrischer Stromdichte zu spezifischer Leitfahigkeit entspricht.
• Die Erfindung bietet einen zusätzlichen Effekt: Durch geeignete Wahl der pH-Werte der Puffersysteme kann nämlich erreicht werden, daß für eine Wiedergewinnung uninteressante Verunreinigungen im Substanzgemisch während der elektrophoretischen Konzentrierungsphase zur zweiten Elektrode 18 zuwandern und demzufolge nicht konzentriert werden. Dieser Effekt ergibt eine weitere Erhöhung der Trennleistung, weil ein Teil der Substanzen erst später und dann diffus in das Gel einwandern kann wenn die interessierende Substanzzone bereits scharf aufgetrennt auf dem Weg zum unteren Ende 2 ist.
• Die konstruktive Ausführung ist nicht auf Geräte mit kreisrohrförmigen Rohren beschränkt. Insbesondere sind (rechteckige)Avfbauformen und Konstruktionsdetails mit Erfolg bei der Erfindung anzuwenden, wie sie in den offengelegten deutschen Patentanmeldungen P 20 56 127; P 20 56 128 und P 20 56 129 beschrieben sind.
• Die Trennbarkeit des Elutionssystems vom übrigen Chromatographierohr bringt die Möglichkeit mit sich, die Rohre wie bisher einsetzen zu können. Im Bedarfsfall braucht dann nur ein Elutionssystem aufgeschraubt zu werden. Auf diese Weise ist auch eine Komplettierung vorhandener Rohre möglich.
• Die Erfindung beseitigt den Hauptnachteil der bekannten Gelchromatographen, bei denen bei der Gelfiltration grundsätzlich nur geringe Substanzvolumina (schmale Startzonen) auf das Gel auf getragen werden konnten, wenn befriedigende Ergebnisse erzielt werden sollten. Durch die Erfindung ist ein Weg gezeigt, wie diese limitierende Bedingung vermieden werden kann und große *Substanz volumina mit besten Trennergebuissen filtriert werden können. Die Erfindung bietet daher nicht nur eine Verbesserung bekannter Systeme sondem erweitert den Anwendungsbereich der Methode wesentlich.

Claims (18)

Patentansprüche

1. Verfahren für die Gelchromatographie, bei welchem in einem Chromatographierohr über ein Trenngel die zu trennende Substanz aufgeschichtet wird, d a d u r c h g e k e n n -z e i c h n e t , daß die aufgeschichtete Substanz (28) vor Beginn des chromatographischen Trennvorganges in einem ersten Teil (30) des Geles (5) elektrophoretisch konzentriert wird.

2. Gerät für die Gelchromatographie, insbesondere fiir die Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, mit einem Chromatographierohr (1), mit einem oberen Ende zum Einfüllen des Trenngeles und der Zuführung einer Elutionspufferflüssigkeit (29) und einem unteren Ende (2), das vorzugsweise verjüngt und verschließbar ist, zur Abführung der Fraktionen, z.B. zu einem Fraktionssammler, g e k e n n z e i c h n e t d u r c h ein im oberen Bereich des Chromatögraphierohres vorgesehenes bzw. vorzusehendes Gelelektrophoresesystem (7, 12, 15 bis 18).

3. Gerät nach Anspruch 2, wobei das Gelelektrophoresesystem eine Trennkammer, einen mit dem unteren Ende der Trennkammer elektrisch verbindbar en Pufferflüssigkeitsbehälter mit einer ersten Elektrode und eine mit dem oberen Ende der Trennkammer elektrisch verbindbare zweite Elektrode enthält, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Trennkammer (7) durch den oberen Bereich (7) des Chromatographierohres (1) gebildet ist.

4. Gerät nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch Mittel (10, 11) zum lösbaren Verbinden des Gelelektrophoresesystems vom übrigen unteren Chroinatographierohrteil (8).

5. Gerät nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Trennkammer (7) und das übrige Chromatograph-ierohr (ä) an ihren Verbindungsstellen (6) mit zueinanderpassenden Gewindeteilen (10, 11) versehen sind.

6. Gerät nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß der Pufferflüssigkeitsbehälter durch ein Gefäß (15) gebildet wird, das die Trennkammer (7) mit Abstand umgibt, und daß dessen Boden (ist) mit dem unteren Endbereich der äußeren Trennkammerwand dicht verbunden ist (14).

7. Gerät nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß im Pufferflüssigkeitsbehälter (15) dem Boden (13) benachbart und die Trennkammer (7) umgebend die erste Elektrode (16) angeordnet ist.

8. Gerät nach Anspruch 3 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Höhe der Trennkammer und die des Pufferflüssigkeitsbehälters derart bemessen sind, daß die Pufferflüssigkeit im Behälter bis auf das Niveau der Füllhöhe der Trennkammer auffüllbar ist, vorzugsweise daß die Trennkammer und der Pufferflüssigkeitsbehälter (15) gleich hoch ausgebildet sind.

9. Gerät nach Anspruch 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß im unteren Bereich der Trennkammer zum Zwecke der elektrischen Verbindung zur ersten Elektrode ein Verbindungsteil, vorzugsweise eine poröse Scheibe (17), deren Porm dem Querschnitt der Trennkammerwandung angepaßt ist, vorgesehen ist.

10. Gerät nach Anspruch 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Elektrode (18) im Innern des oberen Trennkammerbereiches angeordnet bzw. anzuordnen ist.

11. Gerät nach Anspruch 3 bis 10, dadurch gekennzelchnet, daß ein Deckel (20) für den oberen Abschluß der Trennkammer vorgesehen ist.

12. Gerät nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß p;wischen.dem oberen Trennkammerende und dem Deckel Dichtungsmittel (19) vorgesehen sind.

13. Gerät nach Anspruch 10 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die weite Elektrode (18) an der Unterseite des Deckels nach unten reichend angeordnet ist und an der Oberseite des Deckels ein elektrisches Anschlußstück, vorzugsweise eine Buchse, vorgesehen ist.

14. Gerät nach Anspruch ii bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Deckel eine mit einem Ventil, vorzugsweise Kükenhahn (21), verschließbare Öffnung (22) für den Austritt von an der zweiten Elektrode (18) beim Betrieb des Gerätes entstehendem Gas besitzt.

15. Gerätnach Anspruch 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Deckel (20) eine mit einem Ventil, vorzugsweise Eükenhahn (23), verschließbare Öffnung (24) für die Zuführung einer Elutionspufferflüssigkeit (29) aufweist.

16. Gerät nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß im Bereich des verjüngten unteren Endes des Ohromatographierohres eine poröse Siebplatte (4) angeordnet ist.

17. Gerät nach Anspruch 2 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß das verjüngte unterste Ende des Chromatographierohres mit einem Ventil, vorzugsweise Kükenhahn (3), verschließbar ist.

18. Gerät nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die untere Randbegrenzung der Deckelöffnung (24) rur die Zuführung der Elutionspufferflüssigkeit mittels eines Schlauch-Rohr- od.dgl. -Stückes (27) nach unten verlängert ist.

Leerseite